KR101418710B1 - 질산화능 및 탈질능이 우수한 알칼리지너스 패칼리스 ｅｂｎ－ｎｓ13 (kctc 12471bp) - Google Patents

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Abstract

본 발명은 새롭게 분리한 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP)을 제공하는데, 본 발명의 균주 및 그 배양액은 질산화 작용과 탈질 작용에 동시에 적용 가능하며, 우수한 질산화능 및 탈질능을 발휘한다.

Description

질산화능 및 탈질능이 우수한 알칼리지너스 패칼리스 ＥＢＮ－ＮＳ13 (KCTC 12471BP){Alcaligenes faecalis EBN-NS13 (KCTC 12471BP) having excellent ability of nitrification and denitrification}
본 발명은 질산화능 및 탈질능이 우수한 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 및 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 미생물 제제에 관한 것이다.
과거에는 하수나 폐수 처리를 위하여 보도 속(Bodo sp.), 모나스 속(Monas sp.), 퍼레네마 속(Peranema sp.), 보르티셀라 속(Vorticella sp.), 에피스티리스 속(Epistylis sp.), 오퍼큘라리아 속(Opercularia sp.), 주타미디엄 속(Zoothamnium sp.) 등과 같이 다양한 종의 미생물을 이용하는 표준활성슬러지법으로 하수 속의 유기물을 제거하였다. 그러나, 이와 같은 표준활성슬러지법을 이용한 대부분의 하수종말처리장의 경우, 유기물 제거만 고려한 설계가 되어있어 질소와 같은 영양물질의 제거율은 10~30%에 불과하였다. 이로 인해 하천과 호소에 유입되는 질소, 인은 하천의 용존산소 고갈 및 호소의 부영양화를 초래하게 되었고, 이에 따른 국내 하수실정에 맞는 질소 처리 공법 개발이 절실히 필요한 실정이다.
최근, 이와 같은 문제를 해결하기 위해 고도처리 공법개발이 진행됨과 동시에 고도처리에 관여하는 미생물에 대한 연구의 필요성도 높아졌다. 고도처리공정에서 질소를 제거하는 주된 메커니즘은 질산화(Nitrification) 작용과 탈질(Denitrification) 작용이 있다. 이러한 메커니즘에는 매우 다양한 미생물들이 관여하고 있는데, 유기성 질소와 암모니아성 질소가 호기적인 조건에서 질산성 질소로 전환되는 과정인 질산화 작용에는 니트로소모나스 속(Nitrosomonase sp.), 니트로박터 속(Nitrobactor sp.)과 같은 절대 호기성 화학무기독립영양세균이 관여하고, 질산성 질소가 무산소 조건에서 질소가스로 전환되어 대기 중으로 방출하는 과정인 탈질 작용에는 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 마이크로코커스 속(Micrococus sp.), 스피릴러스 속(Spirillus sp.), 바실러스 속(Bacillus sp.) 등의 통성 혐기성 종속영양세균이 주로 관여하는 것으로 알려져 있다.
이와 같이 수 처리에서는 각 공정마다 관여하는 미생물이 다르기 때문에 높은 처리효율을 얻기 위해서는 두 공정을 동시에 진행하는 신 균주를 선별하거나, 각 미생물에 대한 정확한 이해와 고도처리에 관여하는 미생물에 대한 더욱 폭넓은 연구가 절실히 필요하게 되었다.
한편, 정부의 상수원 보존을 위한 영양물질 규제 강화로 하수도법 제7조 제 1항, 하수도법 시행규칙 제3조 제1항 제1호 및 별표1에 의거, 총 질소(T-N)의 방류수수질기준은 2007년 60 mg/L 이하에서 2012년 20 mg/L 이하로 (1일 하수처리용량 50 m2 미만이 곳은 40 mg/L 이하로 예외)강화되었다.
최근에 국내에 신설되는 하수 처리장의 경우, 대부분이 고도처리 공법으로 시공되어 질소처리에 큰 문제가 없는 것처럼 보이나. 아직 노후 된 하수 처리장을 운영하는 많은 곳에서는 질소가 규제치를 벗어나는 경우가 빈번히 발생하는 실정이다.
질소가 가장 문제시되는 곳은 침출수 처리장과 축산폐수처리장 등이 있고, 질소가 문제시되는 폐수는 도금폐수, 비료 폐수, 도축 폐수 및 질소화합물을 원료로 하는 산업폐수 등이 있다. 질소를 처리하는 방법은 여러 가지가 있으나 그 중 가장 현실적이고 경제적인 방법은 미생물에 의한 생물학적 처리 방법이다. 대부분의 처리장이 생물학적 처리장을 갖추고 있기 때문에 기존 시설을 이용하여 처리효율을 향상시키는 접근이 용이하기 때문이다. 따라서, 질소 제거에 효율이 높은 미생물의 선별에 많은 연구가 필요한 실정이다.
대한민국 공개특허 제10-2005-0079114호(공개일자: 2005. 08. 09)에는 황산화 탈질 성능이 우수한 슈도모나스 속 B21(Pseudomonas sp. B21) 균주 (KACC 91066) 및 이를 질산성 질소의 탈질 처리에 이용하는 방법에 대해 개시되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-1222602호(등록일자: 2013. 01. 09)에는 종속영양탈질 및 독립영양탈질을 모두 수행하는 갖는 신종 카스텔라니에라(Castellaniella) 속 균주(KFCC 11514P), 이 균주의 세포, 배양액 또는 이들 혼합물을 유효성분으로 함유하는 탈질용 조성물 및 균주의 세포, 배양액 또는 이들의 혼합물을 수계 또는 토양에 공급하는 단계를 포함하는 탈질 방법에 대해 개시되어 있다.
본 발명은 질산화 작용 및 탈질 작용을 동시에 진행할 수 있는 신규한 균주를 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP)을 제공한다.
미생물을 이용하여 질소를 제거하는 과정은 질산화 공정(유기물 부패→NH3→NO2 -→NO3 -), 탈질화 공정(NO2 -→NO→N2O→N2)으로 각각의 과정에 작용하는 미생물이 다르다. NH3→NO2 - 에는 니트로소모나스 속(Nitrosomonas sp.), NO2 -→NO3 - 에는 니트로박터 속(Nitrobactor sp.), NO2 -→NO 에는 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 바실러스 속(Bacillus sp.)이 작용한다. 이처럼 각 과정마다 관여하는 미생물과 조건이 달라 종래에는 질소 제거에 어려움이 많았다.
이에, 본 발명은 질산화 작용 및 탈질 작용을 동시에 진행할 수 있는 균주에 대하여 예의연구하였고, 그 결과 본 발명에서 새롭게 분리한 본 발명의 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP)이 질산화능 및 탈질능이 우수함을 확인하였다.
상기 균주는 하수종말 처리장으로부터 분리되었는데, 하기의 실험 결과에 의하면, 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 배양액은 악취에 가장 큰 원인물질인 암모니아 제거능이 굉장히 우수하며, 온도, 염분, pH, 저온 및 암모늄 농도에 상관없이 우수한 질산화능 및 탈질능을 발휘함을 확인할 수 있다.
한편, 본 발명은 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 미생물 제제는 유효성분으로 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 또는 그 배양액을 함유하기만 하면 다양한 형태로, 다양한 부형제를 첨가하여 제조될 수 있다. 즉, 미생물 제제의 제조를 위해 필요하다면 담체 등을 사용할 수 있고, 미생물의 초기 생육을 담보할 수 있는 영양원 등이 같이 첨가될 수 있는 것이다.
또한, 제형의 제조에 있어서 필요할 경우, 전분을 비롯한 다양한 형태의 바인더를 사용하여 펠렛 형태로 제조할 수도 있다.
본 발명이 미생물 제제의 유효성분으로 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 또는 그 배양액을 사용하고 있고, 미생물 제제의 제조에 관한 일반적인 사항은 당업계의 통상의 지식을 이용할 수 있기 때문에, 미생물 제제의 제조에 관한 구체적 기재는 생략하기로 한다.
한편, 본 발명의 상기 미생물 제제는, 일 예로 하수 또는 오폐수 정화용일 수 있고, 하천, 강, 호수 및 해양 중 선택되는 어느 하나의 정화용일 수 있다. 또한, 상기 오폐수는 일 예로 축사 유래 오폐수일 수 있다.
한편, 본 발명의 상기 미생물 제제는, 일 예로 악취 가스 제거용일 수 있는데, 상기 악취 가스는 일 예로, 암모니아 유래인 것일 수 있다.
한편, 본 발명의 상기 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 배양액은, 일 예로 멸균된 LB 배지{10 g 염화나트륨(NaCl), 5 g 효모추출물(yeast extract), 10 g 트립톤(tryptone), 1 L 증류수(distilled water)}에 접종하여, 30℃, 150 rpm의 암조건에서 배양하여 수득된 배양액일 수 있다. 또한, 상기 배양액은 농축과정을 추가로 거쳐 농축된 것일 수도 있다.
또한, 상기 미생물 제제에 첨가되는 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 및 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 배양액은 제형에 따라, 액상 또는 분말상의 다양한 형태로 첨가될 수 있다.
본 발명에 의할 경우, 질산화능 및 탈질능이 우수한 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 및 이의 배양액을 함유하는 것을 특징으로 하는 질산화 및 탈질능이 우수한 하수처리용 미생물 제제를 제공할 수 있다.
도 1은 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 균주의 광학현미경 사진이다(좌 : 400배, 우 : 1,000배).
도 2는 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 균주의 그람염색 사진이다(1,000배).
도 3은 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium)에서 온도에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주의 생장곡선을 나타낸 도이다(○ : 15℃, ◇ : 20℃, □ : 25℃, △ : 30℃, ×: 37℃).
도 4는 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium)에서 온도에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주의 암모니아 제거율을 나타낸 도이다(○ : 15℃, ◇ : 20℃, □ : 25℃, △ : 30℃, ×: 37℃).
도 5는 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium)에서 온도에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주의 nitrite 변화를 나타낸 도이다(○ : 15℃, ◇ : 20℃, □ : 25℃, △ : 30℃, ×: 37℃).
도 6은 30℃, 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium)에서 초기 염분농도에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주의 생장곡선을 나타낸 도이다(◇ : 0%, □ : 1%, △ : 2%, ×: 3%, ○: 4%).
도 7은 30℃, 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium)에서 초기 염분농도에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주의 암모니아 제거율을 나타낸 도이다(◇ : 0%, □ : 1%, △ : 2%, ×: 3%, ○: 4%).
도 8은 30℃, 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium)에서 초기 염분농도에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주 배양액의 아질산염(nitrite) 변화를 나타낸 도이다(◇ : 0%, □ : 1%, △ : 2%, ×: 3%, ○: 4%).
도 9는 30℃, 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium)에서 초기 pH에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주의 생장곡선을 나타낸 도이다(◇ : pH 5, □ : pH 6, △ : pH 7, ×: pH 9, ○: pH 10).
도 10은 30℃, 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium)에서 초기 pH에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주의 암모니아 제거율을 나타낸 도이다 (◇ : pH 5, □ : pH 6, △ : pH 7, ×: pH 9, ○: pH 10).
도 11은 30℃, 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium)에서 초기 pH에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주 배양액의 아질산염(nitrite) 변화를 나타낸 도이다(◇ : pH 5, □ : pH 6, △ : pH 7, ×: pH 9, ○: pH 10).
도 12는 15℃, 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium)에서 초기 균주 접종량에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주의 생장곡선을 나타낸 도이다(◇ : 1%, □ : 2%, △ : 4%, ×: 6%).
도 13은 15℃, 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium)에서 초기 균주 접종량에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주의 암모니아 제거율을 나타낸 도이다(◇ : 1%, □ : 2%, △ : 4%, ×: 6%).
도 14는 15℃, 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium)에서 초기 균주 접종량에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주 배양액의 아질산염(nitrite) 변화를 나타낸 도이다(◇ : 1%, □ : 2%, △ : 4%, ×: 6%).
도 15는 15℃, 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium)에서 초기 균주 접종량에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주 배양액의 하이드록실아민(hydroxlyamine)의 변화를 나타낸 도이다(◇ : 1%, □ : 2%, △ : 4%, ×: 6%).
도 16은 30℃, 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium)에서 초기 암모늄 농도에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주의 생장곡선을 나타낸 도이다(◇ : 300 mg/L, □ : 450 mg/L, △ : 600 mg/L, ×: 750 mg/L, ●: 900 mg/L, ○: 1500 mg/L).
도 17은 30℃, 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium)에서 초기 암모늄 농도에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주의 암모니아 제거율을 나타낸 도이다(◇ : 300 mg/L, □ : 450 mg/L, △ : 600 mg/L, ×: 750 mg/L, ●: 900 mg/L, ○: 1500 mg/L).
도 18은 30℃, 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium)에서 초기 암모늄 농도에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주 배양액의 아질산염(nitrite) 변화를 나타낸 도이다(◇ : 300 mg/L, □ : 450 mg/L, △ : 600 mg/L, ×: 750 mg/L, ●: 900 mg/L, ○: 1500 mg/L).
도 19는 30℃, 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium)에서 초기 암모늄 농도에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주 배양액의 하이드록실아민(hydroxlyamine)의 변화를 나타낸 도이다(◇ : 300 mg/L, □ : 450 mg/L, △ : 600 mg/L, ×: 750 mg/L, ●: 900 mg/L, ○: 1500 mg/L).
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
실시예 : 알칼리지너스 패칼리스 ( Alcaligenes faecalis ) EBN - NS13 ( KCTC 12471BP) 균주 분리 및 동정
1) 균주의 분리
후보 균주 분리를 위해 춘천시 하수종말처리장에서 샘플을 채수한 후, 각 샘플을 멸균한 생리식염수(0.85% 염화나트륨)와 혼합하여 10-6까지 단계 희석(serial dilution) 하였다.
각각의 희석된 샘플 100 ㎕를 암모니아 산화 한천 배지(Ammonia oxidizing medium agar) [0.5 g 황산암모늄{(NH4)2SO4}, 13.5 g 인산나트륨(Na2HPO4), 0.7 g 일인산수소칼륨(KH2PO4), 0.1 g 사리염(MgSO4·7H2O), 0.18 g 염화칼슘이수화물(CaCl2·2H2O), 0.5 g 중탄산나트륨(NaHCO3), 0.014 g 염화제이철(FeCl3·6H2O), 15 g 한천 분말(agar powder), 1 L 증류수(distilled water)]와 아질산염 산화 한천 배지(Nitrite oxidizing medium agar) {0.5 g 질산나트륨(NaNO2), 13.5 g 인산나트륨(Na2HPO4), 0.7 g 일인산수소칼륨(KH2PO4), 0.1 g 사리염(MgSO4·7H2O), 0.18 g 염화칼슘이수화물(CaCl2·2H2O), 0.5 g 중탄산나트륨(NaHCO3), 0.014 g 염화제이철(FeCl3·6H2O), 15 g 한천 분말(agar powder), 1 L 증류수(distilled water)}에 도말하고 30℃ 암조건에서 정치배양 하였다.
콜로니가 형성되면 형태나 색 혹은 특성에 따라 유관상 구분하고 새로운 암모니아한천배지(Ammonia oxidizing medium agar)와 아질산염 산화 한천 배지(Nitrite oxidizing medium agar)에 획선배양 하였다. 그 후, 단일 콜로니만 나올 때까지 상기 각각의 배지에서 계대배양을 계속 실시하여 순수한 균주를 분리하였다.
2) 균주의 배양
암모니아 산화 한천 배지(Ammonia oxidizing medium agar)에서 순수하게 분리된 균주 콜로니 하나를 화염 멸균한 백금이를 이용하여 멸균된 LB 배지{10 g 염화나트륨(NaCl), 5 g 효모 추출물(yeast extract), 10 g 트립톤(tryptone), 1 L 증류수(distilled water)}에 접종하여, 30℃, 150 rpm의 암조건에서 1일간 배양하였다.
3) 균주의 스크리닝
상기에서 순수하게 분리된 균주들의 암모니아성 질소 제거능 시험을 통하여 선별하였으며, 1차 선별을 위해 상기 암모니아 산화 한천 배지(Ammonia oxidizing medium agar)와 아질산염 산화 한천 배지(Nitrite oxidiizing medium agar)에서 콜로니가 잘 자라나는 균주를 선택하였다.
암모니아성 질소 제거능 시험은 다음과 같이 수행하였다. 균주를 LB 배지에서 24 h, 150 rpm, 30℃에서 배양하였다. 그 후, 1 ㎖ 샘플을 취하고 10000×g, 4℃에서 5분 동안 원심분리한 후, 상층의 배지를 버리고 멸균 생리식염수 1 ㎖로 워싱(washing) 하는 과정을 2회 반복하였다. 생리식염수 100 ㎕를 암모니움 아세테이트 한천 배지(ammonium acetate agar) [11.2 g 최소 배지(minimal medium), 10 ㎖ 미량 원소(trace element), 5 mM 황산암모늄{(NH4)2SO4}, 50 mM 아세트산 나트륨 삼수화물(H3O2Na·3H2O), 15 g 한천 분말(agar powder), 1 L 증류수(distilled water)]에 도말한 후, 균주를 24 h, 30℃, 암조건에서 배양하였다. 그 후, 생성된 콜로니 위에 아질산염 칼라 시약(nitrite color regent) [그리스시약{(Griess's reagent); 25% 진한 염산(concentrated HCl)에 4% 설파닐아미드(sulfanilamide)를 녹임}, 0.08% 엔-1-나프탈렌디아민 디하이드로클로라이드(N-1-napthylendiamine dihydrochloride)]을 살포하고, 연분홍에서 적자색으로 변한 콜로니를 선택하였다.
4) 균주의 동정
암모니아 산화 한천 배지(Ammonia oxidizing medium agar)에서 순수 분리된 EBN-NS13 균주를 다용도 프라이머(universal primer) 518F(5’-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3’)와 800R(5’-TACCAGGGTATCTAATCC-3’)을 이용한 16S rRNA 시퀀싱(sequencing) 하여 얻은 염기서열을 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)등록 균주 염기서열과 비교하여 98% 이상 일치하면서 상동성이 가장 높게 나온 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 균주로 동정하였고, 2013년 8월 8일자에 한국생명공학연구원에 기탁하고, 기탁번호 KCTC 12471BP를 부여받았다.
도 1은 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 균주의 광학현미경 사진이고(좌 : 400배, 우 : 1,000배), 도 2는 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 균주의 그람염색 사진이며(1,000배), 하기 표 1은 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 균주의 일반적인 특성을 나타낸 표이다.
균주 종명 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13
그람 염색(Gram staining) 음성 (-)
운동성 O
모양 간균
실험예 1: 온도에 따른 알칼리지너스 패칼리스 ( Alcaligenes faecalis ) EBN -NS13 ( KCTC 12471 BP ) 균주의 생장 확인
본 실험예에서는 온도에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주의 생장을 확인하고자 하였다.
LB 고체배지의 균주 콜로니 하나를 LB 액체배지 100 ㎖에 접종한 후, 150 rpm, 30℃, 24 h, 암조건에서 배양하였다. 그 후, 배양액 1 ㎖를 암모니아 산화 배지(ammonium oxidizing medium) 100 ㎖에 접종하였다(1% 접종). 그 후, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 37℃의 온도조건에서 150 rpm 암조건으로 배양하고, 하루 단위로 OD600nm를 측정하여 생장을 확인하였다.
실험결과, 30~37℃에서 생장이 가장 빠르고 우수하였다. 특히, 30℃에서 24~48시간 동안 LB 배지에서 배양한 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP)의 OD600nm 값이 0.60~0.95로 가장 우수한 생장을 보였다. 한편, 온도가 30℃ 이하로 감소하면 생장도 같이 감소하였으나, 30~37℃에 비해서는 생장속도가 비교적 느리나 15℃에서도 생장이 이루어짐을 확인할 수 있었다(도 3).
실험예 2: 온도에 따른 알칼리지너스 패칼리스 ( Alcaligenes faecalis ) EBN -NS13 ( KCTC 12471 BP ) 균주의 암모니아 제거능 확인
본 실험예에서는 온도에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주의 암모니아 제거능을 확인하고자 하였다.
LB 고체배지의 균주 콜로니 하나를 LB 액체배지 100 ㎖에 접종한 후, 150 rpm, 30 ℃, 24 h, 암조건에서 배양하였다. 그 후, 배양액 1 ㎖를 암모니아 산화 배지(ammonium oxidizing medium) 100 ㎖에 접종한 후, 온도를 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 37℃로 변화를 주고, 150 rpm, 암조건에서 배양을 하며, 24시간 간격으로 네슬러법을 이용하여 NH4 +-N을 측정하였다.
네슬러법이란, 배양 중인 균주를 원심분리한 후. 상등액 1 ㎖를 바이알(vial)에 옮겨 담고, 네슬러 시약(Nessler's reagent) 2 ㎖, 10% 타르타르산 나트륨 칼륨(potassium sodium tartrate) 2 ㎖를 첨가한 후, 분광광도계를 이용하여 425 nm에서 흡광도를 측정하는 방법이다. 암모늄이 시료에 많이 있을수록 짙은 노란색~갈색으로 변한다.
표준곡선(Standard curve)은 황산암모늄(Ammonium sulfate)을 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium)에 농도별로 넣고, 네슬러법으로 측정하여 표준 곡선(standard curve)을 그리고 이를 바탕으로 실험값을 정량하였다.
실험결과, 2일 후, 25, 30, 37℃에서 암모니아의 제거율이 99%이상 이였고, 3일 후, 15℃에서는 79%, 20℃에서는 98%로 나타났으며, 7일 후에는 15℃에서 88%로 나타났다. 저온에서는 최적온도에서보다 느리지만 암모니아 제거능을 나타냈다. 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주는 온도에 많은 영향을 받지 않고 우수한 암모니아 제거능을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 4).
실험예 3: 온도에 따른 알칼리지너스 패칼리스 ( Alcaligenes faecalis ) EBN -NS13 ( KCTC 12471 BP ) 균주 배양액의 아질산염( nitrite ) 변화 확인
본 실험예에서는 온도에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주 배양액의 아질산염(nitrite) 변화를 확인하고자 하였다.
LB 고체배지의 균주 콜로니 하나를 LB 액체배지 100 ㎖에 접종한 후, 150 rpm, 30 ℃, 24 h, 암조건에서 배양하였다. 그 후, 배양액 1 ㎖를 암모니아 산화 배지(ammonium oxidizing medium) 100 ㎖에 접종한 후, 온도를 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 37℃로 변화를 주고, 150 rpm, 암조건에서 배양을 하며, 24시간 간격으로 디아조화(diazotization) 방법을 이용하여 NO2 --N을 측정하였다.
디아조화 방법(Diazotization method)이란, 배양 중인 균주를 원심분리한 후, 상등액 5 ㎖를 바이알(vial)에 옮겨 담고, 디아조화 시약(diazotization reagent) 0.1 ㎖를 넣은 후, 분광광도계를 이용하여 543 nm에서 흡광도를 측정하는 방법이다.
표준곡선(Standard curve)은 NaNO2를 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium) 배지에 농도별로 넣고 상기 디아조화(diazotization) 방법으로 측정하여 표준곡선(standard curve)을 그리고, 이를 바탕으로 실험값을 정량하였다.
실험결과, 온도에 상관없이, 아질산염(nitrite)의 양이 불규칙적으로 변화함을 확인할 수 있었다. 상기와 같은 결과는 질산화가 잘 진행되고 있다는 간접적인 증거이므로, 본 발명의 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주는 온도와 상관없이 질산화가 진행됨을 확인할 수 있었다(도 5).
실험예 4: 염분농도에 따른 알칼리지너스 패칼리스 ( Alcaligenes faecalis ) EBN-NS13 ( KCTC 12471 BP ) 균주의 생장 확인
본 실험예에서는 염분농도에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주의 생장을 확인하고자 하였다.
LB 고체배지의 균주 콜로니 하나를 LB 액체배지 100 ㎖에 접종하고, 150 rpm, 30℃, 24 h, 암조건에서 배양하였다. 그 후, 배양액 1 ㎖를 0, 1, 2, 3, 4% 염화나트륨(NaCl)이 포함된 각각의 암모니아 산화 배지(ammonium oxidizing medium) 100 ㎖에 접종하였다 (1% 접종). 그 후, 30℃, 150 rpm, 암조건으로 배양하며, 24시간 간격으로 OD600nm를 측정하여 균주의 생장을 확인하였다.
실험결과, 염분의 농도가 4%일 때, OD600nm 값이 0.96으로 최대 생장을 나타냈다. 또한, 4% 이내의 염분농도에서는 균주 생장에 큰 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다(도 6).
실험예 5: 염분농도에 따른 알칼리지너스 패칼리스 ( Alcaligenes faecalis ) EBN-NS13 ( KCTC 12471 BP ) 균주의 암모니아 제거능 확인
본 실험예에서는 염분농도에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주의 암모니아 제거능을 확인하고자 하였다.
LB 고체배지의 균주 콜로니 하나를 LB 액체배지 100 ㎖에 접종하고, 150 rpm, 30℃, 24 h, 암조건에서 배양하였다. 그 후, 배양액 1 ㎖를 0, 1, 2, 3, 4% 염화나트륨(NaCl)이 포함된 각각의 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium) 100 ㎖에 접종하였다(1% 접종). 그 후, 30℃, 150 rpm, 암조건으로 배양하며, 24시간 간격으로 네슬러법을 이용하여 NH4 +-N을 측정하였다.
실험결과, 1일째, 0% 염분농도에서 94%의 가장 우수한 암모니아 제거율을 나타냈고, 4% 염분농도에서 약 74%로 비교적 우수한 암모니아 제거율을 나타냈다. 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주는 염도에 큰 영향없이 암모니아 제거능이 우수함을 확인할 수 있었다(도 7).
실험예 6: 염분농도에 따른 알칼리지너스 패칼리스 ( Alcaligenes faecalis ) EBN-NS13 ( KCTC 12471 BP ) 균주 배양액의 아질산염( nitrite ) 변화 확인
본 실험예에서는 염분농도에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주 배양액의 아질산염(nitrite) 변화를 확인하고자 하였다.
LB 고체배지의 균주 콜로니 하나를 LB 액체배지 100 ㎖에 접종하고, 150 rpm, 30℃, 24 h, 암조건에서 배양하였다. 그 후, 배양액 1 ㎖를 0, 1, 2, 3, 4% 염화나트륨(NaCl)이 포함된 각각의 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium) 100 ㎖에 접종하였다(1% 접종). 그 후, 30℃, 150 rpm, 암조건으로 배양하며, 24시간 간격으로 디아조화(diazotization) 방법을 이용하여 NO2 --N을 측정하였다.
실험결과, 염분농도에 상관없이, 아질산염(nitrite)의 양이 불규칙적으로 변화함을 확인할 수 있었다. 상기와 같은 결과는 질산화가 잘 진행되고 있다는 간접적인 증거이므로, 본 발명의 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주는 염분이 있는 곳에서도 질산화가 진행됨을 확인할 수 있었다(도 8).
실험예 7: 초기 pH 에 따른 알칼리지너스 패칼리스 ( Alcaligenes faecalis ) EBN-NS13 ( KCTC 12471 BP ) 균주의 생장 확인
본 실험예에서는 초기 pH에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주의 생장을 확인하고자 하였다.
LB 고체배지의 균주 콜로니 하나를 LB 액체배지 100 ㎖에 접종한 후, 150 rpm, 30℃, 24h, 암조건에서 배양하였다. 그 후, 배양액 1 ㎖를 20% 염산(HCl)과 40% 수산화나트륨(NaOH)으로 초기 pH가 각각 pH 5, 6, 7, 9, 10으로 보정된 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium) 100 ㎖에 접종하였다(1% 접종). 그 후, 30℃, 150 rpm 암조건으로 배양하며, 24시간 간격으로 OD600nm 값을 측정하여 균주의 생장을 확인하였다.
실험결과, pH 6~9 범위에서 2일째 OD600nm 값이 0.86~0.97로 최적의 생장곡선을 보였다(도 9).
실험예 8: 초기 pH 에 따른 알칼리지너스 패칼리스 ( Alcaligenes faecalis ) EBN-NS13 ( KCTC 12471 BP ) 균주의 암모니아 제거능 확인
본 실험예에서는 초기 pH에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주의 암모니아 제거능을 확인하고자 하였다.
LB 고체배지의 균주 콜로니 하나를 LB 액체배지 100 ㎖에 접종한 후, 150 rpm, 30℃, 24 h, 암조건에서 배양하였다. 그 후, 배양액 1 ㎖를 20% 염산(HCl)과 40% 수산화나트륨(NaOH)으로 초기 pH가 각각 pH 5, 6, 7, 9, 10으로 보정된 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium) 100 ㎖에 접종하였다(1% 접종). 그 후, 30℃, 150 rpm 암조건으로 배양하며, 24시간 간격으로 네슬러법을 이용하여 NH4 +-N을 측정하였다.
실험결과, pH 6~9 범위에서 최적의 암모니아 제거능을 나타내었다. 또한, 제거 시간이 최적 pH 보다 오래 걸리지만 pH 5와 10에서도 암모니아 제거능을 나타냈다(도 10). 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주는 다양한 pH에서도 암모니아 제거능을 발휘함을 확인할 수 있었다
실험예 9: 초기 pH 에 따른 알칼리지너스 패칼리스 ( Alcaligenes faecalis ) EBN-NS13 ( KCTC 12471 BP ) 균주 배양액의 아질산염( nitrite ) 변화 확인
본 실험예에서는 초기 pH에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주 배양액의 아질산염(nitrite) 변화를 확인하고자 하였다.
LB 고체배지의 균주 콜로니 하나를 LB 액체배지 100 ㎖에 접종한 후, 150 rpm, 30℃, 24 h, 암조건에서 배양하였다. 그 후, 배양액 1 ㎖를 20% 염산(HCl)과 40% 수산화나트륨(NaOH)으로 초기 pH가 pH 5, 6, 7, 9, 10으로 보정된 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium) 100 ㎖에 접종하였다(1% 접종). 그 후, 30℃, 150 rpm 암조건으로 배양하며, 24시간 간격으로 디아조화(diazotization)을 이용하여 NO2 --N을 측정하였다.
실험결과, 초기 pH에 상관없이, 아질산염(nitrite)의 양이 불규칙적으로 변화함을 확인할 수 있었다. 상기와 같은 결과는 질산화가 잘 진행되고 있다는 간접적인 증거이므로, 본 발명의 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주는 초기 pH와 상관없이 질산화가 진행됨을 확인할 수 있었다(도 11).
실험예 10: 저온에서 초기 균주 접종량에 따른 알칼리지너스 패칼리스( Alcaligenes faecalis ) EBN - NS13 ( KCTC 12471 BP ) 균주의 생장 확인
본 실험예에서는 저온에서 초기 균주 접종량에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주의 생장을 확인하고자 하였다.
LB 고체배지의 균주 콜로니 하나를 LB 액체배지 100 ㎖에 접종하고, 150 rpm, 30℃, 24 h, 암조건에서 배양하였다. 그 후, 배양액 1, 2, 3, 6 ㎖를 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium) 100 ㎖에 접종하고(1, 2, 4, 6% 접종), 15℃, 150 rpm, 암조건으로 배양하며, 24시간 간격으로 OD600nm를 측정하여 균주의 생장을 확인하였다.
실험결과, 저온에서 초기 균주 접종량이 많아질수록 대수생장기가 짧아짐을 확인하였고, OD600nm 값의 최고 수치는 0.71~0.77으로 저온에서도 균주의 생장이 우수함을 확인할 수 있었다(도 12).
실험예 11: 저온에서 초기 균주 접종량에 따른 알칼리지너스 패칼리스( Alcaligenes faecalis ) EBN - NS13 ( KCTC 12471 BP ) 균주의 암모니아 제거능 확인
본 실험예에서는 저온에서 초기 균주 접종량에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주의 암모니아 제거능을 확인하고자 하였다.
LB 고체배지의 균주 콜로니 하나를 LB 액체배지 100 ㎖에 접종하고, 150 rpm, 30℃, 24 h, 암조건에서 배양하였다. 그 후, 배양액 1, 2, 3, 6 ㎖를 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium) 100 ㎖에 접종하고(1, 2, 4, 6% 접종), 15℃, 150 rpm, 암조건으로 배양하며, 24시간 간격으로 네슬러법을 이용하여 NH4 +-N 측정하였다.
실험결과, 2일째부터, 초기 균주 접종량이 많을수록 암모니아 제거능이 우수함을 확인할 수 있었다(도 13). 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주는 저온에서도 우수한 암모니아 제거능을 발휘함을 확인할 수 있었다.
실험예 12: 저온에서 초기 균주 접종량에 따른 알칼리지너스 패칼리스( Alcaligenes faecalis ) EBN - NS13 ( KCTC 12471 BP ) 균주 배양액의 아질산염( nitrite ) 변화 확인
본 실험예에서는 저온에서 초기 균주 접종량에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주 배양액의 아질산염(nitrite) 변화를 확인하고자 하였다.
LB 고체배지의 균주 콜로니 하나를 LB 액체배지 100 ㎖에 접종하고, 150 rpm, 30℃, 24h, 암조건에서 배양하였다. 그 후, 배양액 1, 2, 3, 6 ㎖를 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium) 100 ㎖에 접종하고(1, 2, 4, 6% 접종), 15℃, 150 rpm, 암조건으로 배양하며, 24시간 간격으로 디아조화(diazotization) 방법을 이용하여 NO2 --N을 측정하였다.
실험결과, 수중의 암모니아성 질소(NH3 -N)나 유기성 질소(Organic nitrogne)를 산화하여 생성되는 아질산염(nitrite)이 꾸준히 상승하였다. 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주는 저온에서도 질산화가 진행됨을 확인할 수 있었다(도 14).
실험예 13: 초기 균주 접종량에 따른 알칼리지너스 패칼리스( Alcaligenes faecalis ) EBN - NS13 ( KCTC 12471 BP ) 균주 배양액의 하이드록실아민 ( hydroxlyamine ) 변화 확인
본 실험예에서는 저온에서 초기 균주 접종량에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주 배양액의 하이드록실아민(hydroxlyamine) 변화를 확인하고자 하였다.
LB 고체배지의 균주 콜로니 하나를 LB 액체배지 100 ㎖에 접종하고, 150 rpm, 30℃, 24 h, 암조건에서 배양하였다. 그 후, 배양액 1, 2, 3, 6 ㎖를 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium) 100 ㎖에 접종하고(1, 2, 4, 6% 접종), 15℃, 150 rpm, 암조건으로 배양하였다. 배양 중인 균주를 원심분리한 후, 상등액 1 ㎖를 튜브에 옮겨 담고, pH 6.8, 0.05 M의 인산완충용액(phosphate buffer) 1 ㎖, 증류수 2.8 ㎖, 증류수에 12% 녹인 트리클로로아세트산 용액(Trichloroacetic acid solution 0.2 ㎖, 100 ㎖의 앱솔루트 에틸 알콜(absolute-ethyl-alcohol)에 1 g의 8-퀴놀리놀(8-Quinolinol)을 녹여 제조된 8-퀴놀리놀(8-Quinolinol solution) 1 ㎖를 넣고 흔들어주었다. 그 후, 1 M 탄산 나트룸 용액(sodium carbonate solution) 1 ㎖를 넣은 다음, 끓는 물에서 1분 동안 방치하고, 상온에서 15분 동안 식힌 후, 705 nm에서 흡광도를 측정하였다.
표준곡선(Standard curve)은 상기 원심분리한 후, 상등액을 넣는 과정에서 상등액 대신 하이드록실아민(hydroxylamine)을 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium)에 농도별로 넣고 이하 과정을 상기와 같이 수행하여 표준 곡선(standard curve)을 그리고, 이를 바탕으로 실험값을 정량하였다.
실험결과, 하이드록실아민의 생성량은 상기 실험예 11에서 확인된 암모니아 제거 효율(도 13)과 비례하여 측정되었다. 하이드록실아민은 질산화 과정 중 잠시 나타나는 불안정한 중간대사산물로, 상기와 같은 결과로부터 질산화 과정이 진행되고 있다는 것을 확인할 수 있다(도 15).
실험예 14: 초기 암모늄 농도에 따른 알칼리지너스 패칼리스( Alcaligenes faecalis ) EBN - NS13 ( KCTC 12471 BP ) 균주의 생장 확인
본 실험예에서는 초기 암모늄 농도에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주의 생장을 확인하고자 하였다.
LB 고체배지의 균주 콜로니 하나를 LB 액체배지 100 ㎖에 접종한 후, 150 rpm, 30℃, 24 h, 암조건에서 배양하였다. 그 후, 배양액 1 ㎖를 (NH4)2OH가 300, 450, 600, 750, 900, 1500 mg/L 포함된 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium) 100 ㎖에 접종하고(1% 접종), 30℃, 150 rpm, 암조건으로 배양하며, 24시간 간격으로 OD600nm를 측정하여 균주의 생장을 확인하였다.
실험결과, 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주는 초기 암모늄 농도에 상관없이 일정하게 생장함을 확인할 수 있었다(도 16).
실험예 15: 초기 암모늄 농도에 따른 알칼리지너스 패칼리스 ( Alcaligenes faecalis ) EBN - NS13 ( KCTC 12471 BP ) 균주의 암모니아 제거능 확인
본 실험예에서는 저온에서 초기 암모늄 농도에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주의 암모니아 제거능을 확인하고자 하였다.
LB 고체배지의 균주 콜로니 하나를 LB 액체배지 100 ㎖에 접종한 후, 150 rpm, 30℃, 24 h, 암조건에서 배양하였다. 그 후, 배양액 1 ㎖를 (NH4)2OH가 300, 450, 600, 750, 900, 1500 mg/L 포함된 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium) 100 ㎖에 접종하고(1% 접종), 30℃, 150 rpm, 암조건으로 배양하며, 24시간 간격으로 네슬러법을 이용하여 NH4 +-N을 측정하였다.
실험결과, 4일째까지는 초기 암모늄 농도 300 mg/L에서는 72%, 1500 mg/L에서는 54%의 암모니아 제거율을 나타내어 암모늄 농도를 높혔을 때, 암모니아 제거능이 감소하였으나, 그 이후로는 큰 변화가 없었다. 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주는 높은 암모늄 농도에서도 암모니아 제거능을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 17).
실험예 16: 초기 암모늄 농도에 따른 알칼리지너스 패칼리스( Alcaligenes faecalis ) EBN - NS13 ( KCTC 12471 BP ) 균주 배양액의 아질산염( nitrite ) 변화 확인
본 실험예에서는 초기 암모늄 농도에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주 배양액의 아질산염(nitrite) 변화를 확인하고자 하였다.
LB 고체배지의 균주 콜로니 하나를 LB 액체배지 100 ㎖에 접종한 후, 150 rpm, 30℃, 24 h, 암조건에서 배양하였다. 그 후, 배양액 1 ㎖를 (NH4)2OH가 300, 450, 600, 750, 900, 1500 mg/L 포함된 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium) 100 ㎖에 접종하고(1% 접종), 30℃, 150 rpm, 암조건으로 배양하며, 24시간 간격으로 디아조화(diazotization) 방법을 이용하여 NO2 --N을 측정하였다.
실험결과, 초기 암모늄 농도에 상관없이, 아질산염(nitrite)의 양이 불규칙적으로 변화함을 확인할 수 있었다. 상기와 같은 결과는 질산화가 잘 진행되고 있다는 간접적인 증거이므로, 본 발명의 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주는 초기 암모늄 농도와 상관없이 질산화가 진행됨을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 18).
실험예 17: 초기 암모늄 농도에 따른 알칼리지너스 패칼리스( Alcaligenes faecalis ) EBN - NS13 ( KCTC 12471 BP ) 균주 배양액의 하이드록실아민 ( hydroxlyamine ) 변화 확인
본 실험예에서는 초기 암모늄 농도에 따른 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주 배양액의 하이드록실아민(hydroxlyamine) 변화를 확인하고자 하였다.
LB 고체배지의 균주 콜로니 하나를 LB 액체배지 100 ㎖에 접종한 후, 150 rpm, 30℃, 24 h, 암조건에서 배양하였다. 그 후, 배양액 1 ㎖를 (NH4)2OH가 300, 450, 600, 750, 900, 1500 mg/L 포함된 암모니움 산화 배지(ammonium oxidizing medium) 100 ㎖에 접종하고(1% 접종), 30℃, 150 rpm, 암조건으로 배양하였다. 배양 중인 균주를 원심분리한 후, 상등액 1 ㎖를 튜브에 옮겨 담고, pH 6.8, 0.05 M의 인산완충용액(phosphate buffer) 1 ㎖, 증류수 2.8 ㎖, 증류수에 12% 녹인 트리클로로아세트산 용액(Trichloroacetic acid solution 0.2 ㎖, 100 ㎖의 앱솔루트 에틸 알콜(absolute-ethyl-alcohol)에 1 g의 8-퀴놀리놀(8-Quinolinol)을 녹여 제조된 8-퀴놀리놀(8-Quinolinol solution) 1 ㎖를 넣고 흔들어주었다. 그 후, 1 M 탄산 나트룸 용액(sodium carbonate solution) 1 ㎖를 넣은 다음, 끓는 물에서 1분 동안 방치하고, 상온에서 15분 동안 식힌 후, 705 nm에서 흡광도를 측정하였다.
표준곡선(Standard curve)은 상기 실험예 13과 같은 방법으로 그렸고, 이를 바탕으로 실험값을 정량하였다.
실험결과, 하이드록실아민의 생성량은 상기 실험예 15에서 확인된 암모니아 제거 효율(도 17)과 비례하여 측정되었다. 하이드록실아민은 질산화 과정 중 잠시 나타나는 불안정한 중간대사산물로, 상기와 같은 결과로부터 질산화 과정이 진행되고 있다는 것을 확인할 수 있었다(도 19).
실험예 18: 알칼리지너스 패칼리스 ( Alcaligenes faecalis ) EBN - NS13 ( KCTC 12471 BP ) 균주와 바실러 스 메틸로트로피쿠스 스트레인 엘7 ( Bacillus methylotrophicus strain L7 ) 균주의 암모늄 제거능 비교
본 실험예에서는 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주와 바실러스 메틸로트로피쿠스 스트레인 엘7(Bacillus methylotrophicus strain L7) 균주의 암모늄 제거능을 비교하고자 하였다.
Zhang, Q. L., Liu, Y., Ai, G. M., Miao, L. L., Zheng, H. Y., Liu, Z. P., 2012. The characteristics of a novel heterotrophic nitrification-aerobic denitrification bacterium, Bacillus methylotrophicus strain L7. Bioresource Technology . 108:35-44에 따르면 바실러스 메틸로트로피쿠스 스트레인 엘7(Bacillus methylotrophicus strain L7) 균주를 접종하고 5일 후, 측정된 비교 균주의 암모늄 제거율은 하기 표 2와 같다.
Initial NH4 +-N
(mg/L)		 OD600 NO2 --N
(mg/L)		 Final NH4 +-N
(mg/L)		 Removal efficiency
(mg/d)
78.750 0.256±0.009 0.108±0.005 28.901±1.047 11.08
427.444 0.360±0.064 0.179±0.021 229.110±25.783 41.22
1121.241 0.644±0.052 0.154±0.017 711.988±29.466 90.95
Values are means ± SD for triplicates.
Initial NH4 +-N
(mg/L)		 Final NH4 +-N
(mg/L)		 Removal efficiency
(mg/d)
139.9 0.043±0.028 34.96423
300 79.177±1.708 55.20568
450 223.435±1.814 56.64128
600 200.125±4.548 99.96879
750 306.918±14.636 110.7706
900 381.717±19.536 129.5707
1500 658.093±25.402 210.476
상기 표 3은 본 발명의 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주를 접종하고 4일 후, 암모늄 제거율을 측정한 결과이다.
실험결과, 상기 표 2 내지 3에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 균주는 시간이 짧음에도 불구하고, 기존에 암모늄 제거 효율이 우수하다고 알려진 비교 균주보다 암모늄 제거 효율이 약 2배 이상 높은 것을 확인할 수 있었다.
한국생명공학연구원 KCTC12471BP 20130808

Claims (7)

  1. 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP).
  2. 삭제
  3. 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하며,
    하수 또는 축사 유래 오폐수 정화용인 것을 특징으로 미생물 제제.
  4. 삭제
  5. 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하며,
    암모니아 유래 악취 가스 제거용인 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
  6. 삭제
  7. 알칼리지너스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) EBN-NS13 (KCTC 12471BP) 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하며,
    하천, 강, 호수 및 해양 중 선택되는 어느 하나의 정화용인 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150121429A (ko) * 2014-04-21 2015-10-29 (주)케비젠 암모니아 및 황화수소 악취 저감 효과를 갖는 미생물 및 이의 용도

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108707570B (zh) * 2018-06-15 2020-12-01 中国科学院亚热带农业生态研究所 一株具有对高氨氮废水快速脱氮功能的异养硝化菌及其应用
CN109110912A (zh) * 2018-09-27 2019-01-01 河北建设集团安装工程有限公司 一种纳污坑塘黑臭水体治理方法
CN111218410B (zh) * 2018-11-26 2021-10-01 中国科学院微生物研究所 一株产碱菌菌株ho-1及其应用
CN111117912B (zh) * 2019-12-28 2021-07-30 北京翰祺环境技术有限公司 一种耐盐反硝化细菌菌株、菌液、筛选方法和应用
CN112501075B (zh) * 2020-12-17 2022-11-04 青岛尚德生物技术有限公司 粪产碱杆菌在制备用于降解水产养殖水体中氨氮和亚硝酸盐氮的微生物菌剂中的应用
CN116376756B (zh) * 2023-03-09 2023-10-03 清远海贝生物技术有限公司 一种好氧反硝化菌及其在污水处理中的应用
CN117050922B (zh) * 2023-10-11 2023-12-08 江苏聚庚科技股份有限公司 一种含氟苯腈类化合物降解菌及其在环境治理中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002199875A (ja) * 2001-01-05 2002-07-16 Rikogaku Shinkokai 脱窒方法
JP2005034783A (ja) 2003-07-17 2005-02-10 New Industry Research Organization 微生物を利用してｎｈ４＋とｎｏ３−とを同時除去する硝化・脱窒方法
KR20050079114A (ko) * 2004-02-04 2005-08-09 정욱진 황산화 탈질능을 가진 신균주 슈도모나스 속 비21 및 이를 이용한 질산성 질소의 탈질 처리방법
JP2009534046A (ja) 2006-04-27 2009-09-24 エコ ソルーシヨン 排水処理用の新規の微生物、及び対応する方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100666723B1 (ko) * 2006-01-19 2007-01-09 정욱진 고농도의 질산성 질소를 제거할 수 있는 황 산화 독립 영양탈질 미생물인 골도니아 속 ｃｒ 균주
KR101222602B1 (ko) * 2011-07-26 2013-01-16 부산대학교 산학협력단 혼합영양 탈질능력을 가지는 신규 카스텔라니엘라 균주와 이를 이용한 탈질공정

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002199875A (ja) * 2001-01-05 2002-07-16 Rikogaku Shinkokai 脱窒方法
JP2005034783A (ja) 2003-07-17 2005-02-10 New Industry Research Organization 微生物を利用してｎｈ４＋とｎｏ３−とを同時除去する硝化・脱窒方法
KR20050079114A (ko) * 2004-02-04 2005-08-09 정욱진 황산화 탈질능을 가진 신균주 슈도모나스 속 비21 및 이를 이용한 질산성 질소의 탈질 처리방법
JP2009534046A (ja) 2006-04-27 2009-09-24 エコ ソルーシヨン 排水処理用の新規の微生物、及び対応する方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150121429A (ko) * 2014-04-21 2015-10-29 (주)케비젠 암모니아 및 황화수소 악취 저감 효과를 갖는 미생물 및 이의 용도
KR101580780B1 (ko) 2014-04-21 2015-12-29 (주)케비젠 암모니아 및 황화수소 악취 저감 효과를 갖는 미생물 및 이의 용도

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