KR100466211B1 - 폐수 중의 질소 제거능을 가지는 바실러스속 ｃｈ-ｎ 균주 - Google Patents

폐수 중의 질소 제거능을 가지는 바실러스속 ｃｈ-ｎ 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폐수 중의 질소 제거능을 가진 바실러스속 (Bacillussp.) CH-N 균주에 관한 것으로서, 상기 균주는 자연계에서 생육이 양호하며 폐수 중에 존재하는 각종 질소를 산화 시킴으로써 악취 제거 및 부영양화 방지 등에 있어서 탁월한 효과가 있다. 기존의 물리화학적 방법의 복잡하고 고비용의 질소제거 공법을 대체할 수 있는 생물학적 수처리 시스템에 사용하기 위한 미생물로서 생육특성, 질소제거능력 및 담체고정에 의한 질소제거의 조사에서 그 효과가 우수한 바실러스속(Bacillussp.) CH-N에 관한 것이다.

Description

폐수 중의 질소 제거능을 가지는 바실러스속 ＣＨ-Ｎ 균주 {Bacillus sp. CH-N strain with nitrogen removal activity in wastewater}
본 발명의 목적은 기존의 물리화학적 질소처리 공법에 수반되는 문제점을 해결하는 생물학적 수처리 시스템의 개발을 위한 효과적인 미생물제재를 개발하기 위한 것이다. 생물학적 수처리 시스템에서 미생물을 이용하여 처리하는 기법이 가장 자연친화적인 방법이고 처리비용도 저렴한 것이므로, 본 발명은 질소제거를 위한 효율적인 생물학적 폐수처리 시스템에 적용할 수 있으며, 저온, 고온 및 산성 조건의 다양한 환경조건에서도 생존력이 강하며 최적인 미생물을 개발하고자 하는 것이다.
인간 및 가축의 분뇨, 도시하수, 산업폐수, 비료에 의한 농업 폐수 및 쓰레기 침출수에 포함된 질소성분은 호소의 부영양화를 일으켜 수생 생태계의 악 영향을 끼친다.[참조: Yun, D. I., Lee, J. T., Kim, D. J. and Lee, K. Y. (1998) The effect of external carbon sources on batch denitrification process.Kor. J. Appl. Microbiol.,26, 96-101]. 이들 질소 오염원의 질소 형태를 살펴보면, 암모니아성 질소와 유기질소로 구성되어 있다. 일반적으로 자연계에서의 질소 사이클은 질소분자(N2) → 암모니아성 질소(NH3-N) → 아질산성 질소(NO2-N) → 질산성질소(NO3-N) → 질소분자(N2)의 순환고리에 의해 질소의 존재 형태가 변화되어진다.[참조: Barnes, D and Bills, P. J. (1983) Biological control of nitrogen in waste water treatment.2(6), 3-7.] 암모니아성 질소는 질산화 반응에 상당량의 산소를 소모함으로 수중 용존 산소를 고갈시키며, 유리 암모니아 형태의 경우는 어패류에 독성을 발휘하기도 한다. 아질산성 질소는 신속하고 용이하게 질산성 질소로 전환한다. 질산성 질소는 질소 분해의 최종 생성물로 인체에 유해하며 유아의 청색증을 일으키는 원인이 된다.
이러한 질소 오염원을 제어하는 방법은 물리·화학적 처리법과 생물학적 처리법이 알려져 있다. 물리·화학적 처리법으로 암모니아 stripping 법이나 불연속적 염소 처리법이 주로 암모니아 질소의 제거에 이용되고 있다. 생물학적 처리법에서는 암모니아 형태의 질소를 질산화 미생물에 의해 아질산성 질소 및 질산성 질소로 질산화 시키고, 탈질균에 의해 질소 가스로 탈질 처리를 수행하고 있다. 암모니아성 질소의 산화는 니트로소모나스(Nitrosomonassp.)에 의하여 아질산성 질소로 되며, 불안정한 아질산성 질소는 니트로박터(Nitrobactersp.)에 의하여 질산성 질소로 산화되며, 이 경로는 더 빠르게 반응이 진행되어진다.[참조: Fang, H. Y. and Chou, M. S. (1993) Nitrification of ammonia nitrogen in refinary wastewater.Water Research 27, 1761-1765.] 이 등은[참조: Song, J. Y., Hwang, S. Y. and Kim, D. S. (2001) A Study on the denitrification characteristics of permeabilizedParacoccus denitrificans.Kor. J. Biotechnol. Bioeng.16, 290-294.; Lee, S. I., Park, S. K. ane Lee, W. H. (1994) Temperature dependency of denitrification rate with addition of various electron doners,J. Kor. Soc. of Environ. Engineers.16,677-683.; Nam, B. S., Ryu, W. R., Lee, Y. H., Kim, J. M. and Cho, M. H. (1999) Isolation and Characterization of Ammonia and Nitrite Nitrogen Oxidizing Strains.Kor. J. Biotechnol. Bioeng.14,76-81.] 파라코쿠스 디니트리피칸스(Paracoccus denitrificans),슈도모나스(Pseudomonassp.)를 이용하여 기질, 온도 변화 등의 조건 변화 및 고정화 균주를 이용한 효율적 탈질 방법을 연구해 왔다. 유기 오염 물질들을 제어하는 생물학적 방법이 있지만 여러 가지 어려운 점이 있다.
본 발명의 상기 목적은 균주를 생활 하수 및 산업 폐수로 오염된 토양으로부터 분리, 동정하여 분류학상의 위치를 확인하고, 질소 제거 균주의 특성, 균체 생육도, 폐수와 배지에서의 질소제거 능력 및 세라믹 담체에 고정시킨 바실러스(Bacillussp.) CH-N에 의한 질소제거 능력 등을 조사함으로써 달성하였다.
도 1은 바실러스(Bacillussp.) CH-N의 주사전자현미경 사진을 나타낸다.
도 2는 초기 pH와 배양 온도의 차이에 의한 바실러스(Bacillussp.) CH-N의 생육도를 나타낸다.
도 3은 탄소원의 농도 차이에 의한 바실러스(Bacillussp.) CH-N 균주의 암모니아성 질소의 제거 정도를 나타낸다.
도 4는 탄소원의 농도 차이에 의한 바실러스(Bacillussp.) CH-N 균주의 아질산성 질소의 제거 정도를 나타낸다.
도 5는 바실러스(Bacillussp.) CH-N 균주의 도시 하수 속의 암모니아성 질소의 제거 정도를 나타낸다.
도 6은 바실러스(Bacillussp.) CH-N 균주의 산업 폐수 속의 암모니아성 질소의 제거 정도를 나타낸다.
도 7은 바실러스(Bacillussp.) CH-N 균주의 세라믹 담체에 고정화하기 전과 고정 후의 정도를 나타낸다.
도 8은 바실러스(Bacillussp.) CH-N 균주의 세라믹 담체 고정화 후 암모니아성 질소의 제거 정도를 나타낸다.
본 발명은 수중에 존재하는 각종 형태의 질소를 제거하는 바실러스(Bacillussp.) CH-N(KACC91045)에 관한 것이다.
본 발명에서 수중의 질소 제거능을 가진 미생물 부산·경남 근교의 생활 하수 및 공장 폐수로 오염된 토양 환경 조건을 가진 10여가지 지역의 토양을 채취하여 분리된 세균 중에서 질소의 이용이 양호한 바실러스(Bacillussp.) 균주를 분리하여 사용하였다. 얻어진 콜로니 수백 개를 암모니아가 함유된 배지(표 1)에서 7일간 진탕 배양을 하면서 암모니아성 질소 제거능이 우수한 균주를 이차적으로 분리하였다. 분리 균주 중에서 암모니아 질소 제거능이 가장 우수한 균주를 선별하였다. 균주의 일반적인 계대 배양은 엘비 배지(LB-broth)를 사용하였으며, 질소 제거 측정을 위한 배지의 조성은 표 1에 나타내었다.
표1. Media composition for the measurement of nitrification
선별 균주의 동정은 각종 형태, 생리학적, 생화학적 특성을 분석하여 Bergey's manual of systematic bacteriology에 준하여 동정하였다.[참조:Krieg, M. R. and Holt, J. G. (1984) Bergey's manual of systematic bacteriology, Thewilliams and wilkins Co., Baltimore. USA.]. 선별 균주의 질소 제거능을 측정하기 위하여 암모늄 설페이트(ammonium sulfate)를 첨가한 배지에서 배양한 후, 시간대에 따른 암모니아성 질소의 경시적인 감소율 변화를 보고자 하였다. 일정 시간대 별로 샘플링하여 균 생육 정도를 측정하고 생육된 균을 4℃, 10,000 rpm에서 원심분리 하여 얻은 배지의 상등액에 존재하는 암모니아성, 아질산성 및 질산성 질소의 함량을 측정하였다. 또한, 아질산성 질소의 산화를 확인하기 위해서는 sodium nitrite를 첨가한 배지에서 배양한 배양 상등액으로부터 동일 방법으로 샘플링하여 균 생육 정도를 측정하고 생육된 배지의 상등액에 존재하는 각종 아질산성 질소와 질산성 질소의 함량을 측정하였다. 분리 균주의 생육도는 610 nm에서 흡광도로 측정하였으며, 사용한 기기는 UV-spectrophotometer(Phamacia Biotech. Ultrospec3000. U.S.A.)를 사용하였다. 암모니아성 질소 및 아질산성 질소 제거 균주의 제거율은 배지 내의 암모니아성 질소, 아질산성 질소 및 질산성 질소의 농도 변화를 경시적으로 측정하였다. 암모니아성 질소는 인돌페놀법, 아질산성 질소는 디아조화법, 질산성 질소는 부루신 법을 이용하였으며, 이는 수질 오염 공정 시험법에 준하여 분석하였다.[참조: 수질오염·폐기물·토양오염 공정 시험법. 동화기술.1992]
선별 균주의 전자 현미경 사진을 촬영하기 위해서 선별 균주를 2∼4% glutar aldehyde (0.1M Cacodylate buffer pH 7.2 , 0.1% MgSO4포함)로 30분에서 24시간동안 실온에서 전고정한다. Cacodylate buffer pH7.2로 2시간 동안 세척하고, 0.2Mcacodylate buffer (pH7.4)에 1% 되게 녹인 오스미움산 용액으로 4℃에서 24시간 동안 2차 고정시킨다. 고정된 샘플에서 용액을 제거한 뒤에 탈수를 한다. 탈수 과정은 50%, 70%, 95% 에탄올에서 각 10분간, 그리고 무수 에탄올에서 10분 간 2회 탈수한다. 탈수한 뒤에 샘플을 풍건하고, 임계점 건조기에서 건조한 뒤에, 주사 전자 현미경(SEM)으로 관찰하여 사진 촬영하였다.
선별 균주를 담체에 고정화 하여 질소 제거율을 측정하기 위해서 선별 균주인 바실러스(Bacillussp.) CH-N을 48시간 동안 배양한 배양액에 하루 동안 건열 멸균시킨 평균 직경이 0.5 mm의 세라믹 담체를 완전히 잠기게 담근다. 미생물 배양액과 담체가 섞여진 샘플을 실온에서 좌우로 흔들어 주는 장치(호기적 조건)로 48시간 정도 반응시키면서 담체에 고정시킨다. 이 때 건조된 담체의 다공질 공극 사이로 수분이 충전되면서 미생물 입자가 흡착, 고정되어 생물막을 형성하게 된다. 이 과정에서 형성된 생물막의 모습을 전자 현미경으로 관찰하여 확인한다. 질소 산화능의 측정은 미생물이 부착된 담체를 1/50, 1/250 (v/v)의 양이 되게 액체 배지에 접종한 후, 경시적으로 암모니아성 질소와 질산성 질소의 변화 양상을 측정하였다.
실험예 1: 균주의 분리 및 동정
생활 하수, 공장 폐수 및 오염된 토양 환경에서 토양을 채취하여, 10g을 100㎖의 멸균수에 넣고 200rpm, 30분 동안 혼합한 후 6단계 희석 평판법으로 LB 배지에 도말하여 생성된 콜로니를 암모니아가 함유된 배지(Table 1)에서 7일간 진탕 배양을 하여 농화된 균주를 고체 평판 배지에서 도말하여 37 ℃에서 1일 배양하였다. 생성된 콜로니를 4일간 액체 배양하면서 암모니아성 질소 및 아질산성 질소를 제거시키는 균주를 분리하여 CH-N이라 하였다. 분리 균주를 동정하고자 생리, 생화학적 특성을 조사한 결과와 전자 현미경으로 관찰한 결과를 표 2와 도 1에 나타내었다. 분석된 생리 생화학적 특성을 Bergey's manual에 의해 검토한 결과 그람양성의 짧은 간균인 바실러스(Bacillussp.)로 확인되어 바실러스(Bacillussp.) CH-N(KACC 91045)으로 명명하였다.
표 2. Biochemical and physiological characteristics of isolatedBacillussp.CH-N
실험예 2: 균주의 생육 특성
선별 균주의 배양학적 조건에 따른 질소의 제거능을 조사하고자 배양 온도 및 배양배지의 초기 pH에 따른 균주의 생육 특성을 조사하였다(도. 2). 선별 균주 바실러스(Bacillussp.)CH-N의 균주는 교반 속도 180rpm, 배양 온도 37℃에서는초기 pH 4.5에서 pH 10까지의 범위에서 생육이 왕성하였으며, 배양된 균주의 밀도를 높게 접종한 경우는 보다 더 넓은 범위의 초기 생육 pH에서도 생육 활성이 가능하였다 (자료 미제시). 배양 온도를 달리한 28℃ 에서 37℃의 범위에서는 생육이 양호하였다. 또한 4℃에서 45℃의 배양 온도에서도 비교적 양호한 생육 활성을 나타내고 있음을 실험을 통해 알 수 있어서, 미생물을 이용한 생물학적 처리의 문제점인 겨울철 처리 효율에 있어서도 안정적인 처리 효율을 유지 할 수 있는 균주로서 이용이 가능할 것으로 예상된다. 도 2에 나타내었다.
실험예 3: 균주의 배지 중 암모니아성 질소 제거 능력
선별 균주 바실러스(Bacillussp.) CH-N을 30℃에서 질소 원으로 암모늄 설페이트(ammonium sulfate)를 첨가한 배지에 배양시켜서 글루코스(glucose) 농도에 따른 질소 산화능을 비교한 결과는 도. 3에서 보여주고 있다. 선별 균주는 OD610에서 약 O.D 1.5까지의 생장률을 보였으며, 배양 48시간 이후에 0.25% glucose 첨가 배양에서 암모니아성 질소를 85% 정도까지 감소시키고, 암모니아성 질소의 제거되면서 배양 24시간에는 아질산성 질소의 생성이 최고치를 나타내었다가 이후 감소되는 현상을 볼 수 있었다(도 3a). 질소 원으로 암모니아성 질소를 첨가한 배지에서의 생육도는 글루코스(glucose)의 농도를 0.5%로 2배 증가시킨 처리 주에서 약간 증가하는 것으로 나타났다. 암모니아성 질소의 감소량과 아질산성 질소의 상대적인 생성량의 경시적인 변화 시험을 실시한 결과, 이는 탄소원의 농도가 증가함에 따라더욱 빨라지며 산화율이 증가되어지는 현상을 확인하였으며, 0.5% 글루코스(glucose)로 처리한 바실러스(Bacillussp.)CH-N의 균주에서는 더 빠른 암모니아의 제거율을 보였으며, 상대적으로 아질산태 질소는 0.5% 글루코스(glucose) 처리 주에서 보다 빨리 제거되는 것으로 나타났다(도 3b). 따라서 이 균주를 생물학적 처리용 미생물 제재로서 개발 시에는 저농도 탄소 원에서의 균주 생육 조건 확립과 저렴한 탄소원을 이용한 배양 시험을 실시하여 보다 더 경제적이며 적합한 배양 조건과 질소 제거 효과의 확립을 위한 실험이 더욱 요망되어진다.
실험예 4: 균주의 배지 중 아질산성 질소 제거 능력
질소원으로 소디움 나이트라이트(sodium nitrite)를 첨가한 배지에서 분리 균주의 질소 산화능을 측정한 결과는 도 4와 같다. 탄소원의 농도를 0.25% 글루코스(glucose)를 첨가하였을 때, 바실러스(Bacillussp.)CH-N 균주에서는 배양 48시간 후 50% 잔류량을 보였으나 탄소원의 농도가 0.5% 첨가하였을 때는 아질산성 질소가 90% 이상 소모되었다. 아질산성 질소의 급격한 제거가 이루어지는 12시간 경에는 질산성 질소가 최대의 증가치를 보이다가 점차 급격한 감소하는 경향을 보였다. 이러한 결과는 남 등이 분리한 질소 산화 균주는 아질산성 질소 제거시에 4일 후에는 아질산성 질소가 거의 제거되면서 상대적으로 질산성 질소가 증가되는 균주였으나 본 실험에서의 균주는 아질산성 질소의 감소에 따른 질소 제거 효과가 뛰어난 것으로 생각되어 질소 제거용 균주로서 더욱 적합하다고 할 수 있겠다. [참조; Nam, B. S., Ryu, W. R., Lee, Y. H., Kim, J. M. and Cho, M. H. (1999) Isolation and Characterization of Ammonia and Nitrite Nitrogen Oxidizing Strains.Kor. J. Biotechnol. Bioeng.14,76-81.]
실험예 5; 폐수 중의 암모니아성 질소 제거 능력
선별 균주인 바실러스(Bacillussp.) CH-N을 공장 폐수와 생활 폐수를 이용하여 폐수에 존재하는 암모니아성 질소 및 아질산성 질소 산화율을 측정하였다. 미리 전 배양한 균주를 접종하고 아무런 영양 요소를 첨가하지 않고서 30℃에서 진탕하면서 질소의 제거률을 측정한 결과를 도 5와 도 6에 나타내었다. 도 5에서 보는 바와 같이 폐수 중 암모니아성 질소는 CH-N을 처리한 경우 48%의 감소율을 보였으며 암모니아성 질소의 급속한 감소로 악취가 제거되었으며 아질산성 질소가 늘어나는 것을 확인할 수 있었다. 아질산성 질소는 각 초기 배지에 존재하는 농도에 비해 증가하였다. 따라서 공장 폐수에서의 질소 제거 능력은 사용한 분리 균주에서 높은 제거 효과를 나타내었다. 도 6은 생활 하수 중 암모니아성 질소의 산화를 나타낸다. 배지에서 생육시 질소 제거 능력이 우수한 바실러스(Bacillussp.) CH-N의 균주가 공장 폐수와 생활 폐수에서 생육 영양원의 무 첨가 상태에서 높은 질소 제거 능력을 보였다. 그러나 배양 시간이 길어짐에 따라 암모니아 제거 효율이 거의 변화가 없는 것은 폐수와 하수 중의 영양원이 고갈된 것이 원인으로 생각된다.
실험예 6: 미생물 고정 담체를 이용한 질소 제거 효과
생물학적 처리의 효율성 증대를 위하여 다수의 미생물을 고정시키는 재료로 각종 담체가 이용되어지고 잇다. 본 발명에서는 미생물체의 고정이 용이하며 수중에서도 장기간 안정된 구조를 유지하는 물리적 구조를 취하여 고정효과가 뛰어난 것으로 잘 알려져 있는 세라믹 담체를 사용하였다. 질소 제거 우수 균주인 바실러스(Bacillussp). CH-N의 균주를 48시간 동안 배양한 배양액을 직경 10 mm에서 15mm 정도의 다각형 세라믹 담체에 호기적 조건으로 진탕시키면서 고정시켰다. 담체에 고정된 미생물의 상태를 확인하고자 주사전자현미경(SEM)으로 관찰하여 사진 촬영한 결과, 담체의 공극에 수많은 미생물이 잘 고정되어 있는 것을 확인하였다(도 7).
미생물을 고정시킨 고정 담체를 이용한 질소의 제거능을 조사하고자, 고정 담체를 질소 배지에 넣고 30℃에서 교반 시키면서 암모니아성 질소와 아질산성 질소가 경시적으로 산화되어 변화된 결과를 도 8에 나타냈다. 담체를 1/50, 1/250 (v/v) 양으로 접종한 시험한 결과, 반응 후 24시간에는 초기의 암모니아성 질소가 전부 없어진 결과를 보였다. 이때, 균주를 직접 배양한 처리 구에서와 같이 아질산성 질소의 일시적 생성을 확인하였다.
같은 질소의 농도를 처리하여 균주가 고정된 담체와 액체 배양균을 처리한 결과를 비교해보면, 담체의 경우 반응 후 24시간에 초기의 암모니아성 질소와 질산성 질소가 전부 없어진 반면, 액체 배양균은 36시간에 전부 없어졌다. 이 결과는 담체가 액체 배양액보다 효율이 우수함을 나타내준다.
이러한 암모니아성 질소의 제거에는 세라믹 담체에 고정된 균주의 질소 제거효과를 액체 배양한 균주의 처리구와 비교해 보면, 담체에 고정된 균주의 처리구가 더 효율적이었다.
본 발명은 폐수 중의 질소 제거를 위한 생물학적 처리용 미생물 개발을 위한 목적으로 질소의 산화 능력이 뛰어난 균주를 분리하였다. 본 발명은 분리된 균주 중에서 질소 제거능과 생육 속도가 뛰어난 CH-N 균주를 선별하였으며, 생리, 생화학적 특성을 조사한 후 바실러스(Bacillussp.) CH-N으로 동정하였다. 본 발명에서 바실러스(Bacillussp.) CH-N 균주는 액체 배지 조건에서 암모니아성 질소 및 아질산성 질소가 함유된 배지 속의 질소를 빠른 시간 내에 배양 후 각각 85%와 90%의 암모니아성 질소과 아질산성 질소의 제거율을 나타내었다. 본 발명에서 바실러스(Bacillussp.) CH-N은 산업 폐수 및 생활 하수 속의 암모니아성 질소를 단시간에 크게 감소시키며, 암모니아의 악취 제거 효과가 우수하였다. 본 발명에서 바실러스(Bacillussp.) CH-N를 고정시킨 담체의 질소 제거 효과를 시험한 결과, 배양 2일 후에는 암모니아성 질소가 전부 제거시키는 효과를 나타내어 환경 폐수의 생물학적인 질소 제거용 담체 개발용 균주로서 매우 유용한 발명이다.

Claims (3)

  1. 폐수 중의 질소 제거하는 것을 특징으로 하는 바실러스속 (Bacillussp.) CH-N 균주(KACC91045)
  2. 제1항의 균주를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 수중의 질소제거용 미생물제재
  3. 제2항에 있어서, 균주는 세라믹 담체에 고정화시켜 사용하는 것을 특징으로 하는 수중의 질소제거용 미생물제재
KR10-2003-0024659A 2003-04-18 2003-04-18 폐수 중의 질소 제거능을 가지는 바실러스속 ｃｈ-ｎ 균주 KR100466211B1 (ko)

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