JP2002199875A - 脱窒方法 - Google Patents
脱窒方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規な微生物的脱窒方法の提供。
【解決手段】 アルカリゲネス・フェカリス(Alcaligen
es faecalis)細菌にアンモニア態窒素化合物を接触せし
めることによりアンモニア態窒素を窒素ガス（N2）に変
換する方法において、前記細菌が１５２mg-N／Ｌ／日又
は０．６mmol／時／ｇ蛋白質の脱窒速度を有することを
特徴とする方法。
es faecalis)細菌にアンモニア態窒素化合物を接触せし
めることによりアンモニア態窒素を窒素ガス（N2）に変
換する方法において、前記細菌が１５２mg-N／Ｌ／日又
は０．６mmol／時／ｇ蛋白質の脱窒速度を有することを
特徴とする方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は微生物を利用する脱
窒方法に関し、この方法は、種々の由来の排水等に含ま
れるアンモニア態窒素を窒素ガスに変えて脱窒する方法
に関する。
窒方法に関し、この方法は、種々の由来の排水等に含ま
れるアンモニア態窒素を窒素ガスに変えて脱窒する方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】アンモニア態窒素(NH4 + ) を他の形態の
窒素に変化させる方法としては、NH3→(HH2OH)-NO2 -
→NO3 - と変化する硝化反応と、NO3 - →NO2 - →NO→
N2O →N2と変化する脱窒反応が知られている。硝化反応
は硝酸菌と称する独立栄養細菌により行われる。この細
菌は二酸化炭素を炭素源として利用し、この際に二酸化
炭素の還元のためにアンモニウムの酸化を行う。このた
め、硝化反応の反応速度は一般に非常に低い。
窒素に変化させる方法としては、NH3→(HH2OH)-NO2 -
→NO3 - と変化する硝化反応と、NO3 - →NO2 - →NO→
N2O →N2と変化する脱窒反応が知られている。硝化反応
は硝酸菌と称する独立栄養細菌により行われる。この細
菌は二酸化炭素を炭素源として利用し、この際に二酸化
炭素の還元のためにアンモニウムの酸化を行う。このた
め、硝化反応の反応速度は一般に非常に低い。
【０００３】脱窒反応は脱窒菌と称する細菌により行わ
れる。この細菌は、嫌気状態においてエネルギーを獲得
する手段として硝酸イオンなどを還元するので、脱窒反
応は嫌気的条件下においてのみ進行する。上記２種類の
反応を別々の細菌（硝化菌及び脱窒菌）により行う場合
には、上記のごとく硝化作用の反応速度が非常に低い、
硝化反応のための好気的条件と脱窒反応のための嫌気的
条件とを同時に使用する必要がある等の問題点があり、
排水処理等のための実用化は困難である。
れる。この細菌は、嫌気状態においてエネルギーを獲得
する手段として硝酸イオンなどを還元するので、脱窒反
応は嫌気的条件下においてのみ進行する。上記２種類の
反応を別々の細菌（硝化菌及び脱窒菌）により行う場合
には、上記のごとく硝化作用の反応速度が非常に低い、
硝化反応のための好気的条件と脱窒反応のための嫌気的
条件とを同時に使用する必要がある等の問題点があり、
排水処理等のための実用化は困難である。
【０００４】他方、Y.Inamori ら、Wat.Sci.Tech.Vol.3
6, No.10, p.65-72(1997) には、１種類の細菌アルカリ
ゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)を用いて、
好気的条件下で硝化反応と脱窒反応とを同時に行い、ア
ンモニウムイオンを脱窒(N2Oまでの酸化）することが記
載されている。しかしながら、この反応の速度は非常に
低く８．３mg N2O／日／リットルである。また、T.Nish
ioら、J, Ferment. Bioeng., Vol.86, No.2, p.351-356
(1998)には、固定化したアルカリゲネス・フェカリスOK
K17 細菌が、０．２８mmol／時／ｇ蛋白質の速度でアン
モニウムイオンの脱窒を行うことが記載されている。
6, No.10, p.65-72(1997) には、１種類の細菌アルカリ
ゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)を用いて、
好気的条件下で硝化反応と脱窒反応とを同時に行い、ア
ンモニウムイオンを脱窒(N2Oまでの酸化）することが記
載されている。しかしながら、この反応の速度は非常に
低く８．３mg N2O／日／リットルである。また、T.Nish
ioら、J, Ferment. Bioeng., Vol.86, No.2, p.351-356
(1998)には、固定化したアルカリゲネス・フェカリスOK
K17 細菌が、０．２８mmol／時／ｇ蛋白質の速度でアン
モニウムイオンの脱窒を行うことが記載されている。
【０００５】しかしながら、上記いずれの場合の、アン
モニウムイオンの脱窒速度が低く、実用性に乏しい。
モニウムイオンの脱窒速度が低く、実用性に乏しい。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、実用
的な高速でアンモニウムイオンの脱窒を行うことができ
る方法を提供しようとするものである。
的な高速でアンモニウムイオンの脱窒を行うことができ
る方法を提供しようとするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の課題
を解決すべく種々検討した結果、アルカリゲネス・フェ
カリス種に属する細菌株に、従来知られていた微生物よ
りもはるかに高い速度でアンモニウムイオンからの脱窒
反応を行うことができるものが存在することを見出し、
本発明を完成した。
を解決すべく種々検討した結果、アルカリゲネス・フェ
カリス種に属する細菌株に、従来知られていた微生物よ
りもはるかに高い速度でアンモニウムイオンからの脱窒
反応を行うことができるものが存在することを見出し、
本発明を完成した。
【０００８】従って本発明は、アルカリゲネス・フェカ
リス(Alcaligenes faecalis)細菌にアンモニア態窒素化
合物を接触せしめることによりアンモニア態窒素を窒素
ガス（N2）に変換する方法において、前記細菌が少なく
とも１５２mg N2O／日／リットル又は少なくとも０．６
mmol／時／ｇ蛋白質の脱窒速度を有することを特徴とす
る方法を提供する。本発明はさらに、アルカリゲネス・
フェカリスNo. ４株(FERM P-18114 ）細菌をアンモニア
態窒素化合物に接触せしめることを特徴とする、アンモ
ニア態窒素の脱窒方法を提供する。
リス(Alcaligenes faecalis)細菌にアンモニア態窒素化
合物を接触せしめることによりアンモニア態窒素を窒素
ガス（N2）に変換する方法において、前記細菌が少なく
とも１５２mg N2O／日／リットル又は少なくとも０．６
mmol／時／ｇ蛋白質の脱窒速度を有することを特徴とす
る方法を提供する。本発明はさらに、アルカリゲネス・
フェカリスNo. ４株(FERM P-18114 ）細菌をアンモニア
態窒素化合物に接触せしめることを特徴とする、アンモ
ニア態窒素の脱窒方法を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明の方法において使用する微
生物としては、アルカリゲネス・フェカリス種に属し、
少なくとも１５２mg N2O／日／リットル又は少なくとも
０．６mmol／時／ｇ蛋白質の脱窒速度でアンモニウムイ
オンの脱窒を行うことができるものであればよいが、そ
の具体例として、細菌株No. ４が挙げられる。この菌株
は、アルカリゲネス・フェカリス種に属するものと同定
され、２０００年１１月９日にFERM P-18114として生命
工学工業技術研究所に寄託された。
生物としては、アルカリゲネス・フェカリス種に属し、
少なくとも１５２mg N2O／日／リットル又は少なくとも
０．６mmol／時／ｇ蛋白質の脱窒速度でアンモニウムイ
オンの脱窒を行うことができるものであればよいが、そ
の具体例として、細菌株No. ４が挙げられる。この菌株
は、アルカリゲネス・フェカリス種に属するものと同定
され、２０００年１１月９日にFERM P-18114として生命
工学工業技術研究所に寄託された。
【００１０】本発明の脱窒用細菌は、少なくとも１５２
mg N2O／日／リットル、好ましくは３００mg N2O／日／
リットル、さらに好ましくは、６００mg N2O／日／リッ
トル、そしてさらに好ましくは１２００mg N2O／日／リ
ットルの脱窒速度を有する。アルカリゲネス・フェカリ
ス（Alcaligenes faecalis）を用いた脱窒反応に関する
今までの報告の値と本菌との比較を以下に示す。
mg N2O／日／リットル、好ましくは３００mg N2O／日／
リットル、さらに好ましくは、６００mg N2O／日／リッ
トル、そしてさらに好ましくは１２００mg N2O／日／リ
ットルの脱窒速度を有する。アルカリゲネス・フェカリ
ス（Alcaligenes faecalis）を用いた脱窒反応に関する
今までの報告の値と本菌との比較を以下に示す。
【００１１】（１）IFO14479株を用いた報告（Water Sc
ience and Technology 36(1997)65-72) IFO14479株を用いた実験の脱窒は培養初期（１０日くら
いまで）は、ほとんど、N2O が生産されず、その後、徐
々に、N2O が生産されている。従って、３０日以後の値
を比較する。IFO14479株の最大N2O 放出量（すなわち最
大の脱窒量）Fig.2 から３５日付近で、４．８mg-N／日
である。この値は、培養液５８０mLの値であるから、培
養液１Ｌ（リットル）に換算すると８．３mg-N／日／Ｌ
となる。一方、No.4株の脱窒量は、表１および表２から
培養３０時間後から５０時間後の２０時間の脱窒量は１
５２mg-N／日／Ｌとなり、No.4株の方が約２０倍高い脱
窒能を持つ。
ience and Technology 36(1997)65-72) IFO14479株を用いた実験の脱窒は培養初期（１０日くら
いまで）は、ほとんど、N2O が生産されず、その後、徐
々に、N2O が生産されている。従って、３０日以後の値
を比較する。IFO14479株の最大N2O 放出量（すなわち最
大の脱窒量）Fig.2 から３５日付近で、４．８mg-N／日
である。この値は、培養液５８０mLの値であるから、培
養液１Ｌ（リットル）に換算すると８．３mg-N／日／Ｌ
となる。一方、No.4株の脱窒量は、表１および表２から
培養３０時間後から５０時間後の２０時間の脱窒量は１
５２mg-N／日／Ｌとなり、No.4株の方が約２０倍高い脱
窒能を持つ。
【００１２】（２）OKK17 株を用いた報告（Journal of
Fermantation and Bioengineerimg86(1998)351-356) OKK17 株（PVA ゲルで菌を固定化）の脱窒量は最大で
０．２８mmol／時／ｇ蛋白質でありNo.4株は０．６mmol
／時／ｇ蛋白質となる。No.4株はOKK17 株の２倍の活性
を示した。OKK17 株はPVA により包括したため高い脱窒
能を示したと考えられる。No.4株もPVA による包括を行
うとさらに高い脱窒能を示すと予想される。
Fermantation and Bioengineerimg86(1998)351-356) OKK17 株（PVA ゲルで菌を固定化）の脱窒量は最大で
０．２８mmol／時／ｇ蛋白質でありNo.4株は０．６mmol
／時／ｇ蛋白質となる。No.4株はOKK17 株の２倍の活性
を示した。OKK17 株はPVA により包括したため高い脱窒
能を示したと考えられる。No.4株もPVA による包括を行
うとさらに高い脱窒能を示すと予想される。
【００１３】本発明の微生物は、ペプトン、酵母エキス
等を主成分とする有機培地及びリン酸カリウム、硫酸マ
グネシウム等を主成成分とすいる無機培地のいずれにお
いても増殖することができ、脱窒反応のための菌体の生
成のための培地としても有機培地及び無機培地のいずれ
も使用することができる。有機培地の例としては、ペプ
トン（ポリペプトン商標名） １０ｇ／Ｌ、酵母エキス
５ｇ／Ｌ及びNaCl５ｇ／Ｌ含有するＬ培地、無機培地
の例として、K2HPO4 １４ｇ／Ｌ、KH2PO4６ｇ／Ｌ、(N
H4)2SO4 ２ｇ／Ｌ、クエン酸三ナトリウム・二水和物
１５ｇ／Ｌ及びMgSO4 ・7H2O ０．２ｇ／Ｌを含むＭ
Ｍ培地等を使用することができる。
等を主成分とする有機培地及びリン酸カリウム、硫酸マ
グネシウム等を主成成分とすいる無機培地のいずれにお
いても増殖することができ、脱窒反応のための菌体の生
成のための培地としても有機培地及び無機培地のいずれ
も使用することができる。有機培地の例としては、ペプ
トン（ポリペプトン商標名） １０ｇ／Ｌ、酵母エキス
５ｇ／Ｌ及びNaCl５ｇ／Ｌ含有するＬ培地、無機培地
の例として、K2HPO4 １４ｇ／Ｌ、KH2PO4６ｇ／Ｌ、(N
H4)2SO4 ２ｇ／Ｌ、クエン酸三ナトリウム・二水和物
１５ｇ／Ｌ及びMgSO4 ・7H2O ０．２ｇ／Ｌを含むＭ
Ｍ培地等を使用することができる。
【００１４】さらには、最も脱窒速度が大きい培地組成
（表１）が望ましい。培養条件としては、微生物自体の
高い増殖速度及び高い脱窒速度を得るために好気的条件
が好ましい。好気的条件を確保するためには、小規模培
養のためには振とう培養が用いられるが、大規模な培養
においては通気及び撹拌培養が好ましい。細菌の通気・
撹拌培養等の好気培養の技術はすでに確立されており、
常用の技術を用いることができる。
（表１）が望ましい。培養条件としては、微生物自体の
高い増殖速度及び高い脱窒速度を得るために好気的条件
が好ましい。好気的条件を確保するためには、小規模培
養のためには振とう培養が用いられるが、大規模な培養
においては通気及び撹拌培養が好ましい。細菌の通気・
撹拌培養等の好気培養の技術はすでに確立されており、
常用の技術を用いることができる。
【００１５】培養温度は１５〜３７℃であり、好ましく
は２５〜３０℃である。培地のpHは、５〜８であり、好
ましくは中性附近である。本発明において使用する細菌
の増殖速度は比較的高く、培養条件や、接種する菌体量
等によっても異るがおよそ回分式培養においては半日〜
１日で最高菌体濃度に達する。本発明の脱窒は、本発明
の微生物と脱窒の対象となる窒素化合物とを接触せしめ
ることにより行われる。具体的には、脱窒の対象となる
アンモニウムイオン等を含有する培地中で脱窒用微生物
を好気的条件下で培養すればよい。この培養は回分式又
は連続式に行うことができる。微生物の回分式培養のみ
ならず、連続式培養もすでに確立された技術である。上
記の方法に代えて、一旦脱窒微生物を増殖させて菌体を
得た後、これを好気的条件下で脱窒対象となる窒素化合
物と接触せしめることができる。
は２５〜３０℃である。培地のpHは、５〜８であり、好
ましくは中性附近である。本発明において使用する細菌
の増殖速度は比較的高く、培養条件や、接種する菌体量
等によっても異るがおよそ回分式培養においては半日〜
１日で最高菌体濃度に達する。本発明の脱窒は、本発明
の微生物と脱窒の対象となる窒素化合物とを接触せしめ
ることにより行われる。具体的には、脱窒の対象となる
アンモニウムイオン等を含有する培地中で脱窒用微生物
を好気的条件下で培養すればよい。この培養は回分式又
は連続式に行うことができる。微生物の回分式培養のみ
ならず、連続式培養もすでに確立された技術である。上
記の方法に代えて、一旦脱窒微生物を増殖させて菌体を
得た後、これを好気的条件下で脱窒対象となる窒素化合
物と接触せしめることができる。
【００１６】例えば、培養により菌体を得た後、その培
地中に脱窒対象化合物を加えて、さらに通気・撹拌、振
とう等の手段により好気的条件を生成する。あるいは、
培養により菌体を増殖せしめた後、培地から菌体を分離
し、それを別の反応媒体に懸濁した後、それに脱窒対象
となる窒素化合物を添加するか、あるいは、脱窒対象と
なる窒素化合物を含有する媒体中に前記のごとき分離し
た微生物菌体を懸濁する。次に、こうして形成した、菌
体及び脱窒対象化合物を含有する反応媒体に、通気・撹
拌、振とう等の常用手段により好気的条件を付与すれば
よい。
地中に脱窒対象化合物を加えて、さらに通気・撹拌、振
とう等の手段により好気的条件を生成する。あるいは、
培養により菌体を増殖せしめた後、培地から菌体を分離
し、それを別の反応媒体に懸濁した後、それに脱窒対象
となる窒素化合物を添加するか、あるいは、脱窒対象と
なる窒素化合物を含有する媒体中に前記のごとき分離し
た微生物菌体を懸濁する。次に、こうして形成した、菌
体及び脱窒対象化合物を含有する反応媒体に、通気・撹
拌、振とう等の常用手段により好気的条件を付与すれば
よい。
【００１７】あるいは、培地から分離した菌体を固定化
して使用することもできる。生きた微生物菌体、特に細
菌菌体を担体に固定化し、あるいは菌体間を連結するこ
とにより固定化し、それを好気的条件下で反応に用いる
技術はすでに確立しており、常用の方法により菌体の固
定化、及び反応を行うことができる。例えば、脱窒用菌
の菌体を担体に固定し、その表面に脱窒対象窒素化合物
を含有する媒体を流過させ、その際に、好気的条件を確
保するために通気を行えばよい。
して使用することもできる。生きた微生物菌体、特に細
菌菌体を担体に固定化し、あるいは菌体間を連結するこ
とにより固定化し、それを好気的条件下で反応に用いる
技術はすでに確立しており、常用の方法により菌体の固
定化、及び反応を行うことができる。例えば、脱窒用菌
の菌体を担体に固定し、その表面に脱窒対象窒素化合物
を含有する媒体を流過させ、その際に、好気的条件を確
保するために通気を行えばよい。
【００１８】本発明における脱窒は、NH4 + →NH2OH →
NO2 - →NO3 - と変化する硝化反応と、NO3 - →NO2 -
→NO→N2O →N2と変化する脱窒反応との組合わせによっ
て行われると考えられる。従って、本発明の方法におい
ては、上記中間体窒素化合物のいずれもが脱窒対象化合
物となり得る。しかしながら、実用上最も重要なのは、
アンモニア態窒素（アンモニウムイオン）(NH4 + ）の脱
窒である。アンモニウムイオンの脱窒においては、脱窒
反応媒体中の初期アンモニウムイオンの濃度は３００〜
１５００mg／Ｌが好ましい。
NO2 - →NO3 - と変化する硝化反応と、NO3 - →NO2 -
→NO→N2O →N2と変化する脱窒反応との組合わせによっ
て行われると考えられる。従って、本発明の方法におい
ては、上記中間体窒素化合物のいずれもが脱窒対象化合
物となり得る。しかしながら、実用上最も重要なのは、
アンモニア態窒素（アンモニウムイオン）(NH4 + ）の脱
窒である。アンモニウムイオンの脱窒においては、脱窒
反応媒体中の初期アンモニウムイオンの濃度は３００〜
１５００mg／Ｌが好ましい。
【００１９】従って、例えば、アンモニウムイオンを含
有する排液の脱窒においては、アンモニウムイオン濃度
が所定の濃度となる量の排液を培地に添加して脱窒用細
菌を培養するか、あるいは排液により脱窒用媒体を調製
し、これに脱窒用菌体を添加すればよい。あるいは、排
液を所望により希釈した後に、固定化菌体表面と接触さ
せればよい。
有する排液の脱窒においては、アンモニウムイオン濃度
が所定の濃度となる量の排液を培地に添加して脱窒用細
菌を培養するか、あるいは排液により脱窒用媒体を調製
し、これに脱窒用菌体を添加すればよい。あるいは、排
液を所望により希釈した後に、固定化菌体表面と接触さ
せればよい。
【００２０】
【実施例】次に、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。実施例１ ．ＭＭ培地（K2HPO4 １４ｇ／Ｌ、KH2PO4 ６
ｇ／Ｌ、(NH4)2SO4 ２ｇ／Ｌ、クエン酸三ナトリウム
・二水和物 １ｇ／Ｌ及びMgSO4 ・H2O ０．２ｇ／
Ｌ）５mlを試験管（直径１８mm×長さ１８０mm）に入れ
て蒸気殺菌し、アルカリゲネス・フェカリスNo. ４株(F
ERM P-18114 ）を接種し、３０℃にて１６時間１２０sp
m （ストローク／分）で培養し、前培養物として、５０
０mLの三角フラスコに表１の培地３００mLを入れ、蒸気
殺菌し、これに上記の前培養物を１％（ｖ／ｖ）植菌
し、５００mL／分の通気を行い、培地に空気が均一に行
きわたるようにスターラーを用いて撹拌した。
説明する。実施例１ ．ＭＭ培地（K2HPO4 １４ｇ／Ｌ、KH2PO4 ６
ｇ／Ｌ、(NH4)2SO4 ２ｇ／Ｌ、クエン酸三ナトリウム
・二水和物 １ｇ／Ｌ及びMgSO4 ・H2O ０．２ｇ／
Ｌ）５mlを試験管（直径１８mm×長さ１８０mm）に入れ
て蒸気殺菌し、アルカリゲネス・フェカリスNo. ４株(F
ERM P-18114 ）を接種し、３０℃にて１６時間１２０sp
m （ストローク／分）で培養し、前培養物として、５０
０mLの三角フラスコに表１の培地３００mLを入れ、蒸気
殺菌し、これに上記の前培養物を１％（ｖ／ｖ）植菌
し、５００mL／分の通気を行い、培地に空気が均一に行
きわたるようにスターラーを用いて撹拌した。
【００２１】
【表１】
【００２２】培養を５０時間行い、その間に経時的にサ
ンプリングを行い、生菌数、NH4 +，NH2OH ，NO2 - ，N
O3 - ，NO及びN2O を測定した。また３０時間後にまた
は５０時間後に培養を終了し、菌体の元素分析を行い、
各中間体窒素化合物及び菌体成分の窒素収支からN2生産
量を算出した。各測定は次のようにして行った。
ンプリングを行い、生菌数、NH4 +，NH2OH ，NO2 - ，N
O3 - ，NO及びN2O を測定した。また３０時間後にまた
は５０時間後に培養を終了し、菌体の元素分析を行い、
各中間体窒素化合物及び菌体成分の窒素収支からN2生産
量を算出した。各測定は次のようにして行った。
【００２３】生菌数の測定 培養中の生菌数の測定は、平板希釈法により測定した。NH4 + の定量 NH4 + の定量には、インドフェノール法を使用した。N
o. ４株の培養液１mLを遠心分離（８０００rpm ×５mi
n)し、さらにフィルターろ過（ADVANTEC；pore size
０．２μｍ）して、除菌液を得た。この除菌液を１／１
０００希釈したもの１mLに、吸収液（ホウ酸５ｇを１リ
ットルの蒸留水に溶かしたもの）２００μＬ、フェノー
ル・ニトロプルシドナトリウム溶液（フェノール５ｇと
ニトロプルシドナトリウム２５mgを５００mLの蒸留水に
溶かしたもの）６００μＬ、次亜塩素酸ナトリウム溶液
（次亜塩素酸ナトリウム２０mLとNaOH１５ｇを１リット
ルの蒸留水に溶かしたもの）６００μＬを順に添加し、
試薬を添加する度にボルテックスにより十分撹拌した。
この溶液１ｈ静置し反応させた後、波長６４０nmの吸光
度を測定した。
o. ４株の培養液１mLを遠心分離（８０００rpm ×５mi
n)し、さらにフィルターろ過（ADVANTEC；pore size
０．２μｍ）して、除菌液を得た。この除菌液を１／１
０００希釈したもの１mLに、吸収液（ホウ酸５ｇを１リ
ットルの蒸留水に溶かしたもの）２００μＬ、フェノー
ル・ニトロプルシドナトリウム溶液（フェノール５ｇと
ニトロプルシドナトリウム２５mgを５００mLの蒸留水に
溶かしたもの）６００μＬ、次亜塩素酸ナトリウム溶液
（次亜塩素酸ナトリウム２０mLとNaOH１５ｇを１リット
ルの蒸留水に溶かしたもの）６００μＬを順に添加し、
試薬を添加する度にボルテックスにより十分撹拌した。
この溶液１ｈ静置し反応させた後、波長６４０nmの吸光
度を測定した。
【００２４】Ｌ培地中では、インドフェノール法の阻害
物質が存在するためNH4 + の定量はＭＭ培地のみ行っ
た。NH2OH の定量 NH2OH の定量には、R.C.Burrell(2)らの方法を使用し
た。No. ４株の培養液の除菌液２００μＬに０．０５Ｍ
リン酸バッファー（pH６．８）２００μＬと滅菌水１６
０μＬを加えた。次にトリクロロ酢酸水溶液（１２％）
４０μＬ、８−キノリノール溶液（１ｇ／１００ml脱水
エタノール）２００μＬ、１．０Ｍ NaCO 3 水溶液２０
０μＬを順に添加した。試薬を添加する度にボルテック
スにより十分撹拌した。合計１mLになった溶液を熱水
（８０℃）で１min 加熱し、１５min冷却後、波長７０
５nmの吸光度を測定した。NH2OH の検量線は、NH2OH の
標準液を用いて吸光度とNH2OH 量との関係から作成し
た。
物質が存在するためNH4 + の定量はＭＭ培地のみ行っ
た。NH2OH の定量 NH2OH の定量には、R.C.Burrell(2)らの方法を使用し
た。No. ４株の培養液の除菌液２００μＬに０．０５Ｍ
リン酸バッファー（pH６．８）２００μＬと滅菌水１６
０μＬを加えた。次にトリクロロ酢酸水溶液（１２％）
４０μＬ、８−キノリノール溶液（１ｇ／１００ml脱水
エタノール）２００μＬ、１．０Ｍ NaCO 3 水溶液２０
０μＬを順に添加した。試薬を添加する度にボルテック
スにより十分撹拌した。合計１mLになった溶液を熱水
（８０℃）で１min 加熱し、１５min冷却後、波長７０
５nmの吸光度を測定した。NH2OH の検量線は、NH2OH の
標準液を用いて吸光度とNH2OH 量との関係から作成し
た。
【００２５】NO2 - およびNO3 - の定量 NO2 - およびNO3 - の定量は、イオンクロマトグラフィ
ー（ＩＣ）を用いた。No. ４株の培養液の除菌液から、
さらにフィルター（C18CARTRIDGES, SEP-PACK)で有機物
を除去した後、ＩＣ（HIC-6A, SHIMAZU)で定量分析し
た。ＩＣの運転条件は、次の通りである。 ＩＣの運転条件 カラム：Shim-pack IC-A1, SHIMAZU 移動相：２．５mM フタル酸 ２．４mM トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン 流速：１．５mL／min 温度：４０℃ 検量線は、NO2 - は(NaNO2) のおよびNO3 - は(NaNO3)
の標準液を用いて、NO 2 - およびNO3 - とピーク面積と
の関係から作成した。
ー（ＩＣ）を用いた。No. ４株の培養液の除菌液から、
さらにフィルター（C18CARTRIDGES, SEP-PACK)で有機物
を除去した後、ＩＣ（HIC-6A, SHIMAZU)で定量分析し
た。ＩＣの運転条件は、次の通りである。 ＩＣの運転条件 カラム：Shim-pack IC-A1, SHIMAZU 移動相：２．５mM フタル酸 ２．４mM トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン 流速：１．５mL／min 温度：４０℃ 検量線は、NO2 - は(NaNO2) のおよびNO3 - は(NaNO3)
の標準液を用いて、NO 2 - およびNO3 - とピーク面積と
の関係から作成した。
【００２６】NOの測定 NOの測定は、NOX 計（AP1 200A型分析計 RIKEN KEIKI C
O., LTD.) を用いて行った。NOX 計は、試料ガス中のNO
とO3の反応によって生じる化学発光強度がNO濃度に比例
関係にあることを利用してNOを測定する分析計である。
また、NOの濃度は、３０７０ppb のNO標準ガスとの相関
性により算出される。
O., LTD.) を用いて行った。NOX 計は、試料ガス中のNO
とO3の反応によって生じる化学発光強度がNO濃度に比例
関係にあることを利用してNOを測定する分析計である。
また、NOの濃度は、３０７０ppb のNO標準ガスとの相関
性により算出される。
【００２７】NOの測定は、通気培養中の排気を直接NOX
計に送り込むことによって測定した。NOは、空気中で
は、すぐにNO2 に酸化されるため、NO＋NO2 でNOの値と
した。また、NO生産量は、サンプリング時のNO濃度を積
分することによって算出した。N2O の測定 N2O の測定には、ECD ガスクロマトグラフィー（GC-14
B, SHIMAZU)により測定した。通気実験中の排気をCaCl
2 管でH2O を除き、NaOH管でCO2 を除き(CO2の除去は、
N2O のピークに影響を与えるためを行った。）１００mL
サンプリング瓶に収集し測定を行った。また、N2O 生産
量は、サンプリング時の経時変化のN2O 濃度を積分する
ことによって算出した。また、N2O の濃度は、３５０pp
b のN2O 標準ガスとの相関性を用いて算出した。ECD ガ
スクロマトグラフィーの運転条件は次の通りである。 ECD ガスクロマトグラフィーの運転条件 GCカラム：Unibeads C, 1/8 ”＊2m ss tube, 70℃恒温 キャリヤーガス：窒素、４０mL／min ECD ：定電流１nA、レンジ１０0 、３００℃ ECD makeup gas：高純度メタン、４．２％ｖ／ｖ元素分析 窒素源であるNH4 + は、すべてが硝化反応、脱窒反応に
使われるわけではない。NH4 + は菌体生成にも使われる
ため乾燥菌体の重量測定、元素分析をおこなった。培養
３０時間後および５０時間後の培養液３００mLを遠心分
離（８０００rpm ×２０min)し、沈澱した菌体懸濁液を
滅菌水で２度十分に洗浄し、菌体の外部に付着している
物質を取り除いた後、１０５℃で菌体を完全に乾燥させ
た。乾燥菌体の重量を測定し、元素分析にかけて菌体中
の各元素（水素、炭素、窒素）の重量％を測定した。こ
れより菌体の窒素量を算出した。
計に送り込むことによって測定した。NOは、空気中で
は、すぐにNO2 に酸化されるため、NO＋NO2 でNOの値と
した。また、NO生産量は、サンプリング時のNO濃度を積
分することによって算出した。N2O の測定 N2O の測定には、ECD ガスクロマトグラフィー（GC-14
B, SHIMAZU)により測定した。通気実験中の排気をCaCl
2 管でH2O を除き、NaOH管でCO2 を除き(CO2の除去は、
N2O のピークに影響を与えるためを行った。）１００mL
サンプリング瓶に収集し測定を行った。また、N2O 生産
量は、サンプリング時の経時変化のN2O 濃度を積分する
ことによって算出した。また、N2O の濃度は、３５０pp
b のN2O 標準ガスとの相関性を用いて算出した。ECD ガ
スクロマトグラフィーの運転条件は次の通りである。 ECD ガスクロマトグラフィーの運転条件 GCカラム：Unibeads C, 1/8 ”＊2m ss tube, 70℃恒温 キャリヤーガス：窒素、４０mL／min ECD ：定電流１nA、レンジ１０0 、３００℃ ECD makeup gas：高純度メタン、４．２％ｖ／ｖ元素分析 窒素源であるNH4 + は、すべてが硝化反応、脱窒反応に
使われるわけではない。NH4 + は菌体生成にも使われる
ため乾燥菌体の重量測定、元素分析をおこなった。培養
３０時間後および５０時間後の培養液３００mLを遠心分
離（８０００rpm ×２０min)し、沈澱した菌体懸濁液を
滅菌水で２度十分に洗浄し、菌体の外部に付着している
物質を取り除いた後、１０５℃で菌体を完全に乾燥させ
た。乾燥菌体の重量を測定し、元素分析にかけて菌体中
の各元素（水素、炭素、窒素）の重量％を測定した。こ
れより菌体の窒素量を算出した。
【００２８】ブランク実験 窒素源であるNH4 + は、撹拌、通気などによってNH3 に
なり、気体となって放出される可能性がある。また、N
o. ４株がNH3 を放出している可能性もある。そこで、
上記フラスコと同一のものを用意し、３０時間および５
０時間、出口ガスから放出されるNH3 を３５mmol／Ｌの
硫酸１００mLに溶かし、NH3 量を前記の方法で測定し
た。
なり、気体となって放出される可能性がある。また、N
o. ４株がNH3 を放出している可能性もある。そこで、
上記フラスコと同一のものを用意し、３０時間および５
０時間、出口ガスから放出されるNH3 を３５mmol／Ｌの
硫酸１００mLに溶かし、NH3 量を前記の方法で測定し
た。
【００２９】結果は次の通りであった。通気実験による菌数及び硝化産物(NH2OH，NO2 - ，NO3
- ）の変化 通気培養によるNo. ４株の生菌数、及び培地中に生産さ
れた硝化産物(NH2OH，NO2 - ，NO3 - ）の経時変化を図
１に示す。培養初期から硝化産物が検出され、NO2 - ，
NO3 - ともに培養５０時間まで増加した。
- ）の変化 通気培養によるNo. ４株の生菌数、及び培地中に生産さ
れた硝化産物(NH2OH，NO2 - ，NO3 - ）の経時変化を図
１に示す。培養初期から硝化産物が検出され、NO2 - ，
NO3 - ともに培養５０時間まで増加した。
【００３０】通気培養によるNH4 + および脱窒中間生成
物（NO，N2O)の変化 通気培養によるNo. ４株のNH4 + と脱窒中間生成物（N
O，N2O)の経時変化を図２に示す。NO及びN2O は、共に
対数増殖期１０時間後より生産され、瞬間の濃度の最大
値は、培養３０時間後であり、その値は、NOは１３ppm
、N2O は２ppm であった。この間、NH4 + の減少が続
いた。硝化産物の生産の後、脱窒反応によりNO, NO2 が
生産されていることを意味している。
物（NO，N2O)の変化 通気培養によるNo. ４株のNH4 + と脱窒中間生成物（N
O，N2O)の経時変化を図２に示す。NO及びN2O は、共に
対数増殖期１０時間後より生産され、瞬間の濃度の最大
値は、培養３０時間後であり、その値は、NOは１３ppm
、N2O は２ppm であった。この間、NH4 + の減少が続
いた。硝化産物の生産の後、脱窒反応によりNO, NO2 が
生産されていることを意味している。
【００３１】乾燥菌体の元素分析 乾燥菌体の重量測定と元素分析を行った結果の１つを表
２の培養１に示す。乾燥菌体の重量は、９５８mg／Ｌで
あった。また、元素分析により乾燥菌体は、水素６％、
炭素４３％、窒素１２％を含んでいた。これらより、菌
体中の窒素量を算出（８３×０．１２／１４）すると、
８．２１mmol／Ｌという値となった。これは、NH4 + の
減少量１４．４mmol／Ｌの５７％であった。
２の培養１に示す。乾燥菌体の重量は、９５８mg／Ｌで
あった。また、元素分析により乾燥菌体は、水素６％、
炭素４３％、窒素１２％を含んでいた。これらより、菌
体中の窒素量を算出（８３×０．１２／１４）すると、
８．２１mmol／Ｌという値となった。これは、NH4 + の
減少量１４．４mmol／Ｌの５７％であった。
【００３２】ブランク実験 ブランク実験の結果、NH3 は０．８２mmol／Ｌ放出され
ていることがわかった。通気培養による窒素収支 通気培養による培養３０時間と５０時間後の窒素収支を
それぞれ表２および表３に示す。培養前と培養後の窒素
収支よりN2を算出した。２回の実験データを示した。
ていることがわかった。通気培養による窒素収支 通気培養による培養３０時間と５０時間後の窒素収支を
それぞれ表２および表３に示す。培養前と培養後の窒素
収支よりN2を算出した。２回の実験データを示した。
【００３３】
【表２】
【００３４】
【表３】
【００３５】
【発明の効果】表２および表３の窒素収支により算出し
たNo. ４株の窒素生産量は今まで報告された値の２〜２
０倍高い値であり、これらより、本発明の脱窒菌は、好
気条件下でNH4 + を高い割合でN2に変換していると予想
される。このことから、本発明の脱窒菌の利用法とし
て、生物的汚水処理システムに導入することが考えら
れ、好気槽一槽のみの窒素除去を可能にし、施設の縮
小、コストの削減が予想される。
たNo. ４株の窒素生産量は今まで報告された値の２〜２
０倍高い値であり、これらより、本発明の脱窒菌は、好
気条件下でNH4 + を高い割合でN2に変換していると予想
される。このことから、本発明の脱窒菌の利用法とし
て、生物的汚水処理システムに導入することが考えら
れ、好気槽一槽のみの窒素除去を可能にし、施設の縮
小、コストの削減が予想される。
【図１】図１は、本発明の脱窒菌No. ４株の表１に示す
培地における培養での生菌数、及び培地中に生産された
硝化産物(NH2OH，NO2 - 及びNO3 - ）の経時変化を示す
グラフである。
培地における培養での生菌数、及び培地中に生産された
硝化産物(NH2OH，NO2 - 及びNO3 - ）の経時変化を示す
グラフである。
【図２】図２は、本発明の脱窒菌No. ４株のＭ培地にお
ける培養でのNH4 + 濃度及び脱窒中間生成物（NO及びN2
O)の濃度の経時変化を示すグラフである。
ける培養でのNH4 + 濃度及び脱窒中間生成物（NO及びN2
O)の濃度の経時変化を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:05） Ｃ１２Ｒ 1:05）
Claims (2)
- 【請求項１】 アルカリゲネス・フェカリス(Alcaligen
es faecalis)細菌にアンモニア態窒素化合物を接触せし
めることによりアンモニア態窒素を窒素ガス（N2）に変
換する方法において、前記細菌が少なくとも１５２mg N
2O／日／リットル又は少なくとも０．６mmol／時／ｇ蛋
白質の脱窒速度を有することを特徴とする方法。 - 【請求項２】 前記アルカリゲネス・フェカリス細菌
が、アルカリゲネス・フェカリスNo. ４株(FERM P-1811
4 ）である、請求項１に記載の方法。
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| JP2001000745A JP3750053B2 (ja) | 2001-01-05 | 2001-01-05 | 脱窒方法 |
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|---|---|---|---|
| JP2001000745A JP3750053B2 (ja) | 2001-01-05 | 2001-01-05 | 脱窒方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002199875A true JP2002199875A (ja) | 2002-07-16 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008104361A (ja) * | 2006-10-23 | 2008-05-08 | Tokyo Institute Of Technology | 食塩存在下での脱窒方法 |
| JP2009534046A (ja) * | 2006-04-27 | 2009-09-24 | エコ ソルーシヨン | 排水処理用の新規の微生物、及び対応する方法 |
| JP2010054240A (ja) * | 2008-08-26 | 2010-03-11 | Mitsui Eng & Shipbuild Co Ltd | 一酸化二窒素の測定方法及び発生制御方法 |
| WO2011145516A1 (ja) | 2010-05-18 | 2011-11-24 | エイブル株式会社 | メタン生成の抑制方法 |
| KR101418710B1 (ko) * | 2013-09-27 | 2014-07-09 | 강원대학교산학협력단 | 질산화능 및 탈질능이 우수한 알칼리지너스 패칼리스 ｅｂｎ－ｎｓ13 (kctc 12471bp) |
| WO2014112640A1 (ja) * | 2013-01-21 | 2014-07-24 | 昭和電工株式会社 | 含窒素水処理システムおよび含窒素水処理方法 |
| KR20150121429A (ko) * | 2014-04-21 | 2015-10-29 | (주)케비젠 | 암모니아 및 황화수소 악취 저감 효과를 갖는 미생물 및 이의 용도 |
| JP2019010636A (ja) * | 2017-06-30 | 2019-01-24 | 三菱ケミカル株式会社 | 廃水の処理方法および廃水の処理装置 |
| JP2019030850A (ja) * | 2017-08-09 | 2019-02-28 | エイブル株式会社 | アルカリゲネス属菌を用いた廃水処理方法 |
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-
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- 2001-01-05 JP JP2001000745A patent/JP3750053B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JP4528981B2 (ja) * | 2006-10-23 | 2010-08-25 | 国立大学法人東京工業大学 | 食塩存在下での脱窒方法 |
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