KR100666723B1

KR100666723B1 - 고농도의 질산성 질소를 제거할 수 있는 황 산화 독립 영양탈질 미생물인 골도니아 속 ｃｒ 균주

Info

Publication number: KR100666723B1
Application number: KR1020060005916A
Authority: KR
Inventors: 정욱진; 유남종; 김성현; 권은미; 심동민; 안주현; 에스피 플로레스 앤젤; 마스바테 니솔라 그레이스; 말리우 갈레라 멜빈; 펠리페 알. 레딜라스 마크
Original assignee: 정욱진; (주)일신종합환경
Priority date: 2006-01-19
Filing date: 2006-01-19
Publication date: 2007-01-09

Abstract

본 발명은 폐수에 함유되어 있는 고농도의 NO₃ ^--N를 제거하는 활성을 갖는 황 산화 독립 영양 탈질 미생물 골도니아 속 CR(Gordonia sp. CR)균주에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 도금폐수를 유입수로 하는 황 산화 탈질 반응기에서 분리한 본 발명의 미생물은 고농도의 NO₃ ^--N 주입, 반응산물 증가율, 실제폐수의 주입, 중금속에 대한 영향 및 실제폐수내에서의 균주 성장을 관찰한 결과, 배양된 슬러지의 접종군, 배양된 슬러지 및 골도니아 속 CR 접종군 및 골도니아 속 CR만 접종한 군 중에서 골도니아 속 CR만을 접종한 군에서 가장 탁월한 NO₃ ^--N(질산성 질소) 제거율을 확인할 수 있었으며, 특히 고농도의 NO₃ ^--N 이 유입되어도 90%이상의 탈질율을 확인할 수 있었다. 또한, FISH(Fluorescence in situ Hybridization)를 통해 인공폐수보다 실제 도금폐수를 유입시켰을 경우 본 발명의 미생물이 보다 잘 성장하고 있다는 것을 확인함으로서, 본 발명의 미생물은 폐수에 함유되어 있는 NO₃ ^--N를 효과적으로 처리할 수 있는 황산화 독립영양탈질 미생물로서 실제폐수에도 적용 가능한 미생물로서, 본 발명은 환경공학분야에서 아주 유용한 발명이다.

황 산화 독립영양 탈질, 골도니아 속 CR균주, 질산성 질소 제거율

Description

고농도의 질산성 질소를 제거할 수 있는 황 산화 독립 영양 탈질 미생물인 골도니아 속 ＣＲ 균주{A sulfer-based autotrophic denitrifying microorganism, Gordonia sp. CR which could remove nitrate nitrogen of high concentration }

도 1은 11개의 분리된 황산화탈질 미생물의 NO₃ ^--N 제거효율 및 NO₂ ^--N 축적농도를 나타낸 도이며,

도 2는 분리된 골도니아 속 CR 균주의 서열 131에서 390까지 10개의 유사 ㄱ골도니아 균주를 비교한 멀트알린^®(MultAlin^®) 의 결과를 나타낸 도이며,

도 3은 배양 슬러지를 첨가한 반응기(R1), 배양 슬러지 및 CR 균주를 첨가한 반응기(R2) 및 CR 균주만을 첨가한 반응기(R3)의 NO₃ ^--N 농도변화에 따른 탈질효율의 변화를 나타낸 도이며,

도 4는 각 반응기의 NO₃ ^--N 농도 증가에 따른 NO₃ ^--N 제거량을 나타낸 도이며,

도 5는 각 반응기의 NO₃ ^--N 농도 증가에 따른 SO₄ ² ^--S의 생성양을 나타낸 도이며,

도 6은 각 반응기의 운전시간에 따른 pH의 변화를 나타낸 도이며,

도 7은 각 반응기의 NO₃ ^--N 농도 증가에 따른 NO₂ ^--N 의 축적양을 나타낸 도이며,

도 8은 각 반응기의 NO₃ ^--N 농도 증가에 따른 NH₃-N 축적양을 나타낸 도이며,

도 9는 각 반응기의 NO₃ ^--N 농도 증가에 따른 TN(Total Nitrogen)의 제거효율을 나타낸 도이며,

도 10은 중금속 농도 증가에 따른 골도니아 속 CR 균주의 탈질효율을 나타내는 도이며,

도 11은 6, 63, 130, 140, 158일 동안의 R3 반응기 유출수의 FISH(Fluorescence in situ Hybridization)를 나타내는 도이다.

본 발명은 폐수에 함유되어 있는 고농도의 NO₃ ^--N를 제거하는 활성을 갖는 황 산화 독립 영양 탈질 미생물 골도니아 속 CR 균주에 관한 것이다.

독립영양 탈질 중의 하나로 황 산화 독립 영양 탈질은 여러 종류의 황 화합 물을 황산염이온으로 산화시키면서 동시에 NO₃ ^--N 를 질소가스로 환원시키면서 폐수에 함유되어 있는 NO₃ ^--N를 제거하는 탈질 공정이다(Soares MIM, Denitrification of groundwater with elemental sulfur. Wat . Res., 36, pp1392-1395, 2002). 하기 식은 황산화 미생물을 이용한 황 산화 독립 영양 탈질 과정이다(Batchelor and Lawrence 1978).

NO₃ ^-+ 1.1 S + 0.4 CO₂ + 0.7 6H₂O + 0.08 NH₄ ⁺→

0.5 N₂ + 1.1 SO₄ ² ^- + 1.28 H⁺ + 0.08 C₅H₇O₂N

종속 영양 탈질과 대조적으로 황산화 독립영양 탈질은 알칼리도를 소모하고 탈질과정에서 수소이온을 발생시켜 pH를 저하시킨다(Oh SE et al., Effect of organics on sulfur-utilizing autotrophic denitrification under mixotrophic conditions. J. Biotechnol ., 92, pp1-8, 2001). 이러한 조건의 처리수는 자연 계로 배출하기 알맞지 않다. 처리수의 낮은 알칼리도와 pH의 문제점을 해결하기 위해 유입수에 CaCO₃를 첨가함으로써 pH 저하를 방지하고 알칼리도를 공급함으로서 상기와 같은 문제점을 해결할 수 있다. 그러나 CaCO₃와 황 산화 탈질 과정에서 발생하는 SO₄ ^2-가 반응하여 염을 생성하게 된다. 이렇게 발생된 염으로 인해 반응기의 공극이 막히는 문제점이 발생한다.

이에 따라, 본 발명자들은 황산화 탈질 미생물을 분리 동정하고 그에 대한 유전적 특징 및 탈질 효율, pH 변화, 중금속에 대한 영향 등을 관찰한 결과, 황과 CaCO₃를 혼합한 담체를 사용하여 SO₄ ² ^-가 반응하여 생성되는 염으로 인해 반응기의 공극이 막히는 문제점을 해결함과 동시에 실제 폐수의 NO₃ ^--N를 가장 탁월하게 제거하는 미생물을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 폐수에 함유되어 있는 고농도의 NO₃ ^--N를 제거하는 활성을 갖는 황 산화 독립 영양 탈질 미생물 골도니아 속 CR 균주를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폐수에 함유되어 있는 고농도의 NO₃ ^--N를 제거하는 활성을 갖는 황 산화 독립 영양 탈질 미생물 골도니아 속 CR KCTC 10865BP를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 골도니아 속 CR KCTC 10865BP를 배양기로 배양한 배양액을 황-CaCO₃ 복합담체가 충진되어 있는 용기에 주입하는 단계; 황-CaCO₃ 복합담체 표면에 골도니아 속 CR KCTC 10865BP를 배양시키는 단계; 골도니아 속 CR KCTC 10865BP가 붙어있는 황-CaCO₃ 복합담체를 페수처리를 위한 반응기에 충진시키는 단계; 혐기성 상태 하에서 하수처리장 방류수를 반응기에 유입시키는 단계로 구성되 어 고농도의 NO₃ ^--N을 처리함을 특징으로 하는 폐수처리방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

도금폐수를 유입수로 사용한 황 산화 탈질 반응기 내에서 황-CaCO₃ 복합 담체를 채취하고, 이를 초음파 분해한 후 담체에 붙어 있는 미생물을 채취하여 혐기 챔버에 넣고, 황 산화 탈질 아가 배지에 분무하고, 플레이트는 혐기 병에 넣어 배양할 수 있다. 배양 1주일 후 9개의 콜로니를 임의로 선택하여 새로운 아가 플레이트에 분무하고 혐기조건하에서 배양하고, 상기 배양 1-2주일 후에 분리된 콜로니를 1-3주 동안 액체배지를 스쿠루 캡 바이얼(screw cap vial)에서 배양할 수 있다.

상기 배양된 콜로니를 황 산화 독립영양탈질 액체배지에 황-CaCO₃ 복합 담체가 포함된 배지와 티오황산이 포함된 배지에서 각각 배양하고, 혐기성 조건으로 만들기 위해 질소가스를 주입하여 산소를 제거하고 실리콘 마개와 파라필름으로 밀봉하여 20-30℃ 에서, 1-5일 동안 배양할 수 있다.

상기 콜로니들 중에서 NO₃ ^--N의 제거율이 가장 높고 NO₂ ^--N 축적이 가장 낮은 균주를 선정할 수 있다.

상기 균주가 골도니아 속 CR 균주이며, 이는 2006년 1월 10일자에 한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁되었으며, 기탁번호는 KCTC 10865BP이다.

따라서, 본 발명은 폐수에 함유되어 있는 고농도의 NO₃ ^--N를 제거하는 활성을 갖는 황 산화 독립 영양 탈질 미생물 골도니아 속 CR 균주를 제공한다.

상기 골도니아 속 CR 균주는 암모니아성 질소와 아질산성 질소의 생성이 거의 없고 질산성 질소 1000mg/L에서 97.69%의 탈질효율을 보이며 탈질 성능이 현저히 탁월한 미생물이다.

또한, FISH(Fluorescence in situ hybridization) 실험 결과, 실제 하수처리장 방류수에서 보존되며, 유기탄소의 존재 하에서도 보존될 수 있다.

본 발명의 골도니아 속 CR 균주는 중금속 중에서, 구리 10ppm, 니켈 5ppm, 아연 2ppm, 철 2ppm의 농도에서 비성장 속도가 0.0813, 0.0914, 0.0481, 0.0863h^-1로 가장 탁월한 성장률을 나타내며, 아연은 니켈, 구리 그리고 철 이온보다 골도니아 속 CR 균주의 성장에 있어서 가장 저해인자가 되며, 철 이온을 제외하고는 각각의 중금속 20㎖/ℓ의 농도에서는 저해작용을 일으킨다.

또한, 본 발명은 골도니아 속 CR균주를 배양기로 배양한 배양액을 황-CaCO₃ 복합담체가 충진되어 있는 용기에 주입하는 단계; 황-CaCO₃ 복합담체 표면에 골도니아 속 CR 균주를 배양시키는 단계; 골도니아 속 CR 균주가 붙어있는 황-CaCO₃ 복합담체를 페수처리를 위한 반응기에 충진시키는 단계; 혐기성 상태하에서 하수처리장 방류수를 반응기에 유입시키는 단계로 구성되어 고농도의 NO₃ ^--N을 처리함을 특 징으로 하는 폐수처리방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명의 예시일뿐 본 발명이 이에 의하여 한정되지는 않는다.

실시예 1. 황 산화 탈질 세균의 분리 및 선별

1-1. 황 산화 탈질 세균의 분리

도금폐수(효성산업)를 유입수로 사용한 파일럿 스케일(pilot scale)의 황 산화 탈질 반응기 내에서 황-CaCO₃ 복합 담체를 채취하였다. 상기 채취한 담체는 5분 동안 초음파 분해하였다. 초음파 분해한 후 담체에 붙어 있는 미생물을 채취하여 혐기 챔버에 넣은 후, 하기 표 1과 같은 조성을 가진 황 산화 탈질 아가 배지에 100㎕를 분무하였다. 플레이트는 혐기 병에 넣고 28℃에서 일주일 동안 배양하였다.

1주일 후 9개의 콜로니를 임의로 선택하여 새로운 아가 플레이트에 분무하고 혐기조건하에서 배양하였다. 상기 배양 1주일 후에 분리된 콜로니를 2주 동안 액체배지를 스쿠루 캡 바이얼(screw cap vial)에서 배양하였다.

황 산화 탈질 미생물 배지의 구성

주요 성분		미네랄 솔루션
Na₂S₂O₃·5H₂O	2.5g	EDTA	500㎎
KNO₃	2.0g	CaCl₂	55.4㎎
NH₄Cl	0.5g	CuSO₄·5H₂O	15.7㎎
MgCl₂·6H₂O	0.5g	CoCl₂·6H₂O	16.1㎎
FeSO₄·7H₂O	0.01g	MnCl₂·4H₂O	50.6㎎
NaHCO₃	1.0g	ZnSO₄·7H₂O	220.0㎎
K₂HPO₄	2.0g	FeSO₄·7H₂O	49.9㎎
미네랄 솔루션	40㎖	이온이 제거된 물	1000㎖
이온이 제거된 물	1000㎖	1M KOH로 pH 6.0으로 조정
1M NaOH로 pH 7.5로 조정		1M KOH로 pH 6.0으로 조정

1-2. 황 산화 균주의 선별

250㎖ 플라스크 24개에 상기 표 1의 황 산화 독립영양 탈질 액체배지를 넣어 준비하였다(300 mg/ℓ NO₃ ^--N). 상기 24개의 플라스크 중 12개의 플라스크는 오토클레이브(autoclave) 하기 전 티오 황산나트륨(sodium thiosulfate)을 포함하였고 또 다른 12개의 플라스크는 황 이온의 첨가없이 오토클레이브를 하였다. 황 이온이 없는 플라스크들은 3차 증류수로 세척한 후 UV상에서 건조된 황-CaCO₃ 복합 담체를 첨가하였다. 상기 실시예 1-1에서 파일럿-스케일의 황 산화 독립영양 탈질 반응기로부터 분리한 9개의 균주를 황-CaCO₃ 복합 담체가 포함된 배지와 티오황산이 포함된 배지에서 각각 배양하였다. 모든 플라스크를 혐기성 조건을 만들기 위해 N₂가스를 주입하여 플라스크에 존재하는 산소를 제거하고 실리콘 마개와 파라필름(paraflim)으로 밀봉하였다. 모든 플라스크는 흔들림 없이 28℃에서 2일 동안 배양하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 11개의 분리된 균주 중에서 NO₃ ^--N의 제거율이 가장 높고 NO₂ ^--N 축적이 가장 낮은 CR균주를 선택하였다. 배치(batch) 실험에서 9개의 분리된 균주 중 CR 균주는 45-56%의 탈질 효율로 가장 높은 효율을 보이고 NO₂ ^--N의 축척 또한 담체 가루를 사용한 CR 균주가 가장 적게 나타남을 확인할 수 있었다. 상기 CR 균주는 한국생명공학연구원 유전자은행에 2006년 1월 10일자로 기탁하였으며, 기탁번호는 KCTC 10865BP이다.

실시예 2. CR 유전자 동정 및 프로브 구성

2-1. 16s rRNA 동정

상기 실시예 1-2에서 분리, 선별한 골도니아 속 CR 배양균은 황 이용 독립영양 배지에서 배양하였다. 그 후 같은 구성 성분이 포함된 아가배지에 평판배양하고 1주일 동안 성장시켰다. 상기 배양된 골도니아 속 CR균을 드라이아이스와 물 30℃에서 에탄올을 이용하여 얼리고 녹이는 과정을 3분 동안 3회 진행하였다. 샘플은 일반 프라이머(universal primers)와 함께 PCR을 수행하였는바, 매스터사이클러(Mastercycler, Eppendorf, German)을 사용하여 96℃에서 2분간 초기 변성하고 95℃에서 20초간 변성, 55℃에서 20초간 어닐링, 72℃에서 30초간 신장 과정을 40회 반복한 후 72℃에서 7분간 마지막 신장을 하여 골도니아 속 CR 균주의 DNA를 증폭시켰다. PCR 생성물을 세척하고 전기영동으로 샘플의 PCR 생성물의 길이와 순수함을 분석하였다. 미생물은 NCBI(the National Center for Biotechnology Information’s)의 뉴클레오티드-뉴클레오티드 BLAST 프로그램 (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST) 에서 16s rRNA 서열을 분석하였다.

상기 분리된 골도니아 속 CR균의 분리된 16s rRNA 서열은 서열목록 1에서 보는 바와 같다.

2-2. 올리고뉴클레오티드 프로브 구성

상기 실시예 2-1에서의 미생물 16s rRNA 서열 분석 후에 BLAST 데이터베이스에서 비슷한 16s rRNA 서열을 가지고 있는 균주 8개를 복사하여 다중 서열 정렬 프로그램(multiple sequence alignment program)인 MultAlin (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin)를 이용하여 평가하였다.

그 결과는 도 2에서 보는 바와 같다. 골도니아 속 CR 균주에 25 염기의 서열이 다른 균에는 존재하지 않았다. 쇼트 뉴클레오티드-뉴클레오티드 블래스트 프로그램(The short nucleotide-nucleotide BLAST program)을 이용하여 유일함을 시험하였는데 어떠한 미생물 균주도 분리된 균주와 100% 동일하지 않았다.

상기 결과를 통해 서열이 동일하지 않은 부분을 구별한 후에 올리고뉴클레오티드 프로브의 제작을 위한 서열을 아트만바이오사(AtmanBio Science Co.)에 제공하고 올리고뉴클레오티드 프로브를 제작하였다.

CR균주와 가장 비슷한 10개의 골도니아 균주와 비교하였다. 1235개로 암호화 된 CR 균주의 서열은 오직 골도니아 시환이엔시스 주(Gordonia sihwaniensis strain) DSM 44576과 92.71% 정도만 동일하였다. DSM 44576유전 서열과 비교하여 CR의 서열은 129개의 염기의 차이를 가진다(667에서 794까지). 그러나 분석된 서열에서 전체 갭(gap)은 이-밸루(E value)가 e-131에서 단지 6/974였다. 선택한 25-염기 올리고뉴클레오티드 서열은 190에서 214를 선택하였고 이것을 완벽히 모든 분리 균주들과 차이가 있음을 보였다. GS25의 서열은 5′→GGACCACTGATTGCATGGGTTGGTG→3′이다.

실험예 1. 니트레이트 농도 증가에 따른 효과

1-1. 니트레이트 농도 증가에 따른 효과

5ℓ의 발효기(KobioTech Co., Ltd)를 이용하여 가루로 만든 콜로이드 황 입자(80-85%, Fluk -aTM)를 포함하는 황 산화 독립영양 배지 3ℓ에 상기 실시예 1-2에서 분리한 골도니아 속 CR균주를 배양하였다. 발효기는 질소가스를 사용하여 용존산소가 0이 될 때까지 산소를 제거하였다. 발효기에 0.1M NaOH 용액을 주입하여 pH를 7.5로 유지시켰다.

이와 동시에 동일한 배지를 사용하여 하수처리장의 슬러지(용인하수처리장)를 배양하였다. 배양 2주 후에 UV처리한 황-CaCO₃ 복합 담체를 첨가한 1.3ℓ 반응기에 접종하였다. 반응기는 질소가스로 30분 동안 주입하여 용존 산소를 제거하였다.

반응기 안에 NO₃ ^--N 가 질소 가스로 전환됨으로 인한 압력의 축적을 없애 기 위해 6시간 마다 밸브를 열어주었다. 반응기에서 탈질 미생물을 일주일 동안 배양한 후에, HRT를 24 hr로 조정하고 Autoclave 한 하기 표 2의 인공폐수(초기 농도 100 mg/ℓ NO₃ ^--N)를 주입시켰다.

실험은 세가지 형태로 진행하였으며, 첫번째는 NO₃ ^--N 의 농도를 1000 mg/ℓ까지 점진적으로 증가시켰고, 두번째는 슬러지를 접종한 반응기와 골도니아 속 CR균주를 접종한 반응기를 비교하고, 반응기 실험의 마지막 부분은 NO₃ ^--N 농도를 500 mg/ℓ까지 증가시킨 실제 하수처리장 방류수(용인하수처리장)를 반응기에 유입시켰다. 각 반응기의 구성은 다음과 같다. R1은 배양 슬러지(enriched sludge), R2는 배양 슬러지 및 골도니아 속 CR균주 첨가, R3는 골도니아 속 CR 균주만을 반응기에 주입하여 실험을 진행하였다.

인공폐수의 조성

주요 성분(L^-1)		미네랄 솔루션(L^-1)
KNO₃	0.721-7.214g	EDTA	500㎎
NH₄Cl	12㎎	CaCl2	55.4㎎
MgCl₂·6H₂O	0.5g	CuSO4·5H2O	15.7㎎
FeSO₄·7H₂O	0.01g	CoCl2·6H2O	16.1㎎
NaHCO₃	0.5-2.0g	MnCl2·4H2O	50.6㎎
K2HPO4	0.2g	ZnSO4·7H2O	220.0㎎
미네랄 솔루션	10㎖	FeSO4·7H2O	49.9㎎
1M NaOH로 pH 7.5로 조정		1M KOH로 pH 6.0으로 조정

1-2. 샘플링 및 분석방법

하루에 채취한 샘플은 다음 3가지로 분할하여 저장하였다. 폴리에틸렌 통에 100 ㎖, 10 ㎖의 희석한 샘플, 2 ㎖ 에펜돌프 튜브(eppendorf tube)에 1.5 ㎖를 저장하였다. 희석한 샘플은 이론 크로마토그래피 시스템(equipped with Waters 626 pump, IC-Pak Anion HR column)을 이용하여 NO₃ ^--N, NO₂ ^--N, SO₄ ² ^- 를 분석하였다.

브랜 및 루베 자동 분석기 3(Bran and Luebbe Automatic Analyzer 3)을 이용하여 암모니아를 분석하였고. 100 ㎖의 샘플은 표준방법에 따라 알칼리도를 분석하였으며 pH 프로브로 pH를 측정하였다. 에펜돌프 튜브의 1.5 ㎖는 1 ㎖ 1X PBS 와 함께 원심 분리한 후 상등액을 제거하는 과정을 3회 반복한 후 1X PBS 0.25 ㎖와 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 0.75 ㎖로 하루 동안 고정시켰다. 샘플은 1 ㎖ 1X PBS 와 함께 원심분리와 상등액을 제거하는 과정을 두 번 반복하여 세척하였다. 고정된 샘플은 cold chamber 4℃에 서 사용하기 전까지 저장하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 3에서 각 반응기에 NO₃ ^--N 의 농도 변화에 따른 NO₃ ^--N 제거율을 보여주고 있다. 도 3에서 보는 바와 같이 NO₃ ^--N 농도가 200mg/ℓ 까지는 모든 반응기의 제거율이 평균 90%를 넘는 것으로 관찰되다가 600 mg/ℓ에서 부터 탈질 효율이 배양한 슬러지를 넣은 반응기(R1)와 배양 슬러지와 CR균주를 함께 넣은 반응기(R2)의 탈질효율이 80% ~ 90%로 감소함을 확인할 수 있었다. CR균주만을 넣은 반응기(R3) 역시 탈질효율이 줄어들었지만 계속해서 90%이상의 탈질 효율을 유지함을 확인할 수 있었다. 1000 mg/ℓ으로 유입수의 농도를 상승시켜 유입하였을 때 농도가 600ppm일 때보다 제거율이 증가함을 확인할 수 있었다. 85.99%, 88.03%, 97.67%로 골도니아 속 CR균주를 넣은 반응기의 제거율이 가장 높게 나타남을 확인할 수 있었다. 이러한 결과 본 발명의 균주는 고농도의 질산성 질소를 함유하고 폐수를 가장 효과적으로 처리할 수 있는 균주이다.

또한, 도 4에서는 NO₃ ^--N 농도 증가에 따른 NO₃ ^--N 제거량을 나타내고 있는 바, NO₃ ^--N 를 100㎎/ℓ에서 200㎎/ℓ로 농도를 증가시켜 주입시켰을 때, 모든 반응기에서 NO₃ ^--N의 제거되는 양이 450-600㎎/ℓ로 증가되었으며, 그 중에서 CR균주만을 첨구한 반응기(R3)가 600㎎/ℓ의 NO₃ ^--N를 제거하여 가장 탁월한 제거율을 보임을 확인할 수 있었으며, NO₃ ^--N을 1000㎎/ℓ으로 유입시켰을 경우, CR 균주만을 첨가한 반응기(R3)의 경우 약 900㎎/ℓ의 NO₃ ^--N를 제거함으로서 고농도의 질산성 질소농도에서 가장 탁월한 니트레이트 제거효율을 보임을 확인할 수 있었다.

한편, 도 5는 각 반응기에 NO₃ ^--N 가 제거되면서 발생되는 SO₄ ² ^--S농도의 변화를 나타내고 있는바, SO₄ ² ^--S생성은 NO₃ ^--N의 감소와 같은 경향으로 관찰되는 것은 NO₃ ^--N의 감소는 황의 산화의 생성물이 나타남을 의미한다. NO₃ ^--N의 농도가 100 과 200 mg/ℓ일때 SO₄ ² ^--S의 생성양은 200과 200 mg/ℓ로 계산되었다. 600 mg/ℓ의 NO₃ ^--N 농도에서 도 3에서 NO₃ ^--N의 감소량과 도 4에서 SO₄ ² ^--S 의 생성량을 비교하면 자주 변함을 확인할 수 있었다.(R3만 제외)

도 4 및 도 5에서 NO₃ ^--N가 530-550 mg/ℓ 제거되는 동안 SO₄ ² ^--S은 약 1200 mg/ℓ생성됨을 확인할 수 있었다. 반면에 NO₃ ^--N가 800 - 900 mg/ℓ제거될 때 SO₄ ² ^--S은 1300-1600 mg/ℓ가 생성됨을 확인할 수 있었다. 유입수의 NO₃ ^--N 농도가 600 mg/ℓ와 1000 mg/ℓ일 때의 NO₃ ^--N 제거양에 대한 SO₄ ² ^--S의 생성량의 비를 계산하여 비교하여 보면 1000 mg/ℓ일 때의 비율이 더 작음을 확인할 수 있었다.(S/N_600ppm = 2.2, S/N_1000ppm = 1.8). 상기 SO₄ ² ^--S 의 농도변화를 보아 황산화 탈질 미생물에 의해서 황을 전자공여체로 하여 NO₃ ^--N가 질소가스로 제거되는 반응 외에 SO₄ ² ^--S을 생성하는 또 다른 반응이 있을 것이라고 추측할 수 있다.

이론적으로 많은 양의 NO₃ ^--N가 제거되면 많은 양의 H⁺이온이 생성되면서 반응기내의 pH를 감소시킨다.

도 6는 각 반응기의 운전시간에 따른 pH변화를 나타내는 도로서, 도 6을 보면 NO₃ ^--N의 제거양이 증가하여도 pH에는 크게 영향을 끼치지 않음을 확인할 수 있었다. 이런 사실로 보아 황-CaCO₃ 복합 담체에 함유되어 있는 CaCO₃가 반응기내에서 알칼리도를 공급하는 것으로 추측할 수 있다.

도 7은 NO₃ ^--N 농도변화에 따른 각 반응기에 NO₂ ^--N 농도의 변화를 나타내는 도로서, 도 7을 보면 NO₂ ^--N는 처음 55일 동안은 생성되지 않지만. NO₃ ^--N를 600 mg/ℓ로 증가시킨 이후부터 R1과 R2반응기에서는 NO₂ ^--N이 생성되기 시작함을 확인할 수 있었다. 그러나 골도니아 속 CR 균주만을 주입한 R3 반응기만이 계속적으로 NO₂ ^--N 가 생성되지 않음을 확인하였다.

도 8은 NO₃ ^--N농도 증가에 따른 NO₃ ^--N 농도의 변화를 나타낸 것으로서, 도 8을 보면 NO₃ ^--N의 농도는 초기 6일 동안 농도가 높게 측정되었다. 이는 공정을 시작하기 전에 배양용 배지에 이미 첨가되어 있던 것의 농도가 높았던 것이라 추측된다. 6일 이후부터는 유입수의 암모니아 농도가 3.2 mg/ℓ보다 적게 첨가되었다. 31일부터 35일 사이에 R2의 축적된 NO₃ ^--N농도가 가장 높게 나타났다. 이 기간 동 안에 R2의 NO₃ ^--N 제거효율이 가장 높게 관찰되었다.

NO₃ ^--N와 NO₂ ^--N의 증가로 인해 TN의 제거효율은 NO₃ ^--N 제거효율과 동일하지 않았다. R2와 R3는 NO₃ ^--N가 600 mg/ℓ일 때 가장 높은 제거효율을 나타냄을 확인할 수 있었다. 그 중에서도 R3의 제거효율은 다른 반응기보다 항상 높은 제거 효율을 보여줌을 확인할 수 있었다.

실제 하수 처리장 방류수의 유입에 대한 CR 균주의 적응을 살펴보면, 실제 하수처리장 방류수를 유입시키면서 NO₃ ^--N 제거 효율은 이 실험을 하는 동안 최소의 값을 나타내었다. NO₃ ^--N 제거효율은 R1, R2, R3 각각1.26, 3.85, 20.68%로 계산되었다. 그러나 시간의 경과에 따라 NO₃ ^--N 제거 효율은 점차 증가하였고 최종적으로 60.48%, 70.38%, 77.58%을 나타내었다. 다른 반응기보다 골도니아 속 CR균주를 접종한 R3의 반응기의 제거효율은 가장 높게 측정되었으며 다른 반응기보다 더 빨리 안정화되었다. NO₂ ^--N 농도는 R3 반응기만이 처음부터 생성되지 않았고 R1과 R2는 시간의 경과에 따라서 점차 감소함을 보였다. NO₃ ^--N 농도는 세개의 반응기 모두 점점 증가하는 형태를 보여주었고 R1은 2-5 mg/ℓ, R2는 5-8 mg/ℓ, R3는 3-7 mg/ℓ안에서 증가하였다.

실험예 2. 분리된 골도니아 속( Gordonia sp .) CR균주 의 성장비율에 대한 중금속의 효과

골도니아 속 CR 균주는 처음 140 mg/ℓ의 NO₃ ^--N 가 포함된 독립영양 배지 300㎖와 같이 500㎖ 플라스크에서 2주 동안 28℃에서 배양하였다. 2주 후에 배양균의 0.1㎖를 중금속이 함유되어 있는 황 산화 독립영양탈질 배지 9.9 ㎖에 포함하는 유리병에 배양시켰다. 중금속은 NiCl₂, CuSO₄, ZnSO₄, FeSO₄ 형태로 개별적으로 2, 5, 10, 20, 30ppm으로 첨가하였다. 배양액의 400㎕를 바이오스크린-c 시스템( bioscreen-c system)의 허니콤브 웰(honeycomb well)에 주입하였다. 바이오스크린-c 시스템에서 28℃에서 67시간 동안 배양하고 매 시간마다 580nm에서 광학밀도값(optical density value)을 자동적으로 측정하였으며 배양한 유리병은 2일 동안 배양한 후 NO₃ ^--N 의 농도를 분석하여 NO₃ ^--N 제거율을 계산하였다.

상기 실험 수행의 결과, 하기 표 3은 각각의 다른 중금속 농도에 따른 본 발명의 CR 균주의 성장속도를 보여준다. 네 가지의 중금속 연구를 보면 아연이 가장 독성이 높았고 그 다음으로 니켈, 구리 그리고 철 순으로 나타났다. 가장 높은 성장률을 보이는 각각의 중금속의 농도는 구리 10 mg/ℓ, 니켈 5 mg/ℓ, 아연 2 mg/ℓ, 철 2 mg/ℓ으로 성장속도는 0.0813, 0.0914, 0.0481, 0.0863 h^-1로 나타났다.

도 10은 중금속 농도 증가에 따른 골도니아 속 CR 균주의 탈질효율을 나타내는 도로서, 도 10을 보면 중금속을 주입하지 않은 유리병은 100%의 탈질 효율을 보여주었지만 중금속을 넣은 모든 유리병들의 제거효율은 거의 50-70%의 효율만 보여주었고 철이온이 15 mg/ℓ인 유리병만 90%이상의 효율을 보여주었다. 결과적으로 중금속의 증가와 함께 탈질은 증가하지만 세부적으로는 성장속도를 감소시켜 탈질을 저해함을 확인할 수 있었다.

중금속 농도에서의 골도니아 속 CR 균주의 성장속도(hr^-1)

농도, ㎎/ℓ	Cu	Ni	Zn	Fe
0	0.1458	0.1458	0.1458	0.1458
2	0.0656	0.0765	0.0481	0.0863
5	0.0580	0.0914	0.0388	0.0814
10	0.0813	0.0784	0.0377	0.0722
15	0.0574	0.0657	0.0076	0.0808
20	0.0444	0.0622	0.0171	0.0780
30	0.0267	0.0153	0.0066	0.0545

실험예 3. 분리된 골도니아 속( Gordonia sp .) CR 균주의 성장 및 생존

각각의 고정된 샘플의 15㎕를 사전에 0.1% 젤라틴과 0.01% 크롬 칼륨 황산염(chromium potassium sulfate)의 혼합물로 코팅된 반응셀(reaction cell)에 올려놓았다. 고정된 샘플을 클린벤치(clean bench)에서 건조시킨 후에 슬라이드를 슬라이드 선반(slide rack)에 위치시키고 50, 80, 100% 에탄올에 각각 3분 동안 담그고 뺀 후 말렸다. 47℃에서 2시간 동안 미리 열처리하여 혼성용액(hybridization solution, Tris-HCl 20 mM, SDS 0.01%, NaCl 900 mM, Formamide 40%)과 상기 실시예 2-2에서 제작한 프로브(50 ng/㎕)를 15 ㎕씩 1:1 비율로 위치시키므로 혼성화시켰다. 세척용액(Tris-HCl 20 mM, SDS 0.01%, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM)으로 한번 반응 슬라이드에 흘려 세척한 후 슬라이드를 슬라이드 병에 끼워 넣어 세척용액에 50℃에서 20분 동안 가열하였다. 슬라이드는 3차 증류수로 세척하고 5분간 20㎕ DAPI(0.1 mg/ℓ)을 올려놓는다. 슬라이드는 다시 3차 증류수로 세척하고 건조하였다. 이후 형광 현미경으로 DAPI와 Cy3 형광색소를 파장 372nm(파란색) 과 552nm(빨간색)의 조건하에서 관찰하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 11은 6, 63, 130, 140, 158일 동안의 R3 유출수의 FISH(Fluorescence in situ Hybridization, DAPI-파란색, GS25-Cy3-빨간색)을 나타낸다. 도 11을 보면 R3 반응기에서 골도니아 속 CR 균주는 높은 NO₃ ^--N 농도에서 보다 낮은 NO₃ ^--N 농도에서 더 많이 보존됨을 확인할 수 있었다. NO₃ ^--N 농도가 1000 mg/ℓ로 증가함에 따라 골도니아 속 CR 균주의 보존율은 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 하수처리장 방류수를 6일 동안 주입시킨 후에 비교적 많은 양의 골도니아 속 CR 균주가 보존되는 것은 골도니아 속 CR 균주는 다른 미생물의 성장과 경쟁할 수 있고 유기탄소의 존재 하에서 극복할 수 있는 것을 나타낸다.

본 발명은 폐수에 함유되어 있는 NO₃ ^--N를 제거하는 활성을 갖는 황 산화 독립 영양 탈질 미생물 골도니아 속(Gordonia sp.) CR KCTC 10865BP를 제공한다. 본 발명의 골도니아 속 CR균주는 암모니아성 질소와 아질산성 질소의 생성이 거의 없고 질산성질소 1000mg/L에서 97.69%의 탈질효율을 보이며 탈질 성능이 현저히 탁월한 미생물로서, FISH 실험 결과, 하수처리장 방류수에서도 본 발명의 골도니아 속 CR 균주는 보존되며, 유기탄소의 존재 하에서도 보존될 수 있다. 또한, 본 발명의 골도니아 속 CR 균주는 중금속 중에서, 구리 10ppm, 니켈 5ppm, 아연 2ppm, 철 2ppm의 농도에서으로 비성장 속도가 0.0813, 0.0914, 0.0481, 0.0863h^-1로 가장 탁월한 성장률을 나타내며, 아연은 니켈,구리 그리고 철 이온보다 골도니아 속 CR 균주의 성장에 가장 저해인자가 되며, 철 이온을 제외하고는 각각의 중금속 20㎖/ℓ의 농도에서는 저해작용을 일으킨다.

따라서, 본 발명의 골도니아 속 CR 균주는 실제 하수처리장 방류수에 넣어도 생존력이 뛰어남과 동시에 암모니아성 질소와 아질산성 질소의 생성이 거의 없이 질산성 질소의 탈질효율이 현저히 탁월하므로, 본 발명은 질산성 질소를 함유한 폐수처리에 있어서 아주 유용한 발명이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

폐수에 함유되어 있는 질산성 질소(NO₃ ^--N)를 제거하는 활성을 갖는 황 산화 독립 영양 탈질 미생물 골도니아 속(Gordonia sp.) CR KCTC 10865BP.
제1항의 골도니아 속 CR KCTC 10865BP를 배양기로 배양한 배양액을 황-CaCO₃ 복합담체가 충진되어 있는 용기에 주입하는 단계; 황-CaCO₃ 복합담체 표면에 골도니아 속 CR KCTC 10865BP를 배양시키는 단계; 골도니아 속 CR KCTC 10865BP가 붙어있는 황-CaCO₃ 복합담체를 페수처리를 위한 반응기에 충진시키는 단계; 혐기성 상태 하에서 하수처리장 방류수를 반응기에 유입시키는 단계로 구성되어 고농도의 NO₃ ^--N을 처리함을 특징으로 하는 폐수처리방법.