CN102094004A - 一种用于生态土壤系统基质dna的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于土壤微生物学领域，具体涉及一种用于生态土壤系统基质DNA的提取方法。该方法是在细胞裂解前先对样品进行预处理，再将经过预处理后的土样中加入磷酸钠缓冲液和MT缓冲液，分离DNA。本发明通过土壤预处理，去除腐殖质，提高DNA产量，所提取的基质微生物DNA可直接应用于分子操作，具有简便，重复性好，准确可靠的特点。

Description

一种用于生态土壤系统基质DNA的提取方法

技术领域

本发明属于土壤微生物学领域，具体涉及一种用于生态土壤系统基质DNA的提取方法。

技术背景

20世纪80年代以来，生态土壤系统受到广泛关注，在提高净化效率的同时，污染物的去除已由经验工程走向定性、定量分析。在生态土壤系统中，由于长期种植植物，形成了独特的基质微生物群落，它们积极参与系统基质物质转化过程，在污染物去除、植物养分有效化和基质层结构的改良等方面起着重要作用，因此对基质微生物相进行深入研究具有重要意义。研究者曾利用传统方法对土壤中的微生物进行了广泛研究，但近年来科学研究发现自然界中绝大部分微生物不能纯培养。因此，20世纪80年代中期以来，一些微生物学家开始通过免培养法，直接利用分子生物学的方法对环境中微生物的存在、群落结构、功能等情况进行研究。免培养法的前提是提取土壤微生物总DNA。提取高质量的DNA是免培养法的基础和关键。在提取土壤微生物总DNA时，不仅要最大限度地保证所提DNA 的代表性，而且要保证片段足够大、杂质少、适合后期的分子生物学操作。20世纪90年代，国内外在这方面作了大量的研究，但目前常规抽提方法，如SDS-酚氯仿抽提法提取的DNA产量低且杂质较多，特别是腐殖酸等杂质会严重影响后续的分子生物学实验操作，降低所得信息的精确度。目前，随着分子生物学技术的应用范围越来越广，针对不同土壤类型微生物DNA提取技术的研究迫在眉睫。本发明将为进一步研究生态土壤系统微生物分布与污染物去除率的相关关系提供技术支持。

发明内容

本发明公开了一种用于定性、定量评价生态土壤系统基质功能菌的微生物基因组DNA提取方法。

本发明用于生态土壤系统基质DNA的提取方法，其步骤是：

（1）在细胞裂解前对样品进行预处理：称取土样，加入TE缓冲液，涡旋振荡1分钟，放入超声波常温水浴10分钟，上清液中再加TE缓冲液，摇匀，在4℃，10,000×rpm下离心5分钟，移去上清液；

（2）经过预处理后的土样中加入磷酸钠缓冲液和MT缓冲液，置于FastPrep仪器上2分钟，速度5.5，冰上冷却后，在4℃，14,000×g下离心15分钟，上清液中加入PPS试剂，在4℃，14,000×g下离心5分钟，上清液中加入Binding Matrix 悬浮液，待蛋白质沉淀，移去上清液，混合物转移至SPIN^TM滤管中，在4℃，14,000×g下离心后，加入SEWS-M，在4℃，14,000×g下离心，移去SPIN^TM滤管，放入试剂盒提供的试管中，室温干燥5分钟，加入DES和重悬的DNA洗脱液体，在4℃，14,000×g下离心后转移洗脱的DNA到试管中进行浓度分析，分离的DNA，贮存于-20℃。

本发明的创新之处在于通过土壤预处理，去除腐殖质，提高DNA产量，所提取的基质微生物DNA可直接应用于分子操作，具有简便，重复性好，准确可靠的特点。

具体实施方式

供试土样为3种生态土壤系统基质，系统中种植植物分别为芦苇、菖蒲和茭白。

实施例一：SDS-酚氯仿抽提法

称取1g土壤样品，加入1ml 0.1mol/l 磷酸缓冲液（pH 8.0），加入直径为0.1、0.5和5mm玻璃珠各0.5g，振荡1分钟，溶菌酶5mg，终浓度为2.5mg/ml，室温振荡15分钟，放置冰箱30分钟，加125μl 20%的SDS溶液振荡处理15分钟，离心，分装EP管，加酚（1:1体积）抽提1次，氯仿-异戊醇（1:1体积）抽提2次，加0.6体积异丙醇，室温放置1小时，离心，70%乙醇清洗，200μl TE溶解。

实施例二：本发明

在细胞裂解前对样品进行预处理，称取5g土样，加入5ml TE缓冲液，涡旋振荡1分钟，放入超声波常温水浴10分钟，上清液中再加5ml TE缓冲液，摇匀，在4℃，10,000×rpm下离心5分钟，移去上清液。经过预处理后的土样中加入978μl磷酸钠缓冲液（pH 8.0分2次加），转移至Lysing Matrix E试管中（取自试剂盒），再加入122μl MT缓冲液，置于FastPrep仪器上2分钟，速度5.5，冰上冷却后，在4℃，14,000×g下离心15分钟，上清液中加入250μl PPS试剂，在4℃，14,000×g下离心5分钟，上清液中加入1ml Binding Matrix 悬浮液，翻转混合，静置待蛋白质沉淀，移去上清液，混合物转移至SPIN^TM滤管（取自试剂盒）中，在4℃，14,000×g下离心2分钟后，加入500μl SEWS-M，在4℃，14,000×g下离心1分钟，移去SPIN^TM滤管，放入试管中，室温干燥5分钟，加入75μl DES和重悬的DNA洗脱液，在4℃，14,000×g下离心1分钟后转移洗脱的DNA到试管中进行浓度分析，分离的DNA，贮存于-20℃。

基质DNA的提取结果对比见表1。由表1可知，本发明方法在DNA提取效率上表现出很大的优势，提取的DNA产量平均值达到了58.68μg/g土，而SDS-酚氯仿抽提法DNA得率相对较低。

在土壤DNA的提取过程中，细胞的裂解是极为关键的一步，常规提取方法中采用了较为常见的玻璃珠击打法以打散土壤颗粒，结合溶菌酶与SDS共同作用裂解细胞的方法。实验结果表明，这种裂解细胞的方法多次抽提会导致DNA得率下降，且会造成DNA的剪切，而这些小DNA片段会影响PCR扩增的敏感性，同时也增加了嵌套作用的可能性。

本方法在细胞裂解前对基质进行预处理，TE缓冲液结合超声波处理打散基质颗粒，为后续细胞裂解提供便利。同时，对试剂盒DNA提取方法进行了改进。本发明通过土壤预处理，去除腐殖质影响，提高DNA产量，所提取的基质微生物DNA可直接应用于分子操作。本方法为土壤–植物生态系统的深入研究提供技术支持。

Claims (1)

1.一种用于生态土壤系统基质DNA的提取方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）在细胞裂解前对样品进行预处理：称取土样，加入TE缓冲液，涡旋振荡1分钟，放入超声波常温水浴10分钟，上清液中再加TE缓冲液，摇匀，在4℃，10,000×rpm下离心5分钟，移去上清液；

（2）经过预处理后的土样中加入磷酸钠缓冲液和MT缓冲液，置于FastPrep仪器上2分钟，速度5.5，冰上冷却后，在4℃，14,000×g下离心15分钟，上清液中加入PPS试剂，在4℃，14,000×g下离心5分钟，上清液中加入Binding Matrix 悬浮液，待蛋白质沉淀，移去上清液，混合物转移至SPIN^TM滤管中，在4℃，14,000×g下离心后，加入SEWS-M，在4℃，14,000×g下离心，移去SPIN^TM滤管，放入试剂盒提供的试管中，室温干燥5分钟，加入DES和重悬的DNA洗脱液体，在4℃，14,000×g下离心后转移洗脱的DNA到试管中进行浓度分析，分离的DNA，贮存于-20℃。