SU1479514A1 - Способ получени иммобилизованной формиатдегидрогеназы - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии, а именно к способам иммобилизации формиатдегидрогеназы.Цель изобретени  - повышение выхода иммобилизованной формиатдегидрогеназы по активности. Способ заключаетс  в иммобилизации фермента на носителе, предварительно обработанном глутаровым альдегидом. Иммобилизацию, провод т в присутствии окисленного никотинамидадениндинуклеотида (НАД) и конкурентных по формиату ингибиторов фермента. Мол рное соотношение фермента и НАД 1:(2-215)

концентраци  ингибитора равна 12,3-1430 константам ингибировани . Дл  увеличени  стабильности иммобилизованную формиатдегидрогеназу обрабатывают боргидридом натри . Выход фермента возрастает с 27 до 56-77%.

Description

1

Изобретение относитс  к биотехнологии и касаетс  способа получени  иммобилизованной формиатдегидрогена- зы, в частности формиатгидрогеназы метилотрофных микроорганизмов, котора  может быть использована как составна  часть системы регенерации кофактора в различных област х биотехнологии - тонком органическом синтезе , анализе, медицинской диагностике .

Цель изобретени  - повышение выхода иммобилизованной формиатдегидроге- наэы по ферментативной активности.

Способ заключаетс  в том, что при инкубации фермента с нерастворимым аминированным носителем5 активированным глутаровым альдегидом, в инкубационную смесь дополнительно ввод т кофактор фермента и конкурентные по отношению к формиату ингибиторы фермента . Соотношение фермент - никоти- намидадениндинуклеотид окисленннып устанавливают 1:2-215, а ингибитор добавл ют в концентрации, равной 21,3-1430 константам ингибировани . Выход целевого продукта по активности возрастает при этом от 27 +51 до 55 - 77%.

ел

31

Способ иллюстрируетс  следующими примерами осуществлени .

Пример 1. 250 мг аминирован- ного силохрома С-800/70 инкубируют в 2 мл дистиллированной воды при 90°С в течение 30 мин. Далее сило- хром промывают 50 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера, рН 7,0 и инкубируют при посто нном перемешивании с 10 мл 2,5%-ного раствора глутарового диаль дегида в том же буфере. Обработан- . ный альдегидом силохром отмывают от несв завшегос  глутарового альдегида на стекл нном (Ьильтре 500 мл 0, 1 М фосфатного буфера, рН 7,8 и 50 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,0. К отмытому силохрому добавл ют 3 мл раствора формиатдегидрогеназы (0,5 мг/мл, 6,2 . ) в С,1 М фосфатном буфере, рН 7,0, 0, + мл НАД (10 мМ) и 100 мкл раствора азида натри  (6,5 , К; ,- 10 ) (мол ное соотношение фермент - НАД -азид составл ет 1:215) и инкубируют при посто нном перемешивании в течение 3 ч при 25°С. Несв завгаийс  фермент смывают 40 мл раствора 3 М формиата в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,8. В результате иммобилизации к силох-ро му присоедин етс  80% белка, .которые сохран ют 60% активности.

П р и м е р 2. Иммобилизацию формиатдегидрогеназы провод т согласно примеру 1. Полученный катализатор обрабатывают при охлаждении х(4 С) 3 мл раствора боргидрида натри  (10 мг/мл) в 0,2 М фосфатном буфере, рН 7,8. Удельна  активность иммобилизованной формиатдегидрогеназы после обработки боргидридом не измен етс . Обработка боргидридом приводит к повышению стабильности иммобилизованных ферментных препаратов при пониженных ( 67,0) значени х рН. При хранении иммобилизованной формиатде- гидрогеназы, полученной согласно примеру 1, в буферном растворе с рН 7,0 в течение 4 мес, при 4°С наблюдаетс  десорбци  до 30% белка. Дл  препаратов иммобилизованного фермен- та, обработанных боргидридом натри , в тех же услови х весь белок остаетс  св занным с сорбентом.

П р и м е р 3. Осуществл ют по примеру 1, но вместо азида натри  берут 20 мкл раствора нитрита натри  (0,1 М; 1- , 4,5 1С-4М). В результате при иммобилизации концентраци  ингибитора составл ет 12,3 К, а к

0

5

0

95

5

5 0 5 0

5-

144

силохрому присоедин етс  83% белка, .который сохран ет 55% активности.

П р и м е р 4. Способ осуществл ют по примеру 1, но НАД добавл ют в концентрации 1,1 -1С-4М, а 100 мкл азида натри  берут из раствора в концентрации 5 (соотношение фермент-НАД составл ет 1:20, концентраци  ингибитора 1430 х К ;). В результате иммобилизации к силохрому присоедин етс  80% белка, которые сохран ют 56% активности.

П р и м е р 5. Отличающийс  от примера 1 тем, что в качестве сорбента используют аминогексилсефарозу, 2 г носител  инкубируют в течение 4 ч в 50 мл 2,5%-ного водного раствора глутарового альдегида при 20°С. Далее носитель отмывают на фильтре О,5 л 3 М КС1, 0,5 л дистиллирован-, ной воды и 0,5 л 0,2 М К-фосфатного буфера, рН 7,0. Затем модифицированный носитель инкубируют с раствором формиатдегидрогенаэы (4 мл. 1 мг/мл) в 0,2 М К-фосфатном. буфере, рН 7,0 при встр хивании на качалке в течение 3 ч при 25°С. Иммобилизацию провод т в присутствии НАД (2 мМ) и.азида натри  (10 М). Мол рное соотношение фермент -НАД равно 1:164, а концентраци  ингибитора 1000 К;.

По окончании процесса иммобилизации носитель отмывают на фильтре 100 мл 3 М НС1, 100 мл 3 М формиата натри , 0,5 л 0,2 М К-фосфатного буфера, рН 7,0. В результате при иммобилизации сохран етс  77% ферментативной активности.

П р . И м е р 6. Способ осуществл ют по примеру 3, но концентраци  нитрита в реакционной смеси составл ет 0,2 М (444 К). К силохрому присоедин етс  86% белка, который сохран ет 60% активности.

Пример. Способ осуществл ют по примеру 6, но иммобилизацию провод т в присутствии 1,5 М хлорида натри . К носителю присоедин етс  87% белка, который сохран ет 58% активности .

Пример8. Способ осуществл ют по примеру 1, но вместо азида используют роданид в концентрации 6 Ю-5М (К; 1,1 - 1СЧМ, .концентраци  55 К-). К носителю присоедин етс  90% фермента, который сохран ет 57% активности.

51

II р и м е р 9. Способ осуществл ют по примеру 1, но вместо азида используют цианат натри  (К; 2 х ) в концентрации 2 (100 К;). К силохрому присоедин етс  85% фермента, который сохран ет 60% активности.

Пример 10. Способ осуществл ют по примеру 1, но концентраци  формиатдегидрогенаэы в растворе составл ет 5 мг/л (6,2 М), НАД 1,2 - 10 М, азид 5 (соотношение фермент -НАД 1:2).Концентраци  ингибитора равна 500 К.. К силохрому присоедин етс  77% фермета , который сохран ет 58% активности

Пример 11. Способ осуществл ют по примеру 1, но концентра- ци  формиатдегидрогеназы в растворе составл ет 5 мг/мл, концентраци  НАД 10 3М, азида 1,4 (соотношение концентраций фермент -НАД 1:16, концентраци  ингибитора 1400 К;). К силохрому присоедин етс  80% фермента, который сохран ет 56% активности.

Преимущество предлагаемого способа иммобилизации формиатдегидрогеназ заключаетс  в том, что благодар  присутствию в реакционной смеси специфических защитных агентов процесс иммобилизации протекает с минимальными потер ми активности, что позво

0

5

0

5

0

л ет получать биоорганические катализаторы на основе формиатдегидрогеназы , обладающие высокой активностью, и приводит к уменьшению расхода фермента . Восстановление лабильной азометиновой св зи боргидридом преп тствует десорбции фермента с носител  в процессе эксплуатации и повышает его операционную стабильность .

Claims (1)

1. Формула изобрете ни 

   Способ получени  иммобилизованной формиатдегидрогеназы, включающий инкубирование фермента в буферном растворе с нерастворимым аминирован- ным носителем, предварительно активированным глутаровым альдегидом, и отмывание носител  от несв завшегос  фермента, о тличающийс  тем, что, с целью повышени  выхода целевого продукта по ферментативной активности, инкубирование фермента провод т в присутствии окисленного никотинамидадениндинуклеотида и конкурентных в отношении формиата ингибиторов фермента, устанавлива  при этом мол рное соотношение фермент- никотинамидадениидинуклеотид окисленный , равным 1:2-215 и концентрацию ингибитора, равной 12,3 - 1430 константам ингибировани .