CN112313344A - 从复杂样品中分离核酸并去除抑制剂 - Google Patents

从复杂样品中分离核酸并去除抑制剂 Download PDF

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Abstract

本公开提供一种从样品中分离核酸的方法，包括：(a)使样品、样品的裂解物或裂解物的上清液、或者样品、裂解物或上清液的一部分与一种或多种第一试剂(例如蛋白质沉淀剂)以及一种或多种第二试剂(例如抑制剂去除剂)接触，以产生混合物；(b)将步骤(a)的混合物分离为固相和液相，其中一种或多种第二试剂主要位于固相中；以及(c)从步骤(b)的液相中分离核酸。也公开了可用于该方法中的组合物和试剂盒。还公开了用包含一种或多种相对温和的离液剂和一种或多种磷酸盐的裂解试剂从样品(尤其是复杂样品，例如土壤或粪便样品)制备裂解物的方法、组合物和试剂盒。

Description

从复杂样品中分离核酸并去除抑制剂
技术背景
技术领域
本公开涉及样品裂解以及从样品中分离核酸并去除抑制剂，所述样品包括复杂样品、如土壤或粪便样品。
背景技术
在分子生物学及相关领域，包括疾病诊断、法医学、食品科学和环境科学中，以高产量和高纯度分离核酸是至关重要的。分离某些种类的样品(例如环境样品，如土壤样品和粪便样品)中的核酸时，现有技术存在产量低和/或纯度低的困扰。污染物质和抑制剂的存在会干扰分离核酸的下游分析。特别是由于上述样品材料含有大量的在某些情况下非常多样化的干扰成分并且非常复杂，因此从中分离和纯化生物分子时可能发生许多相互作用。现有技术的缺点部分地是由于缺乏用于裂解这种复杂样品的有效方法。此外，去除抑制性成分是非常具有挑战性的，特别是如果意欲从同一样品中分离和/或纯化几种不同的生物分子。
发明内容
本公开提供从样品中分离核酸并同时消耗污染分子的方法、组合物和试剂盒。另外还提供从样品制备裂解物的方法、组合物和试剂盒。
在一个方面，本公开提供一种从样品中分离核酸的方法，包括：
(a)使样品、样品的裂解物或裂解物的上清液、或者样品、裂解物或上清液的一部分与选自乙酸铵、硫酸铵、乙酸钾、乙酸钠、氯化钠、乙酸铯及其组合的一种或多种第一试剂以及选自氯化铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化铪(IV)、氯化锆(IV)及其组合的一种或多种第二试剂接触，得到混合物；
(b)将步骤(a)的混合物分离为固相和液相，其中一种或多种第二试剂主要位于固相中；以及
(c)从步骤(b)的液相中分离核酸。
在另一方面，本申请提供一种从样品中分离核酸的组合物，其包含以下组分、基本上由以下组分构成、或者由以下组分构成：
(i)一种或多种第一试剂，选自乙酸铵、硫酸铵、乙酸钾、乙酸钠、氯化钠、乙酸铯及其组合，
(ii)一种或多种第二试剂，选自氯化铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化铪(IV)、氯化锆(IV)及其组合，以及
(iii)任选的水。
在另一方面，本公开提供一种从样品中分离核酸的试剂盒，包括：
(a)本文提供的组合物，
或
(b)(i)一种或多种第一试剂，选自乙酸铵、硫酸铵、乙酸钾、乙酸钠、氯化钠、乙酸铯及其组合，以及
(ii)一种或多种第二试剂，选自氯化铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化铪(IV)、氯化锆(IV)及其组合。
在另一方面，本公开提供一种从样品制备裂解物的方法，包括：
(a)使样品与包含一种或多种磷酸盐和离液剂的裂解试剂接触，以产生裂解物，所述离液剂选自硫氰酸钠、碳酸钠、硫氰酸钾、硫氰酸铵、硫氰酸锂、高氯酸锂、硫酸胍及其组合。
在另一方面，本公开提供一种裂解试剂，包含：
(a)离液剂，选自硫氰酸钠、碳酸钠、硫氰酸铵、硫氰酸钾、硫氰酸锂、高氯酸锂、硫酸胍及其组合，以及
(b)一种或多种磷酸盐。
在另一方面，本公开提供一种用于从样品制备裂解物的试剂盒，包括：
(i)(a)本文提供的裂解试剂，
或
(b)(1)离液剂，选自硫氰酸钠、碳酸钠、硫氰酸铵、硫氰酸钾、硫氰酸锂、高氯酸锂、硫酸胍及其组合，以及
(2)一种或多种磷酸盐。
附图说明
图1所示为如实施例1所述分离的DNA的凝胶电泳。
图2所示为如实施例2所述分离的DNA(上图)、RNA(中图)和蛋白质(下图)的凝胶电泳。
图3所示为如实施例3所述分离的DNA的凝胶电泳。
图4所示为如实施例4所述分离的DNA的凝胶电泳。
图5所示为如实施例5所述分离的DNA的凝胶电泳。
图6A所示为用ZymoBIOMICS DNA小型制备试剂盒(ZymoBIOMICS DNA MiniprepKit)分离的DNA的凝胶电泳。
图6B所示为用PureLink微生物组DNA纯化试剂盒(PureLink Microbiome DNAPurification Kit)分离的DNA的凝胶电泳。
图6C所示为用PowerFecal DNA分离试剂盒(PowerFecal DNA Isolation Kit)分离的DNA的凝胶电泳。
图6D所示为用本公开的示例性方法(“新技术”)分离的DNA的凝胶电泳。
图6E是显示用Nanodrop测得的、用不同试剂盒从粪便样品中分离的DNA的浓度的图。
图6F是显示用Qubit测得的、用不同试剂盒从粪便样品中分离的DNA的浓度的图。
图7所示为如实施例7所述分离的DNA的凝胶电泳。
图8所示为如实施例8所述分离的DNA(左上)和RNA(左下)的凝胶电泳、以及DNA(右上)和RNA(右下)的产量和纯度。
图9所示为如实施例9所述分离的DNA的凝胶电泳。
图10所示为如实施例10所述分离的DNA的凝胶电泳。
图11所示为如实施例11所述分离的DNA的凝胶电泳。
图12所示为如实施例12所述分离的DNA的凝胶电泳。
具体实施方式
本公开提供用于有效地裂解样品以溶解来自样品、尤其是来自复杂样品(例如环境样品，如土壤样品和粪便样品)的DNA和RNA的方法、组合物和试剂盒。本文提供的方法使用包含一种或多种磷酸盐和一种或多种相对温和的离液剂的裂解试剂，以有效地溶解核酸，而在样品裂解过程中不会显著降解该核酸。
另外，本公开还提供从分离自样品、尤其是分离自复杂样品(例如环境样品，如土壤样品和粪便样品)的核酸中有效地去除污染物质(例如抑制剂)的方法、组合物和试剂盒。本文提供的方法使用蛋白质沉淀剂和三价或四价盐的新型组合来沉淀蛋白质和污染物质并将其从核酸制备物中去除。
此外，本文公开的样品裂解和抑制剂去除方法可以彼此组合以增加核酸产量和纯度，而不牺牲分离的核酸的完整性。
该方法可大大减少样品输入量，例如2克至250毫克，而不牺牲每克土壤中的RNA的量。该方法可以在核酸分离过程中使用离心柱形式的固体支持物，这可以实现自动化并促进大规模和高通量。
在以下描述中，本文提供的任何范围包括该范围内的所有值。
还应注意的是，术语“或”通常以包括“和/或”的含义使用(即，意指替代物中的一个、两个或它们的任意组合)，除非上下文中另有说明。
并且，在本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式“一个”，“一种”和“该”包括多个指示物，除非上下文中另有说明。
术语“包括”、“具有”、“包含”和它们的变体被同义地使用并且被解释为非限制性的。
本文所用术语“其组合之一”是指该术语之前的所列项目的所有可能的组合之一。例如，“A、B、C或其组合之一”旨在指代以下任何一种：A、B、C、AB、AC、BC或ABC。类似地，本文所用术语“其组合”是指该术语之前的所列项目的所有可能的组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在指代以下所有：A、B、C、AB、AC、BC和ABC。
I.样品裂解
在一个方面，本公开提供一种从样品制备裂解物的方法，包括：使样品与包含一种或多种磷酸盐和一种或多种相对温和的离液剂的裂解试剂接触。所得裂解物可以用于分离或检测感兴趣的生物分子(例如核酸、蛋白质)。
A.样品
样品可以是含有感兴趣的生物分子的任何样品，包括生物样品、环境样品和食品样品，尤其是那些含有抑制剂的样品，该抑制剂如果存在于分离核酸的制备中，则会干扰分离核酸的下游分析。
本文所用术语“生物样品”是指从生物对象获得或由生物对象产生的样品，包括但不限于器官，组织，细胞，体液(例如血液、血浆、血清、脑脊髓液、或尿液)，拭子样品，粪便样品和植物样品(例如种子、叶、根、茎、花朵、来自植物组织培养物的细胞或组织)。生物样品可以是原核来源或真核来源的。在一些实施方式中，生物样品是哺乳动物，特别是人。
本文提供的方法在从粪便样品中分离生物分子方面特别有用。对来自粪便样品的生物分子(例如核酸)的分析可以检测细菌和病毒感染因子，监测由饮食引起的变化，益生菌和抗生素的使用，以及检测肿瘤特异性变化，其可以用作消化道肿瘤的早期诊断中的参数。
本文所用术语“环境样品”是指包含感兴趣的生物分子的任何环境材料(即，包含在地球和空间中的材料)。环境材料可以是土壤、水和空气中的材料。生物分子包括来自环境材料中的存活或死亡生物的生物分子。
本文所用术语“土壤”是指土壤(例如盆栽混合物、泥土)，沉积物(例如海洋沉积物、湖泊沉积物、河流沉积物)，肥料(例如家禽如鸡或火鸡的粪、马粪、牛粪、山羊粪、绵羊粪)，填埋垃圾，堆肥等的环境样品。
本文所用术语“食物样品”是指供动物(例如人)食用的材料、物质或组合物，包括生食，加工食品，肉，鱼，家禽，蔬菜，蛋，乳制品，烘焙产品，巧克力，花生酱，饮料等。食品样品还可以包括通过使食品样品与培养基接触并在适合微生物(如果样品中存在微生物的话)生长的条件下孵育该混合物而产生的食品富集培养物。
由于其溶解生物分子的高效率并且使生物分子的降解最小化，本公开的方法允许使用比传统上所需的(例如2克)更少量的起始原料(例如小于1克、小于0.5克或小于0.25克)，而不牺牲每克样品中获得的核酸的量。例如，起始原料可以在0.01克～1克、0.01克～0.5克、0.01克～0.25克、0.05克～1克、0.05克～0.5克、0.05克～0.25克、0.1克～1克、0.1克～0.5克、或0.1克～0.25克的范围内。
B.裂解试剂
收集样品后，通常将样品裂解以释放生物分子用于后续的分离或检测。根据本文公开的方法的样品裂解使用裂解试剂，所述裂解试剂包含以下组分、基本上由以下组分构成、或者由以下组分构成：一种或多种相对温和的离液剂和一种或多种磷酸盐(和任选的水)。
离液剂破坏蛋白质和核酸之类的大分子的结构并使之变性。离液性溶质通过干扰由非共价力(例如氢键、范德华力和疏水作用)介导的分子内相互作用来增加系统的熵，大分子的结构和功能取决于所述非共价力。示例性的离液剂包括氯化胍，硫氰酸胍，脲或锂盐。
“相对温和的”离液剂是指比更强的离液剂硫氰酸胍(GuSCN)或氯化胍(GuCl)更少地使蛋白质变性、但比更弱的离液剂氯化钠更多地使蛋白质变性的离液剂。因此，这种相对温和的离液剂同样可以用于纯化和/或分离蛋白质。这种相对温和的(也称为“低侵蚀性”)离液剂包括某些霍夫梅斯特序列(Hofmeister series)离液阳离子/阴离子组合，其中相对强的阴离子与相对弱的阳离子结合，或者相对强的阳离子与相对弱的阴离子结合。
霍夫梅斯特序列是离子的分类，按其盐析或盐溶蛋白质的能力排序。这一盐序列对蛋白质的溶解度及其二级和三级结构的稳定性具有一致的影响。阴离子似乎比阳离子具有更大的作用，示例性的阴离子通常按如下顺序排序：
CO3 2->F-或SO4 2->HPO4 2->乙酸根>Cl->Br->NO3 ->ClO3 ->I->ClO4 ->SCN-
示例性的阳离子的顺序通常如下所示：
N(CH3)4 +>Cs+>Rb+>NH4 +>K+>Na+>Li+>Mg2+>Ca2+>胍盐
示例性的相对温和的离液剂包括NaSCN、NaCO3、KSCN、NH4SCN、LiSCN、LiClO4、硫酸胍及其组合。优选地，相对温和的离液剂是NaSCN或NaCO3。
相对温和的离液剂可以包括具有与可溶性蛋白质中弱于Mg2+的阳离子配对的强阴离子SCN-的盐；具有与可溶性蛋白质中弱于Mg2+的阳离子配对的强阴离子ClO4 -的盐；以及具有与可溶性蛋白质中强于NH4 +的阳离子配对的弱阴离子CO3 2-的盐。
相对温和的离液剂(例如NaSCN)在较强的离液剂(如GuSCN或GuCl)和较弱的离液剂(如RbSCN)之间取得了理想的平衡。这种侵蚀性较小的离液剂通常需要其他机制、如机械破损来裂解样品，尤其是复杂样品(例如粪便样品)。但是，侵蚀性较小的离液剂可以在匀浆过程中有效溶解生物分子，使其可用于下游分离或检测步骤。另一方面，强离液剂和去污剂(例如SDS)可以实现完全的细胞裂解，但是以生物分子降解(例如核酸降解)为代价。侵蚀性较小的离液剂在溶解生物分子(例如核酸)的同时使此类生物分子的降解最小化的能力方面是独特的。
裂解试剂中的相对温和的离液剂的浓度可以在0.05～5M、例如0.05～0.1M、0.1～0.5M、0.5～1M、1～1.5M、1.5～2M、2～5M、0.1～1M、0.1～1.5M、0.1～2M、0.1～5M、0.5～1.5M、0.5～2M、0.5～5M、1～2M或1～5M、优选0.05～0.5M或0.5～2M的范围内。裂解物(即样品和裂解试剂的混合物)中的相对温和的离液剂的终浓度可以为0.01～4M、例如0.01～0.05M、0.05～0.1M、0.1～0.5M、0.5～1M、1～1.5M、1.5～2M、2～4M、0.01～0.1M、0.01～0.5M、0.01～1M、0.01～1.5M、0.01～2M、0.01～4M、0.05～0.5M、0.05～1M、0.05～1.5M、0.05～2M、0.05～2M、0.05～4M、0.1～1M、0.1～1.5M、0.1～2M、0.1～4M、0.5～1.5M、0.5～2M、0.5～4M、1～2M或1～4M，优选为0.05～0.5M或0.5～2M。
例如，裂解试剂中NaSCN的浓度可以为0.5～2M，优选为0.8～1.2M。裂解物(即样品和裂解试剂的混合物)中NaSCN的终浓度可以为0.1～1.8M，优选为0.5～1.1M。
裂解试剂中Na2CO3的浓度可以为0.05～0.2M，优选为0.08～0.12M。裂解物(即样品和裂解试剂的混合物)中Na2CO3的终浓度可以为0.01～0.4M，优选为0.04～0.15M。
如果裂解试剂中存在多种相对温和的离液剂，则裂解试剂中的离液剂的组合的总浓度可以在0.05～5M、例如0.05～0.1M、0.1～0.5M、0.5～1M、1～1.5M、1.5～2M、2～5M、0.1～1M、0.1～1.5M、0.1～2M、0.1～5M、0.5～1.5M、0.5～2M、0.5～5M、1～2M或1～5M、优选0.05～0.5M或0.5～2M的范围内。裂解试剂中的单独一种离液剂的浓度可以在0.01～4.5M、例如0.01～0.05M、0.05～0.1M、0.1～0.5M、0.5～1M、1～1.5M、1.5～2M、2～4.5M、0.01～0.1M、0.01～0.5M、0.01～1M、0.01～1.5M、0.01～2M、0.1～1M、0.1～1.5M、0.1～2M、0.1～4.5M、0.5～1.5M、0.5～2M、0.5～4.5M、1～2M或1～4.5M、优选0.01～0.5M或0.1～2M的范围内。裂解物(即样品和裂解试剂的混合物)中的离液剂的组合的总终浓度可以为0.01～4M、例如0.01～0.05M、0.05～0.1M、0.1～0.5M、0.5～1M、1～1.5M、1.5～2M、2～4M、0.01～0.1M、0.01～0.5M、0.01～1M、0.01～1.5M、0.01～2M、0.01～4M、0.05～0.5M、0.05～1M、0.05～1.5M、0.05～2M、0.05～2M、0.05～4M、0.1～1M、0.1～1.5M、0.1～2M、0.1～4M、0.5～1.5M、0.5～2M、0.5～4M、1～2M或1～4M，优选为0.05～0.5M或0.5～2M。裂解物中的单独一种离液剂的终浓度可以为0.001～3.5M、例如0.001～0.01M、0.01～0.05M、0.05～0.1M、0.1～0.5M、0.5～1M、1～1.5M、1.5～2M、2～3.5M、0.001～0.1M、0.001～0.5M、0.001～1M、0.001～1.5M、0.001～2M、0.001～3.5M、0.01～0.1M、0.01～0.5M、0.01～1M、0.01～1.5M、0.01～2M、0.01～3.5M、0.05～0.5M、0.05～1M、0.05～1.5M、0.05～2M、0.05～2M、0.05～3.5M、0.1～1M、0.1～1.5M、0.1～2M、0.1～3.5M、0.5～1.5M、0.5～2M、0.5～3.5M、1～2M或1～3.5M，优选为0.01～0.5M或0.1～2M。
除了一种或多种相对温和的离液剂外，裂解试剂还可以包含一种或多种磷酸盐。磷酸盐在使土壤颗粒均匀破碎、使土壤有机物增溶以及从土壤中提取腐殖质方面特别有用。除此之外，不希望受到理论的束缚，据信游离磷酸根基团(PO4 3-)也通过与抑制剂去除剂竞争性相互作用来防止或减少抑制剂去除剂(例如AlCl3)与核酸的磷酸二酯基之间的复合物形成。示例性的磷酸盐包括磷酸二氢盐、磷酸氢盐和磷酸盐、以及含有一个或多个游离磷酸根基团的其他化合物，例如磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸铵、磷酸二氢锂、磷酸氢二锂、磷酸锂、磷酸三钠、聚(乙烯基膦酸)钠、六偏磷酸钠、焦磷酸钠、三磷酸钠、聚磷酸钠、其他含磷的氧阴离子及其组合。磷酸盐中的阳离子部分包括但不限于铵、钠、钾和锂。
裂解试剂中的磷酸盐的浓度可以为0.05～0.5M，优选为0.1～0.2M。裂解物(即样品和裂解试剂的混合物)中的磷酸盐的终浓度可以为0.01～0.4M，优选为0.1～0.2M。如果裂解试剂中存在多种磷酸盐，则裂解试剂中的磷酸盐的组合的总浓度可以在0.05～0.5M、优选0.1～0.2M的范围内。裂解试剂中的单独一种磷酸盐的浓度可以在0.01～0.45M、例如0.01～0.1M、0.1～0.2M、0.2～0.3M、0.3～0.45M、优选0.01～0.2M的范围内。裂解物(即样品和裂解试剂的混合物)中的磷酸盐的组合的总终浓度可以为0.01～0.4M、0.01～0.05M、0.05～0.1M、0.1～0.4M，优选为0.1～0.2M。裂解试剂中的单独一种磷酸盐的终浓度可以在0.001～0.35M、例如0.001～0.01M、0.01～0.05M、0.05～0.1M、0.1～0.35M、0.1～0.2M、0.2～0.35M、优选0.01～0.2M的范围内。
裂解试剂还可以包含一种或多种去污剂，包括非离子、阳离子、阴离子(十二烷基硫酸钠)或两性离子型去污剂。示例性的去污剂包括十二烷基硫酸钠(SDS)、肌氨酰、十二烷基肌氨酸钠、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、胆酸、脱氧胆酸、苯甲酰氨基牛磺胆酸酯(BATC)、辛基酚聚乙氧基化物、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯、叔辛基苯氧基聚(氧乙烯)1,4-哌嗪双-(乙磺酸)、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸、聚乙二醇叔辛基苯基醚(
Figure BDA0002854500000000091
X-100)、(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基聚乙二醇(
Figure BDA0002854500000000101
X-114)及其组合。
裂解试剂中的去污剂的组合的总浓度可以在0.01％～15％(v/v)(如果去污剂是液体)或0.01％～15％(w/v)(如果去污剂是固体)的范围内。裂解试剂中的单独一种去污剂的浓度可以在0.001～15％、例如0.005～12％、0.01～10％、0.1～8％、0.05～6％、0.1～4％、0.5～2％、0.8～1％、优选0.01～15％的范围内。裂解物(即样品和裂解试剂的混合物)中的去污剂的组合的总终浓度可以为0.005％～12％、例如0.005％～0.05％、0.05％～0.5％、0.5％～5％、5％～12％、0.05％～10％、0.1％～10％或0.5％～5％。裂解试剂中的单独一种去污剂的浓度可以在0.001～12％、例如0.005～10％、0.01～8％、0.05～6％、0.05～6％、0.1～4％、0.2～2％、0.5～1％、优选0.001～12％的范围内。
在某些其他实施方式中，裂解试剂不包含任何去污剂如SDS。
裂解试剂可以额外包含一种或多种阻断剂，其阻断或减少样品中的污染物与在裂解和溶解过程中释放的核酸之间的相互作用。示例性的阻断剂包括酪蛋白、聚丙烯酸和聚苯乙烯磺酸盐。这类阻断剂可用于阻断具有带正电基团(例如金属离子)的样品中的颗粒(例如土壤颗粒)与从样品中释放的核酸之间的静电相互作用。这种相互作用如果不被破坏，则会导致来自样品的核酸产量显著降低。
裂解试剂中的封闭剂的组合的总浓度可以在相关官能团(例如羧酸根(在聚丙烯酸的情况下)、磺酸根、磷酸根)的0.01～0.5M的范围内。裂解试剂中的单独一种阻断剂的浓度可以在0.001～0.5M的范围内。裂解物(即样品和裂解试剂的混合物)中的封闭剂的组合的总终浓度可以在2～400mM的范围内。裂解试剂中的单独一种阻断剂的终浓度可以在0.2～400M的范围内。在某些其他实施方式中，裂解试剂不包含任何阻断剂。
裂解试剂还可以包含除上述离液剂或磷酸盐以外的一种或多种盐。示例性的盐包括NaCl、NaF、LiCl、NaBr、NaI、RbCl、CsCl、RbBr、CsBr、RbI、Csl及其组合。裂解试剂中的盐的组合的总浓度可以在10～500mM、例如30～300mM或50～200mM的范围内。裂解试剂中的单独一种盐的浓度可以在1～500mM、例如10～200mM或25～100mM的范围内。在某些其他实施方式中，裂解试剂不包含任何额外的盐(如NaCl)。
裂解试剂还可以包含一种或多种缓冲物质，以使得裂解在稳定的pH下进行。裂解试剂的pH可以在pH 6～pH 12、例如pH 6～pH 8、pH 7～pH 9、pH 8～pH 10、pH 8～pH 11、pH 7～pH10的范围内。
裂解试剂可以呈固态，所述裂解试剂包含以下组分、基本上由以下组分构成、或者由以下组分构成：上述一种或多种相对温和的离液剂和上述一种或多种磷酸盐。优选地，裂解试剂是包含以下组分、基本上由以下组分构成、或者由以下组分构成的溶液：一种或多种如上所述的相对温和的离液剂、一种或多种如上所述的磷酸盐、以及水。优选地，一种或多种相对温和的离液剂包含NaSCN或NaCO3或者是NaSCN或NaCO3，尤其是NaSCN。一种或多种磷酸盐优选包含磷酸氢二钠或者是磷酸氢二钠。示例性的优选裂解试剂包含0.5～2M的NaSCN和0.1～0.2M的Na2HPO4、基本上由0.5～2M的NaSCN和0.1～0.2M的Na2HPO4构成、或者由0.5～2M的NaSCN和0.1～0.2M的Na2HPO4构成。另一示例性的优选裂解试剂包含0.05～0.5M的Na2CO3和0.1～0.2M的Na2HPO4、基本上由0.5～0.5M的Na2CO3和0.1～0.2M的Na2HPO4构成、或者由0.5～0.5M的Na2CO3和0.1～0.2M的Na2HPO4构成。
C.裂解工艺
本文提供的从样品制备裂解物的方法包括在适合于感兴趣的生物分子的条件下使样品与上述一种或多种裂解试剂接触足够的时间，以溶解生物分子而不会显著降解此类分子。尽管下文描述的本公开的某些方面关注的是核酸分离，但是上述裂解试剂不仅可用于裂解样品以分离核酸，而且还可用于裂解样品以用于其他目的，例如分离、纯化和/或检测蛋白质。
裂解试剂可以与一种或多种其他样品裂解方法(例如物理破碎和酶法裂解)组合使用，所述裂解试剂包含以下组分、基本上由以下组分构成、或者由以下组分构成：一种或多种相对温和的离液剂和一种或多种磷酸盐。
样品的物理破碎包括超声处理，温度变化，使用机械力、剪切力、机械振动或涡旋仪的机械破碎，或这些方法的组合。
机械破碎可以包括使用珠磨(bead beating)和/或匀浆方法。可用于机械破碎的珠粒可以由以下材料制成或包含以下材料：玻璃、陶瓷、金属、矿物、或两种或更多种这些材料的组合。珠粒的尺寸可以在0.05mm～3mm的范围内。示例性的珠粒包括0.7mm石榴石珠、0.15mm石榴石珠、0.1mm玻璃珠、0.5mm玻璃珠、0.1mm陶瓷珠、0.5mm陶瓷珠、1.4mm陶瓷珠、0.1mm钇稳定锆珠、0.5mm钇稳定锆珠、或这些珠粒的组合(例如等量的0.1mm玻璃珠和0.5mm玻璃珠)。在某些优选实施方式中，珠粒是密度(g/cc)至少为6.0的高密度珠粒，例如钇稳定锆珠、铈稳定珠和不锈钢珠。珠磨可以使用带有珠管适配器或珠磨机的涡旋混合器来进行，如TissueLyzer II(凯杰公司(QIAGEN))、AMBIONTM涡旋仪适配器(Vortex Adapter)(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，马萨诸塞州沃尔瑟姆)和Omini Bead Rupter匀浆器(欧米尼国际公司(OMNI Int’l)，佐治亚州肯尼索)、以及OPS诊断公司(OPSDiagnostics)的各种匀浆器。珠磨的速度和持续时间可以根据样品的种类和尺寸而变化(参见例如Gibbons等，珠磨入门(Bead Beating:A Primer)，OPS诊断公司(OPSDiagnostics,LLC))。例如，可以以珠磨机的最大速度执行珠磨1～20分钟，例如5～10分钟、10～20分钟或5～15分钟。
本文公开的裂解试剂优选与机械破碎(例如珠磨)组合使用，以从复杂样品(例如粪便样品)中分离生物分子(例如DNA、RNA和/或蛋白质)。生物分子可以是微生物来源的。
裂解试剂也可以与酶法裂解组合使用，包括使用淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶等。
如果使用裂解试剂产生用于分离蛋白质的裂解物，则裂解可以在低温(例如4℃)下进行以避免或减少蛋白质变性。在分离的蛋白质的下游分析(例如质谱分析)不需要非变性蛋白质的一些其他实施方式中，裂解可以在更高的温度(例如20～25℃)下进行。此外，蛋白酶通常不包含在裂解试剂中。取而代之，优选地，在临近样品裂解之前，将蛋白酶抑制剂(例如来自赛默飞世尔公司的Halt蛋白酶抑制剂)添加到样品材料、裂解试剂或样品材料与裂解试剂的混合物中，以防止或减少样品裂解和后续的蛋白质分离过程中的蛋白质降解。类似地，可以在临近样品裂解之前将还原剂(例如β-巯基乙醇)添加到样品材料、裂解试剂或样品材料与裂解试剂的混合物中，以避免由氧化引起的蛋白质或酶的活性损失。
所得裂解物可直接用于从样品中分离生物分子的方法中的后续步骤(例如抑制剂去除)。优选地，通过过滤、沉降或优选离心将裂解物分离成包含从样品释放的生物分子的液相和包含来自样品的固体颗粒或残留物的固相。所得液相(即上清液)或其一部分可以用来分离生物分子和/或去除抑制剂。
D.试剂盒
在一个相关方面，本公开提供一种从样品制备裂解物的试剂盒，该试剂盒包括：(a)上述裂解试剂、或(b)分开提供的一种或多种磷酸盐和一种或多种相对温和的离液剂。
试剂盒可以额外包含用于机械破碎样品(例如粪便样品)的匀浆材料(即，可用于匀浆样品的物质，如珠粒，优选高密度珠粒)。
试剂盒还可以包含起到一种或多种蛋白质沉淀剂作用的一种或多种第一试剂。示例性的蛋白质沉淀剂包括乙酸铵、硫酸铵、乙酸钾、乙酸钠和氯化钠，优选乙酸钠和乙酸铯，如下所述。
或者，试剂盒还可以包含起到一种或多种分子筛作用的一种或多种第一试剂，所述分子筛竞争性结合样品中蛋白质的官能团，从而防止这些基团与可用于消耗来自样品的污染物的多价盐的多价阳离子相互作用。这些试剂可用于产生裂解物以供分离蛋白质和任选的其他生物分子(例如核酸)。分子筛可以选自低分子量羧酸盐、低分子量硫酸盐、羧酸盐聚合物、磺化聚合物及其混合物。示例性的分子筛包括氨基酸；短链脂肪酸的盐，如丁酸钠；聚苯乙烯磺酸钠；聚丙烯酸钠；优选硫酸铵、乙醇酸铵、磺基乙酸、甲酸铵、乙酸钠、乙酸铯、乙酸铵、β-丙氨酸、硫酸胍、组氨酸、甘氨酸及其组合。
一些第一试剂(例如乙酸铵)可以在相对高的浓度(例如，在包含裂解物、第一试剂和如下文所述的一种或多种第二试剂的混合物中以1～2M的浓度)下起到蛋白质沉淀剂的作用，但是在相对低的浓度(例如，比起到蛋白质沉淀剂的作用时的浓度低5至15倍的浓度)下起到分子筛的作用。
试剂盒还可以包含起到一种或多种抑制剂去除剂作用的一种或多种第二试剂。示例性的抑制剂去除剂包括硫酸铝铵、十二水合硫酸铝铵、硫酸铵、硫酸铝钾、水合氯化铝、氧化钙、氯化铁(III)、硫酸铁(II)、铝酸钠、硅酸钠、氯化镁、氯化铝、硫酸铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化锆(IV)、氯化铪(IV)及其组合。优选地，抑制剂去除剂包括氯化铝、硫酸铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化锆(IV)、氯化铪(IV)及其组合。
一种或多种第一试剂和一种或多种第二试剂可以形成固体形式或溶液形式的组合物。
在组合物是溶液并且一种或多种第一试剂起到蛋白质沉淀剂作用的实施方式中，溶液中的一种或多种第一试剂的总浓度在0.5M～10M、1～8M或1.5～7.5M、优选0.5～5M、0.5～7.5M、2.5～5M、2.5～7.5M、1～8M或1.5～7.5M的范围内；和/或溶液中的一种或多种第二试剂的总浓度在10～500mM、例如10～100mM、100～200mM、200～300mM、300～400mM、400～500mM、10～200mM、10～300mM、10～400mM、100～300mM、100～400mM、100～500mM、200～400mM、200～500mM和300～500mM、优选10～200mM、10～500mM、50～200mM、50～500mM或75～150mM的范围内。如果组合物包含多种第一试剂，则单独一种第一试剂的浓度可以在0.1～9.5M、例如0.1～0.5M、0.5～2.5M、2.5～5M、5～7.5M、7.5～9.5M、0.1～2.5M、0.1～5M、0.1～7.5M、0.5～5M、0.5～7.5M、0.5～9.5M、2.5～7.5M、2.5～9.5M、5～9.5M、优选0.1～5M、0.5～7.5M、2.5～5M、2.5～7.5M、1～8M或1.5～7.5M的范围内。如果组合物包含多种第二试剂，则单独一种第二试剂的浓度可以在1～450mM、例如1～10mM、10～100mM、100～200mM、200～300mM、300～400mM、400～450mM、1～200mM、1～300mM、1～400mM、1～450mM、100～300mM、100～400mM、100～450mM、200～400mM、200～450mM、300～450mM、优选1～200mM、10～450mM、50～200mM、50～450mM或75～150mM的范围内。
在组合物是溶液并且一种或多种第一试剂起到分子筛作用的实施方式中，溶液中的一种或多种第一试剂的总浓度在0.1～1M、例如0.1～0.25M、0.25～0.5M、0.5～0.75M、0.75～1M、0.1～0.5M、0.1～0.75M、0.25～0.75M、0.1～0.95M、0.25～1M或0.5～1M、优选0.1～0.75M的范围内；和/或溶液中的一种或多种第二试剂的总浓度在10～500mM、例如10～100mM、100～200mM、200～300mM、300～400mM、400～500mM、100～300mM、100～400mM、100～500mM、200～400mM、200～500mM、300～500mM、优选10～200mM、10～500mM、50～200mM、50～500mM或75～150mM的范围内。如果组合物包含多种第一试剂，则单独一种第一试剂的浓度可以在0.01～0.95M、例如0.01～0.1M、0.1～0.25M、0.25～0.5M、0.5～0.75M、0.75～0.95M、0.01～0.25M、0.01～0.5M、0.01～0.75M、0.1～0.5M、0.1～0.75M、0.25～0.75M、0.25～0.95M或0.5～0.95M、优选0.01～0.75M的范围内。如果组合物包含多种第二试剂，则单独一种第二试剂的浓度可以在1～450mM、例如1～10mM、10～100mM、100～200mM、200～300mM、300～400mM、400～450mM、100～300mM、100～400mM、100～450mM、200～400mM、200～450mM、300～450mM、优选1～100mM、10～200mM、10～450mM、50～200mM、50～450mM或75～150mM的范围内。
试剂盒还可以包含以下一种或多种组分：
蛋白质结合溶液、
蛋白质洗涤溶液、
蛋白质洗脱溶液、
核酸结合性固体支持物(例如DNA结合性固体支持物、RNA结合性固体支持物以及能够同时结合DNA和RNA的固体支持物)、
DNA结合溶液、
DNA洗涤溶液、
DNA洗脱溶液、
RNA结合溶液、
RNA洗涤溶液、
RNA洗脱溶液、以及
一种或多种器皿或容器(例如收集管)。
“蛋白质结合溶液”是指促进或增强蛋白质与蛋白质结合性固体支持物的结合的溶液。结合溶液可以包含缓冲溶液(例如柠檬酸盐缓冲液)和一种或多种盐(例如NaCl)。结合混合物中的盐的终浓度可以在1～5M、例如2～3M的范围内。
“蛋白质结合性固体支持物”是指能够结合包括总体上的蛋白质(即总蛋白质)或感兴趣的特定蛋白质在内的蛋白质的固体支持物。示例性的蛋白质结合性固体支持物包括二氧化硅旋转滤膜、二氧化硅离心柱、二氧化硅涂覆的磁珠、硅藻土和二氧化硅颗粒的细分悬浮液。
“蛋白质洗涤溶液”是指可用于从结合于蛋白质结合性固体支持物的蛋白质中去除污染物的溶液，例如含乙醇的溶液。
“蛋白质洗脱溶液”是指可用于将结合于蛋白质结合性固体支持物的蛋白质洗脱的溶液。示例性的蛋白质洗脱溶液包括任选地含有去污剂(例如SDS)的缓冲溶液(例如HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液)。
可用于核酸分离的固体支持物和溶液如下文的“核酸分离”部分所述。
在一个相关方面，本公开提供上述试剂盒在从样品制备裂解物和/或分离生物分子中的用途。
II.核酸分离
在另一方面，本公开提供一种从样品中分离核酸的方法，包括：
(a)使样品、样品的裂解物或裂解物的上清液、或者样品、裂解物或上清液的一部分与选自乙酸铵、硫酸铵、乙酸钾、乙酸钠、氯化钠、乙酸铯及其组合的一种或多种第一试剂以及选自氯化铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化铪(IV)、氯化锆(IV)及其组合的一种或多种第二试剂接触，得到混合物；
(b)将步骤(a)的混合物分离为固相和液相，其中一种或多种第二试剂主要位于固相中；以及
(c)从步骤(b)的液相中分离核酸。
A.方法
1.样品裂解
根据本文提供的方法分离核酸的样品可以是任何包含核酸的样品，包括生物样品/环境样品和食品样品，尤其是那些含有抑制剂的样品，所述抑制剂如果存在于分离核酸的制备物中，则会干扰分离核酸的下游分析。
各种种类的样品如上文的“I.样品裂解”部分的“A.样品”小节所述。优选的样品包括土壤样品和粪便样品。
作为起始原料所需的样品量可以根据从样品中分离的核酸的下游分析而变化。由于其分离核酸的高效率并且将抑制剂消耗掉，本公开的方法允许使用比传统上所需的(例如2克)更少量的原料(例如小于1克、小于0.5克或小于0.25克)，而不牺牲每克样品中获得的核酸的量。例如，起始原料可以在0.01克～1克、0.01克～0.5克、0.01克～0.25克、0.05克～1克、0.05克～0.5克、0.05克～0.25克、0.1克～1克、0.1克～0.5克、或0.1克～0.25克的范围内。
收集样品后，通常将样品裂解以释放核酸，然后将这些分子分离。样品裂解可以与抑制剂去除同时进行，并且优选在抑制剂去除之前进行。
样品裂解可通过物理破碎、化学裂解、酶法裂解或其组合来进行。根据给定的样品种类和样品中存在的生物，可以采用不同的样品破碎方法。例如，尽管人类细胞和病毒衣壳很容易用盐或去污剂裂解，但细菌的孢子或卵囊却需要侵蚀性更大的化学、酶或物理方法。
物理破碎和酶法裂解如上文的“I.样品裂解”部分的“C.裂解工艺”小节所述。
化学裂解包括使用包含一种或多种离液剂的裂解试剂。示例性的离液剂包括氯化胍，硫氰酸胍，脲或锂盐。优选地，一种或多种离液剂是如上文的“I.样品裂解”部分的“B.裂解试剂”小节所述的相对温和的离液剂。
裂解试剂中的一种或多种离液剂的总浓度可以在0.05～5M、例如0.05～0.1M、0.1～0.5M、0.5～1M、1～1.5M、1.5～2M、2～5M、0.1～1M、0.1～1.5M、0.1～2M、0.1～5M、0.5～1.5M、0.5～2M、0.5～5M、1～2M或1～5M、优选0.05～0.5M或0.5～2M的范围内。如果裂解试剂中存在多种离液剂，则裂解试剂中的单独一种离液剂的浓度可以在0.01～4.5M、例如0.01～0.05M、0.05～0.1M、0.1～0.5M、0.5～1M、1～1.5M、1.5～2M、2～4.5M、0.01～0.1M、0.01～0.5M、0.01～1M、0.01～1.5M、0.01～2M、0.1～1M、0.1～1.5M、0.1～2M、0.1～4.5M、0.5～1.5M、0.5～2M、0.5～4.5M、1～2M或1～4.5M、优选0.01～0.5M或0.1～2M的范围内。
裂解物(即样品和裂解试剂的混合物)中的一种或多种离液剂的总终浓度可以为0.01～4M、例如0.01～0.05M、0.05～0.1M、0.1～0.5M、0.5～1M、1～1.5M、1.5～2M、2～4M、0.01～0.1M、0.01～0.5M、0.01～1M、0.01～1.5M、0.01～2M、0.01～4M、0.05～0.5M、0.05～1M、0.05～1.5M、0.05～2M、0.05～2M、0.05～4M、0.1～1M、0.1～1.5M、0.1～2M、0.1～4M、0.5～1.5M、0.5～2M、0.5～4M、1～2M或1～4M，优选为0.05～0.5M或0.5～2M。如果裂解物中存在多种离液剂，则裂解物中的单独一种离液剂的浓度可以在0.001～3.5M、例如0.001～0.01M、0.01～0.05M、0.05～0.1M、0.1～0.5M、0.5～1M、1～1.5M、1.5～2M、2～3.5M、0.001～0.1M、0.001～0.5M、0.001～1M、0.001～1.5M、0.001～2M、0.001～3.5M、0.01～0.1M、0.01～0.5M、0.01～1M、0.01～1.5M、0.01～2M、0.01～3.5M、0.05～0.5M、0.05～1M、0.05～1.5M、0.05～2M、0.05～2M、0.05～3.5M、0.1～1M、0.1～1.5M、0.1～2M、0.1～3.5M、0.5～1.5M、0.5～2M、0.5～3.5M、1～2M或1～3.5M、优选0.01～0.5M或0.1～2M的范围内。
裂解试剂还可以包含如上文的“样品裂解”部分所述的一种或多种磷酸盐。裂解试剂中的一种或多种磷酸盐的总浓度可以为0.05～0.5M，优选为0.1～0.2M。裂解试剂(如果裂解试剂中存在多种磷酸盐)中的单独一种磷酸盐的浓度可以在0.01～0.45M、例如0.01～0.1M、0.1～0.2M、0.2～0.3M、0.3～0.45M、优选0.01～0.2M的范围内。裂解物(即样品和裂解试剂的混合物)中的一种或多种磷酸盐的总终浓度可以为0.01～0.4M，优选为0.1～0.2M。裂解物(如果裂解物中存在多种磷酸盐)中的单独一种磷酸盐的终浓度可以在0.001～0.35M、例如0.001～0.01M、0.01～0.05M、0.05～0.1M、0.1～0.35M、0.1～0.2M、0.2～0.35M、优选0.01～0.2M的范围内。
裂解试剂还可以包含以下一种或多种组分：一种或多种去污剂，一种或多种阻断剂，除上述离液剂或磷酸盐以外的一种或多种盐，以及一种或多种缓冲物质，以使得裂解在稳定的pH下进行。这些额外组分及其浓度也如上文的“I.样品裂解”部分的“B.裂解试剂”小节所述。
优选地，在本文提供的从样品中分离核酸的方法中，使用包含如上文的“I.样品裂解”部分的“B.裂解试剂”小节所述的一种或多种相对温和的离液剂和一种或多种磷酸盐裂解试剂。
在本文公开的分离核酸的方法中的步骤(a)中，可以直接使用样品的裂解物。优选地，通过过滤、沉降或优选离心将裂解物分离成包含从样品释放的核酸的液相和包含来自样品的固体颗粒或残留物的固相。所得液相(即上清液)或其一部分可以用来分离核酸和去除抑制剂。
2.抑制剂去除
本文提供的方法从样品中分离核酸，并从分离的核酸中去除抑制剂，从而允许对分离的核酸进行有效的下游分析。具体而言，本文公开的方法的步骤(a)是使样品、样品的裂解物或裂解物的上清液、或者样品、裂解物或上清液的一部分与选自乙酸铵、硫酸铵、乙酸钾、乙酸钠、氯化钠、乙酸铯及其组合的一种或多种第一试剂以及选自氯化铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化铪(IV)、氯化锆(IV)及其组合的一种或多种第二试剂接触，得到混合物。步骤(b)是将步骤(a)的混合物分离成固相和液相，其中一种或多种抑制剂去除剂主要位于固相中并由此从液相中被去除，所述液相随后用于分离核酸。
一种或多种第一试剂选自乙酸铵、硫酸铵、乙酸钾、乙酸钠、氯化钠、乙酸铯，优选乙酸铵、乙酸钠和乙酸铯。
在某些实施方式中，一种或多种第一试剂不包括氯化钠或乙酸钾。
步骤(a)的混合物中的第一试剂的组合的总浓度可以在0.1～3M、例如0.1～0.25M、0.1～0.5M、0.1～1M、0.1～1.5M、0.1～2M、0.1～2.5M、0.1～3M、0.25～0.5M、0.5～1M、1～1.5M、1.5～2M、2～2.5M、2.5～3M、0.25～1M、0.25～1.5M、0.25～2M、0.25～2.5M、0.25～3M、0.5～1.5M、0.5～2M、0.5～2.5M、0.5～3M、1～2M、1～2.5M、1～3M、2～3M、优选0.5～2.5M或1～2M的范围内。如果步骤(a)的混合物中存在多种第一试剂，则步骤(a)的混合物中的单独一种第一试剂的浓度可以在0.01～2.5M、例如0.01～0.1M、0.1～0.25M、0.25～0.5M、0.5～1M、1～1.5M、1.5～2M、2～2.5M、0.01～0.5M、0.01～1M、0.01～1.5M、0.01～2M、0.01～2.5M、0.1～0.5M、0.1～1M、0.1～1.5M、0.1～2M、0.1～2.5M、0.25～1M、0.25～1.5M、0.25～2M、0.25～2.5M、0.5～1.5M、0.5～2M、0.5～2.5M、1～2M、1～2.5M、优选0.1～2M或0.5～2M的范围内。
一种或多种第一试剂可以在步骤(a)中起到蛋白质沉淀剂的作用，并且被称为“蛋白质沉淀剂”。
一种或多种第二试剂起到抑制剂去除剂的作用，并且可以被称为“抑制剂去除剂”。抑制剂去除剂是含有三价或四价阳离子的三价或四价盐。示例性的抑制剂去除剂包括氯化铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化锆(IV)、氯化铪(IV)及其组合，优选氯化铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬，更优选氯化铝。
步骤(a)的混合物中的一种或多种第二试剂的总浓度可以在1～150mM、例如1～5mM、5～25mM、25～50mM、50～75mM、75～100mM、100～150mM、1～25mM、1～50mM、1～75mM、1～100mM、1～150mM、5～50mM、5～75mM、5～100mM、5～150mM、25～75mM、25～100mM、25～150mM、50～100mM、50～150mM、75～150mM、优选5～25mM或5～50mM的范围内。如果步骤(a)的混合物中存在多种第二试剂，则步骤(a)的混合物中的单独一种第二试剂的浓度可以在0.1～145mM、例如0.1～1mM、1～5mM、5～25mM、25～50mM、50～75mM、75～100mM、100～145mM、0.1～5mM、0.1～25mM、0.1～50mM、0.1～75mM、0.1～100mM、0.1～145mM、1～25mM、1～50mM、1～75mM、1～100mM、1～145mM、5～50mM、5～75mM、5～100mM、5～145mM、25～75mM、25～100mM、25～145mM、50～100mM、50～145mM、75～145mM、优选1～25mM或5～50mM的范围内。
在本文提供的方法的抑制剂去除过程中，可以将上述的任何一种第一试剂(包括起到沉淀剂的作用时)与上述的任何一种第二试剂(包括起到抑制剂去除剂的作用时)组合使用。例如，乙酸铵可以与以下抑制剂去除剂组合：氯化铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化锆(IV)、氯化铪(IV)或其组合。类似地，乙酸钠可以与以下抑制剂去除剂组合：氯化铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化锆(IV)、氯化铪(IV)或其组合；并且，乙酸铯可以与以下抑制剂去除剂组合：氯化铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化锆(IV)、氯化铪(IV)或其组合。另一种变形是将氯化铝与以下蛋白质沉淀剂组合：乙酸铵、硫酸铵、乙酸钾、乙酸钠、氯化钠、乙酸铯或其组合。此外，在本文提供的方法的抑制剂去除过程中，可以将上述的任何两种或多种第一试剂与上述的任何一种第二试剂组合使用；在本文提供的方法的抑制剂去除过程中，可以将上述的任何一种第一试剂与上述的任何两种或多种第二试剂组合使用；在本文提供的方法的抑制剂去除过程中，可以将上述的任何两种或多种第一试剂与上述的任何两种或多种第二试剂组合使用。
第一试剂和第二试剂的优选组合包括：乙酸铵和氯化铝、乙酸钠和氯化铝、乙酸铯和氯化铝。
在步骤(a)中，可以首先使样品、样品的裂解物或裂解物的上清液、或者样品、裂解物或上清液的一部分(统称为“样品材料”)与一种或多种第一试剂接触。将样品材料与一种或多种第一试剂混合后，可以通过沉淀、离心或过滤将所得混合物分离成固相和液相，然后使液相与一种或多种第二试剂接触。优选地，在使样品材料与一种或多种第一试剂接触和使所得混合物与一种或多种第二试剂接触之间，不发生固相和液相的分离。换言之，优选地，与一种或多种第一试剂接触而得的混合物不产生经离心、过滤、沉淀或其他处理而得的、进一步与一种或多种第二试剂混合的上清液。
或者，样品材料可以首先与一种或多种第二试剂接触，然后与一种或多种第一试剂接触。在这样的实施方式中，样品材料与与一种或多种第二试剂的混合物优选不产生经离心、过滤或其他处理而得的、进一步与一种或多种第一试剂混合的上清液。
优选地，样品材料同时与一种或多种第一试剂以及一种或多种第二试剂接触。例如，样品材料可以与包含一种或多种第一试剂以及一种或多种第二试剂的组合物(例如溶液)混合。一种或多种第一试剂以及一种或多种第二试剂的浓度以及示例性的优选溶液在下文的“组合物”部分中详细描述。
步骤(a)的混合物在步骤(b)中离心、过滤、沉淀或以其他方式处理，以使其固相与其液相分离，其中一种或多种第二试剂主要(超过50％)位于固相中。一种或多种第二试剂与来自样品的抑制剂及其它污染材料形成复合物，该复合物在步骤(b)中从液相中被沉淀出去或去除。
在某些实施方式中，多于60％、70％或80％、优选多于90％或更优选多于95％的一种或多种第二试剂在步骤(b)中从液相中被去除。
如本文所用，术语“抑制剂”是指任何干扰涉及从样品中分离的DNA和/或RNA的反应、并且对DNA和/或RNA的操作具有有害作用的物质。抑制剂包括例如以DNA或RNA为底物的酶促反应的抑制剂以及破坏DNA或RNA的杂交的污染物。
抑制剂可以根据样品的种类而变化。例如，粪便样品中的抑制剂包括血红蛋白及其代谢产物、胆红素、胆汁酸和胆汁酸衍生物、未消化或部分消化的纤维、或者未消化或部分消化的食物、以及多糖。
来自土壤样品的抑制剂包括在微生物降解植物残留物时形成的、并通过其反应性位点与金属离子和粘土矿物的共价结合而对于降解保持稳定的腐殖质。其包含与糖类、肽类和酚类连接的多环芳烃。土壤中腐殖质的主要种类是腐殖酸和黄腐酸。其他腐殖质包括腐殖质聚合物和腐殖质。
其他示例性的抑制剂包括几丁质、分解性植物材料、来自堆肥的有机化合物、酚类、酚类聚合物或低聚物、多酚、多糖和单宁。
本文提供的方法能够基本上从样品中去除一种或多种抑制剂。如果在将包含样品材料、任选的裂解试剂以及一种或多种第一试剂和一种或多种第二试剂的混合物分离成固相和液相后，有20％或更少，优选18％或更少、15％或更少、13％或更少或者10％或更少，更优选5％或更少、3％或更少、2％或更少或者1％或更少的来自样品的抑制剂保留在液相中，则基本上去除了抑制剂。
在某些实施方式中，抑制剂抑制分离核酸的PCR扩增，并且被称为“PCR抑制剂”。如本文所用，“PCR扩增”包括各种类型的PCR反应，例如qPCR和RT-PCR。可以通过将使用在有抑制剂去除过程的情况下分离的核酸的PCR反应的某些特征(例如Ct值)与使用在没有抑制剂去除过程的情况下分离的核酸的PCR反应进行比较，来评估特定抑制剂去除过程对这种抑制剂的去除。PCR反应之间Ct值的降低程度可能表征抑制剂去除过程在消耗PCR抑制剂方面的有效性。
3.核酸分离
步骤(b)中得到的液相随后用于分离核酸。
本文所用术语“核酸”包括单链或双链核酸，并且可以使任何DNA(例如基因组DNA、质粒DNA、细菌DNA、酵母DNA、病毒DNA、质体DNA、粘粒DNA和线粒体DNA)或任何RNA(例如rRNA、tRNA、mRNA和snRNA)。
可以采用适合于从溶液中分离DNA、RNA、或DNA和RNA两者的任何方法。优选地，在核酸分离中使用核酸结合性固体支持物。示例性的固体支持物包括二氧化硅基质、玻璃颗粒、硅藻土、磁珠、硝化纤维素、尼龙和阴离子交换材料。固体支持物可以是疏松颗粒、过滤器、膜、纤维或织物或格栅的形式，并且包含在容器中，该容器包括管、柱，并且优选为离心柱。
为了促进或加强核酸与固体支持物的结合，可以使用结合溶液。可以在样品裂解期间(例如在裂解剂的存在下机械破碎样品之后)添加结合溶液，然后在抑制剂去除过程中使样品材料与蛋白质沉淀剂和抑制剂去除剂接触。或者，可以将结合溶液添加至抑制剂去除过程后得到的液相中。
示例性的DNA结合溶液可以包含离液剂(例如GuSCN或GuHCl)、醇(例如乙醇或异丙醇)或两者。其还可以包含缓冲物质、如Tris HCl。
在从样品中分离DNA和RNA两者的实施方式中，可以并行实施DNA分离和RNA分离。换言之，步骤(b)的液相被划分为至少两部分：一个用于DNA分离，一个用于RNA分离。优选地，依次分离DNA和RNA。
依次分离DNA和RNA的方法是已知的(参见例如美国专利第8,889,393号、WO 2004/108925)。优选地，使用用于结合DNA的固体支持物和用于结合RNA的固体支持物。用于结合DNA的固体支持物和用于结合RNA的固体支持物可以相同或不同。当使用相同的固体支持物来分离DNA和RNA时，可以通过调节结合混合物的成分和/或浓度来实现DNA和RNA与固体支持物的差异性结合。例如，可以先将一根硅胶离心柱用于结合DNA，而流出物可以与乙醇混合，然后将所得混合物加至第二硅胶离心柱以结合RNA(Triant和Whitehead,Journal ofHeredity 100:246-50,2009)。
与固相结合后，可以洗涤与固相结合的DNA或RNA，然后从固相洗脱。DNA洗涤溶液可以包含离液剂(例如GuHCl)、醇(例如乙醇、异丙醇)或两者。其还可以包含缓冲物质(例如Tris HCl)、螯合剂(例如EDTA(乙二胺四乙酸))和/或盐(例如NaCl)。DNA洗脱溶液可以是缓冲液(例如Tris缓冲液)或水。
RNA结合溶液可以包含醇(例如乙醇、异丙醇)和任选的另一种有机溶剂(例如丙酮)。RNA洗涤溶液可以包含以下一种或多种：缓冲物质(例如Tris HCl和Tris碱)、螯合剂(例如EDTA)、醇和盐(例如NaCl)。RNA可以用经DEPC处理的水或其他不含RNA酶的水从固体支持物上洗脱。
分离核酸的方法的示例性实施方式在下述实施例13和14中更详细地描述。例如，在实施例14中，通过裂解试剂与珠磨的组合来裂解土壤样品，以有效地溶解来自样品的核酸和蛋白质。将裂解物与DNA结合溶液混合。将DNA结合在二氧化硅离心柱上，然后将包含RNA的流出物与用于将总RNA结合在第二硅胶离心柱上的溶液合并。然后洗涤每个含有固定的DNA或RNA的离心柱，并洗脱被固定的DNA或RNA。
分离的核酸的产量和纯度可以用
Figure BDA0002854500000000251
ND1000分光光度计(NanoDrop技术公司(NanoDrop Technologies Inc.)，特拉华州威尔明顿)、QUBITTMdsDNA HS试验试剂盒(Q32854)和QUBITTMdsDNA Br试验试剂盒(Q32853)(在QUBITTM荧光计(英杰公司(Invitrogen Co.)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)上)、QUANT-ITTM高灵敏dsDNA试验试剂盒(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))、QUANT-ITTM RNA试验试剂盒来确定。用分光光度计和荧光计测得的DNA产量可能会不同。已发现在一些情况下，用
Figure BDA0002854500000000252
分光光度计测得的DNA浓度高于用QUBITTM荧光计测得的DNA浓度。
分离的DNA和RNA的纯度可通过用例如
Figure BDA0002854500000000253
NDIOOO分光光度计(NanoDrop技术公司，特拉华州威尔明顿)测定A260/A280 nm比、A260/A230nm比和A340来评估。
纯DNA和RNA的A260/A280nm比分别为1.8和2.0。如果被蛋白质或苯酚严重污染，则A260/A280比会小于上述给定数值。
A260/A230nm比是在230nm有吸收的污染物的量度。纯DNA和RNA的A260/A230nm比为2.0～2.2。在230nm有明显吸收，就表示被苯酚离子、硫氰酸盐和其他有机化合物污染。
340nm的吸收(即A340)通常是由光散射引起的，表明存在颗粒物。
根据本文提供的方法分离的DNA具有以下一个或多个特征：
(1)其A260/A280在1.6～2.0的范围内，优选在1.7～1.9的范围内，更优选在1.75～1.85的范围内。
(2)其A260/A230在1.0～2.5的范围内，优选在1.5～2.2的范围内。
(3)其A340在0～0.15的范围内，优选在0～0.1的范围内，更优选在0～0.05的范围内。
根据本文提供的方法分离的RNA具有以下一个或多个特征：
(1)其A260/A280在1.8～2.2的范围内，优选在1.9～2.1的范围内，更优选在1.95～2.05的范围内。
(2)其A260/A230在1.0～2.5的范围内，优选在1.5～2.2的范围内。
(3)其A340在0～0.15的范围内，优选在0～0.1的范围内，更优选在0～0.05的范围内。
分离的DNA的完整性可通过在琼脂糖凝胶上观察提取的DNA来评估。分离的RNA的完整性也可通过用凝胶电泳观察提取的RNA来评估。
分离的DNA可以在任何应用中进行分析或用于任何应用，包括PCR、qPCR、RT-PCR、滚环复制、连接酶链式反应、测序(例如新一代测序)、Southern、斑点和狭缝印迹分析、DNA甲基化分析、质谱和电泳。
分离的RNA可以在任何应用中进行分析或用于任何应用，例如RT-PCR、实时RT-PCR、差异显示、cDNA合成、斑点和狭缝印迹分析、以及微阵列分析。
B.组合物
在一个相关方面，本公开提供一种可用于在从样品中分离核酸的过程中去除抑制剂的组合物。该组合物包含以下组分、基本上由以下组分构成、或者由以下组分构成：一种或多种第一试剂，选自乙酸铵、硫酸铵、乙酸钾、乙酸钠、氯化钠、乙酸铯及其组合；一种或多种第二试剂，选自氯化铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化铪(IV)、氯化锆(IV)及其组合；以及任选的水。
第一试剂、第二试剂以及第一试剂和第二试剂的组合如上文的“II.核酸分离”部分的“A.方法”小节所述。
组合物优选为水溶液。在这种情况下，溶液中的一种或多种第一试剂的总浓度可以在0.5～10M、例如0.5～2.5M、2.5～5M、5～7.5M、7.5～10M、0.5～5M、0.5～7.5M、0.5～10M、2.5～7.5M、2.5～10M、5～10M、优选0.5～5M、0.5～7.5M、2.5～5M、2.5～7.5M、1～8M或1.5～7.5M的范围内。如果溶液中存在多种第一试剂，则溶液中的单独一种第一试剂的浓度可以在0.1～9.5M、例如0.1～0.5M、0.5～2.5M、2.5～5M、5～7.5M、7.5～9.5M、0.1～2.5M、0.1～5M、0.1～7.5M、0.5～5M、0.5～7.5M、0.5～9.5M、2.5～7.5M、2.5～9.5M、5～9.5M、优选0.1～5M、0.5～7.5M、2.5～5M、2.5～7.5M、1～8M或1.5～7.5M的范围内。溶液中的一种或多种第二试剂的总浓度可以在10～500mM、例如10～100mM、100～200mM、200～300mM、300～400mM、400～500mM、100～300mM、100～400mM、100～500mM、200～400mM、200～500mM、300～500mM、优选10～200mM、10～500mM、50～200mM、50～500mM或75～150mM的范围内。如果溶液中存在多种第二试剂，则溶液中的单独一种第二试剂的浓度可以在1～450mM、例如1～10mM、10～100mM、100～200mM、200～300mM、300～400mM、400～450mM、1～200mM、1～300mM、1～400mM、1～450mM、100～300mM、100～400mM、100～450mM、200～400mM、200～450mM、300～450mM、优选1～200mM、10～450mM、50～200mM、50～450mM或75～150mM的范围内。
示例性的包含第一试剂和第二试剂的优选溶液包括：
(1)含有1～8M(优选2.5～5M)的乙酸铵和20～200mM的氯化铝的溶液；
(2)含有1～10M(优选1～8M)的乙酸钠和20～200mM的氯化铝的溶液；
(3)含有1～8M(优选1～5M)的乙酸铯和20～200mM的氯化铝的溶液；
(4)含有1～8M(优选2.5～5M)的乙酸铵和20～200mM的乙酸铒(III)的溶液；
(5)含有1～10M(优选1～8M)的乙酸钠和20～200mM的乙酸铒(III)的溶液；
(6)含有1～8M(优选1～5M)的乙酸铯和20～200mM的乙酸铒(III)的溶液；
(7)含有1～8M(优选2.5～5M)的乙酸铵和20～200mM的氯化铒(III)的溶液；
(8)含有1～10M(优选1～8M)的乙酸钠和20～200mM的氯化铒(III)的溶液；
(9)含有1～8M(优选1～5M)的乙酸铯和20～200mM的氯化铒(III)的溶液；
(10)含有1～8M(优选2.5～5M)的乙酸铵和20～200mM的氯化钬的溶液；
(11)含有1～10M(优选1～8M)的乙酸钠和20～200mM的氯化钬的溶液；以及
(12)含有1～8M(优选1～5M)的乙酸铯和20～200mM的氯化钬的溶液。
或者，组合物可以为固体形式。在这种情况下，该组合物包含一种或多种第一试剂以及一种或多种第二试剂、基本上由一种或多种第一试剂以及一种或多种第二试剂构成、或者由一种或多种第一试剂以及一种或多种第二试剂构成，从而当向组合物中加入适量的水时，所得溶液具有如上文中在组合物已经是溶液的情况下所描述的一种或多种第一试剂以及一种或多种第二试剂的浓度。添加的水也可以由样品中的水产生，即，盐的组合可以直接添加到水性样品材料中。
在一个相关方面，本公开提供上述组合物在从样品中分离核酸中的用途。
C.试剂盒
在另一方面，本公开提供一种从样品中分离核酸的试剂盒。该试剂盒包括如上文的“II.核酸分离”部分的“组合物”小节所述的、包含一种或多种第一试剂以及一种或多种第二试剂的组合物。或者，该试剂盒包括分开提供的一种或多种第一试剂以及一种或多种第二试剂。
试剂盒还可以包含以下一种或多种组分：
裂解试剂、
匀浆材料、
核酸结合性固体支持物、
DNA结合溶液、
DNA洗涤溶液、
DNA洗脱溶液、
RNA结合溶液、
RNA洗涤溶液、
RNA洗脱溶液、以及
一种或多种器皿或容器(例如收集管)。
裂解试剂优选为包含以下组分、基本上由以下组分构成、或者由以下组分构成的裂解试剂：如上文的“I.样品裂解”部分所述的磷酸盐和相对温和的离液剂。
匀浆材料是指可用于将样品匀浆的物质，例如珠粒，优选如上文的“I.样品裂解”部分的“C.裂解工艺”小节所述的用于机械破碎样品的高密度珠粒。
其他任选的试剂盒组分如上文的“I.样品裂解”部分的“D.试剂盒”小节所述。
在一个相关方面，本公开提供上述试剂盒在从样品中分离核酸中的用途。
实施例
以下实施例中提及以下试剂：
裂解试剂I：1M NaSCN、0.2M Na2HPO4。
裂解试剂II：0.09M硫氰酸胍、0.13M Na2HPO4、0.006M NaCl、1.76M乙酸铵、0.25％SDS、0.10％消泡剂A。
裂解溶液I：0.18M Na2HPO4、0.12M GuSCN、pH 8.8～9.2。
裂解溶液II：0.1M NaCl、0.5M Tris碱、4％SDS(0.14M)、pH 10.75～11.25。
DNA结合溶液I：含离液剂。
DNA结合溶液II：含离液剂、缓冲液和异丙醇。
DNA结合溶液III：含乙醇。
DNA结合溶液IV：含离液剂、缓冲碱和乙醇。
DNA洗涤溶液I：含离液剂、缓冲液、异丙醇和乙醇。
DNA洗涤溶液II：含缓冲液、螯合剂、盐和乙醇。
DNA洗脱溶液：含pH为微碱性的缓冲液。
RNA结合溶液：含丙酮和乙醇。
RNA洗涤溶液：含缓冲液、螯合剂、盐和醇。
蛋白质结合溶液：含盐和缓冲液，其pH为酸性。
蛋白质洗涤溶液：含乙醇。
蛋白质洗脱溶液：含缓冲液和去污剂，其pH为微碱性。
实施例1
去除或不去除抑制剂的裂解试剂对从粪便样品中分离DNA的影响
本实施例考察去除或不去除抑制剂的不同裂解试剂对从粪便样品中分离DNA的影响。
如下表所示实施四个不同实验(A、B、C和D)。A和B使用本公开的示例性裂解试剂(“裂解试剂I”)，而C和D使用现有的裂解试剂(“裂解试剂II”)。A和C不进行抑制剂去除，而B和D进行了抑制剂去除。
A B C D
输入 0.2g冷冻狗粪便 X X X X
裂解，650μl 裂解试剂I X X
裂解试剂II X X
100ul苯酚 X X
6.5μlβ-巯基乙醇(beta-ME) X X X X
6.5μl蛋白酶抑制剂 X X
DNA结合(350μl) DNA结合溶液 X X
抑制剂去除(150μl) 52mM AASD X
0.12M AASD X
DNA结合(350μl) DNA结合溶液 X X
DNA洗涤 DNA洗涤溶液I X X X X
DNA洗涤溶液II X X X X
DNA洗脱 DNA洗脱溶液 X X X X
分离的DNA的产量和纯度示于下表：
Quant-iT dsDNA
Figure BDA0002854500000000321
以上结果是使用QUANT-ITTM dsDNA试验试剂盒(赛默飞世尔科技公司)遵循供应商的说明书得到的。
NanoDrop
样品 DNA(ng/uL) A260/A280 A260/A230 A340
A 167.176 1.826 1.016 0.096
A 152.183 1.821 1.153 0.109
A 166.272 1.81 1.431 0.125
A 161.637 1.822 1.393 0.091
A 160.319 1.816 1.406 0.109
B 111.448 1.832 0.799 0.046
B 110.381 1.831 0.64 0.074
B 112.97 1.81 1.734 0.051
B 113.903 1.843 1.53 0.075
B 108.207 1.828 0.956 0.079
C 101.056 1.782 0.779 0.077
C 97.665 1.801 1.447 0.104
C 98.104 1.788 1.666 0.113
C 97.556 1.793 1.267 0.078
C 94.579 1.799 1.429 0.121
D 58.715 1.767 0.314 -0.321
D 55.321 1.802 0.593 0.039
D 60.959 1.753 0.226 0.051
D 57.62 1.799 0.324 0.07
D 58.641 1.782 0.662 0.054
以上结果是使用THERMOSCIENTIFICTM NANODROPTM ND-1000分光光度计(赛默飞世尔科技公司)遵循供应商的说明书得到的。
分离的DNA的凝胶电泳示于图1。
结果显示，与裂解试剂II相比，裂解试剂I提取并溶解了明显更多的DNA。在没有抑制剂去除的情况下，两种裂解方法之间的DNA产量差异为47％。在有抑制剂去除的情况下，差异为52％。
实施例2
乙酸铵的滴加对从粪便样品中分离DNA、RNA和蛋白质的影响
本实施例考察不同浓度的乙酸铵对从粪便样品中分离DNA、RNA和蛋白质的影响。
事先收集狗粪便并立即冷冻。将用于本实验的等分试样解冻一次。在最大设置下，在涡旋仪上在混合锆珠管(1.2g 0.1mm+1.2g 0.5mm)中珠磨10分钟。裂解并添加DNA结合溶液后，合并所有上清液。从每个管中回收到约800μl，但重新分装了750μl以进行抑制剂去除步骤。所有的NH4Oac浓度均为与十二水合硫酸铝铵(AASD)混合后的浓度。
A B C D E F
输入 0.2g冷冻狗粪便 X X X X X X
裂解，650μl 1M NaSCN+0.2M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> X X X X X X
6.5μl beta-ME X X X X X X
6.5μl蛋白酶抑制剂 X X X X X X
DNA结合(350μl) DNA结合溶液 X X X X X X
抑制剂去除(150μl) 水 X
0.06M AASD X X X X X
3.75M NH<sub>4</sub>OAc X
0.9375M NH<sub>4</sub>OAc X
0.46875M NH<sub>4</sub>OAc X
0.234375M NH<sub>4</sub>OAc X
DNA洗涤 DNA洗涤溶液I X X X X X X
DNA洗涤溶液II X X X X X X
DNA洗脱 DNA洗脱溶液 X X X X X X
RNA结合(750μl) RNA结合溶液I X X X X X X
RNA洗涤 RNA洗涤溶液 X X X X X X
乙醇 X X X X X X
RNA洗脱 不含RNA酶的水 X X X X X X
蛋白质结合(1400μl) 蛋白质结合溶液 X X X X X X
蛋白质洗涤 蛋白质洗涤溶液 X X X X X X
蛋白质洗脱 蛋白质洗脱溶液 X X X X X X
分离的核酸的产量和纯度示于下表：
NanoDrops
样品 DNA(ng/uL) A260/A280 A260/A230 A340
A 104.416 1.825 0.438 0.007
A 95.522 1.831 1.109 0.043
B 85.73 1.839 0.517 0.025
B 101.538 1.82 0.442 0.019
C 53.212 1.837 0.169 0.038
C 46.831 1.862 0.568 -0.039
D 90.398 1.874 0.145 0.119
D 95.833 1.83 0.683 0.023
E 100.071 1.823 1.028 0.021
E 103.32 1.827 1.514 -0.008
F 103.579 1.82 0.904 0.014
F 99.634 1.974 0.497 21.406
样品 RNA(ng/uL) A260/A280 A260/A230 A340
A 278.767 2.052 0.986 21.997
A 316.745 1.983 1.059 0.551
B 344.048 1.996 1.137 0.471
B 307.839 1.993 0.971 0.407
C 394.183 2.001 1.21 0.582
C 389.246 2.003 1.18 0.649
D 364.583 1.995 1.163 0.991
D 314.102 1.995 1.066 0.524
E 363.972 1.998 0.69 0.602
E 329.715 2.009 1.024 0.502
F 365.367 2.01 1.086 0.506
F 335.324 2 1.095 0.426
DNA Qubits
Figure BDA0002854500000000361
上表中的结果是使用INVITROGENTM QUBITTM荧光计(英杰公司)遵循供应商的说明书得到的。
分离的DNA、RNA和蛋白质的凝胶电泳分别示于图2中的上图、中图和下图。
结果显示，3.75M乙酸铵导致大量DNA损失并减少DNA结合。当乙酸铵的用量为0.9375M或更少时，DNA、RNA和蛋白质的分离均得到改善，以匹敌或超过对照(3.75M乙酸铵)。对于A260/A230至少为1.0的所有核酸和蛋白质而言，DNA的最佳产量是E(0.234375M的乙酸铵)，RNA的最佳产量是D(0.46875M的乙酸铵)。
实施例3
从土壤样品中分离DNA
本实施例考察不同的裂解和/或抑制剂去除方法对从土壤样品中分离DNA的影响。
如下表所示进行DNA分离。除对照(样品5)外，所有样品均一式四份。
1 2 3 4 5
输入 花园土壤(VVG),0.25g x x x x x
裂解 Zymo ZR BashingBead裂解管 x x x
0.7mm石榴石珠(凯杰公司) x x
PowerLyzer(2,500RPM；45secs) x
PowerLyzer(1,800RPM；5min) x
涡旋仪 x x x
0.18M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>,810μl x x x x
Lysis solution I,750μl x
Lysis solution II,60μl x
抑制剂去除 3.75M NH<sub>4</sub>OAc,0.096M AASD；250μl x x x x
3.8M NH<sub>4</sub>OAc,250μl x
0.12M AASD,200μl x
DNA结合 DNA结合溶液II,1200μl x x x x x
DNA洗涤 DNA洗涤溶液II,500μl x x x x x
DNA洗脱 DNA洗脱溶液,100μl x x x x x
花园土壤(VVG)：一种非常肥沃的花园土壤，其中含有高浓度的PCR抑制化合物。
分离的DNA的产量和纯度示于下表。
Figure BDA0002854500000000381
平均DNA产量
Figure BDA0002854500000000382
分离的DNA的凝胶电泳示于图3。
结果显示，样品1和3的条件以最少量的DNA剪切实现了最高的DNA产量。PowerLyzer未显著提高DNA产量，但可以节省通常花费在珠磨上的时间。样品2实现了最高的产量，但DNA呈较小的片段。这些样品的纯度非常好，因为在抑制剂去除前裂解物几乎是黑色的。样品4使用石榴石珠。锆珠管的表现比这些样品高出20ng/μl(2μg)。样品5是常规方案，用作对照。这些实验显示，DNA产量可以提高250％。
实施例4
不同的裂解缓冲液对从土壤样品中分离DNA的影响
本实施例考察不同的裂解缓冲液对从土壤样品中分离DNA的影响。
如下表所示进行DNA分离。所有样品均一式两份。在任何一个节点上都没有将样品合并。
1 2 3 4 5
输入 花园土壤(VVG),0.25g x x x x x
裂解 Zymo ZR BashingBead裂解管 x x x x
0.7mm石榴石珠(凯杰公司) x
1M NaSCN,0.18M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>,810μl x
1M NH<sub>4</sub>SCN,0.18M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>,810μl x
0.1M Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>,0.18M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>,810μl x
0.18M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>,810μl x
裂解溶液I,750μl x
裂解溶液II,60μl x
抑制剂去除 3.75M NH<sub>4</sub>OAc,0.096M AASD；250μl x x x x
3.8M NH<sub>4</sub>OAc,250μl x
0.12M AASD,200μl x
DNA结合 DNA结合溶液II,1200μl x x x x
DNA结合溶液III,700μl x
DNA洗涤 DNA洗涤溶液II,500μl x x x x x
DNA洗脱 DNA洗脱溶液,100μl x x x x x
分离的DNA的产量和纯度示于下表。
Figure BDA0002854500000000401
分离的DNA的凝胶电泳示于图4。
结果显示，样品1的DNA似乎具有比仅含磷酸盐的对照(样品4)更高的DNA产量，表明在仅含磷酸盐的裂解缓冲液中添加NaSCN提高了DNA产量。样品2的DNA产量难以通过凝胶和nanodrop确定，因为DNA结合溶液III中的乙醇同样会导致RNA结合。样品3实现了有质量的DNA。
实施例5
不同的裂解缓冲液对从粪便样品中分离DNA的影响
本实施例考察不同的裂解缓冲液对从土壤样品中分离DNA的影响。
所有样品均一式两份，并且如下表所示分两部分处理。所有样品均在裂解后合并。分配540uL至每个样品。
第1部分
1 2 3 4 5
输入 狗粪便,0.2g x x x x x
裂解 1.2g 0.1mm+1.2g 0.5mm珠粒(MOBIO) x x x x x
0.18M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>,810μl x x x x
1M NaSCN,0.18M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>,810μl x
抑制剂去除 3.75M NH<sub>4</sub>OAc,0.096M AASD；250μl x x
DNA结合 DNA结合溶液I,500μl x x x
DNA结合溶液II,1200μl x x
DNA洗涤 DNA洗涤溶液I,650μl x x x
DNA洗涤溶液II,500μl x x x x x
DNA洗脱 DNA洗脱溶液,100μl x x x x x
第2部分
6 7 8
输入 狗粪便,0.2g x x
来自P1的BT 1 x
裂解 1.2g 0.1mm+1.2g 0.5mm珠粒(MOBIO) x
0.7mm石榴石珠(凯杰公司) x
裂解溶液I,750μl x
裂解溶液II,60μl x
1M NaSCN+0.18M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>,810μl x x
DNA结合 DNA结合溶液II,1200μl x
DNA结合溶液I,500μl x x
DNA洗涤 DNA洗涤溶液I,650μl x x
DNA洗涤溶液II,500μl x x x
DNA洗脱 DNA洗脱溶液,100μl x x x
“来自P1的BT 1”是指第1组中的珠管组合物(包含缓冲液)(1.2g 0.1mm和1.2g0.5mm珠子粒+0.18M磷酸盐)。在第8组中使用相同的珠管，但在裂解和去除上清液后，将1MNaSCN+0.18M Na2HPO4加回到珠管中，以检查DNA(如果在裂解步骤中释放)可否溶解。
分离的DNA的凝胶电泳示于图5。
结果显示，粪便样品中的微生物裂解似乎需要NaSCN。具体而言，从在裂解溶液中除了磷酸盐之外还含有NaSCN的样品5和7中分离出了DNA，而从在裂解溶液中不含NaSCN的其他样品中分离出很少的DNA。
实施例6
关于从粪便样品中分离DNA，在不同试剂盒之间进行比较
本实施例关于从粪便样品中分离DNA，在不同的市售试剂盒(测试1～3)和本公开的示例性方法(“新技术”，测试4)之间进行比较。
所有样品均一式三份。遵循各试剂盒方案。珠磨在所有试剂盒之间标准化。珠管以最大速度匀浆10分钟。
Figure BDA0002854500000000421
Figure BDA0002854500000000431
名称“O”和“Y”对应于来自老年“O”和青年“Y”供体的人粪便样本。“老年”供体为65岁以上，“青年”供体不满50岁。
ZymoBIOMICS DNA小型制备试剂盒样品A将Zymo-Spin IV旋转过滤器堵塞。将样品分到2个旋转过滤器中，并在离心后重组裂解物。
分离的DNA的凝胶电泳示于图6A(ZymoBIOMICS DNA小型制备试剂盒)、图6B(PureLInk微生物组DNA纯化试剂盒)、图6C(MO BIO Power Soil)和图6D(新技术)。
用Nanodrop测得的、用不同试剂盒分离的DNA的浓度示于下表和图6E。
PureLink微生物组PowerSoil DNA分离
Figure BDA0002854500000000432
***平均值采用经校正的ng/uL
用Qubit测得的、用不同试剂盒分离的DNA的纯度和浓度示于下表和图6F。
Figure BDA0002854500000000441
*粗体的数值表示最佳比例
PureLink微生物组PowerSoil DNA分离
Figure BDA0002854500000000442
结果显示，根据本公开的新技术实现了所有试剂盒中最高的DNA产量。尤其是，从老年粪便样品中分离DNA时，这项新技术的表现比所有其他试剂盒高出超过400％。
实施例7
用其他三价金属盐从土壤样品中去除抑制剂
本实施例在从土壤样品中去除抑制剂方面，测试了与十二水合硫酸铝铵类似的其他三价金属盐。
所有样品均一式两份，并且在抑制剂去除之前合并。
1 2 3 4 5
输入 土壤样品(LCC),0.25g x x x x x
裂解 1.2g 0.1mm+1.2g 0.5mm陶瓷珠(MOBIO) x x x x x
1M NaSCN,0.18M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>,800μl x x x x x
抑制剂去除 3.75M NH<sub>4</sub>OAc,0.096M ErOAc,200μl x
3.75M NH<sub>4</sub>OAc,0.096M AICl<sub>3</sub>,200μl x
3.75M NH<sub>4</sub>OAc,0.096M HoCl<sub>3</sub>,200μl x
3.75M NH<sub>4</sub>OAc,0.096M ErCl<sub>3</sub>,200μl x
3.75M NH<sub>4</sub>OAc,0.096M AASD,200μl x
DNA结合 DNA结合溶液I,450μl x x x x x
DNA洗涤 DNA洗涤溶液I,650μl x x x x x
DNA洗涤溶液II,650μl x x x x x
DNA洗脱 DNA洗脱溶液,100μl x x x x x
LCC：来自拉科斯塔峡谷的土壤样品。这是PCR抑制剂含量非常高的中高生物质土壤。
分离的DNA的产量和纯度示于下表。
Figure BDA0002854500000000451
分离的DNA的凝胶电泳示于图7。
如下所述的PCR用于定量分离的DNA中的抑制。
Figure BDA0002854500000000461
Figure BDA0002854500000000462
PCR循环如下所述执行：95℃下5分钟，以及95℃下15秒钟和60℃下30秒钟的45个循环。
结果如下表所示。
结果5μl
Figure BDA0002854500000000471
结果显示，所有测试的三价金属盐均以不同的DNA损失程度比AASD更有效地去除土壤抑制剂。AlCl3(测试2)去除了最多量的抑制剂并同时去除了最少量的DNA。
实施例8
用不同的裂解试剂和抑制剂去除溶液从土壤样品中分离DNA和RNA
本实施例显示不同的裂解溶液和抑制剂去除对从土壤样品中分离DNA和RNA的影响。
方案：
-在珠管中加入0.25g土壤，
-加入650uL的裂解试剂II(管1～4)或810uL的裂解试剂I(管5～7)，
-加入7uL的beta-ME和100uL的苯酚(管1～7)，
-在涡旋仪上以高档匀浆10分钟，
-去除上清液并置于新管中，并且
-加入150uL的0.12M AASD(管1～4)或250uL的3.75M NH4OAc、96mM AASD(管5～7)，孵育5分钟，旋转，去除上清液。
结合DNA：
-加入等体积的DNA结合溶液IV(管1～4)或等体积的DNA结合溶液I，并且
-将750uL置于离心柱中，离心，将流出物保存在其他2mL管中(即RNA流出物)；重复直到所有裂解物都流过离心柱。
结合RNA：
-在5mL管中加入等体积的100％乙醇(约1mL)以结合RNA，并且
-将750uL置于离心柱中，离心；重复直到所有裂解物都流过离心柱。
洗涤DNA/RNA：
-用650ul的RNA洗涤溶液洗涤离心柱，然后用650ul的乙醇(管1～4)洗涤离心柱或用600ul的DNA洗涤溶液I洗涤离心柱，然后用600ul的DNA洗涤溶液II洗涤离心柱。
-以10,000旋转干燥2分钟，并且
-将旋转过滤器加入新管，并且
-在100uL H2O中洗脱DNA/RNA(管1～7)
Figure BDA0002854500000000491
结果示于图8。具体而言，图8的左上图是分离的DNA的凝胶电泳；左下图是分离的RNA的凝胶电泳；右上表是分离的DNA的产量和纯度；右下表是分离的RNA的产量和纯度。
结果显示，与使用裂解溶液II与AASD的组合的DNA和RNA产量相比，使用裂解溶液I与包含乙酸铵和AASD的抑制剂去除溶液的组合的DNA和RNA产量明显更高。
实施例9
用氯化铝从土壤样品中去除抑制剂
本实施例显示，氯化铝在从土壤样品中去除抑制剂方面是有效的。
样品1和3由5个重复构成，而样品2和4一式两份。
1x5 2 3x5 4
输入 VVG,0.25g x x
LCC,0.25g x x
裂解 1.2g 0.1mm+1.2g 0.5mm陶瓷珠(MOBIO) x x x x
1M NaSCN,0.18M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>,800μl x x x x
抑制剂去除 3.75M NH<sub>4</sub>OAc,0.096M AICl<sub>3</sub>,200μl x x
3.75M NH<sub>4</sub>OAc,0.096M AASD,200μl x x
DNA结合 DNA结合溶液I,450μl x x x x
DNA洗涤 DNA洗涤溶液I,650μl x x x x
DNA洗涤溶液II,650μl x x x x
DNA洗脱 DNA洗脱溶液,100μl x x x x
分离的DNA的产量和纯度示于下表。
Figure BDA0002854500000000501
Figure BDA0002854500000000511
分离的DNA的凝胶电泳示于图9。
如下所述的PCR用于定量分离的DNA中的抑制。
Figure BDA0002854500000000512
Figure BDA0002854500000000513
PCR循环如下所述执行：95℃下5分钟，以及95℃下15秒钟和60℃下30秒钟的45个循环。
结果如下表所示。
结果5μl
Figure BDA0002854500000000521
结果显示，在两种土壤种类中，AlCl3都实现了等同于对照(AASD)的DNA产量。AlCl3在VVG中实现了3.8～1的dCt，在LCC中实现了5～0.5的dCt，表明AlCl3在从两种土壤样品中去除PCR抑制化合物方面比AASD更有效。
实施例10
乙酸钾和硫酸铵对从土壤样品中分离DNA的影响
本实施例考察乙酸钾和硫酸铵对从土壤样品中分离DNA的影响。
如下表所示进行DNA分离。所有样品均一式两份。
D1a D1b D3a 0
花园土壤(VVG),0.25g x x x x
0.7mm石榴石珠 x x x x
裂解溶液I,750μl x x x x
裂解溶液II,60μl x x x x
33.6mM KOAc,250μl x
33.6mM KOAc,3.8M NH<sub>4</sub>OAc,250μl x
3.8M硫酸铵,250μl x
3.8M乙酸铵,250μl x
0.12M AASD,200μl x x x x
DNA结合溶液II,1200μl x x x x
DNA洗涤溶液I,500μl x x x x
DNA洗脱溶液,100μl x x x x
分离的DNA的凝胶电泳示于图10。
用Nanodrop测得的分离的DNA的产量和纯度示于下表：
Figure BDA0002854500000000541
结果显示，由实验D1b和D3a得到的DNA产量和纯度与对照实验0相似，而实验D1a产生了较少的DNA。因此，硫酸铵对于从土壤样品中分离DNA具有与乙酸铵类似的影响，而乙酸钾产生了比乙酸铵更少的DNA。
实施例11
乙酸钠和氯化钠对从土壤样品中分离DNA的影响
本实施例考察乙酸钠和氯化钠对从土壤样品中分离DNA的影响。
如下表所示进行DNA分离。所有样品均一式两份。所有相似样品(1～6)均在珠磨后合并。分配550uL至每个收集管。
1 2 3 4 5 6 7
输入 花园土壤(VVG),0.25g x x x x x x x
裂解 石榴石珠管 x x x x x x x
裂解溶液II,60μl x
抑制剂去除 1.87M NaOAc,250μl x
3.75M NaOAc,250μl x
7.5M NaOAc,250μl x
3.75M NaCl,250μl x
5M NaCl,250μl x
3.8M NH<sub>4</sub>OAc,250μl x x
0.12M AASD,200μl x x x x x x x
DNA结合 DNA结合溶液II,1200μl x x x x x x x
DNA洗涤 DNA洗涤溶液I,500μl x x x x x x x
DNA洗脱 DNA洗脱溶液,100μl x x x x x x x
分离的DNA的凝胶电泳示于图11。
用Nanodrop测得的分离的DNA的产量和纯度示于下表：
Figure BDA0002854500000000561
结果显示，以测试浓度使用乙酸钠(实验1～3)的DNA产量与在不包括裂解溶液II的情况下使用乙酸铵(实验6)的DNA产量相似，而以测试浓度使用氯化钠(实验4和5)的DNA产量比在不包括裂解溶液II的情况下使用乙酸铵(实验6)的DNA产量低。实验6和7的比较表明，在DNA分离过程中包括裂解溶液II会降低DNA产量。
实施例12
乙酸铯和氯化铯对从土壤样品中分离DNA的影响
本实施例考察乙酸铯和氯化铯对从土壤样品中分离DNA的影响。
如下表所示进行DNA分离。所有样品均一式两份。所有相似样品(1～7)均在珠磨后合并。分配550uL至每个收集管。
1 2 3 4 5 6 7 8
输入 花园土壤(VVG),0.25g x x x x x x x x
裂解 石榴石珠管 x x x x x x x x
裂解溶液II,60μl x
抑制剂去除 1.87M CsOAc,250μl x
3.75M CsOAc,250μl x
7.5M CsOAc,250μl x
1.87M CsCl,250μl x
3.75M CsCl,250μl x
7.5M CsCl,250μl x
3.8M NH<sub>4</sub>OAc,250μl x x
0.12M AASD,200μl x x x x x x x x
DNA结合 DNA结合溶液II,1200μl x x x x x x x x
DNA洗涤 DNA洗涤溶液I,500μl x x x x x x x x
DNA洗脱 DNA洗脱溶液,100μl x x x x x x x x
分离的DNA的凝胶电泳示于图12。
用Nanodrop测得的分离的DNA的产量和纯度示于下表：
Figure BDA0002854500000000571
结果显示，在提高的乙酸铯浓度下(实验1～3)，DNA产量下降。在测试的最低浓度下(实验1)，乙酸铯实现了比使用乙酸铵而非裂解溶液II的对照(实验7)更高的DNA产量。在测试的任何CsCl浓度下均未分离出DNA。
实施例13
从土壤或粪便样品中分离DNA的示例性方法
本实施例描述了根据本公开的从土壤或粪便样品中分离DNA的示例性方法。
方案概述
通过化学和机械匀浆来裂解土壤或粪便样品在含有样品的混合锆珠管中加入裂解缓冲液。可以使用带有珠管适配器的标准台式涡旋仪或高功率的组织匀浆器(TissueLyzer)进行珠磨。然后对粗裂解物进行单步沉淀反应，以去除PCR和RT-PCR抑制化合物。去除抑制剂后，将纯化的裂解物与DNA结合溶液混合，并通过二氧化硅旋转滤膜。用两步洗涤方案洗涤膜。然后用DNA洗脱缓冲液将结合于二氧化硅的DNA洗脱。
具体方案
裂解：
1.在钇稳定锆混合珠管(例如0.1和0.5mm珠粒，各1克)中加入至多250mg的土壤(或粪便)。
2.加入800μl裂解缓冲液(例如含有NaSCN和Na2HPO4的缓冲液)。
3.以高档涡旋混合。
4.以最大速度珠磨10分钟。
5.将珠管以15,000×g离心1分钟。
6.将上清液(预期为550μl)转移至新收集管。
抑制剂去除：
7.加入200μl抑制剂去除溶液(例如含有NH4OAc和AlCl3的溶液)。
8.以高档涡旋混合。
9.将管以15,000×g离心1分钟。
10.将上清液(预期为650μl)转移至新收集管。
DNA结合：
11.加入450μl的DNA结合溶液I。
12.以高档涡旋混合。
13.将550μl上样至离心柱。
14.将离心柱以15,000×g离心1分钟。舍弃流出物。
15.将剩余体积的裂解物上样至离心柱。
16.将离心柱以15,000×g离心1分钟。舍弃流出物。
DNA洗涤：
17.在离心柱中加入650μl的DNA洗涤溶液I。
18.将离心柱以15,000×g离心1分钟。舍弃流出物。
19.在离心柱中加入500μl的DNA洗涤溶液II。
20.将离心柱以15,000×g离心1分钟。舍弃流出物。
21.将空离心柱以15,000×g离心2分钟。
22.将离心柱转移至新收集管。
DNA洗脱：
23.向离心柱膜的中心加入100μl的DNA洗脱溶液。
24.将离心柱以15,000×g离心1分钟。舍弃离心柱。
实施例14
从土壤样品中分离DNA和RNA的示例性方法
本实施例描述了根据本公开的从土壤样品中分离DNA和RNA的示例性方法。
方案概述
通过化学和机械匀浆来裂解至多250mg土壤。在含有样品的混合锆珠管中加入裂解缓冲液。可以使用带有珠管适配器的标准台式涡旋仪或高功率的组织匀浆器(TissueLyzer)进行珠磨。然后对粗裂解物进行单步沉淀反应，以去除PCR和RT-PCR抑制化合物。去除抑制剂后，将纯化的裂解物与DNA结合溶液混合，并通过二氧化硅旋转滤膜。在DNA流出物中加入等体积的异丙醇，并将该溶液流过第二离心柱以捕获总RNA。用两步洗涤方案洗涤两张膜。然后将结合于二氧化硅的DNA和RNA洗脱。
具体方案
裂解：
1.在钇稳定锆混合珠管(例如0.1和0.5mm珠粒，各1克)中加入至多250mg的土壤。
2.加入800μl裂解缓冲液(例如含有NaSCN和Na2HPO4的缓冲液)、7μl的β-巯基乙醇和100μl的苯酚-氯仿-异戊醇(PIC)，用pH 8.0的Tris缓冲液平衡。
3.以高档涡旋混合。
4.以最大速度珠磨10分钟。
5.将珠管以15,000×g离心1分钟。
6.将上清液(预期为500μl)转移至新收集管。
抑制剂去除：
7.加入250μl抑制剂去除溶液(例如含有NH4OAc和AlCl3的溶液)。
8.以高档涡旋混合。
9.将管以15,000×g离心1分钟。
10.将上清液(预期为650μl)转移至新收集管。
DNA结合：
11.加入450μl的DNA结合溶液I。
12.以高档涡旋混合。
13.将550μl上样至离心柱。
14.将离心柱以15,000×g离心1分钟。保留含RNA的流出物。
15.将剩余体积的裂解物上样至离心柱。
16.将离心柱以15,000×g离心1分钟。保留含RNA的流出物。
17.在分离RNA时，将固定有DNA的离心柱置于+4℃下。
RNA结合：
18.在上文中保留的离心柱流出物中加入1000μl异丙醇。
19.将750μl含RNA的裂解物上样至离心柱。
20.将离心柱以15,000×g离心1分钟。舍弃流出物。
21.重复进行裂解物上样和离心，直至所有裂解物均已通过离心柱进行了处理。
DNA和RNA洗涤：
22.在离心柱中加入650μl的DNA洗涤溶液I。
23.将离心柱以15,000×g离心1分钟。舍弃流出物。
24.在离心柱中加入650μl的DNA洗涤溶液2。
25.将离心柱以15,000×g离心1分钟。舍弃流出物。
26.将空离心柱以15,000×g离心2分钟。
27.将离心柱转移至新收集管。
DNA洗脱：
28.向离心柱膜的中心加入100μl的DNA洗脱溶液。
29.将离心柱以15,000×g离心1分钟。舍弃离心柱。
RNA洗脱：
30.向离心柱膜的中心加入100μl不含RNA酶的水。
31.将离心柱以15,000×g离心1分钟。舍弃离心柱。
也可以组合上述所述各种实施方式以提供其它实施方式。本说明书中提及的和/或列于申请数据表单中的所有美国专利、美国专利申请公开文本、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开文本，包括2018年4月24日提交的美国临时专利申请第62/662,063号，均通过引用其全文纳入本文，除非引用文献或其一部分与本公开内容相抵触。所述实施方式的各方面可被修改，必要时可应用各种专利、申请和出版物的概念，以提供更多的实施方式。
根据上述详细说明可对实施方式进行这些和其它改变。总体而言，权利要求中所用的术语应不被认为是将权利要求限制到本说明书和权利要求中公开的具体的实施方式，而应认为是包括遵循与所列权利要求等同的完全范围的所有可能的实施方式。因此，权利要求并不受本公开内容限制。

Claims (72)

1.一种从样品中分离核酸的方法，包括：
(a)使样品、样品的裂解物或裂解物的上清液、或者样品、裂解物或上清液的一部分与选自乙酸铵、硫酸铵、乙酸钾、乙酸钠、氯化钠、乙酸铯及其组合的一种或多种第一试剂以及选自氯化铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化铪(IV)、氯化锆(IV)及其组合的一种或多种第二试剂接触，得到混合物；
(b)将步骤(a)的混合物分离为固相和液相，其中一种或多种第二试剂主要位于固相中；以及
(c)从步骤(b)的液相中分离核酸。
2.如权利要求1所述的方法，其中第一试剂是乙酸铵，并且第二试剂是氯化铝。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中步骤(a)的混合物中的一种或多种第一试剂的总浓度为0.1～3M、例如0.1～0.25M、0.1～0.5M、0.1～1M、0.1～1.5M、0.1～2M、0.1～2.5M、0.1～3M、0.25～0.5M、0.5～1M、1～1.5M、1.5～2M、2～2.5M、2.5～3M、0.25～1M、0.25～1.5M、0.25～2M、0.25～2.5M、0.25～3M、0.5～1.5M、0.5～2M、0.5～2.5M、0.5～3M、1～2M、1～2.5M、1～3M、2～3M，优选为0.5～2.5M或1～2M。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中步骤(a)的混合物中的一种或多种第二试剂的总浓度在1～150mM、例如1～5mM、5～25mM、25～50mM、50～75mM、75～100mM、100～150mM、1～25mM、1～50mM、1～75mM、1～100mM、1～150mM、5～50mM、5～75mM、5～100mM、5～150mM、25～75mM、25～100mM、25～150mM、50～100mM、50～150mM、75～150mM、优选5～25mM或5～50mM的范围内。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中步骤(c)中分离的核酸包含DNA、RNA或两者。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中样品是粪便样品、植物样品或环境样品，优选土壤、水或空气样品。
7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其中步骤(a)通过使样品、样品的裂解物或裂解物的上清液、或者样品、裂解物或上清液的一部分与包含一种或多种第一试剂以及一种或多种第二试剂的组合物接触来进行。
8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中在使样品、样品的裂解物或裂解物的上清液与一种或多种第一试剂接触和使样品、样品的裂解物或裂解物的上清液与一种或多种第二试剂接触之间，不进行沉淀、离心或过滤。
9.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括：
(a)(1)使样品、样品的裂解物或裂解物的上清液与一种或多种第一试剂接触，以产生混合物；
(a)(2)将步骤(a)(1)的混合物沉淀、离心或过滤，得到液相；以及
(a)(3)使(a)(2)的液相与一种或多种第二试剂接触。
10.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其中步骤(a)在裂解试剂的存在下进行。
11.如权利要求10所述的方法，其中裂解试剂包含离液剂，该离液剂选自硫氰酸钠、碳酸钠、硫氰酸铵、硫氰酸钾、硫氰酸锂、高氯酸锂、硫酸胍及其组合。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中裂解试剂还包含一种或多种磷酸盐。
13.如权利要求12所述的方法，其中磷酸盐具有以下一个或多个特征：
a)其是磷酸氢盐；
b)磷酸盐中的阳离子部分选自铵、钠、钾或锂；
c)其是磷酸氢二钠。
14.如权利要求10所述的方法，其中裂解试剂包含硫氰酸钠和磷酸氢二钠。
15.如权利要求10～14中任一项所述的方法，其中进一步包括使样品或样品的一部分与裂解试剂接触以产生样品的裂解物，其中步骤(a)包括使样品的裂解物、裂解物的上清液、或者裂解物或上清液的一部分与一种或多种第一试剂以及一种或多种第二试剂接触。
16.如权利要求11～15中任一项所述的方法，其中裂解试剂中的一种或多种离液剂的总浓度在0.05～5M、0.05～0.1M、0.1～0.5M、0.5～1M、1～1.5M、1.5～2M、2～5M、0.1～1M、0.1～1.5M、0.1～2M、0.1～5M、0.5～1.5M、0.5～2M、0.5～5M、1～2M或1～5M、优选0.05～0.5M或0.5～2M的范围内。
17.如权利要求11～16中任一项所述的方法，其中裂解物中的一种或多种离液剂的总终浓度为0.01～4M、0.01～0.05M、0.05～0.1M、0.1～0.5M、0.5～1M、1～1.5M、1.5～2M、2～4M、0.01～0.1M、0.01～0.5M、0.01～1M、0.01～1.5M、0.01～2M、0.01～4M、0.05～0.5M、0.05～1M、0.05～1.5M、0.05～2M、0.05～2M、0.05～4M、0.1～1M、0.1～1.5M、0.1～2M、0.1～4M、0.5～1.5M、0.5～2M、0.5～4M、1～2M或1～4M，优选为0.05～0.5M或0.5～2M。
18.如权利要求12～17中任一项所述的方法，其中裂解试剂中的一种或多种磷酸盐的总浓度为0.05～0.5M，优选为0.1～0.2M。
19.如权利要求12～18中任一项所述的方法，其中裂解物中的一种或多种磷酸盐的总终浓度为0.01～0.4M，优选为0.1～0.2M。
20.如权利要求1～19中任一项所述的方法，其中样品包含与步骤(a)中的一种或多种第二试剂形成复合物的污染物或抑制剂，并且该复合物通过一种或多种第二试剂从步骤(b)的液相中沉淀并去除。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中还包括：
(d)分析步骤(c)中分离的核酸。
22.如权利要求21所述的方法，其中步骤(d)包括PCR、qPCR、RT-PCR或核酸测序。
23.如权利要求1～22中任一项所述的方法，其中步骤(a)中样品的量少于1克，优选少于0.5克。
24.一种从样品中分离核酸的组合物，其包含以下组分、基本上由以下组分构成、或者由以下组分构成：
(i)一种或多种第一试剂，选自乙酸铵、硫酸铵、乙酸钾、乙酸钠、氯化钠、乙酸铯及其组合，
(ii)一种或多种第二试剂，选自氯化铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化铪(IV)、氯化锆(IV)及其组合，以及
(iii)任选的水。
25.如权利要求24所述的组合物，其中一种或多种第一试剂是乙酸铵、乙酸钠、乙酸铯或其组合，第二试剂是氯化铝。
26.如权利要求24或25所述的组合物，其中所述组合物是水溶液。
27.如权利要求26所述的组合物，其中一种或多种第一试剂的总浓度在0.5～10M、例如0.5～2.5M、2.5～5M、5～7.5M、7.5～10M、0.5～5M、0.5～7.5M、0.5～10M、2.5～7.5M、2.5～10M、5～10M、优选0.5～5M、0.5～7.5M、2.5～5M、2.5～7.5M、1～8M或1.5～7.5M的范围内。
28.如权利要求24～26中任一项所述的组合物，其中一种或多种第二试剂的总浓度在10～500mM、例如10～100mM、100～200mM、200～300mM、300～400mM、400～500mM、100～300mM、100～400mM、100～500mM、200～400mM、200～500mM、300～500mM、优选10～200mM、10～500mM、50～200mM、50～500mM或75～150mM的范围内。
29.一种从样品中分离核酸的试剂盒，包括：
(a)权利要求24～28中任一项所述的组合物，
或
(b)(i)一种或多种第一试剂，选自乙酸铵、硫酸铵、乙酸钾、乙酸钠、氯化钠、乙酸铯及其组合，以及
(ii)一种或多种第二试剂，选自氯化铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化铪(IV)、氯化锆(IV)及其组合。
30.如权利要求29所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括权利要求24～28中任一项所述的组合物。
31.如权利要求29或30所述的试剂盒，其中一种或多种第一试剂是乙酸铵、乙酸钠、乙酸铯或其组合，第二试剂是氯化铝。
32.如权利要求29～31中任一项所述的试剂盒，其中还包括核酸结合性固体支持物。
33.如权利要求29～32中任一项所述的试剂盒，其中还包括选自DNA结合溶液、DNA洗涤溶液、DNA洗脱溶液、RNA结合溶液、RNA洗涤溶液和RNA洗脱溶液的一种或多种溶液。
34.如权利要求29～33中任一项所述的试剂盒，其中还包括裂解试剂。
35.如权利要求34所述的试剂盒，其中裂解试剂包含一种或多种离液剂，该离液剂选自硫氰酸钠、碳酸钠、硫氰酸铵、硫氰酸钾、硫氰酸锂、高氯酸锂、硫酸胍及其组合。
36.如权利要求35所述的试剂盒，其中裂解试剂还包含一种或多种磷酸盐。
37.如权利要求34所述的试剂盒，其中裂解试剂包含磷酸氢二钠和硫氰酸钠。
38.如权利要求35～37中任一项所述的试剂盒，其中裂解试剂中的一种或多种离液剂的总浓度在0.05～5M、0.05～0.1M、0.1～0.5M、0.5～1M、1～1.5M、1.5～2M、2～5M、0.1～1M、0.1～1.5M、0.1～2M、0.1～5M、0.5～1.5M、0.5～2M、0.5～5M、1～2M或1～5M、优选0.05～0.5M或0.5～2M的范围内。
39.如权利要求36～38中任一项所述的试剂盒，其中一种或多种磷酸盐的总浓度为0.05～0.5M，优选为0.1～0.2M。
40.一种从样品制备裂解物的方法，包括：
(a)使样品与包含一种或多种磷酸盐和一种或多种离液剂的裂解试剂接触，以产生裂解物，所述离液剂选自硫氰酸钠、碳酸钠、硫氰酸钾、硫氰酸铵、硫氰酸锂、高氯酸锂、硫酸胍及其组合。
41.如权利要求40所述的方法，其中裂解试剂包含磷酸氢二钠和硫氰酸钠。
42.如权利要求40或41所述的方法，其中裂解试剂中的一种或多种磷酸盐的总浓度在0.05～0.5M、优选0.1～0.2M的范围内。
43.如权利要求40～42中任一项所述的方法，其中裂解物中的一种或多种磷酸盐的总终浓度在0.01～0.4M、优选0.1～0.2M的范围内。
44.如权利要求40～43中任一项所述的方法，其中裂解试剂中的一种或多种离液剂的总浓度在0.05～5M、例如0.05～0.1M、0.1～0.5M、0.5～1M、1～1.5M、1.5～2M、2～5M、0.1～1M、0.1～1.5M、0.1～2M、0.1～5M、0.5～1.5M、0.5～2M、0.5～5M、1～2M或1～5M、优选0.05～0.5M或0.5～2M的范围内。
45.如权利要求40～44中任一项所述的方法，其中裂解物中的一种或多种离液剂的总浓度在0.01～4M、例如0.01～0.05M、0.05～0.1M、0.1～0.5M、0.5～1M、1～1.5M、1.5～2M、2～4M、0.01～0.1M、0.01～0.5M、0.01～1M、0.01～1.5M、0.01～2M、0.01～4M、0.05～0.5M、0.05～1M、0.05～1.5M、0.05～2M、0.05～2M、0.05～4M、0.1～1M、0.1～1.5M、0.1～2M、0.1～4M、0.5～1.5M、0.5～2M、0.5～4M、1～2M或1～4M、优选0.05～0.5M或0.5～2M的范围内。
46.如权利要求40～45中任一项所述的方法，其中样品是粪便样品、植物样品或环境样品，优选土壤、水或空气样品。
47.如权利要求40～46中任一项所述的方法，其中还包括样品的机械破碎。
48.如权利要求47所述的方法，其中机械破碎用高密度珠粒进行。
49.如权利要求40～48中任一项所述的方法，其中还包括：
(b)使裂解物、裂解物的上清液、或者裂解物或裂解物的上清液的一部分与蛋白质沉淀剂和一种或多种抑制物去除剂接触。
50.如权利要求49所述的方法，其中一种或多种蛋白质沉淀剂选自乙酸铵、硫酸铵、乙酸钾、乙酸钠、氯化钠、乙酸铯及其组合。
51.如权利要求49或50所述的方法，其中一种或多种抑制剂去除剂选自氯化铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化铪(IV)、氯化锆(IV)、硫酸胍及其组合。
52.如权利要求49或50所述的方法，其中一种或多种抑制剂去除剂选自硫酸铝铵、十二水合硫酸铝铵、硫酸铝钾、水合氯化铝、硫酸铝、氧化钙、氯化铁(III)、硫酸铁(II)、铝酸钠、硅酸钠、氯化镁及其组合。
53.如权利要求49至52中任一项所述的方法，其中还包括：
(c)将步骤(b)的混合物离心，从步骤(b)的混合物得到上清液；以及
(d)从步骤(c)的上清液中分离核酸。
54.一种裂解试剂，包含：
(a)一种或多种离液剂，选自硫氰酸钠、碳酸钠、硫氰酸铵、硫氰酸钾、硫氰酸锂、高氯酸锂、硫酸胍及其组合；以及
(b)一种或多种磷酸盐。
55.如权利要求54所述的裂解试剂，其中裂解试剂包含磷酸氢二钠和硫氰酸钠。
56.如权利要求54或55所述的裂解试剂，其中裂解试剂是溶液，溶液中的一种或多种离液剂的总浓度在0.05～5M、0.05～0.1M、0.1～0.5M、0.5～1M、1～1.5M、1.5～2M、2～5M、0.1～1M、0.1～1.5M、0.1～2M、0.1～5M、0.5～1.5M、0.5～2M、0.5～5M、1～2M或1～5M、优选0.05～0.5M或0.5～2M的范围内。
57.如权利要求54～56中任一项所述的裂解试剂，其中溶液中的一种或多种磷酸盐的总浓度在0.05～0.5M、优选0.1～0.2M的范围内。
58.一种从样品制备裂解物的试剂盒，包括：
(i)(a)如权利要求54～57中任一项所述的裂解试剂；
或
(b)(1)一种或多种离液剂，选自硫氰酸钠、碳酸钠、硫氰酸铵、硫氰酸钾、硫氰酸锂、高氯酸锂、硫酸胍及其组合；以及
(2)一种或多种磷酸盐。
59.如权利要求58所述的试剂盒，其中还包括：
(ii)适合于样品的机械破碎的高密度珠粒。
60.如权利要求58或59所述的试剂盒，其中还包括：
(iii)一种或多种第一试剂，选自氨基酸；短链脂肪酸的盐，如丁酸钠；聚苯乙烯磺酸钠；聚丙烯酸钠；优选硫酸铵、乙醇酸铵、磺基乙酸、甲酸铵、乙酸钠、乙酸铯、乙酸铵、β-丙氨酸、硫酸胍、组氨酸、甘氨酸及其组合。
61.如权利要求58或59所述的试剂盒，其中一种或多种第一试剂选自乙酸铵、硫酸铵、乙酸钾、乙酸钠、氯化钠、乙酸铯及其组合。
62.如权利要求58～61中任一项所述的试剂盒，其中还包括：
(iv)一种或多种第二试剂，选自氯化铝、硫酸铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化锆(IV)、氯化铪(IV)、硫酸铝铵、十二水合硫酸铝铵、硫酸铝钾、水合氯化铝、氧化钙、氯化铁(III)、硫酸铁(II)、铝酸钠、硅酸钠、氯化镁及其组合。
63.如权利要求62所述的试剂盒，其中一种或多种第二试剂选自氯化铝、硫酸铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化锆(IV)、氯化铪(IV)及其组合。
64.如权利要求62所述的试剂盒，其中第二试剂是硫酸铝铵或十二水合硫酸铝铵。
65.如权利要求62～64中任一项所述的试剂盒，其中一种或多种第一试剂和一种或多种第二试剂形成组合物。
66.如权利要求65所述的试剂盒，其中所述组合物是溶液。
67.如权利要求66所述的试剂盒，其中溶液中的一种或多种第一试剂的总浓度在0.5M～10M、例如1～8M或1.5～7.5M或0.1～1M、例如0.1～0.75M的范围内。
68.如权利要求66或67所述的试剂盒，其中溶液中的一种或多种第二试剂的总浓度在0.01M～0.5M、0.05～0.2M或0.075～0.15M的范围内。
69.如权利要求58～68中任一项所述的试剂盒，其中还包括核酸结合性固体支持物。
70.如权利要求58～69中任一项所述的试剂盒，其中还包括选自DNA结合溶液、DNA洗涤溶液、DNA洗脱溶液、RNA结合溶液、RNA洗涤溶液和RNA洗脱溶液的一种或多种溶液。
71.如权利要求58～70中任一项所述的试剂盒，其中还包括蛋白质结合性固相。
72.如权利要求58～71中任一项所述的试剂盒，其中还包括蛋白质结合溶液、蛋白质洗涤溶液和蛋白质洗脱溶液中的一种或多种。
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