CN107858350B - 一种鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物及设计和扩增方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可用于快速鉴别鲽形目鳎科鱼类的鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物及设计和扩增方法，所提供的鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物可以高效和特异地扩增弯鲽形目鳎科鱼类蛸的ITS2，并能够一次性对多个物种同时进行扩增，具有高效快速和便捷的优点，且由于ITS2序列在鳎科鱼类不同物种中长度差异明显，可以通过凝胶电泳技术直接肉眼观察，进而高效快捷对形态相似或者形态损伤的物种进行鉴定。

Description

一种鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物及设计 和扩增方法

技术领域

本发明涉及一种分子生物技术领域，尤其涉及一种可用于快速鉴别鲽形目鳎科鱼类的鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物及设计和扩增方法。

背景技术

鳎科(Soleidae)作为鲽形目鱼类最丰富的类群，约有35属175种，很多种类都具有非常重要的经济价值，但是迄今关于鳎科鱼类核糖体序列的报道极其罕见，其中关于核糖体内转录间隔区2的研究更是空白。

核糖体内转录间隔区2（internal transcribed spacer1，简称ITS2）是一段位于核糖体RNA编码基因5.8S rDNA和28S rDNA中间的一段非编码区。5.8S rDNA和28S rDNA进化速率较慢，序列非常保守，而ITS2进化速率相对较快，在种内基本趋于相似，而在种间则表现出显著的差异，因此可以作为区分不同物种以及进行系统进化分析的分子标记。

中国专利局于2017年9月29日公开了一种蜘蛛线粒体基因组全序列扩增引物及扩增方法的发明授权，授权公开号：CN104531688B，该发明采用提取蜘蛛基因组的总DNA，通过线粒体基因组DNA的长PCR(L-PCR)扩增和测序对蜘蛛进行鉴定，但其仅能对蜘蛛进行扩增；同样是采用DNA技术对生物进行鉴定，但是其不能对明确的生物物种进行鉴定，且必须通过测序才能准确判定，并需要设计多对引物对基因组全序列进行扩增，耗时较长，过程繁琐。

发明内容

为解决上述迄今关于鳎科鱼类核糖体序列的报道极其罕见，其中关于核糖体内转录间隔区2的研究更是空白的问题，本发明提供了一种通过设计鳎科鱼类ITS2的通用引物，能够一次性批量扩增多种头足类ITS2，不需要针对某个单独物种设计特异性引物，既节省了时间成本，又大大提高了工作效率，具有高效快捷特点的鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物及设计和扩增方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物，所述鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物包括：正向引物SEQ ID NO.1:5' - DACAACTCTTAGCGGTGGATCA -3'，反向引物SEQ ID NO.2:5' - GCTCTTCCCTCTTCACTCG - 3'。

作为优选，所述鲽形目鳎科鱼类包括但不限于：蛾眉条鳎、缨鳞条鳎、带纹条鳎、日本条鳎、东方箬鳎、眼斑豹鳎、圆鳞鳎、褐斑栉鳞鳎、角鳎、卵鳎、塞内加尔鳎和卡氏大鼻鳎。

一种鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物的设计方法，从Genbank数据库中下载目前所有已经公布的鳎科鱼类5.8S rDNA和28S rDNA序列，对这些序列进行多重比对，分别在3’端和5’端找出比较保守的序列用于设计扩增ITS2的通用引物。

一种鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物的扩增方法，所述鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物的扩增方法包括以下步骤：

（1）DNA抽提试剂盒法提取鲽形目鳎科鱼类的总DNA；

（2）采用权利要求1中所述的鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物；

（3）以待测鲽形目鳎科鱼类的总DNA作为模版，进行PCR扩增；

（4）扩增引物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，试剂盒法割胶回收扩增片段，测序及序列拼接。

作为优选，所述步骤（1）中为避免鲽形目鳎科鱼类肠道内容物污染，舍去其头颈部，只从其尾部提取DNA。

作为优选，步骤（3）所述PCR扩增的反应体系组成为：2.5mM的dNTP2μL、10×TaqDNA聚合酶Buffer2.5μL、10μM的正向引物SEQ ID NO.1和反向引物SEQ ID NO.2各1μL、5U/μL的TaqDNA聚合酶0.2μL、100g/μL的DNA模版溶液1μL及灭菌双蒸水17.3μL；

所述PCR扩增条件为：95℃预变性5min，随后95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共进行35个循环，最后进行72℃延伸5min，4℃条件下保存。

作为优选，所述待测的鲽形目鳎科鱼类包括但不限于：蛾眉条鳎、缨鳞条鳎、带纹条鳎、日本条鳎、东方箬鳎、眼斑豹鳎、圆鳞鳎、褐斑栉鳞鳎、角鳎、卵鳎、塞内加尔鳎和卡氏大鼻鳎。

本发明的有益效果是：

（1）本发明所提供的一种鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物可以高效和特异地扩增弯鲽形目鳎科鱼类蛸的ITS2，并能够一次性对多个物种同时进行扩增，具有高效快速和便捷的优点；

（2）ITS2序列在鳎科鱼类不同物种中长度差异明显，可以通过凝胶电泳技术直接肉眼观察，可以高效快捷对形态相似或者形态损伤的物种进行鉴定。

附图说明

图1为本发明所提供的鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物对鲽形目鳎科鱼类进行PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图谱；

其中，M为Marker，1为蛾眉条鳎，2为日本条鳎，3为带纹条鳎，4为缨鳞条鳎，5为圆鳞鳎，6为角鳎，7为褐斑栉鳞鳎，8为卡氏大鼻鳎，9为眼斑豹鳎，10为卵鳎，11为东方箬鳎，12为塞内加尔鳎。

具体实施方式

下面结合本发明实施例和附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然所描述实施例仅为本发明一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

（1）鲽形目鳎科鱼类样品的采集、鉴定和保存

实施例中所用鲽形目鳎科鱼类样品均采自野外自然环境中，所采标本均带回实验室进行信息登记，并均用体视显微镜鉴定，以确定种类。种类鉴定完成的鲽形目鳎科鱼类样品用100%浓度的纯酒精浸泡并保存于4℃的冰箱中备用。

（2）鲽形目鳎科鱼类基因组的提取

采用DNA抽提试剂盒法提取待测鲽形目鳎科鱼类样品的总基因组DNA，为避免待测鲽形目鳎科鱼类样品的肠道内容物污染，舍去其头颈部，只从其尾部提取DNA，DNA提取直接采用DNA提取试剂盒进行提取，所提取的鲽形目鳎科鱼类保存于-20℃条件下备用。

（3）鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物的设计和合成

从Genbank数据库中下载目前所有已经公布的鳎科鱼类5.8S rDNA和28S rDNA序列，对这些序列进行多重比对，分别在3’端和5’端找出比较保守的序列用于设计扩增ITS2的通用引物。所合成的引物为：

正向引物SEQ ID NO.1:5' - DACAACTCTTAGCGGTGGATCA - 3'；

反向引物SEQ ID NO.2:5' - GCTCTTCCCTCTTCACTCG - 3'。

（4）PCR扩增

PCR扩增的反应体系组成为：2.5mM的dNTP2μL、10×TaqDNA聚合酶Buffer2.5μL、10μM的正向引物SEQ ID NO.1和反向引物SEQ ID NO.2各1μL、5U/μL的TaqDNA聚合酶0.2μL、100g/μL的DNA模版溶液1μL及灭菌双蒸水17.3μL；

所述PCR扩增条件为：95℃预变性5min，随后95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共进行35个循环，最后进行72℃延伸5min，4℃条件下保存。

（5）PCR产物的鉴定

PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳图谱如图1所示，ITS2序列在某些鳎科鱼类不同物种中长度差异非常明显，可以肉眼直接观察，高效快捷对形态相似或者形态损伤的物种进行鉴定。测序结果如下：

蛾眉条鳎的测序结果如SEQ ID NO.3所示：

5'-AACAACTCTTAGCGGTGGATCACTTGGCTCGTGCGTCGATGAAGGACGCAGCTAGCTGCGAGAACTAATGTGAATTGCAGGACACATTGATCATTGACACTTCGAACGCACCTTGCGGCCCCGGGTTCCTCCCGGGGCTACGCCTGTCTGAGGGTCGCTTTGCCATCAATCGGAGACGCCCGCGTCTCCGCGGCTGGGGCAGTCGAAGGCCGCTAGCGGCGGCCTCCGTCCCCCTAAGTGCAGACCACTGTGGCCTCCCGGAGCAGACTTGGCCGACCCTCCCGCGCACGAGCCGGGCGCGGCTGCCGGTGGACTCTCGGGTCTCCGCGCTGCCCGCGTTACGCATGCGCCGGGCGGGTCGGCCTCCGCACCGGGCCGGCCGGCCGCTCAGCGCGACGGGTAGCGGGCACACCCCCGCTGCCCGTCGCCGGGCCACGTCACCTCGTTCGACTACGACCTCAGATCAGACGAGACGACCCGCTGAATTTAAGCATATTACTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACCAGGATTCCCCAGTAGCGGCGAGTGAAGAGGGAAGAGC-3'；

缨鳞条鳎的测序结果如SEQ ID NO.4所示：

5'-AACAACTCTTAGCGGTGGATCACTTGGCTCGTGCGTCGATGAAGGACGCAGCTAGCTGCGAGAACTAGTGTGAATTGCAGGACACATTGATCATTGACACTTCGAACGCACCTTGCGGCCCCGGGTTCCTCCCGGGGCTACGCCTGTCTGAGGGTCGCTTTGCCATCAATCGGAGACGCCCGCGTCTCCGCGGCTGGGGCAGTCGCAGGGCGCGCGCACACAACGCACGGCCTCCGTCCCCCCAAGTTCAGACCACTGTGGCCTCCCCTGCCGGACGGAGCAGTCTGGGCCCCCCAACCCCACCCGCACACGAGCCGGGCGCGGCTGCCGGTGGACTCTCGGGTCTCCGCGCTGCCCGCGTTACGCGTGCGACGGGCGGGCCGGCCCCTGCCCGACCGGCCGGGCTGGCTGCCCAGCGCGACGGGGGCCACCCCCCCCCTCGCCGGGCGCCACCACCTCGTTCGACTACGACCTCAGATCAGACGAGACGACCCGCTGAATTTAAGCATATTACTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACCAGGATTCCCCCAGTAGCGGCGAGTGAAGAGGGAAGAGC-3'；

带纹条鳎的测序结果如SEQ ID NO.5所示：

5'-AACAACTCTTAGCGGTGGATCACTTGGCTCGTGCGTCGATGAAGGACGCAGCTAGCTGCGAGAACTAATGTGAATTGCAGGACACATTGATCATTGACACTTCGAACGCACCTTGCGGCCCCGGGTTCCTCCCGGGGCTACGCCTGTCTGAGGGTCGCTTTGCCATCAATCGGAGACGCCCGCGTCTCCGCGGCTGGGGCAGTCGCAGGCCGCGCAGGCCTCCGTCCCCCCAAGTGCAGACCGAAATGGCCGGAACGGAACGGAGCGTTTCCGGGGCCGAAAAACCCCCCACCCCCCCGCGCGCGCACGAGCCGGGCGCGGCTGCCGGTGGACTCTCGGGTCTCCGCGCTGCCCGCGTTACGCGTGCGCCGCACCCGGGTGGGGTCGGCCCCTCTGCCCCCGACCGCGCCGGCCGCCCAGCGCGCCCCGACGGGGGCGCCGGGCGACATCACCTCGTTCGACTACGACCTCAGATCAGACGAGACGACCCGCTGAATTTAAGCATATTACTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACCAGGATTCCCTCAGTAGCGGCGAGTGAAGAGGGAAGAGC-3'；

日本条鳎的测序结果如SEQ ID NO.6所示：

5'-AACAACTCTTAGCGGTGGATCACTTGGCTCGTGCGTCGATGAAGGACGCAGCTAGCTGCGAGAACTAATGTGAATTGCAGGACACATTGATCATTGACACTTCGAACGCACCTTGCGGCCCCGGGTTCCTCCCGGGGCTACGCCTGTCTGAGGGTCGCTTTGCCATCAATCGGAGAGTGCCTGTCACTCTCCGCGGCTGGGGCAGTCGCAGGCCGCCGCAGGCCTCCGTCCCCCCAAGTGCAGACCACCACATCTCTGCCGGGACGGAGCAGTCTCTCTCCTCTCCCCGCCCACCCCGAGCGCATGAGCCGGGCGCGGCTGCCGGTGGACTCTCGGGTCTCCCCGCGCTGCCCGCGTTACGCGTGCGCCGTGGTCAGGGGTTAGGAGGTCTCTGCCCGCCACCGCCGCCCAGCGCGAGGGGGCCCCCCCCCCTCGCCGGGCACCATCACCTCGTTCGACTACGACCTCAGATCAGACGAGACGACCCGCTGAATTTAAGCATATTACTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACCAGGATTCCCTCAGTAGCGGCGAGTGAAGAGGGAAGAGC-3'；

东方箬鳎的测序结果如SEQ ID NO.7所示：

5'-TACAACTCTTAGCGGTGGATCACTCGGCTCGTGCGTCGATGAAGGACGCAGCTAGCTGCGAGAACTAATGTGAATTGCAGGACACATTGATCATTGACACTTCGAACGCACCTTGCGGCCCCGGGTTCCTCCCGGGGCTACGCCTGTCTGAGGGTCGCTTTGCCATCAATCGGAGACCCCCGCGTCTCCGCGGCTGGGGCAGTCGCAGGCCTTCGCGGGCCTTCGTCCCCCTAAGTGCAGACCTCTGCGTCGCCGGGAACGGAGTCCCCTCCCTCCCGCTCCGCGCGCGTTCCCTCGCCGCTGCTGCCGCAGCAGCCCCGCGAAAGCCGCCGGGCCCCCCGCACGATGCCTGGCGCGGCTGCCGGTGGACTCCCGGGTCTCCGCGCTGCCCGCGCCACGGCGTGCGTCGGGTCCCCGTCCGGTGGGGCTGCGGGCCAGCGGGCTCCGGGGCGCCGCGCCGCGGTTCGGTTCGGGTCGGGCGGCGTTCCCGCCGTGAGTCCCGCCGCGCGCTCCGCCGCGGCGGGCCACCGCCAACCCCCCATCGTTCGACTACGACCTCAGATCAGACGAGACGACCCGCTGAATTTAAGCATATTACTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACCAGGATTCCCTCAGTAGCGGCGAGTGAAGAGGGAAGAGC-3'；

眼斑豹鳎的测序结果如SEQ ID NO.8所示：

5'-GACAACTCTTAGCGGTGGATCACTCGGCTCGTGCGTCGATGAAGGACGCAGCTAGCTGCGAGAACTAATGTGAATTGCAGGACACATTGATCATTGACACTTCGAACGCACCTTGCGGCCCCGGGTTCCTCCCGGGGCTACGCCTGTCTGAGGGTCGCTTTGACATCAATCGGAGACCCCCGCGTCTCCGCGGCTGGGGCAGTCGCAGGCGGGCTGAGCCGGCCTTCGTCCCCCCCAAGTGCAGACCTCAGGGTGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGACCCTCTCCCGCTCTCTCTCTCTCTCTTCCTCCACCCGCCGCTGTCTCAGGGGCGGGTGGCACCTCCCGCCCCCAACGCGCGAGTCGGGCGCGGCTGCCGGTGGACTCCCGAGTCTCCGCGCTGCCCGCGTTACGCGTGCGAGAGGGGGACGGGGCGGAAGAAGGTCTGAGGGCCGAGGGCCGCCGCCGCCGCCGTCCCTGTCACTGTCGGCCGATCCCGTGAGCCCAGCCCCAGGTGGGCTGGCCACGCCGCGCTTCCTCGGCTTACGACCTCAGATCAGACGAGACGACCCGCTGAATTTAAGCATATTACTAAGCGGAGGAAAAGAAGCTAACCAGGATTCCCTCAGTAGCGGCGAGTGAAGAGGGAAGAGC-3'；

圆鳞鳎的测序结果如SEQ ID NO.9所示：

5'-GACAACTCTTAGCGGTGGATCACTCGGCTCGTGCGTCGATGAAGGACGCAGCTAGCTGCGAGAACTAATGTGAATTGCAGGACACATTGATCATTGACACTTCGAACGCACCTTGCGGCCCCGGGTTCCTCCCGGGGCTACGCCTGTCTGAGGGTCGCTTTGACATCCATCGGAGACGGTCCATCCACCGTCTCCGCGGCTGGGGCAGTCGCAGGCGGCGTCCTCGCCCGCCTTCGTCCCCCCAAAAGCAGACGTCTGGCGCAGCACTCTCTCCTCCTCCTGCTCCTCCGTCGTGTGCCCGTGCACGAGCCGGGCGCGGCTGCCGGCGGACTCCCGAGTCTCCGCGCTGCCCGCGTTACGCGTGCCCCCCGTGGCCTCTGGCAGAGACAGGCAGAGACAGAGAGAGAGCGGCGGCCCCCGCCGAATCCCGTGAGCCCACCTCCGGGCGGGCCACGAGCCCTTACCGCTCCGACTACGACCTCAGATCAGACGAGACGACCCGCTGAATTTAAGCATATTACTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACCAGGATTCCCTCAGTAGCGGCGAGTGAAGAGGGAAGAGC-3'；

褐斑栉鳞鳎的测序结果如SEQ ID NO.10所示：

5'-GACAACTCTTAGCGGTGGATCACTCGGCTCGTGCGTCGATGAAGGACACAACTAGCTGCGAGAACTAATGTGAATTGCAGGACACATTGATCATTGACACTTCGAACGCACCTTGCGGCCCCGGGTTCCTCCCGGGGCTACGCCTGTCTGAGGGTCGCTTTGACATCAATCGGAGACGCGCGCCTGCGTCTCCGCGGCTGGGGCAGTCGCAAGCGGCTTAGCCCGCCTTCGTCCCCCTAAGTGCAGACCTCTGGGTACGCTCCGGGAGCGGAGTGGCATCCACCAGCGTCAAATACAAACCCCCCGTCGGGTCCGCACGAGTCGGGCGCGGCTGCCGGTGGACTCCCGGGTCTCCGCGCTGCCCGCGTGACGCGCGTGCTGCGGCCCGGCCCGTGGGTTTGTAGCGGGTGAGTGTGCCTCCCGTTTCCCTTCCGTATCCAGGTCCCCCCCCCCCGGTTCACGTGAGCCCGGCCTCGGCCTGGGCCACGCCAAACACTCTGACTACGACCTCAGATCAGACGAGACGACCCGCTGAATTTAAGCATATTACTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACCAGGATTCCCTCAGTAGCGGCGAGTGAAGAGGGAAGAGC-3'；

角鳎的测序结果如SEQ ID NO.11所示：

5'-TACAACTCTTAGCGGTGGATCACTTGGCTCGTGCGTCGATGAAGGACGCAGCTAGCTGCGAGAACTAATGTGAATTGCAGGACACATTGATCATTGACACTTCGAACGCACCTTGCGGCCCCGGGTTCCTCCCGGGGCCACGCCTGTCTGAGGGTCGCTTTGCCATCAGTCGGAGACGCCCGCGTGCGCCTCCGCGGCTGGGGCAGTCGCAGGCCCGGGGCCCACGCGCCTCGGCCTCCGTCCCCCCAAGTGCAGACCACCTCGCGGAGAGAGAGCAGCGACTCCTGCCCCCGCCCGACGCACGAGCCGGGCGCGGCTGCCGGTGGACTCCAGAGTCTCCGCGCTGCCCGCGCTACGCGTGCGCCGCGTGCGGGTCGGGTCTCTCTGCCCCGCTGCCCAGCGCGACGGGCGGGAGGGCGTCGGAAAAAGACGCCCGCCCCCGCCCGCCGCCGGGCGCCAGCAAACCTCCTTCGACTACGACCTCAGATCAGACGAGACGACCCGCTGAATTTAAGCATATTACTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACCAGGATTCCCTCAGTAGCGGCGAGTGAAGAGGGAAGAGC-3'；

卵鳎的测序结果如SEQ ID NO.12所示：

5'-TACAACTCTTAGCGGTGGATCACACGGCTCGTGCGTCGATGAAGGACGCAGCTAGCTGCGAGAACTAATGTGAATTGCAGGGCACATTGATCATTGACACTTCGAACGCACCTTGCGGCCCCGGGTTCCTCCCGGGGCTACGCCTGTCTGAGGGTCGCTTTGCCATCAATCGGAGACGCCCGCGTCTCCGCGGCTGGGGTCAGTCGCAGGCGCCCGCCGGCGCCTTCGTGCCCCTAAGTGCAGACTCTTGTCGTCGAAAGCTGTGCGACGGTTCCCGTCCTCCCCCCCCACCACCCTCCGTGTCGCACACCCCCACCCGCCCGACCGCCAACCCAAACCGCTGGGCTCCACGCACGAGTCGGGCGCGGCTGCCGGTGGACTCTCGGGTCTCCGCGCTGCCCGCGCTACGCGTGCGTCGGTTCCAGTCCGGCGGGGCGGCCCGTGGCGGTGGAGGTGGCTGGCGCGCGGAGGAGGAGGAGGAGGCCGCGCGAAGCCCGTCCGACGTGAGTCCCGCTCTGTGCGCGCGGGCCACCCCCCCTCCTCATTCGACTACGACCTCAGATCAGACGAGACAACCCGCTGAATTTAAGCATATTACTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACCAGGATTCCCTCAGTAGCGGCGAGTGAAGAGGGAAGAGC-3'；

塞内加尔鳎的测序结果如SEQ ID NO.13所示：

5'-TACAACTCTTAGCGGTGGATCACTCGGCTCGTGCGTCGATGAAGGACGCAGCTAGCTGCGAGAACTAATGTGAATTGCAGGACACATTGATCATTGACACTTCGAACGCACCTTGCGGCCCCGGGTTCCTCCCGGGGCTACGCCTGTCTGAGGGTCGCTTTGCCATCAATCGGAGACGCCCGCGTCTCCGCGGCTGGGGTCAGTCGCAGGCACTCACCGTGCCTTCGTGCCCCTAAGTGCAGACACACGACGCAAACTCTGTTGTCGGAAAACAAGCTGTGTGACGGTTCCGTTCACCCTCCACTGCCACACGCCCCCCCCACGACCGCTAACCCAAACCGCTGGGCCCCGCATGAGTCGGGCGCGGCTGCCGGTGGACTCTCGGGTCTCCGCGCTGCCCGCGTTACGCGTGCGTCGGTTCTCGGCGGGGCGGCCCCGTTGGGGTGGGTTGTGTGTGGTGCCTGGAAGGGCGGCGGTTGCGTGAAGCCCGTCCGACGTGAGCTCTGTCCACCCCTTTGACCGGGTTGGGCGGACCACCCCCCTCCTCATTCGACTACGACCTCAGATCAGACGAGACAACCCGCTGAATTTAAGCATATTACTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACCAGGATTCCCTCAGTAGCGGCGAGTGAAGAGGGAAGAGC-3'；

卡氏大鼻鳎的测序结果如SEQ ID NO.14所示：

5'-AACAACTCTTAGCGGTGGATCACTCGGCTCGTGCGTCGATGAAGGACGCAGCTAGCTGCGAGAACTAATGTGAATTGCAGGACACATTGATCATTGACACTTCGAACGCACCTTACGGCCCCGGGTTCCTCCCGGGGCTACGCCTGTCTGAGGGTCGCTTTGCCATCAATCGGAGGGGGTCTGCCCGCCCCCGTCCGCAGCTGGGGCAGTCGCAGGCCCACGTCCGGCCTTCGTCCCCCTAAGAGCAGACCACCGGGAGAGAGATAGAGAGAAAAGACCGTCACCGTACGGACTCGCCCGTTCCCCCCCCCAGCCGGGACTCGCTCGCCACCCCCTCCGCACGAGTCGGGCGCGGCTGCCGGTGGACTCCGCTGCCCGGGTCTCCGCGCTGCCCGCGTTACGCGTGCGAAGGACGGTCGACGCGAACCGACCCGACTTCCTCCTCCTGGCTCTCTCCCTCCTTCCCAGCGGCGGGACCCGTCCCGCCCGGGAGCGCAACCAGCTTTCGACTACGACCTCAGATCAGACGAGACGACCCGCTGAATTTAAGCATATTACTAAGTGGAGGAAAAGAAGCTAACCAGGATTCCCTCAGTAGCGGCGAGTGAAGAGGGAAGAGC-3'。

序列表

<110> 浙江海洋大学

<120> 一种鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物及设计和扩增方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 通用引物(consensus primer)

<400> 1

dacaactctt agcggtggat ca 22

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 通用引物(consensus primer)

<400> 2

gctcttccct cttcactcg 19

<210> 3

<211> 560

<212> DNA

<213> 蛾眉条鳎的测序结果(The sequencing results of Zebrias quagga)

<400> 3

aacaactctt agcggtggat cacttggctc gtgcgtcgat gaaggacgca gctagctgcg 60

agaactaatg tgaattgcag gacacattga tcattgacac ttcgaacgca ccttgcggcc 120

ccgggttcct cccggggcta cgcctgtctg agggtcgctt tgccatcaat cggagacgcc 180

cgcgtctccg cggctggggc agtcgaaggc cgctagcggc ggcctccgtc cccctaagtg 240

cagaccactg tggcctcccg gagcagactt ggccgaccct cccgcgcacg agccgggcgc 300

ggctgccggt ggactctcgg gtctccgcgc tgcccgcgtt acgcatgcgc cgggcgggtc 360

ggcctccgca ccgggccggc cggccgctca gcgcgacggg tagcgggcac acccccgctg 420

cccgtcgccg ggccacgtca cctcgttcga ctacgacctc agatcagacg agacgacccg 480

ctgaatttaa gcatattact aagcggagga aaagaaacta accaggattc cccagtagcg 540

gcgagtgaag agggaagagc 560

<210> 4

<211> 576

<212> DNA

<213> 缨鳞条鳎的测序结果(The sequencing results of Zebrias quagga)

<400> 4

aacaactctt agcggtggat cacttggctc gtgcgtcgat gaaggacgca gctagctgcg 60

agaactagtg tgaattgcag gacacattga tcattgacac ttcgaacgca ccttgcggcc 120

ccgggttcct cccggggcta cgcctgtctg agggtcgctt tgccatcaat cggagacgcc 180

cgcgtctccg cggctggggc agtcgcaggg cgcgcgcaca caacgcacgg cctccgtccc 240

cccaagttca gaccactgtg gcctcccctg ccggacggag cagtctgggc cccccaaccc 300

cacccgcaca cgagccgggc gcggctgccg gtggactctc gggtctccgc gctgcccgcg 360

ttacgcgtgc gacgggcggg ccggcccctg cccgaccggc cgggctggct gcccagcgcg 420

acgggggcca ccccccccct cgccgggcgc caccacctcg ttcgactacg acctcagatc 480

agacgagacg acccgctgaa tttaagcata ttactaagcg gaggaaaaga aactaaccag 540

gattccccca gtagcggcga gtgaagaggg aagagc 576

<210> 5

<211> 572

<212> DNA

<213> 带纹条鳎的测序结果(The sequencing results of Zebrias zebra)

<400> 5

aacaactctt agcggtggat cacttggctc gtgcgtcgat gaaggacgca gctagctgcg 60

agaactaatg tgaattgcag gacacattga tcattgacac ttcgaacgca ccttgcggcc 120

ccgggttcct cccggggcta cgcctgtctg agggtcgctt tgccatcaat cggagacgcc 180

cgcgtctccg cggctggggc agtcgcaggc cgcgcaggcc tccgtccccc caagtgcaga 240

ccgaaatggc cggaacggaa cggagcgttt ccggggccga aaaacccccc acccccccgc 300

gcgcgcacga gccgggcgcg gctgccggtg gactctcggg tctccgcgct gcccgcgtta 360

cgcgtgcgcc gcacccgggt ggggtcggcc cctctgcccc cgaccgcgcc ggccgcccag 420

cgcgccccga cgggggcgcc gggcgacatc acctcgttcg actacgacct cagatcagac 480

gagacgaccc gctgaattta agcatattac taagcggagg aaaagaaact aaccaggatt 540

ccctcagtag cggcgagtga agagggaaga gc 572

<210> 6

<211> 569

<212> DNA

<213> 日本条鳎的测序结果(The sequencing results of Zebrias japonicus)

<400> 6

aacaactctt agcggtggat cacttggctc gtgcgtcgat gaaggacgca gctagctgcg 60

agaactaatg tgaattgcag gacacattga tcattgacac ttcgaacgca ccttgcggcc 120

ccgggttcct cccggggcta cgcctgtctg agggtcgctt tgccatcaat cggagagtgc 180

ctgtcactct ccgcggctgg ggcagtcgca ggccgccgca ggcctccgtc cccccaagtg 240

cagaccacca catctctgcc gggacggagc agtctctctc ctctccccgc ccaccccgag 300

cgcatgagcc gggcgcggct gccggtggac tctcgggtct ccccgcgctg cccgcgttac 360

gcgtgcgccg tggtcagggg ttaggaggtc tctgcccgcc accgccgccc agcgcgaggg 420

ggcccccccc cctcgccggg caccatcacc tcgttcgact acgacctcag atcagacgag 480

acgacccgct gaatttaagc atattactaa gcggaggaaa agaaactaac caggattccc 540

tcagtagcgg cgagtgaaga gggaagagc 569

<210> 7

<211> 660

<212> DNA

<213> 东方箬鳎的测序结果(The sequencing results of Brachirusorientalis)

<400> 7

tacaactctt agcggtggat cactcggctc gtgcgtcgat gaaggacgca gctagctgcg 60

agaactaatg tgaattgcag gacacattga tcattgacac ttcgaacgca ccttgcggcc 120

ccgggttcct cccggggcta cgcctgtctg agggtcgctt tgccatcaat cggagacccc 180

cgcgtctccg cggctggggc agtcgcaggc cttcgcgggc cttcgtcccc ctaagtgcag 240

acctctgcgt cgccgggaac ggagtcccct ccctcccgct ccgcgcgcgt tccctcgccg 300

ctgctgccgc agcagccccg cgaaagccgc cgggcccccc gcacgatgcc tggcgcggct 360

gccggtggac tcccgggtct ccgcgctgcc cgcgccacgg cgtgcgtcgg gtccccgtcc 420

ggtggggctg cgggccagcg ggctccgggg cgccgcgccg cggttcggtt cgggtcgggc 480

ggcgttcccg ccgtgagtcc cgccgcgcgc tccgccgcgg cgggccaccg ccaacccccc 540

atcgttcgac tacgacctca gatcagacga gacgacccgc tgaatttaag catattacta 600

agcggaggaa aagaaactaa ccaggattcc ctcagtagcg gcgagtgaag agggaagagc 660

<210> 8

<211> 650

<212> DNA

<213> 眼斑豹鳎的测序结果(The sequencing results of Pardachiruspavoninus)

<400> 8

gacaactctt agcggtggat cactcggctc gtgcgtcgat gaaggacgca gctagctgcg 60

agaactaatg tgaattgcag gacacattga tcattgacac ttcgaacgca ccttgcggcc 120

ccgggttcct cccggggcta cgcctgtctg agggtcgctt tgacatcaat cggagacccc 180

cgcgtctccg cggctggggc agtcgcaggc gggctgagcc ggccttcgtc ccccccaagt 240

gcagacctca gggtgcgtgt gtgtgtgtgt gtgtgaccct ctcccgctct ctctctctct 300

cttcctccac ccgccgctgt ctcaggggcg ggtggcacct cccgccccca acgcgcgagt 360

cgggcgcggc tgccggtgga ctcccgagtc tccgcgctgc ccgcgttacg cgtgcgagag 420

ggggacgggg cggaagaagg tctgagggcc gagggccgcc gccgccgccg tccctgtcac 480

tgtcggccga tcccgtgagc ccagccccag gtgggctggc cacgccgcgc ttcctcggct 540

tacgacctca gatcagacga gacgacccgc tgaatttaag catattacta agcggaggaa 600

aagaagctaa ccaggattcc ctcagtagcg gcgagtgaag agggaagagc 650

<210> 9

<211> 583

<212> DNA

<213> 圆鳞鳎的测序结果(The sequencing results of Liachirusmelanospilus)

<400> 9

gacaactctt agcggtggat cactcggctc gtgcgtcgat gaaggacgca gctagctgcg 60

agaactaatg tgaattgcag gacacattga tcattgacac ttcgaacgca ccttgcggcc 120

ccgggttcct cccggggcta cgcctgtctg agggtcgctt tgacatccat cggagacggt 180

ccatccaccg tctccgcggc tggggcagtc gcaggcggcg tcctcgcccg ccttcgtccc 240

cccaaaagca gacgtctggc gcagcactct ctcctcctcc tgctcctccg tcgtgtgccc 300

gtgcacgagc cgggcgcggc tgccggcgga ctcccgagtc tccgcgctgc ccgcgttacg 360

cgtgcccccc gtggcctctg gcagagacag gcagagacag agagagagcg gcggcccccg 420

ccgaatcccg tgagcccacc tccgggcggg ccacgagccc ttaccgctcc gactacgacc 480

tcagatcaga cgagacgacc cgctgaattt aagcatatta ctaagcggag gaaaagaaac 540

taaccaggat tccctcagta gcggcgagtg aagagggaag agc 583

<210> 10

<211> 612

<212> DNA

<213> 褐斑栉鳞鳎的测序结果(The sequencing results of Aseraggodeskobensis)

<400> 10

gacaactctt agcggtggat cactcggctc gtgcgtcgat gaaggacaca actagctgcg 60

agaactaatg tgaattgcag gacacattga tcattgacac ttcgaacgca ccttgcggcc 120

ccgggttcct cccggggcta cgcctgtctg agggtcgctt tgacatcaat cggagacgcg 180

cgcctgcgtc tccgcggctg gggcagtcgc aagcggctta gcccgccttc gtccccctaa 240

gtgcagacct ctgggtacgc tccgggagcg gagtggcatc caccagcgtc aaatacaaac 300

cccccgtcgg gtccgcacga gtcgggcgcg gctgccggtg gactcccggg tctccgcgct 360

gcccgcgtga cgcgcgtgct gcggcccggc ccgtgggttt gtagcgggtg agtgtgcctc 420

ccgtttccct tccgtatcca ggtccccccc ccccggttca cgtgagcccg gcctcggcct 480

gggccacgcc aaacactctg actacgacct cagatcagac gagacgaccc gctgaattta 540

agcatattac taagcggagg aaaagaaact aaccaggatt ccctcagtag cggcgagtga 600

agagggaaga gc 612

<210> 11

<211> 585

<212> DNA

<213> 角鳎的测序结果(The sequencing results of Pleuronectiformes)

<400> 11

tacaactctt agcggtggat cacttggctc gtgcgtcgat gaaggacgca gctagctgcg 60

agaactaatg tgaattgcag gacacattga tcattgacac ttcgaacgca ccttgcggcc 120

ccgggttcct cccggggcca cgcctgtctg agggtcgctt tgccatcagt cggagacgcc 180

cgcgtgcgcc tccgcggctg gggcagtcgc aggcccgggg cccacgcgcc tcggcctccg 240

tccccccaag tgcagaccac ctcgcggaga gagagcagcg actcctgccc ccgcccgacg 300

cacgagccgg gcgcggctgc cggtggactc cagagtctcc gcgctgcccg cgctacgcgt 360

gcgccgcgtg cgggtcgggt ctctctgccc cgctgcccag cgcgacgggc gggagggcgt 420

cggaaaaaga cgcccgcccc cgcccgccgc cgggcgccag caaacctcct tcgactacga 480

cctcagatca gacgagacga cccgctgaat ttaagcatat tactaagcgg aggaaaagaa 540

actaaccagg attccctcag tagcggcgag tgaagaggga agagc 585

<210> 12

<211> 660

<212> DNA

<213> 卵鳎的测序结果(The sequencing results of Solea ovata)

<400> 12

tacaactctt agcggtggat cacacggctc gtgcgtcgat gaaggacgca gctagctgcg 60

agaactaatg tgaattgcag ggcacattga tcattgacac ttcgaacgca ccttgcggcc 120

ccgggttcct cccggggcta cgcctgtctg agggtcgctt tgccatcaat cggagacgcc 180

cgcgtctccg cggctggggt cagtcgcagg cgcccgccgg cgccttcgtg cccctaagtg 240

cagactcttg tcgtcgaaag ctgtgcgacg gttcccgtcc tcccccccca ccaccctccg 300

tgtcgcacac ccccacccgc ccgaccgcca acccaaaccg ctgggctcca cgcacgagtc 360

gggcgcggct gccggtggac tctcgggtct ccgcgctgcc cgcgctacgc gtgcgtcggt 420

tccagtccgg cggggcggcc cgtggcggtg gaggtggctg gcgcgcggag gaggaggagg 480

aggccgcgcg aagcccgtcc gacgtgagtc ccgctctgtg cgcgcgggcc accccccctc 540

ctcattcgac tacgacctca gatcagacga gacaacccgc tgaatttaag catattacta 600

agcggaggaa aagaaactaa ccaggattcc ctcagtagcg gcgagtgaag agggaagagc 660

<210> 13

<211> 664

<212> DNA

<213> 塞内加尔鳎的测序结果(The sequencing results of Senegal sole)

<400> 13

tacaactctt agcggtggat cactcggctc gtgcgtcgat gaaggacgca gctagctgcg 60

agaactaatg tgaattgcag gacacattga tcattgacac ttcgaacgca ccttgcggcc 120

ccgggttcct cccggggcta cgcctgtctg agggtcgctt tgccatcaat cggagacgcc 180

cgcgtctccg cggctggggt cagtcgcagg cactcaccgt gccttcgtgc ccctaagtgc 240

agacacacga cgcaaactct gttgtcggaa aacaagctgt gtgacggttc cgttcaccct 300

ccactgccac acgccccccc cacgaccgct aacccaaacc gctgggcccc gcatgagtcg 360

ggcgcggctg ccggtggact ctcgggtctc cgcgctgccc gcgttacgcg tgcgtcggtt 420

ctcggcgggg cggccccgtt ggggtgggtt gtgtgtggtg cctggaaggg cggcggttgc 480

gtgaagcccg tccgacgtga gctctgtcca cccctttgac cgggttgggc ggaccacccc 540

cctcctcatt cgactacgac ctcagatcag acgagacaac ccgctgaatt taagcatatt 600

actaagcgga ggaaaagaaa ctaaccagga ttccctcagt agcggcgagt gaagagggaa 660

gagc 664

<210> 14

<211> 620

<212> DNA

<213> 卡氏大鼻鳎的测序结果(The sequencing results of Pegusa cadenati)

<400> 14

aacaactctt agcggtggat cactcggctc gtgcgtcgat gaaggacgca gctagctgcg 60

agaactaatg tgaattgcag gacacattga tcattgacac ttcgaacgca ccttacggcc 120

ccgggttcct cccggggcta cgcctgtctg agggtcgctt tgccatcaat cggagggggt 180

ctgcccgccc ccgtccgcag ctggggcagt cgcaggccca cgtccggcct tcgtccccct 240

aagagcagac caccgggaga gagatagaga gaaaagaccg tcaccgtacg gactcgcccg 300

ttcccccccc cagccgggac tcgctcgcca ccccctccgc acgagtcggg cgcggctgcc 360

ggtggactcc gctgcccggg tctccgcgct gcccgcgtta cgcgtgcgaa ggacggtcga 420

cgcgaaccga cccgacttcc tcctcctggc tctctccctc cttcccagcg gcgggacccg 480

tcccgcccgg gagcgcaacc agctttcgac tacgacctca gatcagacga gacgacccgc 540

tgaatttaag catattacta agtggaggaa aagaagctaa ccaggattcc ctcagtagcg 600

gcgagtgaag agggaagagc 620

Claims (7)

1.通用引物在扩增鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2中的应用，其特征在于，所述通用引物包括：正向引物SEQ ID NO.1:5' - DACAACTCTTAGCGGTGGATCA - 3'，反向引物SEQID NO.2:5' - GCTCTTCCCTCTTCACTCG - 3'。

2.根据权利要求1所述的通用引物在扩增鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2中的应用，其特征在于，所述鲽形目鳎科鱼类包括但不限于：蛾眉条鳎、缨鳞条鳎、带纹条鳎、日本条鳎、东方箬鳎、眼斑豹鳎、圆鳞鳎、褐斑栉鳞鳎、角鳎、卵鳎、塞内加尔鳎和卡氏大鼻鳎。

3.一种如权利要求1所述的鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物的设计方法，其特征在于，从Genbank数据库中下载目前所有已经公布的鳎科鱼类5.8S rDNA和28SrDNA序列，对这些序列进行多重比对，分别在3’端和5’端找出比较保守的序列用于设计扩增ITS2的通用引物。

4.一种如权利要求1所述的鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物的扩增方法，其特征在于，所述鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物的扩增方法包括以下步骤：

（1）DNA抽提试剂盒法提取鲽形目鳎科鱼类的总DNA；

（2）采用权利要求1中所述的鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物；

（3）以待测鲽形目鳎科鱼类的总DNA作为模版，进行PCR扩增；

（4）扩增引物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，试剂盒法割胶回收扩增片段，测序及序列拼接。

5.根据权利要求4所述的一种鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物的扩增方法，其特征在于，所述步骤（1）中为避免鲽形目鳎科鱼类肠道内容物污染，舍去其头颈部，只从其尾部提取DNA。

6.根据权利要求4所述的一种鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物的扩增方法，其特征在于，步骤（3）所述PCR扩增的反应体系组成为：2.5mM的dNTP2μL、10×TaqDNA聚合酶Buffer2.5μL、10μM的正向引物SEQ ID NO.1和反向引物SEQ ID NO.2各1μL、5U/μL的TaqDNA聚合酶0.2μL、100g/μL的DNA模版溶液1μL及灭菌双蒸水17.3μL；

所述PCR扩增条件为：95℃预变性5min，随后95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共进行35个循环，最后进行72℃延伸5min，4℃条件下保存。

7.根据权利要求4所述的一种鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物的扩增方法，其特征在于，所述待测的鲽形目鳎科鱼类包括但不限于：蛾眉条鳎、缨鳞条鳎、带纹条鳎、日本条鳎、东方箬鳎、眼斑豹鳎、圆鳞鳎、褐斑栉鳞鳎、角鳎、卵鳎、塞内加尔鳎和卡氏大鼻鳎。

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