CN105368819A - 一种从黄鳝体表粘液提取基因组dna的方法 - Google Patents

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曹哲明
丁炜东
邴旭文
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
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Abstract

本发明涉及一种从黄鳝体表粘液提取基因组DNA的方法，包括黄鳝体表粘液的采集：无创伤地从黄鳝体表采集体表粘液；黄鳝体表粘液基因组DNA的提取。本发明方法简单、高效、便捷，且不会对黄鳝造成损伤，不影响其存活能力和生产性能。

Description

一种从黄鳝体表粘液提取基因组DNA的方法
技术领域
本发明涉及黄鳝基因组DNA提取方法检测，具体地说，涉及一种如何从黄鳝体表粘液提取基因组DNA的方法。
背景技术
黄鳝(Monopterusalbus)是我国的一种重要的经济鱼类之一，属于硬骨鱼纲，合鳃目，合鳃科，黄鳝属。受环境污染及滥捕的影响，黄鳝的自然资源量不断下降，而人工养殖因受苗种繁殖的制约，尚难以形成规模，所以对黄鳝遗传育种的研究一直是黄鳝主要方向。
随着遗传育种研究的不断深入，从DNA水平分析黄鳝遗传多样性及优良性状相关的分子标记寻找已成为热点。基因组DNA的提取是进行研究的基本前提，取肌肉、肝脏等组织的方式难以使鱼类存活下来。因此一些鱼类可以通过采用鳍条或鳞片的方式来提取其DNA，从而可以保证鱼类继续存活。而体重大于100g的鱼，从尾静脉采血0.5mL也不会对鱼的生存造成威胁。但是由于黄鳝即无鳞片，也无鳍条，抽取少量的血液后的黄鳝很快就会死亡。因此要想进行黄鳝家系构建，优良性状分子标记寻找等，不仅要知道对亲本基因型，而且还要求亲本能够存活下来，以便与子代的出现的某些性状进行比较。因此，寻找一种可以在黄鳝亲本活着的情况下提取其DNA的方法对于黄鳝杂交育种工作就显得尤为重要了。
为了保证能够在黄鳝存活的情况下提取其DNA，本发明研究尝试从黄鳝体表粘液中提取DNA，同时观察采集粘液的后的黄鳝经过一个月的饲养的死亡率。这就为研究黄鳝遗传育种提供了重要方法。
发明内容
为了解决现有技术所存在的上述不足，本发明提供一种从黄鳝体表粘液提取基因组DNA的方法，本发明方法简单、高效、便捷，且不会对黄鳝造成损伤，不影响其存活能力和生产性能。
本发明的技术方案如下：
一种从黄鳝体表粘液提取基因组DNA的方法，包括以下步骤：
1)黄鳝体表粘液的采集：无创伤地从黄鳝体表采集体表粘液；
2)黄鳝体表粘液基因组DNA的提取。
优选地，步骤1)包括用干净的卫生纸无创伤地擦拭黄鳝体表粘液，获得黄鳝体表粘液基因组DNA样品；
优选地，步骤1)还包括将含有黄鳝粘液的卫生纸剪碎放入灭菌离心管中加入无水乙醇(例如500微升)，保存于零下20度冰箱中；可以长久保存黄鳝体表粘液基因组DNA样品，便于随用随取；
优选地，步骤2)包括将黄鳝体表粘液基因组DNA样品加入STE，用蛋白酶K消化，然后用苯酚和氯仿除去蛋白，用乙醇沉淀后，12000r/min离心沉淀DNA，弃上清，吹干沉淀，用双蒸水溶解。
具体地，步骤2)包括将黄鳝体表粘液基因组DNA样品适量，置于灭菌离心管中，加入STE500ul，再加入10ul的PK于55℃恒温消化，至消化完为止；然后加入Tris饱和的酚(PhenolStaturated)500ul，震荡5-6min，12000r/min离心10min，取上清液，再重复一次(即加入Tris饱和的酚500ul，震荡5-6min，12000r/min离心10min)，
取上清液300ul，加入异丙醇300ul，震荡，12000r/min离心10min，弃去上清液；加入无水乙醇100ul，然后弃乙醇清洗，再重复一次(即加入无水乙醇100ul，然后弃乙醇清洗)；加入无菌水50ul溶解，溶解后加入200ul乙醇，混匀，12000r/min离心10min；弃上清液，阴干；然后加入双蒸水30ul，即得含黄鳝体表粘液基因组DNA的溶液。
上述从黄鳝体表粘液中提取基因组DNA的方法，还包括用黄鳝actin基因引物检测，验证是否为黄鳝基因组DNA。
本发明所述卫生纸也可用吸水性能相近的纸巾纸、餐巾纸、纸手帕等代替；关于卫生纸等的相关要求可参考国家标准《GB/T20808-2011纸巾纸》。
本发明同现有技术相比，具有如下优点：
1、本发明采用黄鳝体表粘液作为基因组DNA提取材料，对黄鳝机体不造成任何损伤；保护了取样个体的组织完整性，通过不长的恢复期个体即可从应激状态中恢复过来，并可以长期多次取样；
2、本发明方法将黄鳝体表粘液基因组DNA提取材料直接固定于无水乙醇中，方便保存；
3、本发明方法所提取的DNA能用于黄鳝基因指纹分析、亲子鉴定、家系结构组成等遗传学和分子生物学应用与基础研究中，也为利用分子手段连续监测特定个体的生长发育情况奠定了基础。
4、本发明方法简单、高效、便捷，且不会对黄鳝造成损伤，不影响其存活能力和生产性能。
附图说明
图1为实验例1中粘液DNA、肌肉DNA电泳结果图，其中M为分子量为2000的Marker；1、3、5为三组黄鳝的粘液DNA；2、4、6分别为对应三组黄鳝的肌肉DNA。
图2为实验例2中粘液DNA、肌肉DNAactin引物扩增后的检测结果图，M为分子量为2000的Marker；1、3、5为三组黄鳝的粘液DNA；2、4、6分别为对应三组黄鳝的肌肉DNA。
图3为实验例3中回收纯化后粘液DAN、肌肉DNA的检测结果图，其中M为分子量为2000的Marker；1为纯化后收集的黄鳝的粘液DNA；2、为纯化后收集的黄鳝的肌肉DNA。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
本发明采用以下方法对黄鳝基因组DNA(黄鳝体表粘液基因组DNA、肌肉基因组DNA)进行检测：用超微量紫外分光光度计测定黄鳝基因组DNA溶液A260/A280比值和浓度，进而来判断提取得到的DNA溶液的质量。然后用水平电泳检测提取得到的粘液DNA溶液，观察提取的粘液DNA溶液的完整性。
实施例1
一种从黄鳝体表粘液提取基因组DNA的方法，包括以下步骤：
1)黄鳝体表粘液的采集：
将黄鳝取出，放置干净容器内，用镊子撕取少量卫生纸轻轻擦取黄鳝体表的少量粘液，然后将吸取粘液的卫生纸剪碎转移到2ml的灭菌离心管中。每组作三个重复。
2)黄鳝体表粘液基因组DNA的提取
向含有黄鳝粘液的灭菌离心管中加入STE500ul，再加入10ul的PK于55℃恒温消化，至消化完为止。然后加入Tris饱和的酚(PhenolStaturated)500ul，震荡5-6min，12000r/min离心10min，取上清液，再重复一次(即加入Tris饱和的酚500ul，震荡5-6min，12000r/min离心10min)。取上清液300ul，加入异丙醇300ul，震荡，12000r/min离心10min，弃去上清液。加入无水乙醇100ul，然后弃乙醇清洗，再重复一次(即加入无水乙醇100ul，然后弃乙醇清洗)。加入无菌水50ul溶解，溶解后加入200ul乙醇，混匀，12000r/min离心10min。弃上清液，阴干。然后加入无菌双蒸水30ul，即得含黄鳝体表粘液基因组DNA的溶液。
对比例1
黄鳝肌肉组织基因组DNA的提取，与实施例1的区别在于：剪取小块黄鳝肌肉组织作为基因组DNA样品，将肌肉组织剪碎后进行提取，获得含黄鳝肌肉组织基因组DNA的溶液。
实验例1DNA的检测
实验样品：实施例1制得的三组含黄鳝体表粘液基因组DNA的溶液和对比例1制得的三组含黄鳝肌肉组织基因组DNA的溶液。
用超微量紫外分光光度计检测所述实验样品，A260/A280值和浓度分别为：
实施例1：1.87、234.9ng/ul，1.90、360.6ng/ul，1.84、250.6ng/ul；
对比例1：1.88、289.2ng/ul，1.89、325.5ng/ul，1.86、315ng/ul。
由于提取到的粘液DNA和肌肉DNA的A260/A280值都大于1.80且小于2.0，说明提取到的DNA还是比较纯净的。提取得到的粘液DNA的浓度与肌肉DNA的浓度也相差不大，说明从粘液中能够提取到较高质量的DNA的。此外，提取得到的DNA溶液的电泳结果(图1)显示，三组黄鳝粘液DNA与肌肉DNA的片段大小基本一致，都有微弱的亮带。这说明从黄鳝粘液中提取到的DNA与从肌肉中提取得到的DNA基本上是一致的，虽然提取到的量较少，但都为比较完整的黄鳝DNA片段。
实验例2actin引物的扩增
为了验证从粘液中提取到的DNA是否是黄鳝基因组DNA，我们使用黄鳝actin基因的引物对从粘液提取的DNA和从肌肉组织提取的DNA溶液进行扩增。扩增的反应体系总共25ul，分别加入10×PCRBuffer2.5ul，Mgcl2(2.5mmeach)2.0ul，dNTP(2.5mmeach)，模板DNA2.0ul，正向反向引物各0.5ul，Taq酶0.5ul，补充无菌水至25ul。扩增程序为：95℃预变性2min，95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延长5min；最后放入4℃冰箱保存。实验时取4ulLoadingBuffer和8ul预扩增产物混合，在1.5％的琼脂糖凝胶中检测预扩增的效果。
本次研究以提取得到的黄鳝粘液DNA和肌肉DNA为模板，选择actin引物进行扩增，结果显示：与扩增的肌肉DNA一样，三组黄鳝的粘液DNA也扩增出来了大小一样的亮带，大约为250bp左右的片段(图2)。这进一步说明了粘液中扩增出来的DNA为黄鳝的，并且可以用于黄鳝的基因组分析。
实验例3DNA的回收、纯化、测序、克隆
将实验例2得到的扩增产物切割下来，然后使用在申能博彩生物科技有限公司生产的3S柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒进行回收和纯化。具体步骤按照说明书进行，并稍微加以优化。回收纯化后得到的DNA片段送到铂尚生物技术(上海)有限公司进行测序和克隆。
为了保回收到了凝胶中的DNA，我们取离心管中纯化后的液体4ul进行了琼脂糖凝胶检测，结果如图3所示。回收纯化后粘液和肌肉DNA都检测到了比较亮的条带，并且片段大小在250bp左右，与actin引物的扩增出来的条带大小一致，说明纯化后的DNA即为经过actin引物的扩增后的DNA。在铂尚生物技术(上海)有限公司的测序克隆结果表明，从粘液中提取到的DNA与肌肉中的DNA一致，都为黄鳝的DNA。
实验例4成活率统计结果
从中国水产科学院无锡淡水渔业研究中心实验基地随机选取10尾黄鳝，采用与实施例1同样的方法采集黄鳝体表粘液，采集每尾黄鳝的粘液约40ul，然后把黄鳝放入网箱中模拟自然条件进行养殖，养殖一个月之后统计这些黄鳝的成活率。
采集粘液之后的黄鳝经过一个多月的饲养之后，10条黄鳝全部都存活了下来，没有出现死亡的情况。这说明了从擦取粘液对黄鳝的生存的影响很小，是一种可以保证在黄鳝活着的条件下提取其DNA的新方法。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种从黄鳝体表粘液提取基因组DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)黄鳝体表粘液的采集：无创伤地从黄鳝体表采集体表粘液；
2)黄鳝体表粘液基因组DNA的提取。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)包括用干净的卫生纸无创伤地擦拭黄鳝体表粘液，获得黄鳝体表粘液基因组DNA样品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)包括将含有黄鳝粘液的卫生纸剪碎放入灭菌离心管中加入无水乙醇，保存于零下20度冰箱中。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)包括将黄鳝体表粘液基因组DNA样品加入STE，用蛋白酶K消化，然后用苯酚和氯仿除去蛋白，用乙醇沉淀后，12000r/min离心沉淀DNA，弃上清，吹干沉淀，用双蒸水溶解。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)包括将黄鳝体表粘液基因组DNA样品适量，置于灭菌离心管中，加入STE500ul，再加入10ul的PK于55℃恒温消化，至消化完为止；然后加入Tris饱和的酚500ul，震荡5-6min，12000r/min离心10min，取上清液，再重复一次，取上清液300ul，加入异丙醇300ul，震荡，12000r/min离心10min，弃去上清液；加入无水乙醇100ul，然后弃乙醇清洗，再重复一次；加入无菌水50ul溶解，溶解后加入200ul乙醇，混匀，12000r/min离心10min；弃上清液，阴干；然后加入无菌水30ul，即得含黄鳝体表粘液基因组DNA的溶液。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，还包括用黄鳝actin基因引物检测，验证是否为黄鳝基因组DNA。
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