JPH02503388A - ヘパリンの中和 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般に、ヘパリンを生体内で中和する方法および装置、とくに高い表 面積の基質を使用する方法および装置の分野に関する。

全血で潅流した生体外系は、腎臓、心臓および肺の疾患の処置において多年にわ たって有効な成分であった。不都合なことには、機械、例えば、透析単位装置お よび酸素発生器の人工的表面は、血栓および塞栓の形成を起こし得る。したがっ て、医師は血液の適合性を与えるために全身＋７）ヘパリン化に頼らなくてはな らない。

不都合なことには、ヘパリン、すなわち、交互するＤ−グルコサミンおよびＤ− グルクロン酸のサブユニットから成りかつほぼａ、ｏｏｏ〜２０．０００の分子 量を有するムコ多糖は、多くの患者において出血の合併症に導く。抗凝固技術を 改良する試みに拘らず、多くの患者は、このような装置を使用するとき、脱塩の 合併症を発現する。はぼ２０．Ｏｏｏ、ｏｏｏの生体外の処置のうちで、毎年、 患者の８〜３３％は凝固の異常を発生し、それらのあるものは生命に危険を及ぼ す。比較的新しい膜の酸素発生器の使用の増大にともない、より長い連続的潅流 時間を期待することができ、これに関連して、これらのヘパリンの悪化は問題を 引き起こす。ヘパリンを局所的に注入するか、あるいは他の方法でヘパリンを固 定化または除去する試みは、血液凝固の防止に成功せず、あるいは高い血液流速 に関連して作業することができなかった。

ヘパリンを除去または中和することができる血液フィルターの組み込みは、生体 外の回路の抗凝固を可能とするであろうが、ヘパリンへの全身の暴露を制限する 。この型の装置の入手可能性は、前に非常に大きい危険にさらされてきた患者に おいて、人工的器官またはフィルターの使用を可能とするであろう。

米国特許第４．３７３，０２３号（Ｒｏｂｅｒｔ　　Ｓ、Ｌａｎｇｅｒら）は、 固定化したヘパリナーゼを使用して血液中のヘパリンを分解および中和すること を教示している。実施例は、ヘパリナーゼが効果的にアガロースビーズに結合し 、そしてヘパリンと反応することができることを実証している。不都合なことに は、この実施態様を血液について臨床的流速で血液について試みたとき、アガロ ースビーズは充填し、そして装置は不能になった。記載されている装置は、また 、血液処置装置と直列でのみ有用であり、血液処置のために使用する前以て存在 する装置中に組み込むことができない。

他のこのようなはドイツ国公開明細書ＤＥ３４０６５６２Ａ１号（Ｆｒａｕｎｈ ｏｆｅｒ−Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｇｔ　　ｚｕｒ　　Ｆｏｒｄｅｒｕｎｇ　　ｄ ｅｒ　　ａｎｇｅｗａｎｄｔｅｎ　　Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ）により教示されてい る。ヘパリン分解酵素は、２５．０００〜３０．０００以下の分子量を通過させ る粒子サイズを有する膜に化学的に結合する。

この装置は、膜を通過できる血流中のヘパリンを不活性化するように設計される 。不都合なことには、この装置は、ヘパリンが酵素との接触前に多孔質膜を通し て拡散するという要件のために臨床的に望ましい高いヘパリンの転化速度を提供 しない。この制限は、高い速度、こうして装置内のヘパリンの短い滞留時間を考 慮すると、とくに厳しい。

したがって、本発明の目的は、生体外装置の流出液から臨床的レベルのヘパリン を除去する方法および装置を提供することである。

本発明の他の目的は、血液適合性、機械的安定であり、かつ構造的一体性を有す る支持体材料上に、ヘパリン分解性まＩ；は中和性化合物が固定化されている、 ヘパリンのオンライン除去に有用な前記化合物を利用する、このような方法およ び装置を提供することである。

本発明のなお他の装置は、血液処置ならびにヘパリン除去を可能とする、多目的 装置を提供することである。

発明の要約 本発明は全身のヘパリンまたは低分子量のヘパリン誘導体を排除する方法であり 、ここで固定化された酵素または他のヘパリン分解性または中和性化合物を含有 するは生体外装置の流出液において使用するために構成される。この方法は、生 体内使用のためのパラメーターおよび基準を設計する反応器を包含する。

血液のフィルターは臨床的使用のための特定の厳格なガイドラインを満足しなく てはならない。第１の考慮は系全体の生物適合性である。この装置は、血液溶解 、血小板の凝固、白血球減少、抗体形成を引き起こしてはならず、まＩ；毒性の 副生物を解放してはならない。除去の系は、臨床的血液の流速に適合し、そして 要求される潅流時間より大きい有効寿命をもたなくてはならない。

本発明ｊこおいて有用な化合物は、酵素、例えば、ヘパリナーゼ、グルコネート −リダクターゼ、アルドース−リダクターゼ、ベーターゲルコニダーゼ、０−ス ル７アターゼ、およびＮ−スル７アターゼを包含する。

試験において、ヘパリン除去は抗原性または毒性でなく、また抗原の応答を生成 しないか、あるいは毒性副生物を解放しないことが示された。

他の化合物、例えば、硫酸プロタミンは、同様に、適当な反応器の形状寸法を使 用して有効でろう。

有用な系は臨床的レベルのヘパリンを可変流速で、大人について４ａ／分までか ら乳児について５０ｍＱ／分程度に低い流速で除去しなくてはならず、潅流時間 は新生児の呼吸不全について数時間から２〜ｌＯ日間までである。同時に、いく つかの用途のため、フィルターの体積は最小にして、患者自信の血液供給で回路 を始動できるようにしなくてはならない。最後に、系は病院の人員により操作容 易でなくてはならない。

腎臓透析のために使用される型の再構成したセルロースの中空繊維の装置に、塩 化トレシルまたはＣＮＢｒ技術により、結合したヘパリン除去を使用する特定の 実施態様は開示されている。結合しＩ；酵素の結合および活性の保持を最適化す る方法は、また、開示されている。支持体および化学的結合技術の選択および変 更に加えて、酵素それ自体は結合部位の数（例えば、ヘパリナーゼ中のりジン残 基の数）を増加する。単独であるいは透析または酸素供給（ｏｘｙｇｅｎａｔ　 １ｏｎ）と組み合わせたヘパリン除去に適当な、単一段階または多段階装置が包 含される。

まＩ；、類似の多膜装置が開示されている。

図面の簡単な説明 第１図は、反応速度の逆数（１／Ｖ＠、時間／ｍｇヘパリナーゼ）対反応した基 質の量の逆数（１／Ｓｏ、ｍＱ／ｍｇヘパリン）の流速の関数としてのライヌイ ーバーーパーク（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅ）のプロットである。

第２図は、酵素の安定性を実証する、３７℃およびｐＨ７，４における水性系に おける、正規化した酵素活性対時間（時間）のグラフである。

第３Ａ図は、典型的な透析反応器のヘパリン固定化した内側中空繊維を含有する 本発明による発生の平面図である。

第３Ｂ図は、透析ジャケットをもたず、関心術で使用するより大きい数の繊維を 有する、第３Ａ図の装置の平面図である。

第４図は、腎臓透析装置の出口端における中空繊維のみが固定化ヘパリン除去を 含有する、本発明の２段階装置の平面図である。

第５図は、被覆しない中空繊維が固定化ヘパリン除去を含有する中空繊維から流 体不透過性バリヤーにより分離されている、第４図の装置の態様の平面図である 。

第６図は、ヘパリナーゼが多層の膜シート上に固定化された、本発明による装置 の斜視図である。

発明の詳細な説明 本発明の方法は、ヘパリン中和性または分解性化合物、例えば、ヘパリナーゼを 、血液適合性支持体上に固定化することに関し、前記血液適合性支持体は、５０ 〜ｍＱ／分〜４Ｑ／分の範囲の流速で循環する血液を含有する生体外回路中のヘ パリンの臨床的レベルで、前記化合物の反応を可能とするために十分な表面積、 結合能力、および構造的一体性を有する。

支持体の選択は、次の基準に依存する：支持体は血液適合性でなくてはならない 、すなわち、それは雪性成分を血流中に放出してはならず、それは免疫学的また は血栓発生の応答を誘発してはならず、そしてそれは血液成分のいずれとも反応 してはならない。

支持体材料は、十分な機械的安定性および構造的一体性を有して、ヘパリン分解 化合物のカップリング、貯蔵、およびほぼ５０ｍＱ／分〜４゜０００ｍρ／分の 流速Ｉ：８ける血液循環に耐えなくてはならない。

支持体材料は、ヘパリン分解化合物を十分なレベルでかつ十分活性の保持で結合 して、臨床的値のヘパリンを循環する血液から除去することができなくて１マ′ ならない。

支持体材料は、好ましくは十分表面積を得るために要求されるような、中空繊維 または膜の形態の、アガロース、架橋したデキストラン、ポリヒドロキシエチル メタクリレート、ポリアクリルアミド、セルロース、およびそれらの誘導体また はそれらの組み合わせを包含する。多層膜シートおよび中空繊維をもつ過当な装 置は、腎臓透析ユニットとして商業的に入手可能である。

化合物を固定化するために使用する方法は、支持体と化合物との間の強い結合を 必要する。好ましい冥施態様において、化合物はヘパリンまたはヘパリンの低分 子量誘導体を分解する酵素、例えば、ヘパリナーゼ（ＥＣ−４，２，２，７）で ある。他のヘパリン分解酵素は、次のものを包含するニゲルクロネート−リダク ターゼ（ＥＣ−１，１，１，１９）、０−スルファダーゼ、Ｎ−スルファダーゼ 、ベーターグルクロニダーゼ（ＥＣ−３，２，１，３１）、およびアルドース− リダクターゼ（ＥＣ−１，１，１，２１）。ヘパリンと複合化してその抗凝固活 性を中和する硫酸プロタミンを、また、ある臨床的場合において利用することが できる。２１！当なカップリング方法を決定する基準は、次のとおりである：支 持体から漏れる酵素の最小化、酵素の熱安定性の維持、およびヘパリン除去活性 の最適な保持。この技術は、また、支持体材料を劣化させたり、あるいは生体内 で血液成分と結合する反応性基を支持体上で生成させてはならない。

可能なカップリング方法および支持体を表１に、吸収（溶液中に存在するタンパ ク質の量に関する支持体へ結合したタンパク質のパーセント）、収率（活性を有 する結合した酵素のパーセント）、および活性（吸収×収率に等しい、支持体へ 結合した活性酵素の全体の量）と−緒に記載する。本発明において利用すること ができる他のカップリング方法および支持体は、本発明の詳細な説明から当業者 にとって明らかであろう。

ト メ　　Ｉ ♀　Ｓ 支持体へヘバリナーゼをカップリングする現在好ましい方法は、塩化トリクレジ ルの活性化である。シアン化臭素の活性化、過ヨウ素化、およびカーポジイミダ ゾールの活性化は、また、ある条件下で好ましい。

塩化トリクレジルの活性化は、ＣＮＢｒの活性化より有利であり、この方法はほ とんどの支持体において同様な装置における酵素の固定化に使用される。塩化ト リクレジルは、安定な第二アミン結合をつくる活性化剤である。反応性塩化スル ホニルを使用して樹脂スルホニル誘導体を形成し、次いでこれをすぐれた離脱基 として作用する。この工程は、樹脂のアルコール炭素上で直接第一アミンおよび チオールの親核攻撃を可能として、第二アミン基を形成する。

塩化トリクレジルを使用する活性化およびカップリングは、次のように線図的に 示されるニ ジアン化臭素の活性化は、高度に毒性の試薬を使用してイソ尿素結合をつくり、 この結合はタンパク質またはアミンの溶液中においてのみ適度に安定である。こ の方法を使用して、少量のヘパリナーゼはフィルターから患者の血流中ｌこ滲出 されうる。これが起こると、患者の免疫系は刺激されるが、今日までの研究はこ れがその場合であると思われないことを寅証している。

シアン化臭素のカップリング方法は、次のように線図的に表される＝（ここでＬ −配位子）−活性化： イソ尿素の結合 イミドカーボネート誘導体 他の基準は、経時的活性の保持である。塩化トリクレジル活性された６％の架橋 したアガロースビーズ（ファーマシア・ファイン・ケミカル・カンパニー、ニュ ージャイジー州ビス力タウェイ）およびセルロース（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ、５０ ｆｆｉ）（シグマ・ケミカル・カンパニー、ミゾリー州セントルイス）を使用す る、初期の研究は、すべてのタンパク質の８５〜９７％が結合すること、および 結合した酵素の３３〜５０％が２つの支持体材料上で酵素的に活性であることを 示す、セルロースーヘバリナーゼの４つの異なる試料を使用して、０．７２５モ ルのリン酸ナトリウム、０．１２５モルのＮａＣ１中で３７°Ｃおよびｐｉ（７ ，０（等張リン酸塩緩衝液）において、固定化酵素の熱安定性を試験した。この 研究は、塩化トリクレジル固定化酵素について３５時間の半減期を示唆し、これ はＣＮＢｒ活性化アガロースのそれと有意に異ならない。

酵素と不溶性多糖支持体との間の結合を生成する第３方法は、次の文献に記載さ れている、カーポジイミダゾールの活性化である：Ｍ、Ｔ。

Ｗ、バーン（Ｈｅａｒｎ）、Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔ、１８５．４６３（１９７９） ；Ｒ，Ｓ、チャプマン（Ｃｈａｐｍａｎ）、Ｃ１ｉｎｉｃａＣｈｉｍｉｃａ　Ａ ｃｔａ、ｌ１ｇ、１２９　（１９８２）　；ｃ、　ｓ、ベテル（Ｂｅｔｈｅｌ） ら、Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔ、２１９．３５３　（１９８１）；ｃ、ｓ、ベテル（Ｂ ｅｔｈｅｌ）ら、Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔ、２１９．３６１　（１９８１）、これは ポリマーの主鎖に正味の電化をもたないウレタンエステルを形成する。電化の欠 乏は血液成分の非特異的結合の減少において重要である。カップリングは水性ま たは有機の溶媒中で進行させることができる。活性化カルバメートは経時的に水 に対して比較的安定である、使用されないカルバメートのすべては加水分解して もとのヒドロキシルになる。生成されるウレタン結合は非常に安定であることが 報告されている。

カーポジイミダゾールのカップリング方法は、次のように線図的に示される： 活性化： カルバメート活性化マトリックス Ｌ冨配位子 酵素を支持体へ固定化するなお他の方法は、次の文献ｌ；記載されて（翫る過ヨ ウ素化である：Ｃ，Ｊ、サンダーンン（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ）ら、Ｔｍｍｕｎｏ 　Ｉｏｇｙｓ　２０．１０６１　　（１９７１）およびＪ、ツルコバ（Ｔｕｒｋ ｏｖａ）ら、Ｃ１１ｅｃｔｉｏｎ　　Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖａ　　Ｃｈｅｍ、Ｃ ｏｍｍｕ、４４．３４１１　（１９７９）、これは水性溶媒を使用してカルビノ ールアミンを形成し、支持体の還元のときアルキルアミンを生成する０反応のた めの条件は、温和であり、そして水溶液を使用する利点を有する。実験は、ＣＮ Ｂｒの活性化を使用するよりこの手順を使用すると、非特異的結合の効果はより 少なし１ことを示唆する。

過ヨウ素化カフプリング方法は、次のように線図的に表される：活性化： マトリックス 還元 ここでＬ−配位子 マトリックス 還元 ここで　Ｌ−配位子 酵素と支持体との間の強さは、担体のマトリックスから剪断する酵素の傾向が増 加するために、最大の可能な流速を制限する。酵素の架橋の時には漏れの減少に 有効である。しかしながら、ＣＮＢｒ活性化により形成されるイン尿素をグルタ ルアルデヒドで安定化する標準の手順はヘバリナーゼを不活性化する。

支持体へ結合する酵素のパーセントを増加し、ならびに活性の保持パーセントを 増加する新規なアプローチにおける、酵素上の結合部位の数は増加される。ヘバ リナーゼの場合において、酵素は通常支持体ヘリジン残基により結合する。分子 遺伝学およびタンパク質化学の分野において知られている方法を使用して、タン パク買上のりジン残基の数を増加することができる。好ましい方法において、ヘ パリナーゼをエンコードする遺伝子をクローニングし、そして酵素にリジン残基 の「テイル」を取り付けるヌクレオチド配列を付加する。リジン残基は酵素の活 性部位に位置し、したがって酵素活性において重要な役割を演するので、これは 支持体上の固定化後、酵素の保持を増加する。酵素は、また、同一の方法におい て変性して酵素の特異的活性を増加することができる。

他の流速制限因子は、生体外血液循環の高い流速に暴露したときの、下に横たわ る基質の安定性である。４％のアガロースビーズへＣＮＢｒ活性化により結合さ れＩ；ヘパリナーゼの研究において、２５０ｍ４７分の生体内流速はアガロース ビーズを破裂させた。アガロースの架橋およびアガロースのパーセントの増加は 、床の強さを増加させる。不都合なことには、１０％の架橋したアガロースは生 体内でヘパリンを分解する能力を示さない。１Ω／分以上の流速は、８％の架橋 したアガロースビーズでは不可能である。

酵素の結合の程度、熱安定性、塩化トリクレジル、シアン化臭素の活性化、およ び他の化学物質を使用する活性の保持についての最適な条件は、固定化しＩ；と き、次のようＩニジて測定される。

支持体と酵素との間の化学的強さを決定するために、緩衝液および全血中にタン パク質の最小濃度を測定することが必要である。チロシンアミノ酸の環構造に結 合する＋！＄１を使用する放射線標識を使用して、支持体へ固定化したすべての タンパク質を標識することができる。標識した試料を非標識へパリナーゼで希釈 した後、酵素を支持体へ適当なカップリング方法により結合する。上澄み液を、 インキュページ瀞ンの時間および温度の関数として、放射能について検査する。

このようにして、おだやかｌ；撹拌しながらヘパリナーゼー支持体の相対的強さ を決定することができる。血液の研究を使用して、生理学的流れの状態において 種々の可能な反応器の形状寸法において、結合したヘパリナーゼへの剪断の作用 を検査する。

滲出に対する酵素の安定性は、最適なカップリング方法を選択するときの基準の １つである。塩化トリクレジルおよびＣＮＢｒ活性化支持体の結合は、標識した ［１１１１　］アアルミンの漏れを使用して比較することができる。ＣＮＢｒ活 性化アガロースは、４８時間にわたって、塩化トリクレジル活性化アガロースよ り、０．２モルのトリス、ｐＨ７，８、中で３７℃において固定化タンパク質の １０倍より大きい損失を示す。

酵素活性の損失は、３７℃、ｐＨ７，４の体の条件および生物学的因子に酵素を 延長して暴露する間に起こる。ヘバリナーゼは、温度の増加および極端なｐＨ値 に対して非常に感受性である。活性化の暴露データにおける遊離ヘパリナーゼお よび固定化ヘバリナーゼについての最良の適合線は、時間の関数として、活性の 対数崩壊である：Ｅ＝Ｅａ＊ｅＸ　ｐ（ｋ４＊ｔ） ここでＥは酵素の酵素活性／体積であり、ｋ４は崩壊速度であり、そして ｔはＥ、の初期の活性以来の時間である。

不活性化のプロセスは通常不可逆的であり、そして熱、ｐＨおよび化学的因子に より誘発されるフンフォメーションの変化から生ずる。加熱は酵素のアンフォル ディング（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）のプロセスを促進し、ｐＨは酵素中に存在する 種々のイオン化可能な基の電化を変更し、そして化学的因子は酵素に不可逆的に 結合するか、あるいはそれを分解する。酵素活性の損失は酵素を系中への供給に あると考えなくてはならないので、固定化工程の間の熱安定性の損失は最適なカ ップリング方法の選択おける１つの拘束である。

カップリング方法の最終の分析は、次のものをを包含する：次の３つのパラメー ターの関数として決定される活性の保持の最適化二カップリング溶液のｐＨ，酵 素の配合／支持体体積、および導入される活性された基の数／支持体体積。リン 酸塩緩衝液中における４ａｘｃ２０〜２４時間の接触時間を使用する予備試験は 、塩化トリクレジルの活性化について８．２の最適なｐＨを示す。

結合した酵素活性の最大の保持のためのｐ）（を最適化することが必要である。

ヘバリナーゼの活性は、はぼｐＨ８のより大きいｐａで急速に劣化する。この最 適化は、塊状に必ずしも同等でない微小環境の関数である。最適なｐＨは、酵素 の配合またはトレシレート基の数／支持体体積に不可逆的であるべきである。酵 素の配合および支持体の活性化の程度は、酵素がいったん結合すると、活性化の 保持を最適にすることができる。保持は要求される酵素量／支持体体積および／ 反応器系を決定する。

緩衝液中および全血中の固定化酵素の半減期は、試料を問題の温度（例えば、３ ７℃）において適当な媒質中でインキュベーションすることによって測定される 。支持体の活性は、それがヘバリナーゼを劣化するとき、時間の関数として測定 する。緩衝液において、アッセイは紫外線のアッセイである（Ａ、リンカ−（Ｌ ｉｎｋｅｒ）およびＰ、ホビング（Ｈｏｖｏｎｇｈ）、Ｂｉｏｃｈ、］、２．３ ．４．５．６．８．９および１１．５６３　（１９７２））。全血において、凝 固アッセイを使用する：因子ｘａ％ＡＰＴＴ、ｌ−ロンビン−抗トロンビン１１ Ｌ次の文献に記載されている：Ｅ、Ｔ、イン（Ｙｉｎ）ら、Ｊ、Ｌａｂ、ＣＩ　 ｉｎ。

Ｍｅｄ、８１１８１．２９８　（１９７３）；　Ｊ、Ｗ、ｘステス（Ｅｓｔｅｓ ）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ、Ｒｅｓ、１８．５８（１９７５ ）；Ｌ、Ｈ，ラム（Ｌａｍ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏ ｍｍ、６９．５７０　（１９７６）；およびり、Ｂ。

ジャクニス（Ｊ　ａ　ｃ　ｑ　ｕ　ｅ　ｓ）、Ｐｈａｔｍａｃｏｌ、Ｒｅｖｉｅ ｓｓ３１．９９　（１９８０）。最適な固定化技術は、理想的には、３７℃にお いて結合したヘパリナーゼの熱安定性を減少すべきではない。

ヘバリナーゼは支持体上に種々の活性の保持の程度で固定化することかでさる。

酵素活性の高い収率は、アガロースを使用して（７アーマシア・ファイン・ケミ カル・コーポレーシヨン、ニュージャーシイ州ビス力タウェイ）活性化剤として シアン化臭素を使用して見いだされる。この親木性ビード化ゲルは、膨潤状態の 直径が６０〜１４０ミクロンの球形粒子である。ゲルは５％のアガロースおよび ９６％の水、多孔度９６％、はｌのねじれ、および２０ＸｌＯ’ダルトンの分子 量のカットオフを有する。高度ｌこ多孔質の性質は、支持体内にヘパリンを容易 Ｊ二拡散させる。

アガロースビーズの機械的強さは、アガロースのパーセントを増加するか、ある いはビーズをエビクロロヒドリンまたは２．３−ジブロモプロパノールで、次の 文献の方法を使用して架橋することによって増加することができる。しかしなが ら、アガロースの５０％の増加は、最大使用圧力を２〜４倍増加させる。また、 より高い流速において、前述のように、ビーズの破裂の問題を生ずる。

セルロース樹脂はアガロース支持体より好ましい、セルロースの状態は、生体外 装置、例えば、中空繊維の透析装置ｊこおいて有効に使用されて来ている。セル ロースは、塩化トリクレジル、シアン化臭素、カーポジイミダゾールまたは過ヨ ウ素化で活性化することができる、ヒドロシル官能性を含有する。この樹脂は、 ３７℃において構造的に安定であり、また、高い流速においてさえフィルター中 の使用を可能とする、機械的特性を有する。典型的な血液透析装置は、フィルタ ー構造への損傷が起こる前に、４００ｍｍＨＨのトランスメンブレン圧力に耐え ることができる。

血液透析装置と直列のアガロース反応器は、２５０ｍａＺ分の流速において単一 の通過でヘパリンの４０％を分解する。しかしながら、６０分後、白血球の計数 は典を的には少なくとも１０％だけ減少し、そして血小板は５０％だけ減少する 。白および赤の血栓は、また、フィルター内に形成するが、溶血は存在しない。

アガロースは血小板の凝集のために血液適合性の問題を有することがあるか、あ るいはヘパリンの除去は凝固のカスケードを刺激するように思われる。対照的に 、セルロースはある数の血液濾過装置ｌ：おいて使用されており、そして患者！ ：存意の合併症を引き起こさないで既知の全血の変化を増強する。

はぼ３３〜４９％の間で、ヘパリナーゼの活性は、塩化トリクレジル活性したセ ルロース粒子（Ｓｉｇｍａｃｅ　ＩＬ　５０ｆｆｉ）を使用して保持された。さ らに、ヘバリナーゼーセルロースの熱安定性は３７℃におけるヘパリナーゼーア ガロースのそれに等しい。これらの因子は、セルロースへの寅際的かつ熱的安定 性のカップリングが可能であることを示す。

セルロースは多くの形状、例えば、粒子、膜および繊維で製造されている。細胞 の圧縮可能性を回避する好ましい形態は、限外濾過の目的で典を的に使用されて いる中空繊維のユニットである。

材料の生物適合性１機械的強度、および構造的一体性は、酵素の結合後、再評価 しなくてはならない。生物適合性を研究するために、処置または未処置の材料は 、まず、溶血、白血球減少症、血小板凝集および血栓について生体外検査すべき である。セルロースーヘバリナーゼおよびセルロース単独は、材料を出る形成し た血液成分（赤血球、白血球および血小板）のレベルの当量変化を生成するであ ろう０次いで、機械的強さおよび構造的一体性を試験する。所定の圧力における 血液適合性および一定の最大流速を維持しなくてはならない。

アガロースまたはセルロース以外の支持体材料を利用することができる０例えば 、ポリウレタンは特に血液適合性である。凝固の除去のための現在の血液のフィ ルターのあるものはこの材料を使用する。ポリウレタン固定化ヘバリナーゼは、 凍結乾燥しｌ；精製ヘバリナーゼをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）キャンプ ドトルエンジンシアネートプレボリマーと反応させることによって調製されてき ている。しかしながら、この後者の方法は、結合した酵素による活性のすぐれた 保持をまだ実証していない。

特定の用途のための要求される表面積、反応器の形状寸法、および酵素活性の単 位は、酵素の力学に関する次の等式を使用して概算することができる。いったん モデルの装置が構成されると、装置は当業者ｌ二により実験的に最適化されるこ とができる。

固定化した酵素−支持体の実験研究は、有効速度および力学を使用して開始しな くてはならない。不都合なことには、これらのパラメーターは特定の条件に適合 するだけであり、そして一般に系を記載することができない。固定化酵素の系の 観察される力学の挙動は、分配作用および拡散抵抗により有意に影響を受けるこ とがある。

一般の方法は、外部の拡散、内部の拡散および固定化酵素の力学を処理するため に開発されてきた。生成物および基質の阻害は溶液中で観察されないので、固定 化酵素の力学は、古典的ミカエリスーメンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔ ｅｎ）の法則（Ｋ、Ｊ、ライドラ−（Ｌａｉｄｌｅｒ）８よびＰ、ポンチング（ Ｂｏｎｔｉｎｇ）、酵素作用の化学的力学（Ｔｈｅ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｋ ｉｎｅｔｉｃｓ　　ｏｆ　　Ｅｎｚｙｍ　　Ａｃｔｉｏｌｎ）、第２版（Ｏｘｆ ｏｒｄ　　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　　Ｐｒｅｓｓｓニューヨーク　１９７３）。

これは比定常状態で較的高い濃度においてさえ開いた流れ系であるので、ミカエ リス−メンテンの力学の法則は、古典的酵素の機構を適切に記載する。外部の拡 散は質量移送計数に関係する。このパラメーターは、熱および質量の移送の関係 から種々の形状寸法および流速について容易に定量される。外部の拡散と異なり 、内部の拡散は化学的反応と平行に進行し、したがって除去がより困難である。

一般の方法は種々の可能な形状寸法に適合させることができる。

ミカエリス−メンテンの力学の法則は、次のとおりである：力学的に制御される 反応について、 ｖｋ、、−ｖ、、、＊ｓ／に−［Ｋ、（ａｐｐ）　＋Ｓ］ここでｖ、、、ｈ、酵 素濃度の関数、は線維表面における飽和速度であり、Ｓは塊状の物質濃度であり 、モしてに、　（ａ　ｐ　ｐ）はミカエリス定数である。

Ｖｈ＋−（モル／ｃｍ”５ｅｃ）は、所定の基質濃度についての反応の最大速度 であり、そして基質の拡散が無限に早いとき、固有の反応速度として定義される 。

２つの制限する場合はここで重要である。支持体の壁における基質のレベルＳ０ かに、より非常に高い場合、速度は酵素の配合の関数であり、そして拡散の影響 は存在しない。Ｓｏかに、より非常Ｉ：小さいとき、速度はＳ、において一時で あり、モしてＶ、、、／に、（ａｐｐ）に関係する。

Ｋ、　（ａ　ｐ　ｐ）はコン７ｔメーシヨン、環境および拡散の効果により影響 される。理論は、管を通る流れについて、Ｋ、（ａ　ｐ　ｐ）が次に従い拡散の 抑制の増加とともに増加するであろうことを予測する：に、（ａ　ｐ　ｐ）＝に 、＋（Ｖ、、、／２＊に＋）ここでに、ｈ　ａ力学的パラメーターの拡散自由度 の値である。次いで、観測されるに、　（ａ　ｐ　ｐ）は拡散制限の現象で直線 流速の逆立方フィートとともに変化する。反応速度は、また、Ｋ、　（ａ　ｐ　 ｐ）に逆比例するので、拡散の制御の増加する（低い流速、より大きいＲまたは り、ここでＲは管の半径であり、そしてＬは管の長さである）とともに、低いＳ 、における反応速度は減少する。

これらの結果は全体の反応速度および出口濃度に容易に関係づけられる。生成物 の形成速度、■、は Ｖ　＠　−２＊　３−１４　＊　Ｒ＊　Ｌ　＊　Ｖであり、そして流速に独立で ある。拡散制御の場合、生成物の形成速度は Ｖ、、　、＋ｗａ、　ｏａ＊　（Ｖ、＊Ｄ”＊Ｒ’＊Ｌ”）　ｌ／”＊Ｓであり 、そして転化が生成物の形成／体積流速により決定される基質の出口濃度は Ｓ、、、、−［１−２，５６本（Ｄ　　Ｌ／（Ｒ″＊Ｖ、）　）　”’］　本ｓ である。生成速度は ｖ、、に−２本３．１４木Ｒ＊Ｌ＊Ｖ−１，木Ｓ／（Ｋ、＋Ｓ）であり、そして 基質の出口濃度は Ｓ、、、、−［１−Ｅ２＊Ｌ＊Ｖ＝、、／　（Ｒ＊Ｖｌ　（Ｋ、＋５）））　） 　＊Ｓである。

流速の依存性は特定の場合について特徴ある方法で変化する。例えば、拡散の制 御が存在する場合、５ＩＩＩＩＩｌはＶ、−２／ｌとともに変化し、そして力学 的制御が存在する場合、Ｓ、、、、はＶ、に逆比例する。この知識は、拡散効果 からの固有のパラメーターの理解のために重要である。

この方法は一般の質量移送および力学の原理から展開される。媒質、緩衝液およ び血液の特性は系のもとの説明に含まれている。最初の概算に対する、最終の結 果は媒質の粘度まｔ；は密度に対して独立である。分析の処置を支配するパラメ ーターは、媒質中の拡散性である。一般ｊ二、グラフの技術の多くは問題の場合 を分析するために容易に測定可能な量、例えば、流速、反応速度および基質濃度 を含むので、このパラメーターの大きさが帰属する次数を有することが必要であ るのみである。

しかしながら、特定の反応性における溶液の予測した拡散性を計算することは可 能である。酵素が円筒形繊維に直接取り付けられ、酵素が支持体材料中にに拡散 するために十分に大きい孔が存在せず、そして酵素が単一の分子層で管壁上Ｉ： 結合する、本発明の好ましい実施態様において、内部の拡散作用は固体のマトリ ックス内の酵素に制限されるので、内部の拡散作用は存在しないであろう。塊状 溶液とセルロース繊維の表面との間の拡散抵抗は存在する。外部の拡散は分子お よび対流力の両者を包含する。

観測される反応速度を決定する２つの場合が存在する二制御される体積拡散およ び触媒的に制御される体積具なる。反応器の設計において使用するｔ；めにこれ らの２つの限定的場合を分離することが可能である。

拡散の境界は内側の管の壁に隣接して横たわると推定されるあ。最初に、平らな 濃度のプロフィルは、放射状の座標に独立であり、徐々に変化して放射状の座標 に依存するプロフィルを確立する。拡散層の厚さは、管の半径よりかなり小さい と見なすことができる。拡散の幅は、質量移送係数に依存し、これは体積流れに 対して垂直の方向における基質拡散速度の測度である。反応器の長さにわたって 平均した、質量移送係数は、流速の立方平方根として変化する。酵素の反応は非 常に速いので、壁における基質の濃度はゼロになる： Ｌ／２＊＜ＮＵ、＊Ｎｓ、／１００ ここでＮ□およびＮ３．は、それぞれ、レイドルズおよびシュミットの無次元の 数であり、Ｎ□およびＮｓｃの積は粘度に対して独立であり、そして系の密度は 、 Ｎ　ｍ　、　＊　Ｎ　＊　−２＊　Ｒ＊　Ｖ　ｒ　／　Ｄである。

全血中の基質の拡散性を知ると、反応器の流速および管の半径のために、反応器 が拡散制御されているかどうかを知ることができる。ｋｌが増加するとき、拡散 層は薄くなる；これは高い流速において起こる。低い流速において、拡散層は厚 く、そして拡散効果は観測できる。

壁表面への基質の束は反応速度に類似して挙動し、分子は分解すべき壁に到達し なくてはならない。この束（モル／ｃｍ”５ｅｃ）は、Ｊ　、＝に＋＊　（Ｓ　 　５ｏ） ｌ二より基質濃度に関係する。ここでＳは体積中の基質濃度であり、そしてＳ、 は支持体壁におけるそれである。酵素反応が非常Ｊ：速いとき、襞における表面 濃度はゼロになり、そして最大速度／面積は■−一に、＊ｓ として支配され、そして反応は基質濃度に関して一次である。

反応器を設計するために、まず種々の条件についての特性反応速度を必要とする 。前の節における実験の観測および技術の利用！こより、力学的パラメーターを 定義することができる。次いで、反応器の設計における変数は空間時間、基質の 入口濃度および酵素濃度である。空間時間は反応の体積、■、に比例し、そして 体積流速Ｆに逆比例する。層状流れおよび等温条件を使用する栓流反応器の定常 状態の運転について、設計の等式は Ｖ＊／　Ｆ　−（ｒ　、）　−’＊　ｄ　Ｓである。この設計の等式または適当 な形状寸法についてのそれ、例えば、反応速度のプロフィル、Ｃ−ｒ＊”）、お よび酵素の熱不活性化は、運転条件、管の直径、基質および酵素濃度の範囲につ いて反応器の性能を決める研究の刺激の基礎をつくる。このようにして、運転条 件が与えられると、最適な基質転化のために適当な反応器の設計を決定すること ができる。初期の反応速度は、臨床的に使用するような、基質のレベルおよび流 速の研究から測定することができる。

初期速度のより信頼性ある線状の描写は、エアディー−７ステー（Ｅａｄｉｅ− Ｈｏｆｓｔｅｅ）のプロットである。このプロットはミカエリス−メンテンの等 式 ％式％） 直線化した変形である。これらのプロットは、、■がミカエリス−メンテンの力 学に従いかつ拡散制御されていないとき、直線である。変動を検出するために、 濃度の範囲は広くなくてはならない。研究のライウィーパーーバーケのプロット に比較したこのグラフは、それが拡散限定されているとき、より顕著な変動を有 する。

この時点において、系は生体外装置を使用して試験した。生体外研究は、流速、 反応器の体積、入口基質濃度および酵素濃度の関数として、基質の転化を追跡す る。同時に、血液適合性の試験を実施した。これは形成した血液成分の入口およ び出口の評価および反応器の性能に関するそれらの関係を包含する。これらの性 能の研究は、生体内の場合において使用する溜血液系を精確にまねることを期待 しない。血液の粘度、形成した血液成分および凝固能力の特性は、系における流 体の動力学および質量移送を支配し、こうして、全体の反応器の性能を支配する 。

次ぎは感染の案７Ｎ態様であり、ここで全身のヘパリンの除去において有用な生 体外装置のために、適当な支持体、カップリング技術、要求される酵素の配合お よび反応器の設計を選択する方法について、前に詳述しＩ；基準を利用する。こ れらの実施態様は、本発明の背景において述べた装置の制限の多くを克服する。

詳しくは、それらは腎臓透析または関心術に特徴的な流速において臨床的レベル のヘパリンを除去することができ、それらは拡散制限的でなく、そしてそれらは 滲出または不活性化のための、結合酵素の望ましくない損失を示さない。さらに 、それらは多数の目的、例えば、透析および精製のために、ならびにヘパリン抗 凝固活性の中和のために、利用することができる。

特休材料および反応器の形状寸法の選択セルロースを現在好ましい材料として選 択した。セルロースは、ある数の化学で活性化してこの不溶性支持体にタンパク 質を共有結合させることができる、ヒドロキシル官能性を含有する。再生セルロ ースおよび酢酸セルロースは、臨床的生体外装置、例えば、中空繊維および多層 膜シートの腎臓透析装置において首尾よく使用された。中空繊維は現在好ましい 形態である。これらの繊維は、１５０ｍ１２の装置を通るＩｆｆ／分の高い流速 においてさえ、血液フィルターにおけるそれらの使用を可能とする。平行な繊維 の束は、外部の拡散の制限の固有の可能性をもつ、酵素反応のために適切な表面 積をつくる。

繊維の数および長さ、ならびに直径を計算して、所望のヘパリン除去を生じ、同 時に所望の流速で、装置を通る過度の圧力低下つくらないで、血液の流れを可能 とする。一般に、商業的に入手可能な血液透析装置は１．３ｍ”の表面積を有す る。小児科学の血液透析装置は、はぼこの表面積の１／２を有する。関心術に使 用するように変更すると、表面積は約４〜１０倍に増加するであろう。

ヘパリン中和性化合物の選択 ヘパリナーゼを、ヘバリナーゼ活性の中和のためのセルロース支持体に結合する ための好ましい化合物として選択した。

カップリング技術の選択 塩化トリクレジルおよびシアン化臭素をカップリング技術として選択した。塩化 トリクレジルはよりすぐれた配合結果をセルロース支持体上で与える。次ぎは、 アガロースおよび再生セルロースへ結合したヘバリナーゼにつし１て、両者のカ ップリング技術を使用する、結合した酵素収率の比較である。

豆投庄　　　　　　活性化　　　　　　　収率（％）アガロース　　　　ＣＮＢ 　ｒ　　　　　　　４５塩化トリクレジル　　１５ セルロース　　　　ＣＮＢｒ　　　　　　　０．１塩化トリクレジル　　１０− ２５ 活性化手順後の材料の物理的構造は、無傷であることが示された。支持体への破 裂および孔の損傷の欠如の定量的確証は、高い倍率の光学顕微鏡を使用して示さ れた。巨視的に、圧力、流速および限外濾過速度は、化学的処置前のセルロース 繊維のもとの使用特性と一致する。

セルロース中空繊維への酵素のカップリングセルロースまたは酢酸セルロースの 繊維を含有する、商業的に入手可能な装置は、中空繊維を保持するエポキシ基剤 が有機溶媒に対して抵抗性ではないので、ヘバリナーゼを有機溶媒を使用して固 定化すべきとき、変性しなくてはならない。貯蔵の間の繊維の安定化を増加する ために使用した、繊維中のグリセリンは、また、除去しなくてはならない。中空 繊維にヘパリナーゼを結合する、現在好ましい方法を使用して、繊維をア七トン で反復してフラッシングして、微量の水のすべてを除去する。

次いで、繊維を塩化トリクレジルの溶液中に浸漬し、そして必要な時間反応させ て、ヘパリナーゼの結合のための最適な数の活性部位をつくる。

この最適な数は、リジンの数（ヘバリナーゼにおいて３７）、流速の面において 酵素中に適切に保持される必要性および血流中の種々のグロテアーゼおよび酵素 の活性部位が遮断されないという要件の関数である。

この数はヘパリナーゼについてほぼ１００塩化トリクレジル部位である。

溶液のＰＨは、また、ヘパリナーゼの結合についてきわめて重要である。

ヘパリナーゼは８より高いｐＨにおいて活性を失う。塩化トリクレジルはｐＨ８ 〜９において最も活性である。結合は１日程度に長いことがあるので、反応は好 ましくはｐＨ８において実施する。結合は、また、繊維を通してヘパリナーゼ溶 液を再循環させることによって達成することができるが、より長い期間の間の浸 漬はど均質な結果を生成しない。結合に引き続いて、酵素をグルタルアルデヒド または他のジアルデヒドまたは他の架橋剤、例えば、無水コハク酸と架橋させる 。架橋は、支持体表面上で酵素を安定化するはたらきをするが、酵素の活性部位 を遮断しないように制限しなくてはならない。

酵素の配合および活性の決定 初期の反応速度を、流速および基質濃度の関数として研究した。８〜１０ｃｍ／ ｓｅｃの流速の高い直線流速において、観測される反応速度は固有の最大酵素反 応速度に等しい。最大の反応速度は、中空繊維表面上への酵素の絶対配合により 決定される。ヘパリンの転化は、酵素配合の増加とともに直線的に増加する。酵 素が多孔質中空繊維の中にかつそれを通して拡散するために大きすぎる分子量で あるので、繊維へ結合した酵素の量は外側の表面積により限定される。セルロー ス繊維の内部使用上の現在の最大酵素配合は、０．２２ｍｇの分解ヘパリナーゼ ／時間・ｃｍ”［単位活性／ａｍ’］である。商業的に入手可能なヘパリナーゼ は、２００単位／ｍｇタンパク質の初期比活性を有する。この活性は、４゜５μ ｇのタンパク質が、ヘバリナーゼの源、ならびにヘパリンの特性に依存して、セ ルロースの１ｃｍ”につき繊維の結合するとき、観測される。前述のようｌこ、 固定化し！；ヘパリナーゼは、ヘパリンおよびヘパリンの低分子量誘導体の両者 を分解するために使用することができる。

最大酵素配合、固有力学的パラメーター、および拡散性のデータを組み合わせる と、可変流速における最大ヘパリン転化のために最適な血液フィルターを設計す ることができる。

Ｋ、　（ａ　ｐ　ｐ）が２．５ｍｇヘパリン／ｍ（ｌである場合、次の転化をそ れぞれの流速ｌこおいて、８５ｍβの１０．０００本の繊維の系（ｓ。

−０，０２ｍｇヘパリン／ｍＱ）についてそれぞれの配合を使用して生理学的緩 衝液中で期待することができる：流速　　　　　５０００本位　　２５．００本 位　　　拡散限定（ｍ４７分）　　の酵素（％）　　の酵素（％）　　　　転化 （％）この推定されるに、　（ａ　ｐ　ｐ）は、アガロース系において固有の定 数より１０倍以上大きい。５０００本位についての最初のカラムの数は、繊維上 のヘパリン除去の現在の配合１：相当する。この配合は触媒的Ｉ；純粋な酵素（ ２００本位の活性／ｍｇヘパリン）を使用する。２５，０００本位の酵素は、１ ０００単位の活性／ｍｇタンパク質のレベルに相当する（参照のため、完全に純 粋なヘパリン除去は２．０００〜２０．０００本位／　ｍ　ｇタンパク質程度の 活性を有する）。ヘパリン除去の活性が５倍増加すると、装置通過当たりのヘパ リンの分解は増加する。拡散が制限された場合は、比較のために含めである。こ れは水性系におけるヘパリンの転化の理論的限界である。この限界は装置の形状 寸法（＠維の半径および長さ）およびヘパリンの拡散性に依存する。

反応器の構成および生体外の性能 試料の全血系を、（Ｌ４５ｍＨの合計の内部体積をもつ５０本の繊維を使用して 構成した。これらの繊維は、半径１０７ミクロン亜、長さ２８培地および体積は ぼ０．６ｍ１２の再生セルロース（ＳｐｅｃｔｒｕｍＭｅｄｉｃａｌ、カリフォ ルニア州ロサンゼルス）。繊維の束は、膜に共有結合した２　１ｍｇ分解分解ヘ パリン間の酵素活性を有した。ラインエルケーバーケのプロットのプロットを第 １図にこの装置について示す。全体のヘパリン化血液はこの装置を通して再循環 させた。回路は３’１ｍＱの合計の体積を有した。選択した時間に８いて、試料 を反応器の荊と後！：８いて採取し、そして凝固時間について検査した。活性凝 固時間の試験（Ａ　ＣＴ）は、全血中のヘパリンレベルと直接関係付ける。これ はヘパリンが全血中で中空繊維の装置により分解しＩ：ことを意味する。

この装置の重要な面は、３７℃の患者の体温に関する、酵素の熱安定性である。

酵素の半減期を水性系において３７℃およびｐＨ７，４において決定した。ＩＪ ｐＩＺ図は、正規化した結果を示す。水性系における半減期は３２時間である。

これはこの装置の期待する生体外用途のために十分である。

本発明の好ましい実施態様を、第３図〜第６図に示す。

第３Ａ図は、生体外回路（図示せず）における血液のための入口１４および出口 １６を有する円筒形透析ジャケット１２、中空繊維の束１８、および透析液また は緩衝化等張溶液のための入Ｃｌ２０８よび出口２２から成る、商業的に入手可 能な腎臓透析ユニットから形成した装置１０である。装置１１１１０の大きさお よび立体的配置は、腎臓の透析に関連する使用のために決定する。腎臓透析に典 型的な血液の流速は２００ｍ１２／分の範囲である。

第３Ｂ図は、生体外回路における血液のための入口３２および出口３４、中空繊 維の東３６、および装置ｌＯの透析ジャケット１２の代わりの、密閉した容器３ ８内の束３６を取り囲む緩衝化等張溶液を有する装置３０である。大きさおよび 立体的配置は関心術に関連する使用のために決定する。装置ｌＯと装置３０との 間の主な差異は、はぼ３０００〜４０００ｍＱ／分の流速を取り扱うｌ：めの、 密閉しＩ；容器３８およびより大きい数の繊維３６である。

両者の装置１Ｏ１３０において、中空繊維の束１８．３６は、処置されて繊維内 にヘパリン除去をある濃度において固定化しており、そして装置を通過する血液 中に含有されるヘパリンの大部分を除去するように計算した活性保持率を有する 。

第３Ｂ図の装置３０における中空繊維は、さらに処置して繊維の外側を被覆して 、重要な電解質の損失を防止する。次いで、立体的配置は内部に固定化された酵 素を有する１系列の平行な管である。

第４図は、透析のための中空繊維の第１１Ｋｇ１４２およびヘパリンの除去のた めの固定化ヘパリン除去を含有する第２区画４４を有する装置４０である。この 装置を使用すると、患者を平均時間で診断することができ、ヘパリンの抗凝固活 性は血液が彼の体へ戻る前に連続的に中和される。

第５Ｃ！！ｌは、透析のための中空繊維の第１区画５２およびヘパリンの除去の ための固定化ヘパリン除去を含有する中空ｍ維の第２区画５４を有する装置５０ であり、ここで２つの区画５２．５４は繊維５２．５４の透析液の側で流体不透 過性バリヤー５６により分離されている。流体不透過性バリヤー５゛６は、エポ キシ樹脂または他の同様な材料から形成することができる。この装置は、酵素活 性が透析液の環境に感受性であるか、あるいは透析ユニットの長さが溶質の除去 の効能のために！縮すべき場合において、とくに有用である。　　　　　　。

第６図は、第３図〜第５図に示す装置に類似するが、２つの平らな端の片６２． ６４、透析および／またはヘパリン除去のための１系列の平らなまたはひだつき 膜シート６６、血液のｔ：めの入口６８および出ロア０、および透析流体のため の入口および出ロア２から形成されている。

生体外回路をもつ、ヘパリンのオンラインの除去のための高い表面積、生物適合 性、および機械的強さを有する装置において、ヘパリン分解性または中和性の酵 素または他の化合物を固定化する本発明は、特定の実施態様を参照して記載した 。他の変更および修飾は、本発明の前の詳細な説明から当業者には明らかであろ う。このような変更および修飾は、添付する請求の範囲内に入ることを意図する 。

；１；い（１゜ 句 ０卵−曽り　！　ｎ　　〜 ＝ｏｏｏｏｏｏ　　６　　６　　　　　　。

ＦＩＧＵＲＥ　　３ａ ＦＩＧＵＲＥ　　３ｂ ＦＩＧｔ、ＩＲＥ　　４　　　　　　　　　　ＦＩＧＵＲＥ　　５ＦＩＧＵＲＥ 　　６ 補正嘗の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成１年９月１１日 中 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８８１００６９９ ２、発明の名称 ヘパリンの中和 ３、特許出願人 ４、代理人　〒１０７ 電話　５８５−２２５６ ５、補正書の提出年月日 １９８９年５月１日 ６、添付書類の目録 （１）　　補正書の写しく翻訳文）　　　　　　　　　　１通請求の範囲 ２７、工程： 血液を支持体上ｌ；固定化された物質と接触させる、からなり、前記物質は、ヘ パリンまたはヘパリンの低分子量誘導体の抗凝固活性を特異的に中和し、そして 前記支持体への結合に有効な部位の数を増加することによって変性されいるもの であり、前記物質は血液と直接接触し、そして前記支持体は、はぼ５０ｍ１２／ 分〜４０００ｍＱ／分の流速で血液中の臨床的レベルのヘパリンと反応するため に十分な中和性物質と結合するために十分な表面積を有し、そして前記支持体は これらの条件下に機械的安定性、構造的一体性、および血液適合性を有する、 ことを特徴とする血液からヘパリンを除去する方法。

２８、前記物質は前記酵素上のりジン残基の数を増加することによって変性され ｔ；酵素である、請求の範囲第２６項記載の方法。

２９、工程： 血液を支持体上に固定化されｊ；物質と接触させ、前記物質は、ヘパリンまたは ヘパリンの低分子量誘導体の抗凝固活性を特異的に中和するものである、 ３０、前記脱ヘパリンおよび透析工程は単一の装置において寅施する、請求の範 囲第２９項記載の方法。

３１、前記装置は中空繊維ｔ：ＩＲ形された支持体である、請求の範囲第３０項 記載の装置。

３２、工程： 血液を支持体上に固定化されｌ；物質と接触させる、からなり、前記物質は、ヘ パリンまたはヘパリンの低分子量誘導体の抗凝固活性を特異的に中和するもので あり、前記物質は血液と直接接触し、そして前記支持体は、はぼ１０１００Ｏ／ 分〜４０００ｍ１２／分の流速で血液中の臨床的レベルのヘパリンと反応するた めに十分な中和性物質と結合するために十分な表面積を有し、そして前記支持体 はこれらの条件下に機械的安定性、構造的一体性、および血液適合性を有する、 ことを特徴とする血液からヘパリンを除去する方法。

前記脱ヘパリンした血液を不純物をそれから透析する手段と接触させる、 からなることを特徴とする、血液からヘパリンを除去する方法。

３３、工程： 血液を支持体上に固定化された物質と接触させる、からなり、前記物質は、ヘパ リンまたはヘパリンの低分子量誘導体の抗凝固活性を特異的ｌ：中和するもので あり、前記物質は血液と直接接触し、そして前記支持体は、はぼ２５０ｍｎ／分 〜４０００ｍ１２／分の流速で血液中の臨床的レベルのヘパリンと反応するため に十分な中和性物質と結合するために十分な表面積を有し、そして前記支持体は これらの条件下に機械的安定性、構造的一体性、および血液適合性を有する、 ことを特徴とする血液からヘパリンを除去する方法。

前記脱ヘパリンした血液を不純物をそれから透析する手段と接触させる、 からなることを特徴とする、血液からヘパリンを除去する方法。

３４、工程： 血液を支持体上に固定化された物質と接触させる、カラなす、前記物質は、ヘパ リンまｌ；はヘパリンの低分子量誘導体の抗凝固活性を特異的に中和するもので あり、前記物質は血液と直接接触し、そして前記支持体は、はぼ５０ｍ１２／分 〜４０００ｍ＜１７分の流速で血液中の臨床的レベルのヘパリンと反応するため に十分な中和性物質と結合するために十分な表面積を有し、そして前記支持体は これらの条件下に機械的安定性、構造的一体性、および血液適合性を有する、 ことを特徴とする血液からヘパリンを除去する方法。

前記脱ヘパリンした血液を不純物をそれから透析する手段と接触させる、 からなることを特徴とする、血液からヘパリンを除去する方法。

３５、構成成分： ヘパリンまたはヘパリンの低分子量誘導体を特異的に中和し、そしてそして前記 支持体への結合に有効な部位の数を増加することによって変性されいる物質、前 記物質は血液と直接接触する：およびほぼ５０ｒｒＪ／分〜４０００ｍｆｆ／分 の流速で血液中の臨床的レベルのヘパリンに前記中和性物質を暴露するために十 分な表面積を存し、そしてこれらの条件下に！Ｍ的安定性、構造的一体性、およ び血液適合性を有する支持体、 からなることを特徴とする、生体外ヘパリン中和装置。

３６、前記物質は前記酵素上のりジン残基の数を増加することによって変性され た酵素である、請求の範囲第３５項記載の装置。

３７、構成成分： ヘパリンまｔ；はヘパリンの低分子量誘導体を特異的に中和する物質、前記物質 は血液と直接接触する；およびほぼ１０００ｍ４７分〜４０００ｍ（１７分の流 速で血液中の臨床的レベルのヘパリンに前記中和性物質を暴露するＩ；めに十分 な表面積を有し、そしてこれらの条件下に機械的安定性、構造的一体性、および 血液適合性を有する支持体、 からなることを特徴とする、生体外ヘパリン中和装置。

３８、構成成分： ヘパリンまたはヘパリンの低分子量誘導体を特異的に中和する物質、前記物質は 血液と直接接触する；およびほぼ２５０ｍ１２／分〜４０００ｍＩ２／分の流速 で血液中の臨床的レベルのヘパリンに前記中和性物質を暴露する！こめに十分な 表面積を有し、そしてこれらの条件下に機械的安定性、構造的一体性、および血 液適合性を有する支持体、 からなることを特徴とする、生体外ヘパリン中和装置。

４０、構成成分： ヘパリンまたはヘパリンの低分子量誘導体を特異的に中和する物質、前記物質は 血液と直接接触する：およびほぼ２５０ｍ１２／分〜４０００ｍＱ／分の流速で 血液中の臨床的レベルのヘパリンに前記中和性物質を暴露するために十分な表面 積を有し、そしてこれらの条件下に機械的安定性、構造的一体性、および血液適 合性を有する中空繊維、 からなることを特徴とする、生体外ヘパリン中和装置。

国際調査報告 ＝Ｉ％ＩＩｌ＠Ｔｌ−１Ａ神醜詐−’＆　ＰＣＴ／Ｕ５　８１！１００６９９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、工程： ヘパリンまたはヘパリンの低分子量誘導体の抗凝固活性を特異的に中和する物質 を支持体上に固定化する、 からなり、前記物質は血液と直接接触し、そして前記支持体は、ほぼ５０ｍｌ／ 分〜４０００ｍｌ／分の流速で血液中の臨床的レベルのヘパリンと反応するため に十分な中和性物質と結合するために十分表面積を有し、そして前記支持体はこ れらの条件下に機械的安定性、構造的一体性、および血液適合性を有する、こと を特徴とする血液からヘパリンを除去する方法。 ２、さらに、前記物質をヘパリナーゼ、グルコネート−リダクターゼ、アルドー ス−リダクターゼ、ベーダ−グルコニダーゼ、Ｏ−スルファターゼ、およびＮ− スルファターゼから成る群より選択することを特徴とする、請求の範囲第１項記 載の方法。 ３、さらに、前記物質を変性して、前記支持体へ結合するために有効な部位の数 を増加することを特徴とする、請求の範囲第２項記載の方法。 ４、前記物質を前記酵素上のリジン残基の数を増加することによって変性する、 請求の範囲第３項記載の方法。 ５、さらに、ほぼ２５℃〜３９℃の温度において臨床的レベルのヘパリンと反応 するために要求される中和性物質の量を決定することを特徴とする、請次の範囲 第１項記載の方法。 ６、さらに、前記支持体を中空繊維に成形することを特徴とする、請求の範囲第 １項記載の方法。 ７、さらに、前記支持体を多層の膜に成形することを特徴とする、請求の範囲第 １項記載の方法。 ８、支持体のための材料を再生セルロース、酢酸セルロース、アガロース、架橋 したデキストラン、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクリルアミド 、およびそれらの誘導体から成る群より選択することを特徴とする、請求の範囲 第１項記載の方法。 ９、前記支持体からの前記物質の漏れを最小とし、前記材料の中和機能の損失を 最小とし、そして前記支持体への損傷を最小とするために十分な強さの、前記物 質と前記支持体との間の結合を生成する、固定化方法を選択することを特徴とす る、請求の範囲第１項記載の方法。 １０、前記方法は、シアン化臭素、塩化トリクレシル、およびカーポジイミダゾ ールから成る群より選択される化合物を使用する、請求の範囲第９項記載の方法 。 １１、さらに、患者を処置するための生体外系をもつ循環中に、前記固定化物質 を含有する支持体を配置することを特徴とする、請求の範囲第１項記載の方法。 １２、さらに、血液を患者に戻す前に、血液中にヘパリンを中和するために前記 固定化物質を使用することを特徴とする、請求の範囲第１項記載の方法。 １３、前記固定化物質を、血液の中から外に不純物を透析する手段と直列に配置 する、請求の範囲第１１項記載の方法。 １４、前記固定化物質を、血液を酸素供給する手段と直列に配置する、請求の範 囲第１１項記載の方法。 １５、さらに、前記固定化物質を合有する血液を処置する手段と直列に配置し、 そして前記固定化物質を含有する前記支持体と血液を処置する前記手段との間に 流体不透過性バリヤーを設けることを特徴とする、請求の範囲第１１項記載の方 法。 １６、構成成分： ヘパリンまたはヘパリンの低分子量誘導体を特異的に中和する物質；前記物質は 血液と直接接触する、およびほぼ５０ｍｌ／分〜４０００ｍｌ／分の流速で血液 中の臨床的レベルのヘパリンに前記中和性物質を暴露するために十分表面積を有 し、そしてこれらの条件下に機械的安定性、構造的一体性、および血液適合性を 有する支持体、 からなることを特徴とする、生体外ヘパリン中和装置。 １７、さらに、血液の入口および出口手段を特徴とする、請求の範囲第１６項記 載の装置。 １８、前記支持体は中空繊維の形態である、請求の範囲第１６項記載の方法。 １９、前記中空繊維は多孔質である、請求の範囲第１８項記載の装置。 ２０、前記支持体は多数の膜の形態である、請求の範囲第１６項記載の装置。 ２１、前記支持体は、再生セルロース、酢酸セルロース、アガロース、架橋した デキストラン、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクリルアミド、お よびそれらの誘導体から成る群より選択される材料から形成されている、請求の 範囲第１６項記載の装置。 ２２、さらに、前記中和性物質け、ヘパリナーゼ、グルコネート−リダクターゼ 、アルドース−リダクターゼ、ベータ−グルコニダーゼ、Ｏ−スルファターゼ、 およびＮ−スルファターゼから成る群より選択きれる、請求の範囲第１項記載の 方法。 ２３、さらに、前記中和性物質は変性されて、前記支持体または基質のための結 合部位の数が増加されている、請求の範囲第２２項記載の方法。 ２４、前記物質は酵素上に存在するリジン残基の数増加するように変性されたへ パリナーゼである、請求の範囲第２３項記載の装置。 ２５、さらに、酸素を添加するか、あるいは不純物を除去するための血液を処置 する手段を特徴とする、請求の範囲第１６項記載の装置。 ２６、さらに、固定化物質を含有する支持体および血液処置手段を分離する、流 体不透過性バリヤーを特徴とする、請求の範囲第２５記載の装置。