JP4528981B2 - 食塩存在下での脱窒方法 - Google Patents
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Description
本発明における、アンモニア態窒素から窒素ガスへの変換は、実用上有利には連続培養方式で行うことが出来る。
本発明に使用することができる微生物としては、アルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)種の細菌に属し、0.35重量%以上の塩化ナトリウムの存在下で、アンモニア態窒素化合物を窒素ガスに変換することが出来る微生物であれば使用することができる。その具体例としては、アルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)No.4株(FERM P-18114)を挙げることが出来る。
後の実施例に示すとおり、本願発明の微生物によれば、0重量%〜6重量%の塩化ナトリウムの存在下でほぼ同程度の効率で脱窒を行うことが出来た。また6重量%の塩化ナトリウムの存在下での連続培養方式で脱窒を行うことができた。従って、本発明の方法は、塩化ナトリウム濃度が7重量%程度までは、実用上適用できるものと合理的に推測できる。従来技術においては、塩化ナトリウムの存在下で微生物的に脱窒が可能であるとは考えられていなかった。特に、アルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)を用いて1段階で脱窒を行う方法において、塩化ナトリウムの存在下で可能であることは示されていない。従って、本発明は、塩化ナトリウムの存在下で、特に0.5重量%以上の塩化ナトリウムの存在下で脱窒を行う方法を含む。
本発明の実施に当っては、本発明の微生物が増殖するのに十分な窒素源、炭素源、無機塩類、微量栄養素などを含む培地に、本発明の微生物を好気的な条件下で培養すればよい。アルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)が増殖しうる培地は当業界でよく知られており、本願発明の特徴をなすものではない。すなわち、本発明の微生物は、ペプトン、酵母エキスなどを主成分とする有機培地、及びリン酸カリウム、硫酸マグネシウムなどを主成分とする無機培地の何れにおいても増殖することが出来、脱窒のための菌体の生成のための培地としても有機培地および無機培地の何れも使用することができる。
他方、連続培養方式においては、培養槽に培地を仕込み、それに予め培養した微生物を接種し、微生物濃度が所定濃度に達した後、微生物の増殖速度と同じ速度で当該培養槽に新たな培地を連続的に供給し、同じ速度で培地を抜き取ればよい。大量の排水を処理するには連続方式が好ましい。
実施例1.
ポリペプトン10g/L、酵母エキス5g/L及びNaCl 5g/Lを含む150mlのL培地を含む坂口フラスコに、25%グリセリン保存液中、−80℃にて保存しておいたアルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)No.4株(FERM P-18114)を、1%の接種量で接種し、120 spm(1分間に120往復)、30℃にて24時間培養した(前々培養)。他方、下記表1に示す培地組成を有する培地(基礎無機培地)5mlを入れた試験管に、上記の前々培養物を1%の接種量で接種し、120 spm、30℃にて16時間培養した(前培養)。
NH 4 + の測定
インドール法を用いた。培養液1mlを遠心分離(8000rpm、5分間)し、更にフィルター濾過(ADVANCE;pore size 0.2μm)して除菌液を得た。この除菌液を1/1000希釈したもの1mlに、吸収液(ホウ酸5gを1Lの蒸留水に溶解したもの)200μL、フェノール・ニトロプルシドナトリウム溶液(フェノール5gとニトロプルシドナトリウム25mgを500mlの蒸留水に溶解したもの)600ml、次亜塩素酸ナトリウム溶液(ジア塩素酸ナトリウム20mlとNaOH 15gを1Lの蒸留水に溶解したもの)600μlを順に添加し、試薬を添加する度にボルテックスにより十分撹拌した、この溶液を1時間静止して反応させた後、波長640nmで吸光度を測定した。
NH2OHの測定は、R. Burrell et al, Ana. Chem., 27, p.1664-1665 (1955)の方法により行った。上記のようにして調製した培養液の除菌液200mLに、0.05Mリン酸緩衝液(pH 6.8)200μlと滅菌水160μlを加えた。次に、トリクロロ酢酸水溶液(12%)40μl、8−キノリール溶液(1g/100ml脱水エタノール)200μl、1.0M NaCO3水溶液200μlを順に添加した。試薬を添加する度にボルテックスにより十分撹拌した。合計1mlになった溶液を熱水(80℃)で1分間加熱し、15分間冷却後、波長705nmの吸光度を測定した。NH2OHの検量線は、NH2OHの標準液を用いて、吸光度とNH2OH量との関係から作成した。
NO2 -及びNO3 -の測定は、塩化ナトリウム無添加培地についてはイオンクロマトグラフィー(IC)法により行った。前記のようにして調製した培養液の除菌液から、更にフィルター(C18CARTRIDGES, SEP-PACK)により有機物を除去した後、IC(HIC-5A, SHIMAZU)で分析した。ICの運転条件は、次のとおりである。
移動相:2.5mM フタル酸、2.4トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
流速:1.5 ml/分
温度:40℃
検量線は、NO2 -はNaNO2の標準液を用いて、NO3 -はNaNO3の標準液を用いて、NO2 -及びNO3の量とピーク面積との関係から作成した。
NO2 -及びNO3 -の測定は、塩化ナトリウム添加培地についてはナフチルエチレンジアミン法を用いて行った。
菌体内窒素量の測定は、菌体に付着している物質を洗浄除去した後、105℃にて菌体を完全に乾燥し、元素分析により行った。
NaCl 0%培地、NaCl 3%培地、及びNaCl 6%培地における培養の結果を、それぞれ図1、図2及び図3に示す。培養の経過は、塩化ナトリウムの濃度の増加と共に幾分遅れるものの、最終的には塩化ナトリウム無添加の場合と同等の菌体量に達した。図4は、塩化ナトリウム濃度を異にする前記3種類の培地における、培地中のNH4 +−N窒素の減少を示す。何れの塩化ナトリウム濃度においても、培地中のアンモニア態窒素はほぼ完全に消滅した。
次に、培養後のサンプルについて、脱窒割合(初期アンモニア態窒素の量に対する脱窒だれた窒素の量の割合)は下記の表3に示すとおりである。塩化ナトリウム濃度が6重量%まで増加しても脱窒割合は殆ど低下しない。
培養方法
以下の手順で、オープン系での連続培養を実施した。
-80 ℃で保存したNo. 4株を1.5 mlを、150 ml のL培地(ポリペプトン10g/L, 酵母エキス 5g/L及び NaCl 5g/L)を入れた坂口フラスコに植菌し、120 spm、30 ℃、24 h、前培養を行った。次に、300 mlの合成培地(表1)を入れた坂口フラスコ3本に、前培養液をそれぞれ1.5 ml植菌し、120 spm、30 ℃で本培養を行い、24時間振とう培養を行った。
表5に連続培養の窒素収支を示す。
この結果から、この菌はオープン系での連続培養においても、脱窒素能力が低下することなく、アンモニアの処理が可能であることが分かる。
Claims (4)
- アルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)細菌にアンモニア態窒素化合物を接触せしめることによりアンモニア態窒素を窒素ガスに変換する方法において、当該アンモニア態窒素化合物が、1重量%〜6重量%の塩化ナトリウムを含む水性液中に存在することを特徴とする方法。
- 前記アルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)細菌が、アルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)No.4株(FERM P-18114)である、請求項1に記載の方法。
- 前記塩化ナトリウム濃度が3重量%〜6重量%である、請求項1又は2に記載の方法。
- アンモニア態窒素から窒素ガスへの変換を連続培養方式で行う、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
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