JPH0327282A - 硝酸レダクターゼ酵素系の生産方法 - Google Patents
硝酸レダクターゼ酵素系の生産方法Info
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- JPH0327282A JPH0327282A JP2071719A JP7171990A JPH0327282A JP H0327282 A JPH0327282 A JP H0327282A JP 2071719 A JP2071719 A JP 2071719A JP 7171990 A JP7171990 A JP 7171990A JP H0327282 A JPH0327282 A JP H0327282A
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- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は耐熱性蟻酸結合硝酸レダクターゼ酵素系を生産
し得る新規好熱性微生物、微生物の単離および培養方法
および蟻酸結合硝酸レダクターゼ酵素系の製造方法およ
び硝酸塩含有試料の硝酸塙の定最に対する分析および商
業的のその使用に関する。
し得る新規好熱性微生物、微生物の単離および培養方法
および蟻酸結合硝酸レダクターゼ酵素系の製造方法およ
び硝酸塩含有試料の硝酸塙の定最に対する分析および商
業的のその使用に関する。
蟻酸結合硝酸レダクターゼ酵素系はいくつかの中温微生
物に既に見出されている（ロウおよびギ！） ルスビー、１．９７５） 。これらの酵素系は耐熱性
ではなく、室温で全く不安定である。これらは診断用に
限定きれ、十分な安定性に欠けるため商業的用途はなく
、酸素の存在により阻害され、硝酸塩の還元は分析目的
に対し通例時間中で定鼠的ではない。
物に既に見出されている（ロウおよびギ！） ルスビー、１．９７５） 。これらの酵素系は耐熱性
ではなく、室温で全く不安定である。これらは診断用に
限定きれ、十分な安定性に欠けるため商業的用途はなく
、酸素の存在により阻害され、硝酸塩の還元は分析目的
に対し通例時間中で定鼠的ではない。
水および廃水中の硝酸塩に対し急速かつ有利な分析を求
める嬰求があることは一般に既知である。
める嬰求があることは一般に既知である。
本発明者らはアイスランドの温泉からその環境の近くで
新規耐熱性蟻酸結合硝酸レダクターゼ酵素系を生産し得
る新規微生物を単離した。
新規耐熱性蟻酸結合硝酸レダクターゼ酵素系を生産し得
る新規微生物を単離した。
本発明の耐熱性蟻酸結合硝酸Ｉノダクターゼ酵素系は高
温で酸素の存在で反応でき、非常に短時間に硝酸から亜
硝酸への還元を完結できる。蟻酸結合硝酸レダクターゼ
酵素系は溶液で数週室温で安定であり、乾燥形で数ケ月
安定である。
温で酸素の存在で反応でき、非常に短時間に硝酸から亜
硝酸への還元を完結できる。蟻酸結合硝酸レダクターゼ
酵素系は溶液で数週室温で安定であり、乾燥形で数ケ月
安定である。
硝酸の定量に対し今日入手し得る商品は硝酸を亜硝酸に
還元するためにカドミウムを使用し、０．０１０…のＮ
Ｏ３−Ｎまで硝酸を検出できる。本発明は０． Ｏ０
５ｐｌｌｍ ＮＯｓ Ｎまで硝酸を定置でき、カドミ
ウム還元方法よりはるかに容易に使用でき、カドミウム
廃棄により生ずるような公害問題を提起しない。
還元するためにカドミウムを使用し、０．０１０…のＮ
Ｏ３−Ｎまで硝酸を検出できる。本発明は０． Ｏ０
５ｐｌｌｍ ＮＯｓ Ｎまで硝酸を定置でき、カドミ
ウム還元方法よりはるかに容易に使用でき、カドミウム
廃棄により生ずるような公害問題を提起しない。
通性嫌気性菌である新種Ｔｈｅｔｏｕ＋ｓ ａｌＩａｅ
ｒｅｂｉｅａｓ菌株のような好熱性微生物から耐熱性蟻
酸結合硝酸レダクターゼ酵素系の製造および使用、およ
び硝酸の定量分析および商業的用途に細胞全体又は部分
精製物の使用を供することが本発明の目的である。Ｔｈ
ｅｒｍｕｓ ａｑｕａｊｉｃｕｓのような他の種はこれ
らの酵素系を有さず、偏性好気菌である。
ｒｅｂｉｅａｓ菌株のような好熱性微生物から耐熱性蟻
酸結合硝酸レダクターゼ酵素系の製造および使用、およ
び硝酸の定量分析および商業的用途に細胞全体又は部分
精製物の使用を供することが本発明の目的である。Ｔｈ
ｅｒｍｕｓ ａｑｕａｊｉｃｕｓのような他の種はこれ
らの酵素系を有さず、偏性好気菌である。
本発明は上記菌の単離および好熱微生物の代表としてア
イスランドの温泉から単離した例えば同じＴｈｅｒｍｕ
ｓの菌株を使用する耐熱性蟻酸結金硝酸レダクターゼ酵
素系の製造および上記酵素系による硝酸定置法の記載に
ついて以下に記載する。
イスランドの温泉から単離した例えば同じＴｈｅｒｍｕ
ｓの菌株を使用する耐熱性蟻酸結金硝酸レダクターゼ酵
素系の製造および上記酵素系による硝酸定置法の記載に
ついて以下に記載する。
発明の肇狛
好熱菌は安定で、しばしば室温では不活性であるが、６
０−１００℃のような高温に加熱すると活性化する耐熱
性酵素を含有する。これらの酵素はその固有性から、こ
れらが長期の保存寿命を有し、貯蔵に対し低温で保存し
なくてもよいので触媒として有用になる。本発明により
単離したＴ． ａｎａｅｒｏｂｉｃｎｓの新規好熱菌株
は新規蟻酸結合硝酸レダクターゼ酵素系を有し、これは
ｐＨ４．５で■００℃までの温度で活性を有し、短時間
かつ容易に硝酸を還元し、定量するのに有用である。
０−１００℃のような高温に加熱すると活性化する耐熱
性酵素を含有する。これらの酵素はその固有性から、こ
れらが長期の保存寿命を有し、貯蔵に対し低温で保存し
なくてもよいので触媒として有用になる。本発明により
単離したＴ． ａｎａｅｒｏｂｉｃｎｓの新規好熱菌株
は新規蟻酸結合硝酸レダクターゼ酵素系を有し、これは
ｐＨ４．５で■００℃までの温度で活性を有し、短時間
かつ容易に硝酸を還元し、定量するのに有用である。
本発明は好熱性通性嫌気性菌から新規蟻酸結合硝酸！ノ
ダクターゼ酵素系の製造方法、特に水、廃水、この場合
野菜および他の食料品から水中に抽出できる、のような
硝酸含有試料の硝酸を定量するその分析および商業的使
用に関する。
ダクターゼ酵素系の製造方法、特に水、廃水、この場合
野菜および他の食料品から水中に抽出できる、のような
硝酸含有試料の硝酸を定量するその分析および商業的使
用に関する。
耐熱性酵素系は基質強化基礎培地に好熱菌株の細菌細胞
を高温で接種し、細胞を集め、洗滌することにより製遺
する。蟻酸結合硝酸レダクターゼ酵素系を含有する細胞
はホルメートおよび緩衝物質の存在で硝酸を亜硝酸に還
元するために使用する。
を高温で接種し、細胞を集め、洗滌することにより製遺
する。蟻酸結合硝酸レダクターゼ酵素系を含有する細胞
はホルメートおよび緩衝物質の存在で硝酸を亜硝酸に還
元するために使用する。
分析化学の範囲内では、硝酸の定量は化学診断で特に重
要な役割を演ずる。飲料水、廃水およびいくつかの食別
品、特に野菜中の硝酸濃度は重大な健康および公害問題
を提起する。
要な役割を演ずる。飲料水、廃水およびいくつかの食別
品、特に野菜中の硝酸濃度は重大な健康および公害問題
を提起する。
純粋な化学的定量法又は部分酵素定殴法又は分光定量法
（例えば、カドミウムを使用する特に頻繁に使用される
方法、デバーズー合金還元法、分光光度選別法（ＡＰＨ
Ａ、１９８５））２）と比較して、本発明は一層特異的
で、使用が容易である。
（例えば、カドミウムを使用する特に頻繁に使用される
方法、デバーズー合金還元法、分光光度選別法（ＡＰＨ
Ａ、１９８５））２）と比較して、本発明は一層特異的
で、使用が容易である。
上記化学的方法と比較して重要な利点は、腐禽性強酸又
は有毒薬剤を使用せず、熟練労働者のみでなく、非熟練
者に対しても手動で方法の実施に一般的有用性を有し、
および試料を、すなわち実験室から遠隔地の水源から集
めた後、形成色度を標準クロマトグラフイチャートと比
較することにより２０分以内に測定結果を評価しうる可
能性を有することである。
は有毒薬剤を使用せず、熟練労働者のみでなく、非熟練
者に対しても手動で方法の実施に一般的有用性を有し、
および試料を、すなわち実験室から遠隔地の水源から集
めた後、形成色度を標準クロマトグラフイチャートと比
較することにより２０分以内に測定結果を評価しうる可
能性を有することである。
これまで硝酸定量に対（７既知の酵素系は酸素により阻
害され、熱安定性に欠け、又は反応は異常な程進行が遅
く、従って反応時間は４５℃で４〜５時間かかる。本発
明による硝酸の亜硝酸への還元は酸素が存在してさえ１
０分で実施しうろことは従って驚くべきことである。
害され、熱安定性に欠け、又は反応は異常な程進行が遅
く、従って反応時間は４５℃で４〜５時間かかる。本発
明による硝酸の亜硝酸への還元は酸素が存在してさえ１
０分で実施しうろことは従って驚くべきことである。
高温方法は一層高い反応割合および基質が生成物に転換
する時間が短かい利点を有する。沸騰水中の高温方法は
特に重要である。何故なら加熱処理の温度調整が不要で
あるからである。別の重要な固有性は室温で好熱細胞お
よび酵素の低活性および高安定性であり、これは細胞お
よび酵素の回収中、および貯蔵中冷蔵の必要性を軽減し
、長期保存寿命を有する触媒活性が商業的に供される。
する時間が短かい利点を有する。沸騰水中の高温方法は
特に重要である。何故なら加熱処理の温度調整が不要で
あるからである。別の重要な固有性は室温で好熱細胞お
よび酵素の低活性および高安定性であり、これは細胞お
よび酵素の回収中、および貯蔵中冷蔵の必要性を軽減し
、長期保存寿命を有する触媒活性が商業的に供される。
発明の詳細な記載
本発明の細胞菌株は次のＴｈｅｔｖｕ特徴を有する二グ
ラム陰性、胞子を形戊せず、オキシダーゼ陽性、薄い桿
状体長さ数μｍ，液体培地で７５℃で糸状体を形成二代
表的Ｔｈｅｒ＋ｕｓ種と区別する１つの特徴は電子受容
体として硝酸による嫌気発育である。
ラム陰性、胞子を形戊せず、オキシダーゼ陽性、薄い桿
状体長さ数μｍ，液体培地で７５℃で糸状体を形成二代
表的Ｔｈｅｒ＋ｕｓ種と区別する１つの特徴は電子受容
体として硝酸による嫌気発育である。
嫌気的に硝酸塩上に成育し、硝酸を亜硝酸に還元するｒ
ｂｅｒｍｕｓ菌株は上記したが、これらは詳細に特徴化
されてはいない。これらは硝酸に対ずる還元剤としてホ
ルメートを使用できることを示さなかった。又、これら
のレダクターゼの特徴は全く測定されなかった（ハドソ
ンら、１９８９”；ムンスターら、１９８６”，シャー
プおよびウィリアムズ、１９８８５））。耐熱性蟻酸結
合硝酸レダクターゼ酵素系はこれまで記載されていない
。従ってこれは新規レダクターゼ酵素系を有する新規微
生物である。これらの新しい特徴に基づいて単離物は新
種、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｕｅｔｏｂｉｅｕｓとして規定
される。
ｂｅｒｍｕｓ菌株は上記したが、これらは詳細に特徴化
されてはいない。これらは硝酸に対ずる還元剤としてホ
ルメートを使用できることを示さなかった。又、これら
のレダクターゼの特徴は全く測定されなかった（ハドソ
ンら、１９８９”；ムンスターら、１９８６”，シャー
プおよびウィリアムズ、１９８８５））。耐熱性蟻酸結
合硝酸レダクターゼ酵素系はこれまで記載されていない
。従ってこれは新規レダクターゼ酵素系を有する新規微
生物である。これらの新しい特徴に基づいて単離物は新
種、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｕｅｔｏｂｉｅｕｓとして規定
される。
本発明で使用し、同一特徴を有する
Ｔ． ａｍａｅｔｏｂｉｃｕは：Ｍ−１０ （ＤＳＭ−
５２２５）およびＭ−４１ （ＤＳＭ−５２２６）
（ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｗｓ！Ｉａｇ ｖａｎ Ｍｉｋ
ｒｏｏｔｇａｎｉｓｃｈｅ＋＋ ａｎｄＸｅｌｌｋｉｌ
ｌｗｖｅｎ， ＤＭＢＨ， １ ９ ８ ９年２月２４
日、プダベスト条約により寄託された）である。
５２２５）およびＭ−４１ （ＤＳＭ−５２２６）
（ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｗｓ！Ｉａｇ ｖａｎ Ｍｉｋ
ｒｏｏｔｇａｎｉｓｃｈｅ＋＋ ａｎｄＸｅｌｌｋｉｌ
ｌｗｖｅｎ， ＤＭＢＨ， １ ９ ８ ９年２月２４
日、プダベスト条約により寄託された）である。
７５℃のアイスランドの温泉でその場所でＫＮＯ３溶液
を給与し栄養強化した３ケ月生育菌株を単離した。単離
方法は次の通りであった・その場所で栄養強化した試料
を採取し、７５℃で２週間、完全に満たした瓶中で培養
し、次に新鮮培地を完全に満たした瓶中に接種して２週
間培養した。瓶からの試料は０．４５μｍフィルター上
で濾過し、フィルターは寒天培地上に置いた。６５℃で
２日培養し、フィルター上のコ口ニーを採取し、純粋カ
ルチャーが定着するまで寒天培地上で画線培養した。
を給与し栄養強化した３ケ月生育菌株を単離した。単離
方法は次の通りであった・その場所で栄養強化した試料
を採取し、７５℃で２週間、完全に満たした瓶中で培養
し、次に新鮮培地を完全に満たした瓶中に接種して２週
間培養した。瓶からの試料は０．４５μｍフィルター上
で濾過し、フィルターは寒天培地上に置いた。６５℃で
２日培養し、フィルター上のコ口ニーを採取し、純粋カ
ルチャーが定着するまで寒天培地上で画線培養した。
細胞の生育に対し次のものを使用した：細胞の生育に対
する醗酵は０． ５重量％酵母エキスおよび０．５ｉ
１ＩＦｔ％ＫＮ０３を含有する完全培地で行なった。寒
天培地に対しては、３％寒天（３０ｇ／ｌ）を使用した
。ｐＨはオートクレープ処理前約中性に設定した（例１
参照）。
する醗酵は０． ５重量％酵母エキスおよび０．５ｉ
１ＩＦｔ％ＫＮ０３を含有する完全培地で行なった。寒
天培地に対しては、３％寒天（３０ｇ／ｌ）を使用した
。ｐＨはオートクレープ処理前約中性に設定した（例１
参照）。
細胞は４００ｍｌの培地を含有する５００ｍｌフラスコ
で培養し、振機せずに６５℃又は７５℃で培養した。そ
の後上記と同じ１００ｌの培地を含有する１５０ｌの醗
酵容器で細胞を生育させた。
で培養し、振機せずに６５℃又は７５℃で培養した。そ
の後上記と同じ１００ｌの培地を含有する１５０ｌの醗
酵容器で細胞を生育させた。
細胞および酵素の製造では、細胞は遠心分離により採集
ｊ７、硝酸塩および亜硝酸塩を含まなくなるまで０．８
５％ ＮａＣ ｌ溶液中で洗滌した（例２参照）。洗滌
後、細胞は凍結および解凍を反復し、標準アッセイ條件
下でアッセイ管当り１０分で０．００５〜０．７５μｇ
Ｎｏ３−Ｎに０．０３ｍｌのこの酵素溶液（例３参照）
が定景的に減少するような濃度（湿潤重屋／ｍｌ）に稀
釈した。この方法から得た重要な改良はポルメートの使
用が可能なことである。これは安価な、非毒性還元剤源
であり、非耐熱性酵素を使用する上記系で必要であるよ
うに酵素をアッセイで回避する必要がない。硝酸含有試
料の硝酸定級に対ｌ７この酵素標品の使用方法は例４に
記載する。
ｊ７、硝酸塩および亜硝酸塩を含まなくなるまで０．８
５％ ＮａＣ ｌ溶液中で洗滌した（例２参照）。洗滌
後、細胞は凍結および解凍を反復し、標準アッセイ條件
下でアッセイ管当り１０分で０．００５〜０．７５μｇ
Ｎｏ３−Ｎに０．０３ｍｌのこの酵素溶液（例３参照）
が定景的に減少するような濃度（湿潤重屋／ｍｌ）に稀
釈した。この方法から得た重要な改良はポルメートの使
用が可能なことである。これは安価な、非毒性還元剤源
であり、非耐熱性酵素を使用する上記系で必要であるよ
うに酵素をアッセイで回避する必要がない。硝酸含有試
料の硝酸定級に対ｌ７この酵素標品の使用方法は例４に
記載する。
例１， Ｔｈｅｔｍｕｓ ａｎｉｅｔｏｂｉｃｕｓの発
育Ｔ． ｘｎａｅｔｏｂｉｅｕｓの培養に使用する基礎
塩培地は次の通りである： ニトリロトリ酢酸 ４５■／ＩＦｅＣ
Ｏ４Ｈ ０ ３５０μｇ／ＡＰ３２ ＭｎＣ ・４Ｈ Ｏ １７５μｇ／／２２ ＣｏＣ ＠６１４ Ｇ １０５μｇ／ｊ？
２２ ＺｎＣ ２ ７０．ｃｚｇ／／Ｃ
ｕＣ ・２Ｈ ０ １８１１ｇ／／２２ ＮａＭｏＯ ・２ｔｌ２０ ２４５μｇ／Ａ’４ Ｎ ａ Ｓ ｅ Ｏ −５ １４ ２ ０ ２
８ ０ ／’ ｇ ／ ！！３ Ｈ３Ｂ０４ ７μｇ／Ｉ！Ｎ Ｉ Ｃ
１ ２●６Ｈ２０ ７μｇ／ｊ？Ｋ Ｎ Ｏ
３５ ｇ ／ ’ 緩衝剤はｐＨ７． ２の２０ｍＭリン酸塩緩衝剤であ
る。ＩＩ！の培地に５ｇの酵母玉キス又は２．５ｇの酵
母エキスおよび２．５ｇのトリプトンを添加する。５０
０ｍｌのフラスコ中の発育に対しＮａＮ３１ｌｌｌＭを
オー１・クレープ処理前に添加する。
育Ｔ． ｘｎａｅｔｏｂｉｅｕｓの培養に使用する基礎
塩培地は次の通りである： ニトリロトリ酢酸 ４５■／ＩＦｅＣ
Ｏ４Ｈ ０ ３５０μｇ／ＡＰ３２ ＭｎＣ ・４Ｈ Ｏ １７５μｇ／／２２ ＣｏＣ ＠６１４ Ｇ １０５μｇ／ｊ？
２２ ＺｎＣ ２ ７０．ｃｚｇ／／Ｃ
ｕＣ ・２Ｈ ０ １８１１ｇ／／２２ ＮａＭｏＯ ・２ｔｌ２０ ２４５μｇ／Ａ’４ Ｎ ａ Ｓ ｅ Ｏ −５ １４ ２ ０ ２
８ ０ ／’ ｇ ／ ！！３ Ｈ３Ｂ０４ ７μｇ／Ｉ！Ｎ Ｉ Ｃ
１ ２●６Ｈ２０ ７μｇ／ｊ？Ｋ Ｎ Ｏ
３５ ｇ ／ ’ 緩衝剤はｐＨ７． ２の２０ｍＭリン酸塩緩衝剤であ
る。ＩＩ！の培地に５ｇの酵母玉キス又は２．５ｇの酵
母エキスおよび２．５ｇのトリプトンを添加する。５０
０ｍｌのフラスコ中の発育に対しＮａＮ３１ｌｌｌＭを
オー１・クレープ処理前に添加する。
１． ５ ０ ７’醗酵容器で発育させる場合、始めの
細胞の好気発育後ＮａＮ３１Ｉ！ｌＭを添加する。
細胞の好気発育後ＮａＮ３１Ｉ！ｌＭを添加する。
５００ｍｌフラスコは振盪せずに６５℃で４日恒温器で
培養し、細胞を採集し、硝酸アッセイに使用する。
培養し、細胞を採集し、硝酸アッセイに使用する。
１００ｌ醗酵容器に２ｌの１８時間生育した好気発育細
胞を接種した。２ ５ Ｏ ｒｐｍの一定撹拌および６
５℃で連続通気（５ｌ／分）を７時間維持し、次に６５
℃で２０時間培養基にＮ２ （１７！／分）を連続的に
通気した。細胞を遠心分離により採集し、硝酸塩および
亜硝酸塩を含有しな《なるまで０．８５％ＮａＣｌ中で
洗滌した。
胞を接種した。２ ５ Ｏ ｒｐｍの一定撹拌および６
５℃で連続通気（５ｌ／分）を７時間維持し、次に６５
℃で２０時間培養基にＮ２ （１７！／分）を連続的に
通気した。細胞を遠心分離により採集し、硝酸塩および
亜硝酸塩を含有しな《なるまで０．８５％ＮａＣｌ中で
洗滌した。
例２．細胞全体の懸濁液の製造
洗滌した全体の細胞を次の溶液＝４０％グリセロール、
０．８５％ＮａＣｌおよび０．１７％安息香酸ナトリウ
ムに懸濁する。この酵素溶液の活性は直線的に０．
００５ 〜０．７５ｐｐｍＮ０３Ｎに減少する（第１図
参照）。懸濁液の湿潤細胞の代表的濃度は０． １．
ｇ／ｍｌである。
０．８５％ＮａＣｌおよび０．１７％安息香酸ナトリウ
ムに懸濁する。この酵素溶液の活性は直線的に０．
００５ 〜０．７５ｐｐｍＮ０３Ｎに減少する（第１図
参照）。懸濁液の湿潤細胞の代表的濃度は０． １．
ｇ／ｍｌである。
例３，蟻酸結合硝酸レダクターゼ酵素系の特性例１およ
び２で製造した酵素活性を有イる全体の細胞調製街は特
に記載しない場合５ｏＩｌｌＭのホルメートおよび５
０ ｐｌｌｍ Ｎ ０ ３Ｎ中で８５℃およびｐＨ４．
５で定量分析する。最適活性はｐＨ４． ５にお
いてである（第２図参照）。最高活性は８５℃において
である（第３図参照）。硝酸塩に対する分析條件で水溶
液中の半減期（沸騰水）は少なくとも１５分、９０℃で
少なくとも９０分、および８０℃で少なくとも１２０分
である（第４図参照）。
び２で製造した酵素活性を有イる全体の細胞調製街は特
に記載しない場合５ｏＩｌｌＭのホルメートおよび５
０ ｐｌｌｍ Ｎ ０ ３Ｎ中で８５℃およびｐＨ４．
５で定量分析する。最適活性はｐＨ４． ５にお
いてである（第２図参照）。最高活性は８５℃において
である（第３図参照）。硝酸塩に対する分析條件で水溶
液中の半減期（沸騰水）は少なくとも１５分、９０℃で
少なくとも９０分、および８０℃で少なくとも１２０分
である（第４図参照）。
例４．硝酸塩の定置方法
溶液Ａ：蟻酸結合硝酸レダクターゼ酵素系溶液。
酵素溶液は沸騰水中で１ｏ分で１ ｍｌ試料溶液のＮＯ
３−Ｎを０．００５ 〜０．７５μｇに減少する触媒活
性を示し、Ｏ− １ ｇ／ｍｌ （湿潤重：！Ｉｔ／
ｍｌ）の全体の細胞濃度で４０％グリセロールおよび０
．８５％ＮａＣＩおよび０．１７％安息香酸ナトリウム
溶液として貯蔵した。この溶液は直接分析に使用し室温
で６週間保存できる。
３−Ｎを０．００５ 〜０．７５μｇに減少する触媒活
性を示し、Ｏ− １ ｇ／ｍｌ （湿潤重：！Ｉｔ／
ｍｌ）の全体の細胞濃度で４０％グリセロールおよび０
．８５％ＮａＣＩおよび０．１７％安息香酸ナトリウム
溶液として貯蔵した。この溶液は直接分析に使用し室温
で６週間保存できる。
溶液Ｂ：ホルメート溶液：クエン酸、リン酸塩緩衝液ａ
｝１４． ５中の１。ＯＭホルメート。
｝１４． ５中の１。ＯＭホルメート。
溶液Ｃ ： ０． Ｏ ０ ５”０． ７ ５ｐｐ
ｍ Ｎｏ３−Ｎを含有する試料溶液。
ｍ Ｎｏ３−Ｎを含有する試料溶液。
色素試薬：
溶液Ｄ：３Ｍ ＨＣＩ中の１−％スルファニル酸溶液
Ｅ：０．０２％ Ｎ〜（１〜ナフチル）一エチレンジア
ミンジハイドロクロリド。
Ｅ：０．０２％ Ｎ〜（１〜ナフチル）一エチレンジア
ミンジハイドロクロリド。
実験方法。
試薬ブランクに対する測定。
２ｍｌアッセイ管中にピペットする：
試料溶液（Ｃ） ＋ｌ． Ｏｍｌ
溶液Ａ ３１１ＩＪｌ
３ｈｌ溶液８５０μ１ ５０ｐｌ
混合し、沸騰水中で１０分インキユベートし次に添加：
溶液Ｄ ０． ２ｍｌ
Ｏ． ２ｍ［硝酸塩水溶液。
３ｈｌ溶液８５０μ１ ５０ｐｌ
混合し、沸騰水中で１０分インキユベートし次に添加：
溶液Ｄ ０． ２ｍｌ
Ｏ． ２ｍ［硝酸塩水溶液。
１０分後形或色度を標準化クロマトグラフィーチャート
と比較し、又は形成危度を５４０ｎｍで測定し、試薬ブ
ランクを控除する。
と比較し、又は形成危度を５４０ｎｍで測定し、試薬ブ
ランクを控除する。
例５．各稲試料中の硝酸塩の定量方法
溶液Ｃは食品抽出物から製造することを除いて方法は例
４と同じである。食品試料を秤量し、３分間ブレンダー
中の５０ｍｌ蒸留水中に混合し、１０分間沸騰水浴中の
半分満たしたメスフラスコに保持した。次に水を標線ま
で添加し、試料はワットマンｋｌ濾紙を通して濾遍した
。結果は第１表に示す。
４と同じである。食品試料を秤量し、３分間ブレンダー
中の５０ｍｌ蒸留水中に混合し、１０分間沸騰水浴中の
半分満たしたメスフラスコに保持した。次に水を標線ま
で添加し、試料はワットマンｋｌ濾紙を通して濾遍した
。結果は第１表に示す。
第１表。食品抽出物の硝酸塩の定鼠
ソーセージ
白キャベツ
０．１４５ Ｑ、ＯｆＩ Ｏ．２２５
１０（１０．３４Ｑ Ｏ．０８１）ｉ＋５
９４１００ ４４２ 引用文献 １） Ｌｏｖｅ，Ｒ．ＨＪ Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ．Ｍ．
Ｃ． １９７５ ．ＡｖＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ Ｓｊｒａｉ＋ｉ ｌｏｔ ｔｌｓｅ ｉｎＮｉｔ
ｒａｔｅ Ａｎｘ！ｙｓｉｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ａｇｒｉｃｕｌｔａｒｅａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ２３， ７８３−７８５．２）＾ＰＨＡ，
ＡＷＷ＾，Ｗ［’ＣＦ（１９８５）．Ｓｔａｎｄｍｔｄ
ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒ ！ｈｅ Ｅｘａｍｉｎａｔｉ
ｏｎ ｏｉ Ｖａｌｅｔ ａｎｄＷｍｓ＋ｅｗａｔｅｒ
． １６１ｈ ｅｄ． ＷＲｇｈｉＢｌｕ＋， Ｄ，
Ｃ，３） ｝［Ｉｌｄｓｏｎ， Ｊ． Ａ． ， Ｍｏ
ｒｇｉｎ， Ｈ． Ｗ． ＆ Ｄａｎｉｅｌ， Ｒ．
Ｍ． １９８９．Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｃｌａｓｓｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ ｏ［ ＴｈｅｒｍｕｓＩｓｏｌａｔｅ
ｓ ｆｒｏｍ ＧＩｏｂａｌｌ７ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔ
ｅｄ ｌｌｏｆＳｐｒｉｎｇｓ，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
ａｎｄ＾ｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｉ
Ｉ，２５０−２５６．４） Ｍｕｎｓｔｅｒ． Ｍ．
Ｉ， ， Ｍｕｎｓｔｅｒ， Ａ．Ｐ．Ｗｏｏｄｒｏｗ
， Ｊ．Ｒ， ＆Ｓｈａｒｐ，Ｒ．Ｊ．ＩＨ６．Ｉｓｏ
ｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ＰｒｅｌｉｒＢｉｎａｒｙ
Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ Ｓｔｕｄｉｅｓ ａｌ Ｔｈｅｔ
ｍｕｓ ＳｔｒａｉｎｓＩｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ
Ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｒｋ
，ＵＳＡ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍ
ｉｅｒｏｂｉｏｌｅｇｙ １３２．１６７７−１６８３ ５） Ｓｈａｒｐ，Ｒ．］．＆ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ
．＾， ０． １９８８Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ
Ｔｈｃｔ＋ｕｓ ｒｕｂｃｒ Ｓｔｒａｉｎｓ
Ｉｓｏｌａｔｅｄ ＩｒｏｆｆｉＩｃｅｌａｎｄｉｃ
Ｈｏｔ Ｓｐｒｉｎｇｓ ａｎｄＤＮＡ：ＤＮＡ Ｈｏ
ｍｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｏｂｅｒ
ａｎｄＴｈｅｒｍｎｓ ｍｑ＋ｕｔｉｅｕｓ．Ａｐｐ
ｌｉｅｄ ａｎｄＥｎｒｔｔｏｎｍｅｎｌａｌ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５４．２０４９−２０５３．
１０（１０．３４Ｑ Ｏ．０８１）ｉ＋５
９４１００ ４４２ 引用文献 １） Ｌｏｖｅ，Ｒ．ＨＪ Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ．Ｍ．
Ｃ． １９７５ ．ＡｖＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ Ｓｊｒａｉ＋ｉ ｌｏｔ ｔｌｓｅ ｉｎＮｉｔ
ｒａｔｅ Ａｎｘ！ｙｓｉｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ａｇｒｉｃｕｌｔａｒｅａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ２３， ７８３−７８５．２）＾ＰＨＡ，
ＡＷＷ＾，Ｗ［’ＣＦ（１９８５）．Ｓｔａｎｄｍｔｄ
ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒ ！ｈｅ Ｅｘａｍｉｎａｔｉ
ｏｎ ｏｉ Ｖａｌｅｔ ａｎｄＷｍｓ＋ｅｗａｔｅｒ
． １６１ｈ ｅｄ． ＷＲｇｈｉＢｌｕ＋， Ｄ，
Ｃ，３） ｝［Ｉｌｄｓｏｎ， Ｊ． Ａ． ， Ｍｏ
ｒｇｉｎ， Ｈ． Ｗ． ＆ Ｄａｎｉｅｌ， Ｒ．
Ｍ． １９８９．Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｃｌａｓｓｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ ｏ［ ＴｈｅｒｍｕｓＩｓｏｌａｔｅ
ｓ ｆｒｏｍ ＧＩｏｂａｌｌ７ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔ
ｅｄ ｌｌｏｆＳｐｒｉｎｇｓ，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
ａｎｄ＾ｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｉ
Ｉ，２５０−２５６．４） Ｍｕｎｓｔｅｒ． Ｍ．
Ｉ， ， Ｍｕｎｓｔｅｒ， Ａ．Ｐ．Ｗｏｏｄｒｏｗ
， Ｊ．Ｒ， ＆Ｓｈａｒｐ，Ｒ．Ｊ．ＩＨ６．Ｉｓｏ
ｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ＰｒｅｌｉｒＢｉｎａｒｙ
Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ Ｓｔｕｄｉｅｓ ａｌ Ｔｈｅｔ
ｍｕｓ ＳｔｒａｉｎｓＩｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ
Ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｒｋ
，ＵＳＡ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍ
ｉｅｒｏｂｉｏｌｅｇｙ １３２．１６７７−１６８３ ５） Ｓｈａｒｐ，Ｒ．］．＆ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ
．＾， ０． １９８８Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ
Ｔｈｃｔ＋ｕｓ ｒｕｂｃｒ Ｓｔｒａｉｎｓ
Ｉｓｏｌａｔｅｄ ＩｒｏｆｆｉＩｃｅｌａｎｄｉｃ
Ｈｏｔ Ｓｐｒｉｎｇｓ ａｎｄＤＮＡ：ＤＮＡ Ｈｏ
ｍｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｏｂｅｒ
ａｎｄＴｈｅｒｍｎｓ ｍｑ＋ｕｔｉｅｕｓ．Ａｐｐ
ｌｉｅｄ ａｎｄＥｎｒｔｔｏｎｍｅｎｌａｌ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５４．２０４９−２０５３．
第Ｅ図は試料中の硝酸塩濃度に対Ｌ，Ａの依存関係を示
す。 第２図はｐｌｌが反応速度に如何に影響するがを示す。 第３図は温度が反応速度に如何に影饗するがを示す。 第４図は温度不活性化カーブを示す。
す。 第２図はｐｌｌが反応速度に如何に影響するがを示す。 第３図は温度が反応速度に如何に影饗するがを示す。 第４図は温度不活性化カーブを示す。
Claims (12)
- （１）実質的に純粋形のＴｈｅｒｍｕｓａｎａｅｒｏｂ
ｉｃｕｓを含むことを特徴とする、耐熱性蟻酸結合硝酸
レダクターゼ酵素系を生産し得る新規好熱微生物。 - （２）実質的に純粋形のＴｈｅｒｍｕｓａｎａｅｒｏｂ
ｉｃｕｓＭ−１０およびＭ−４１を含む、請求項１記載
の微生物。 - （３）実質的に純粋形のＴｈｅｒｍｕｓａｎａｅｒｏｂ
ｉｃｕｓＭ−１０（ＤＳＭ−５２２６）およびＭ−４１
（ＤＳＭ−５２２５）を含む、請求項１又は２記載の微
生物。 - （４）ＫＮＯ＿３溶液を給与した、Ｔｈｅｒｍｕｓａｎ
ａｅｒｏｂｉｃｕｓを含有する試料を温泉から単離し、
試料から細菌を適当な収量で生産する温度および生育條
件で、完全に満たした瓶中で培養し、培養物からＴｈｅ
ｒｍｕｓａｎａｅｒｏｂｉｃｕｓを単離することを特徴
とする、実質的に生物学的に純粋形のＴｈｅｒｍｕｓａ
ｎａｅｒｏｂｉｃｕｓを単離する方法。 - （５）６０℃から沸点までの水の温度で基質としてホル
メートを使用して硝酸塩を亜硝酸塩に還元し、酵素系は
Ｔｈｅｒｍｕｓａｎａｅｒｏｂｉｃｕｓに由来すること
を特徴とする、酵素的に活性形の耐熱性蟻酸結合硝酸レ
ダクターゼ酵素系。 - （６）基質として硝酸塩およびホルメートを使用して測
定して８０℃で少なくとも１２０分、９０℃で少なくと
も９０分、１００℃で少なくとも１５分の活性半減期を
有し、酵素系はＴｈｅｒｍｕｓａｎａｅｒｏｂｉｃｕｓ
に由来し、ｐＨ４．５および８５℃の温度で最高活性を
有することを特徴とする、請求項４の耐熱性蟻酸結合硝
酸レダクターゼ酵素系の酵素的に活性の細胞全体の調製
物。 - （７）次の工程： ａ）好熱性菌の菌株を培養基に接種し、 ｂ）６５〜８５℃の温度で細菌を培養し、 ｃ）酸素なしで細菌を培養し、 ｄ）遠心分離により耐熱性蟻酸結合硝酸レダクターゼ酵
素系を含有する消費培地上澄から細菌を純化する工程を
含むことを特徴とする、耐熱性酵素の生産方法。 - （８）硝酸塩含有試料を耐熱性蟻酸結合硝酸レダクター
ゼ酵素系とホルメートの存在で反応させて亜硝酸塩を形
成し、通例技術により試料中の硝酸塩の尺度として形成
亜硝酸塩を測定することを特徴とする、硝酸塩の定量方
法。 - （９）方法は熱水、好ましくは沸騰水中で、酸素の存在
を回避するために何ら特別の予防策を講ぜずに行なう、
請求項８記載の方法。 - （１０）耐熱性蟻酸結合硝酸レダクターゼ酵素系は硝酸
塩およびホルメートを基質として使用して測定して８０
℃で少なくとも１２０分、９０℃で少なくとも９０分、
１００℃で少なくとも１５分の活性半減期を有し、Ｔｈ
ｅｒｍｕｓ ａｎａｅｒｏｂｉｃｕｓに由来し、かつｐ
Ｈ４．５および８５℃の温度で最高活性を有する、請求
項８記載の方法。 - （１１）酵素系はＴｈｅｒｍｕｓ ａｎａｅｒｏｂｉｃ
ｕｓＭ−１０（ＤＳＭ−５２２６）およびＭ−４１（Ｄ
ＳＭ−５２２５）からである、請求項１０記載の方法。 - （１２）耐熱性蟻酸結合硝酸レダクターゼ酵素系はＴｈ
ｅｒｍｕｓ属の細菌からである、請求項８記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE8900982-3 | 1989-03-20 | ||
| SE8900982A SE8900982L (sv) | 1989-03-20 | 1989-03-20 | Isolering av en ny termofil bakterieart thermus anaerobicus framstaellning och preparation av ett nytt formiatbundet nitratreduktassystem av detta foer analytisk och kommersiell anvaendning. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0327282A true JPH0327282A (ja) | 1991-02-05 |
Family
ID=20375404
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2071719A Pending JPH0327282A (ja) | 1989-03-20 | 1990-03-20 | 硝酸レダクターゼ酵素系の生産方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0389457A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0327282A (ja) |
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Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2121561B1 (es) * | 1997-05-09 | 1999-05-16 | Univ Madrid Autonoma | Nitrato reductasa termoestable aplicable para la deteccion de nitratos a alta temperatura. |
| CN108018307B (zh) * | 2017-12-08 | 2021-05-11 | 杭州师范大学 | AtNIA1基因在提高杭白菊苗抗重金属污染和抗氧化活性中的应用 |
-
1989
- 1989-03-20 SE SE8900982A patent/SE8900982L/xx not_active Application Discontinuation
-
1990
- 1990-03-15 EP EP19900850099 patent/EP0389457A3/en not_active Withdrawn
- 1990-03-20 JP JP2071719A patent/JPH0327282A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0389457A2 (en) | 1990-09-26 |
| EP0389457A3 (en) | 1991-09-25 |
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