KR20200086936A

KR20200086936A - 미생물을 이용한 규조토 고결화 기술

Info

Publication number: KR20200086936A
Application number: KR1020190003328A
Authority: KR
Inventors: 조윤래; 신동민; 성호선
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2019-01-10
Filing date: 2019-01-10
Publication date: 2020-07-20

Abstract

본 발명은 미생물을 이용한 규조토의 고결화 기술 개발에 관한 것으로, 미생물을 이용한 규조토 고결화 조성물을 제공하여 미생물광물화작용(Microbially Induced Carbonate Precipitation, MICP)에 의해 발생하는 고결화작용(Cementation)을 이용하여 기존에 사용하던 결합제로 인해 발생하던 규조토 입자 공극손실을 최소화할 수 있다.

Description

미생물을 이용한 규조토 고결화 기술{Development of cementation of diatomite using microbial biomineralization}

본 발명은 미생물을 이용한 규조토의 고결화 기술 개발에 관한 것이다.

규조토는 담수와 해수에 주로 분포하는 크기 20~100㎛의 단세포 조류(algae)인 규조류(diatom) 유해가 퇴적되어 형성된 퇴적암이다. 규조류는 일반적인 조류와는 달리 세포벽에 함수규산(SiO₂nH₂O)이 포함되어 있어 화학처리 및 열처리에도 강한 특성을 가진다. 또한 규조토의 입자는 다공성의 원기둥 형태로 되어있어 우수한 표면적을 제공하며, 가벼운 무게, 통기성과 단열성이 뛰어나 건물 내벽자재와 단열제로 이용되고 있으며, 물질 흡수율이 높아 여과제로 공기청정기, 제습기 필터, 에어컨, 정수기필터를 규조토도 다양하게 사용되고 있다. 이 외에도 생활, 의료, 환경 등의 다양한 분야에 욕실매트, 컵받침, 약물전달 시스템, 마이크로패치, 공기정화 설비, 폐수처리 설비 등으로 활용되고 있다.

하지만, 분말형태의 규조토를 일정한 형태로 성형하는 과정에서 polyvinyl alcohol, carboxymethyl cellulose, 전분, 덱스트린 등의 담체 결합제를 이용하여 일정한 형태로 경화시킨다. 이러한 과정에서 결합제가 규조토 공극 안으로 유입되어 굳어짐으로써 규조토의 가장 큰 특징인 다공성 구조의 공극 손실이 발생하여 기능을 상실을 발생시킨다. 따라서 규조토의 공극을 최대로 활용할 수 있는 기존의 결합제를 대체할 수 있는 물질이 필요한 실정이다.

따라서 본 연구에서는 미생물 광물화 작용(Microbially Induced Calcite Precipitation, MICP)을 응용하여 규조토 분말을 결합시킬 수 있는 새로운 결합제를 개발하고자 한다.

미생물 광물화 작용은 박테리아가 Urea를 분해하여 물 속에 녹아있는 칼슘이온(Ca²⁺)과 결합하여 CaCO₃를 생성하는 작용으로써 최근 광물화작용으로 제조한 바이오 벽돌이나 콘크리트의 대체 물질로 다양한 연구들이 진행되고 있다. 기존에 보고된 연구에서는 Sporosarcina pasteurii의 미생물광물화작용을 응용한 연구들이 많이 보고되어 있지만 S. pasteurii는 호기성균으로, 산소가 존재하지 않는 벽 속이나 땅 속 등에 적용하기에는 많은 한계점을 나타내고 있다.

따라서 S. pasteurii와 비교하여 CaCO₃ 형성능이 우수한 균주를 분리함과 동시에 산소가 존재하지 않는 혐기성 환경에서도 높은 생육도를 나타내어 규조토의 고결화를 효과적으로 발생시킬 수 있는 연구가 필요한 실정이다.

1. 대한민국 등록특허 제10-0985119호

본 발명의 목적은 규조토의 공극을 최대한 유지시키면서 고결화를 유도할 수 있는 결합제를 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명은 S. pasteurii와 비교하여 혐기성 환경에서도 CaCO₃ 형성능이 우수한 균주를 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미생물을 이용한 규조토 고결화 조성물을 제공한다.

본 발명은 미생물광물화작용(Microbially Induced Carbonate Precipitation, MICP)에 의해 발생하는 고결화작용(Cementation)을 이용하여 기존에 사용하던 결합제로 인해 발생하던 규조토 입자 공극손실을 최소화할 수 있다.

또한, 본 발명은 호기성 조건에서 높은 생육도를 나타내는 S. pasteurii에 비하여 광물화작용이 발생하는 환경인 산소가 부족한 혐기적 환경에서도 높은 광물화작용을 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명의 공극 막힘이 억제된 규조토는 자동차용 미세먼지 제거필터 및 단열재로서 활용될 수 있다.

도 1은 배양액과 Cementation Medium 최적 혼합비를 나타낸 이미지이다.
도 2는 통기조건에 따른 S. pasteurii 생육도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 통기조건에 따른 CaCO₃ 생성량을 나타낸 이미지이다.
도 4는 Urea 농도에 따른 CaCO₃ 생성량을 나타낸 이미지이다.
도 5는 CaCl₂ 농도에 따른 CaCO₃ 생성량을 나타낸 이미지이다.
도 6은 pH에 따른 CaCO₃ 생성량을 나타낸 이미지이다.
도 7은 샘플링 결과 확인된 달일 콜로니를 나타낸 이미지이다.
도 8은 Christensen’s Urea Agar에 Urease 활성 측정을 나타낸 이미지이다.
도 9는 분리된 균주의 CaCO₃ 형성능을 나타낸 이미지이다.
도 10은 분리한 균주의 phylogenetic tree를 나타낸 도면이다.

이하에서는 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명자들은 미생물 광물화 작용(Microbially Induced Carbonate Precipitation, MICP)에 의해 발생하는 고결화작용(Cementation)을 응용하여 기존에 사용하던 결합제로 인해 발생하던 규조토 입자 공극손실을 최소화 하여 그 기능을 최대로 활용할 수 있는 최적의 조건을 확립함과 동시에 호기성 조건에서 높은 생육도를 나타내는 S.pasteurii에 비하여 혐기적 환경에서도 높은 광물화작용을 나타낼 수 있는 균주를 탐색하고, 이러한 균주는 S. pasteurii에 비하여 CaCO₃ 형성능이 우수함을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 미생물을 이용한 규조토 고결화 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 혐기성 환경에서도 CaCO₃ 형성능이 우수한 균주 및 이 균줄ㄹ 이용한 규조토 고결화 조성물을 제공한다.

공극이 많은 광물인 규조토는 여과재, 보온재, 연마재 등 산업적 이용이 증가되고 있다. 일반적으로 분말상태의 규조토를 polyvinyl alcohol, carboxymethyl cellulose, 전분, 덱스트린 등의 담체 결합체를 이용하여 경화시킨다. 이 과정에서 담체 결합체로 인해 규조토의 공극의 막힘을 초래하여 규조토의 보온성 및 물 흡수성 등이 감소된다. 미생물광물화작용(MICP, Microbially Induced Calcite Precipitation)은 요소(Urea)를 분해하는 효소를 생산하는 미생물로부터 발생하는 작용으로써, 미생물 내부에 존재하는 Urease에 의해 요소가 분해되어 암모니아(NH₄)와 이산화탄소(CO₂)가 생성된다. 생성된 암모니아(NH₃)와 이산화탄소(CO₂)가 미생물 외부로 분비된 후 물과 반응하여 암모니아는 암모늄이온(NH₄ ⁺)과 수산화이온(OH^-), 이산화탄소(CO₂)는 탄산이온(HCO₃ ^-)이 되어 물속에 이온상태로 존재하게 된다. 수산화이온은 물의 pH를 증가시켜 탄산칼슘(CaCO₃) 생성에 최적화된 환경을 조성하며, 탄산이온은 물속에 녹아있는 칼슘이온(Ca² ⁺)과 반응하여 탄산칼슘을 형성하고 불용성인 탄산칼슘은 침전되는 작용이다. 이러한 작용을 응용하여 규조토의 분말을 미생물광물화 작용으로 경화시켜 기존의 결합제를 대체하고자 한다. 규조토의 경화과정에 광물화 미생물을 도입하여 규조토의 공극을 최대한 유지시키면서 고결화를 유도하여 공극의 막힘을 최대한 억제하면서 규조토를 경화시킬 수 있는 공법을 개발하고자한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1> 규조토 고결화 ( Cementation ) 조건 확립

1-1. 균주 분양

생물자원센터(KCTC)로부터 Sporosarcina pasteurii 3558 균주를 분양받아 공시균주(Standard strain)로 사용하였으며, 분양받은 균주를 최적 배지(표 1)에 접종하여 30℃, 150rpm으로 배양한 후 50% glycerol과 혼합하여 stock을 제조하였으며, 제조 후 -72℃에 동결보존 하였다.

성분	함량
Tryptic Soy Broth	30g/L
Urea	2g/L

1-2. 균주배양액, Cementation Medium 최적 혼합비

CaCO₃의 생성이 가장 많이 발생할 수 있는 균주배양액과 Cementation Medium(표 2)의 혼합비를 조사하기 위하여 S. pasteurii를 TSB-Urea에 72h 배양한 뒤 두 용액의 혼합비를 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5로 조절하여 30℃에 5일 배양 후 CaCO₃ 생성량을 비교하였다.

성분	함량
Urea	8g/L
Ammonium Chloride	1g/L
Sodium Bicarbonate	0.212g/L
Calcium Chloride	0.28g/L

1-3. 통기조건에 따른 CaCO ₃ 생성량 확인

통기조건에 따른 S. pasteurii의 CaCO₃ 생성량을 조사하기 위해 정치배양(Standing Culture), 진탕배양(Shaking Culture, 150rpm)으로 30℃에 Overnight 후 Cementation Medium과 혼합하여 30℃에 5일 배양하여 생성량을 관찰하였다.

1-4. 최적 Urea 농도

Urea 농도에 따른 S. pasteurii의 CaCO₃ 생성량을 조사하기 위하여 Cementation Medium의 Urea의 농도를 8g/L, 16g/L, 24g/L, 32g/L 40g/L로 조절한 후 TSB-Urea에 24h 배양한 S. pasteurii 배양액과 혼합하여 30℃에서 5일 배양한 후 생성량을 관찰하였다.

1-5. 최적 CaCl ₂ 농도

CaCl₂의 농도가 CaCO₃ 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Cementation Medium의 CaCl₂의 농도를 0.01M, 0.02M, 0.04M, 0.08M, 0.1M로 조절하여 TSB-Urea에 24h 배양한 S. pasteurii 배양액과 혼합하여 30℃에서 5일간 배양한 후 생성량을 확인하였다.

1-6. 최적 pH

pH가 CaCO₃ 생성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 Cementation Medium의 pH를 6, 7, 8, 9, 10으로 조절하여 TSB-Urea에 24h 배양한 S. pasteurii 배양액과 혼합하여 30℃에서 5일간 배양한 후 생성량을 확인하였다.

1-7. 최적 온도

CaCO₃ 생성의 최적온도를 조사하기 위해 TSB-Urea에 30℃, 24h 배양한 S.pasteurii 배양액과 Cementation Medium을 혼합하여 20℃, 30℃, 40℃, 50℃ 온도에서 각각 5일간 배양한 후 CaCO₃ 생성량을 확인하였다.

< 실시예 2> Urease 활성균주 분리

2-1. 샘플링

멸균된 Distilled water(D.W) 9ml에 마른 흙, 진흙, 암석조각, 호수, 연못에서 샘플 1g(ml)을 채취하여 10^-1배 희석한 후 Water-Bath에서 2시간 배양하였다.

배양된 샘플을 D.W에 10^-2, 10^-3배로 희석하여 TSA-Urea에 100㎕ 도말한 후 30℃에 배양하였다.

2-2. Urease 활성 측정

TSA-Urea에서 확인된 단일 콜로니를 Christensen’s Urea Agar Medium(Table 3)에 접종하여 2시간 단위로 활성을 관찰하였다.

성분	함량
Urea	2g/L
Peptone	1g/L
Glucose	1g/L
Sodium Chloride	5g/L
Disodium Phosphate	1.2g/L
Monopotassium Phosphate	0.8g/L
Phenol Red	0.012g/L

2-3. CaCO ₃ 형성능 측정

분리한 균주의 CaCO₃ 형성능을 관찰하기 위하여 TSB-Urea에 분리한 균주를 1% 접종하여 24시간 배양 후 Cementation Medium과 혼합하여 30℃에 5일간 배양한 후 생성량을 관찰하였다.

2-4. 동정

우수한 Urease 활성과 CaCO₃ 생성이 관찰된 균주를 동정하기 위해 16s rRNA sequencing을 실시하였다.

< 실험예 1> 규조토 고결화 ( Cementation ) 조건

1-1. 균주배양액, Cementation Medium 최적 혼합비

도 1에서와 같이 가장 많은 양을 생성할 수 있는 배양액과 Cementation Medium의 혼합비를 관찰한 결과 6 : 4의 비에서 CaCO₃가 가장 많이 생성됐음을 확인할 수 있었다.

1-2. 통기조건에 따른 CaCO ₃ 생성량 확인

통기조건에 따른 S. pasteurii의 CaCO₃ 생성량을 확인한 결과 균의 생육도는 진탕배양(Shaking culture)에서 높게 나타났으며(도 2), CaCO₃ 생성량 또한 진탕배양에서 높게 나타나는 것으로 확인되었다(도 3).

1-3. Urea 농도별 CaCO ₃ 생성량 확인

Urea의 농도에 따른 CaCO₃ 생성량을 확인하기 위하여 Cementation Medium의 Urea 농도별로 제조하여 배양액과 혼합 후 30℃에 배양한 결과 8g/L의 Urea가 함유된 그룹에서 CaCO₃ 생성량이 가장 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 4).

1-4. CaCl ₂ 농도에 따른 CaCO ₃ 생성량 확인

Cementation Medium의 CaCl₂ 농도를 조절하여 배양액과 혼합 후 30℃에 배양하여 CaCO₃ 생성량을 관찰한 결과 0.01M CaCl₂에서 가장 많은 양의 CaCO₃가 생성되는 것이 확인되었다(도 5).

1-5. pH에 따른 CaCO ₃ 생성량 확인

CaCO₃ 생성에 미치는 pH의 영향을 확인하기 위하여 Cementation Medium의 pH를 조절하여 배양한 결과 pH 8에서 CaCO₃의 생성량이 가장 많음을 확인할 수 있었다(도 6).

< 실험예 2> 규조토 고결화 ( Cementation ) 균주 분리

2-1. 샘플링

마른 흙, 진흙, 암석조각, 호수, 연못에서 채취한 샘플을 희석하여 TSA-Urea 배지에 도말한 결과 각각의 배지에서 단일 콜로니(Single Colony)를 확인할 수 있었다(도 7).

2-2. Urease 활성

샘플링에서 나타난 단일콜로니는 Christensen’s Urea Agar에 tooth-pick을 실시한 결과 분홍색으로 배지 색이 변하며 활성을 나타낸 균주를 확인할 수 있었다(도 8).

2-3. CaCO ₃ 형성능 측정

분리된 균주를 TSB-Urea에 배양한 뒤 Cementation Medium과 혼합하여 CaCO₃ 형성능을 관찰한 결과 S. pasteurii와 비교하여 C, D 균주가 가장 많은 양의 CaCO₃를 생성하였다(도 9).

2-4. 분리균주 동정

가장 높은 CaCO₃생성량을 나타낸 C,D 균주의 16s rRNA sequencing을 이용하여 Blast search한 결과 두 균주 모두 Pseudomonas mosselii strain CFML 90-83 균주와 99%의 상동성을 나타내었으며 C,D 균주 모두 Pseudomonas mosselii strain CFML 90-83로 최종 동정하였다(도 10).

Claims

미생물을 이용한 규조토 고결화 조성물.