CN113717970A - 一种粪便基因组提取试剂盒及使用方法 - Google Patents
一种粪便基因组提取试剂盒及使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113717970A CN113717970A CN202111202007.8A CN202111202007A CN113717970A CN 113717970 A CN113717970 A CN 113717970A CN 202111202007 A CN202111202007 A CN 202111202007A CN 113717970 A CN113717970 A CN 113717970A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- concentration
- solution
- fecal
- extraction kit
- mmol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 14
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims abstract description 24
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 24
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 claims abstract description 19
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 claims abstract description 19
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims abstract description 11
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims abstract description 11
- 229940045136 urea Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 59
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 24
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 20
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 17
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 10
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 9
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 claims description 7
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 claims description 7
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 229960004249 sodium acetate Drugs 0.000 claims description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 2
- 238000007605 air drying Methods 0.000 claims 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 abstract description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 8
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 7
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 7
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 5
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- FYFFGSSZFBZTAH-UHFFFAOYSA-N methylaminomethanetriol Chemical compound CNC(O)(O)O FYFFGSSZFBZTAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 239000012487 rinsing solution Substances 0.000 description 2
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010357 RNA editing Methods 0.000 description 1
- 230000026279 RNA modification Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000008995 epigenetic change Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请提供的粪便基因组提取试剂盒，包括裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液和洗脱液，其中，所述裂解液包括盐酸胍、尿素、乙酸铵及曲拉通X‑100，上述粪便基因组提取试剂盒在使用过程中无需对粪便样本进行预处理，减少提取时间，提取过程中未使用有毒试剂，操作安全，可高效提取基因组DNA，提取产物可用于下游进一步实验。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种粪便基因组提取试剂盒及其使用方法。
背景技术
结直肠癌属于全球最常见的恶性肿瘤疾病，在我国其发病率和死亡率均位列第5位且呈持续增高趋势。由于早期症状不明显，临床上多数患者就诊时已处于中、晚期，未能及时接受积极治疗而降低生存率。因此对结直肠癌进行早期的初筛普查尤为重要。
结直肠癌的发生过程是良性肿瘤不断向恶性肿瘤进展演变，是遗传学变化和表观遗传学改变不断积累的结果。表观遗传学包括DNA甲基化、基因组印记、RNA编辑等。其中DNA甲基化是表观遗传学最重要的修饰方式，且已被证实在结直肠癌的发生、进展及侵袭转移中发挥一定的作用。检测基因异常甲基化，对结直肠癌的筛查诊断、判断复发转移和选择治疗方案等方面都具有重要意义。
DNA甲基化检测的前提是获取人基因组信息。目前可通过血液和粪便两种途径获得人的基因，但癌细胞直接脱落进入粪便比直接进入血液早，所以从粪便样本中提取脱落细胞的DNA能更早地进行甲基化检测，从而更早的进行结直肠癌的筛查。
但目前的粪便基因组提取试剂盒存在提取效率不高、产量低、操作不安全卫生等缺陷。
发明内容
鉴于此，有必要针对现有技术存在的缺陷提供一种快速、可靠、安全的粪便基因组提取试剂盒及其使用方法。
为解决上述问题，本发明采用下述技术方案：
本申请提供了一种粪便基因组提取试剂盒，包括：裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液和洗脱液；其中，所述裂解液包括盐酸胍、尿素、乙酸铵及曲拉通X-100，所述裂解液中盐酸胍的浓度为4～5mol/L，尿素的浓度为50～100mmol/L，乙酸铵的浓度为30～50mmol/L、曲拉通X-100的浓度为1％～10％(v/v)。
在其中一些实施例中，所述第一洗涤液包括以下原料：盐酸胍、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、盐酸和异丙醇。
在其中一些实施例中，所述第一洗涤液中盐酸胍的浓度为3～6mol/L、三羟甲基氨基甲烷的浓度为15～25mmol/L、乙二胺四乙酸的浓度为2～3mmol/L、盐酸的体积浓度为0.1％～0.2％、异丙醇的体积浓度为20％～30％。
在其中一些实施例中，所述第二洗涤液包括以下原料：乙酸钠、乙酸铵和冰乙酸。
在其中一些实施例中，所述第二洗涤液中乙酸钠浓度为150～200mmol/L，所述乙酸铵的浓度为200～300mmol/L、冰乙酸的体积浓度为1％～2％，所述乙醇的体积浓度为5-10％。
在其中一些实施例中，所述洗脱液包括三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸。
在其中一些实施例中，所述洗脱液中三羟甲基氨基甲烷的浓度5～15mmol/L、乙二胺四乙酸的浓度为1～2mmol/L。
另外，本申请还提供了一种所述的粪便基因组提取试剂盒的使用方法，包括下述步骤：
在粪便样本中加入所述裂解液、乙醇和蛋白酶K溶液，并置于离心管中混合均匀后得到第一混合液；
将所述第一混合液置于金属浴中孵育后进行离心处理，收集上清液；
在所述上清液中加入异丙醇混合均匀后静置，得到第二混合液；
将所述第二混合液转移至DNA制备管中离心，弃滤液；
将所述DNA制备管置回到所述离心管中然后加入所述第一洗涤液后离心并弃滤液；
将所述DNA制备管置回到所述离心管中然后加入所述第二洗涤液后离心并弃滤液；
将所述DNA制备管晾干后加入所述洗脱液以洗脱核酸，离心收集上清液并保存。
在其中一些实施例中，在将所述DNA制备管晾干后加入所述洗脱液以洗脱核酸，离心收集上清液并保存的步骤中，所述上清液于-18～-22℃下保存。
本申请采用上述技术方案具备下述效果：
本申请提供的粪便基因组提取试剂盒，包括裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液和洗脱液，其中，所述裂解液包括盐酸胍、尿素、乙酸铵及曲拉通X-100，上述粪便基因组提取试剂盒在使用过程中无需对粪便样本进行预处理，减少提取时间，提取过程中未使用有毒试剂，操作安全，可高效提取基因组DNA，提取产物可用于下游进一步实验。
此外，本申请提供的粪便基因组提取试剂盒，由于裂解液中含有盐酸胍和尿素，可使天然蛋白转变为复合物导致蛋白质完全变性，且对氨基酸具有增溶作用，浓度高时可破坏水的氢键结构，成为非极性残基的较好溶剂，因此可达到较好裂解效果；第二洗涤液中包括的乙酸铵、乙酸钠均有利于溶解残留蛋白；洗脱液中加入乙二胺四乙酸可去除干扰离子影响，从而更稳定溶解核酸。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的粪便基因组提取试剂盒的使用方法的步骤流程图。
图2为本申请实施例1及实施例2所提样本中β-actin基因扩增曲线图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
本申请提供的粪便基因组提取试剂盒，包括：裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液和洗脱液；其中，所述裂解液包括盐酸胍、尿素、乙酸铵及曲拉通X-100，所述裂解液中盐酸胍的浓度为4～5mol/L，尿素的浓度为50～100mmol/L，乙酸铵的浓度为30～50mmol/L、曲拉通X-100的浓度为1％～10％(v/v)。
可以理解，由于裂解液中含有盐酸胍和尿素，可使天然蛋白转变为复合物导致蛋白质完全变性，且对氨基酸具有增溶作用，浓度高时可破坏水的氢键结构，成为非极性残基的较好溶剂，因此可达到较好裂解效果。
在其中一些实施例中，所述裂解液中盐酸胍的浓度为4～5mol/L，尿素的浓度为50～100mmol/L，乙酸铵的浓度为30～50mmol/L、曲拉通X-100的浓度为1％～10％(v/v)。
在其中一些实施例中，所述第一洗涤液包括以下原料：盐酸胍、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、盐酸和异丙醇。
进一步地，所述第一洗涤液中盐酸胍的浓度为3～6mol/L、三羟甲基氨基甲烷的浓度为15～25mmol/L、乙二胺四乙酸的浓度为2～3mmol/L、盐酸的体积浓度为0.1％～0.2％、异丙醇的体积浓度为20％～30％。
在其中一些实施例中，所述第二洗涤液包括以下原料：乙酸钠、乙酸铵和冰乙酸。
进一步地，所述第二洗涤液中乙酸钠浓度为150～200mmol/L，所述乙酸铵的浓度为200～300mmol/L、冰乙酸的体积浓度为1％～2％，所述乙醇的体积浓度为5-10％。
可以理解，由于第二洗涤液中包括的乙酸铵、乙酸钠均有利于溶解残留蛋白。
在其中一些实施例中，所述洗脱液包括三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸。
进一步地，所述洗脱液中三羟甲基氨基甲烷的浓度5～15mmol/L、乙二胺四乙酸的浓度为1～2mmol/L。
可以理解，由于洗脱液中加入了乙二胺四乙酸可去除干扰离子影响，从而更稳定溶解核酸。
请参阅图1，本申请还提供了一种所述的粪便基因组提取试剂盒的使用方法，包括下述步骤：
步骤S110：在粪便样本中加入所述裂解液、乙醇和蛋白酶K溶液，并置于离心管中混合均匀后得到第一混合液。
具体地，提供新鲜的粪便样本，每200mg或200μL保存好的粪便样本中加入600μL的裂解液、20μL的蛋白酶K溶液并混合均匀。
可以理解，上述粪便样本即可以是固体粪便也可以是保存好的液体样本，如取样后未能立即提取也可先保存样品后进行提取。
步骤S120：将所述第一混合液置于金属浴中孵育后进行离心处理，收集上清液。
具体地，将所述第一混合液置于85℃金属浴中裂解15min，裂解后的溶液12000×g离心1min收集上清液于干净的1.5ml离心管中。
步骤S130：在所述上清液中加入异丙醇混合均匀后静置。
具体地，向收集到的上清液中加入0.5倍体积的异丙醇并混合均匀，静置10分钟，得到第二混合液。
步骤S140：将所述第二混合液转移至DNA制备管中离心，弃滤液。
具体地，将第二混合液转移至DNA制备管中6000×g离心1min并弃滤液。
步骤S150：将所述DNA制备管置回到所述离心管中然后加入所述第一洗涤液后离心并弃滤液。
具体地，将所述DNA制备管置回到所述离心管中，加入500μL第一洗涤液，12000×g离心1min。
步骤S160：将所述DNA制备管置回到所述离心管中然后加入所述第二洗涤液后离心并弃滤液。
具体地，将所述DNA制备管置回到所述离心管中后加入700μL第二洗涤液12000×g离心1min，弃滤液后重复一次。
步骤S170：将所述DNA制备管晾干后加入所述洗脱液以洗脱核酸，离心收集上清液并保存。
具体地，将晾干后的DNA制备管置于另一干净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加入100μL洗脱液,室温静置2min，12000×g离心2min洗脱DNA，收集上清液并保存。
在其中一些实施例中，在将所述DNA制备管晾干后加入所述洗脱液以洗脱核酸，离心收集上清液并保存的步骤中，所述上清液于-18～-22℃下保存。
上述粪便基因组提取试剂盒在使用过程中无需对粪便样本进行预处理，减少提取时间，提取过程中未使用有毒试剂，操作安全，可高效提取基因组DNA，提取产物可用于下游进一步实验。
以下结合具体实施例对本申请的技术方案进行详细描述。
实施例1
本申请实施例1提供了一种提取粪便中基因组DNA的试剂盒，包括裂解液、漂洗液1、漂洗液2和洗脱液。
其中，裂解液包括以下原料：盐酸胍、尿素、乙酸钠、曲拉通X-100；裂解液中盐酸胍的浓度为4.5mol/L，尿素的浓度为75mmol/L，乙酸铵的浓度为45mmol/L，曲拉通X-100的浓度为6.25％(v/v)。
第一洗涤液中盐酸胍的浓度4mol/L、三羟甲基氨基甲烷的浓度为20mmol/L、乙二胺四乙酸的浓度为2.5mmol/L、盐酸的体积浓度为0.15％、异丙醇的体积浓度为25％；
第二洗涤液中乙酸钠浓度为180mmol/L、乙酸铵的浓度为250mmol/L，冰乙酸的体积浓度为1.5％；
洗脱液中三羟甲基氨基甲烷的浓度10mmol/L、乙二胺四乙酸的浓度为1.5mmol/L；洗脱液的pH为8。
使用实施例中的试剂盒提取人体粪便样本3份，按如下步骤操作：
(1)分别收集3份大约200μL保存好的粪便样本，向粪便样本中加入600μL裂解液重悬混匀，加入20μL蛋白酶K溶液混匀；
(2)将混合液置于85℃金属浴中裂解15min；
(3)将裂解后的溶液12000×g离心1min收集上清液于一干净的1.5ml离心管中；
(4)向收集到的上清液中加入0.5倍体积的异丙醇并混合均匀，静置10分钟；
(5)将上述混合液转移至DNA制备管中6000×g离心1min并1弃滤液；
(6)将制备管置回到原来的离心管中，加入500μL第一洗涤液，12000×g离心1min；
(7)将制备管置回到原来的离心管中后加入700μL第二洗涤液12000×g离心1min，弃滤液后重复一次；
(8)将晾干后的DNA制备管置于另一干净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加入100μL洗脱液,室温静置2min，12000×g离心2min洗脱DNA，收集洗脱液并保存。
提取完成后对DNA进行定量和纯度检测。各取2μL样本，以上述所用洗脱液为空白，使用Quawell超微量分光光度计Q3000测定样本A260、A280的值并利用比值评估核酸的纯度。
实施例2
分别取3份保存好的粪便样本各200μL，使用普通市售粪便基因组提取试剂盒对其进行提取，提取完成后对DNA进行定量和纯度检测。各取2μL样本，以上述所用洗脱液为空白，使用Quawell超微量分光光度计Q3000测定样本A260、A280的值并利用比值评估核酸的纯度。
对于上述实施例1和实施例2中提取的粪便基因组DNA用实时荧光定量PCR检测β-actin基因，Ct值结果如下表。
表1-本发明试剂盒提取不同粪便样本中DNA的浓度及PCR检测Ct值
从表1中可知，实施例1中提取到的DNA浓度和纯度都较高，表中C(ng/μL)表示所提取的DNA浓度，260nm和280nm分别代表了核酸和蛋白质有机物的吸光度值，260/280的比值表示了蛋白质等有机物的污染程度，高质量的样品260/280的比值应在1.8-2.0之间。样本1-3均为使用上述方法所提取，可以看出3份样本的260/280比值均在1.8至2.0的范围内，说明样本中无蛋白质等物质污染，使用200μL粪便保存样本提取的DNA浓度均高于120ng/μL。而实施例2中提取的DNA浓度及纯度都低于实施例1中的结果。从荧光定量PCR的结果来看(附图2)实施例1提取样本β-actin基因扩增的Ct值比实施例2中提取样本的Ct值要低3-4，Ct值越大说明靶DNA的含量越低，说明本试剂盒能有效地提取到粪便中的基因组DNA，提取的量可供下一步实验使用。
实施例3-6
实施例3-6与实施例1的不同之处在于裂解液中盐酸胍浓度不同，具体如表2所示
表2 实施例3-6裂解液中盐酸胍浓度
分别取2份保存好的粪便样本各200μL，使用本发明中试剂盒对其进行提取，除裂解液中盐酸胍浓度不同外其余均同实施例1，提取完成后对DNA进行定量和纯度检测。各取2μL样本，以上述所用洗脱液为空白，使用Quawell超微量分光光度计Q3000测定样本A260、A280的值并利用比值评估核酸的纯度。结果如表3所示。
表3 实施例3-6提取样本结果
从表3中可知实施例3-6中提取的粪便样本结果，提取样本核酸浓度均在100ng/μL以上，A260/280均在1.80以上，样本中无蛋白质等物质污染。其中实施例4、5中提取的核酸浓度和实施例3、5相比均要高，实施例3-6中提取样本纯度之间并无明显差异。以上结果说明本试剂盒裂解液中盐酸胍浓度在4-5mol/L裂解效果较好，提取的核酸可供下一步实验使用。
以上仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
Claims (9)
1.一种粪便基因组提取试剂盒，其特征在于，包括：裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液和洗脱液；其中，所述裂解液包括盐酸胍、尿素、乙酸铵及曲拉通X-100，所述裂解液中盐酸胍的浓度为4～5mol/L，尿素的浓度为50～100mmol/L，乙酸铵的浓度为30～50mmol/L、曲拉通X-100的浓度为1％～10％(v/v)。
2.根据权利要求1所述的粪便基因组提取试剂盒，其特征在于，所述第一洗涤液包括以下原料：盐酸胍、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、盐酸和异丙醇。
3.根据权利要求2所述的粪便基因组提取试剂盒，其特征在于，所述第一洗涤液中盐酸胍的浓度为3～6mol/L、三羟甲基氨基甲烷的浓度为15～25mmol/L、乙二胺四乙酸的浓度为2～3mmol/L、盐酸的体积浓度为0.1％～0.2％、异丙醇的体积浓度为20％～30％。
4.根据权利要求1所述的粪便基因组提取试剂盒，其特征在于，所述第二洗涤液包括以下原料：乙酸钠、乙酸铵和冰乙酸。
5.根据权利要求4所述的粪便基因组提取试剂盒，其特征在于，所述第二洗涤液中乙酸钠浓度为150～200mmol/L，所述乙酸铵的浓度为200～300mmol/L、冰乙酸的体积浓度为1％～2％，所述乙醇的体积浓度为5-10％。
6.根据权利要求1所述的粪便基因组提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液包括三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸。
7.根据权利要求1所述的粪便基因组提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液中三羟甲基氨基甲烷的浓度5～15mmol/L、乙二胺四乙酸的浓度为1～2mmol/L。
8.一种根据权利要求1所述的粪便基因组提取试剂盒的使用方法，其特征在于，包括下述步骤：
在粪便样本中加入所述裂解液、乙醇和蛋白酶K溶液，并置于离心管中混合均匀后得到第一混合液；
将所述第一混合液置于金属浴中孵育后进行离心处理，收集上清液；
在所述上清液中加入异丙醇混合均匀后静置，得到第二混合液；
将所述第二混合液转移至DNA制备管中离心，弃滤液；
将所述DNA制备管置回到所述离心管中然后加入所述第一洗涤液后离心并弃滤液；
将所述DNA制备管置回到所述离心管中然后加入所述第二洗涤液后离心并弃滤液；
将所述DNA制备管晾干后加入所述洗脱液以洗脱核酸，离心收集上清液并保存。
9.根据权利要求8所述的粪便基因组提取试剂盒的应用方法，其特征在于，在将所述DNA制备管晾干后加入所述洗脱液以洗脱核酸，离心收集上清液并保存的步骤中，所述上清液于-18～-22℃下保存。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111202007.8A CN113717970A (zh) | 2021-10-15 | 2021-10-15 | 一种粪便基因组提取试剂盒及使用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111202007.8A CN113717970A (zh) | 2021-10-15 | 2021-10-15 | 一种粪便基因组提取试剂盒及使用方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113717970A true CN113717970A (zh) | 2021-11-30 |
Family
ID=78685982
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111202007.8A Pending CN113717970A (zh) | 2021-10-15 | 2021-10-15 | 一种粪便基因组提取试剂盒及使用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113717970A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113789323A (zh) * | 2021-10-15 | 2021-12-14 | 苏州中科先进技术研究院有限公司 | 一种尿液基因组提取试剂盒及使用方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101935647A (zh) * | 2010-09-13 | 2011-01-05 | 原平皓(天津)生物技术有限公司 | 一种提取微生物dna的试剂盒及其方法 |
| US20150353918A1 (en) * | 2014-05-18 | 2015-12-10 | Glc Biotechnology, Inc. | Method and materials for nucleic acids extraction and purification |
| CN112313344A (zh) * | 2018-04-24 | 2021-02-02 | 凯杰科技有限公司 | 从复杂样品中分离核酸并去除抑制剂 |
| CN112553193A (zh) * | 2020-12-23 | 2021-03-26 | 苏州中科先进技术研究院有限公司 | 一种磁珠法提取全血dna的试剂盒及其使用方法 |
-
2021
- 2021-10-15 CN CN202111202007.8A patent/CN113717970A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101935647A (zh) * | 2010-09-13 | 2011-01-05 | 原平皓(天津)生物技术有限公司 | 一种提取微生物dna的试剂盒及其方法 |
| US20150353918A1 (en) * | 2014-05-18 | 2015-12-10 | Glc Biotechnology, Inc. | Method and materials for nucleic acids extraction and purification |
| CN112313344A (zh) * | 2018-04-24 | 2021-02-02 | 凯杰科技有限公司 | 从复杂样品中分离核酸并去除抑制剂 |
| CN112553193A (zh) * | 2020-12-23 | 2021-03-26 | 苏州中科先进技术研究院有限公司 | 一种磁珠法提取全血dna的试剂盒及其使用方法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113789323A (zh) * | 2021-10-15 | 2021-12-14 | 苏州中科先进技术研究院有限公司 | 一种尿液基因组提取试剂盒及使用方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106893777B (zh) | 用于检测结直肠癌相关基因多位点甲基化试剂盒及应用 | |
| US5346994A (en) | Shelf-stable product and process for isolating RNA, DNA and proteins | |
| JP4304348B2 (ja) | Ｄｎａの単離方法 | |
| CN113151397B (zh) | 一种基于磁珠法提取病毒样本的核酸提取试剂盒 | |
| CN110904097A (zh) | 一种用于血液游离dna提取的试剂盒 | |
| CN109762874B (zh) | 核酸助沉剂、孕妇血浆游离dna提取试剂盒及方法 | |
| CN112553193A (zh) | 一种磁珠法提取全血dna的试剂盒及其使用方法 | |
| CN109022420A (zh) | 一种基于磁珠的dna提取方法、裂解液及试剂盒 | |
| CN113717970A (zh) | 一种粪便基因组提取试剂盒及使用方法 | |
| Li et al. | Inability to detect cell free fetal DNA in the urine of normal pregnant women nor in those affected by preeclampsia associated HELLP syndrome | |
| CN111304291A (zh) | 一种dna提取试剂、试剂盒及提取方法 | |
| CN106754884B (zh) | 试剂盒及其应用 | |
| CN113789323A (zh) | 一种尿液基因组提取试剂盒及使用方法 | |
| CN111944802A (zh) | 真菌核酸提取裂解液及提取核酸的试剂盒及方法 | |
| CN113215663B (zh) | 一种基于高通量测序的胃癌靶向治疗基因组文库的构建方法及引物 | |
| CN108977525A (zh) | 一种人类痛风相关基因突变位点的检测方法及试剂盒 | |
| CN108251414A (zh) | 骨髓细胞基因组dna的提取方法及提取试剂盒 | |
| CN112831495B (zh) | 一种富含几丁质的动物基因组dna的提取方法 | |
| CN109439655B (zh) | 适用于超微量细胞核酸提取的试剂盒及方法 | |
| CN113136415A (zh) | 一种核酸提取方法及其用途 | |
| CN113308460A (zh) | 一种提取石蜡切片中细菌dna的试剂盒 | |
| CN112614548B (zh) | 一种计算样本建库投入量的方法及其建库方法 | |
| CN113621606B (zh) | 一种提取血浆游离dna的试剂盒和方法 | |
| Mauger et al. | Maximizing Yield from Plasma Circulating DNA Extraction | |
| JP3922420B2 (ja) | 改良されたリボ核酸の単離方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20211130 |