CN114350634B

CN114350634B - 朝藿定合成用糖苷糖基转移酶及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN114350634B
Application number: CN202111673688.6A
Authority: CN
Inventors: 虞沂; 曹应龙; 刘亚婷
Original assignee: Hubei Carbon Yuan Materia Medica Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hubei Carbon Yuan Materia Medica Biotechnology Co ltd; Wuhan University WHU
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114350634A

Abstract

本发明提供一种朝藿定合成用淫羊藿糖苷糖基转移酶及其编码基因和应用，具体涉及朝藿定A和朝藿定B生物合成途径相关的淫羊藿糖苷糖基转移酶。本发明首次克隆能够催化形成朝藿定的生物合成途径中的两个糖苷糖基转移酶，并通过烟草表达和LC‑HR‑MS鉴定了这两个酶的产物，为深入解析淫羊藿黄酮三糖苷完整的生物合成途径奠定了基础。

Description

朝藿定合成用糖苷糖基转移酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及朝藿定合成技术领域，尤其涉及一种朝藿定合成用淫羊藿糖苷糖基转移酶及其编码基因和应用。

背景技术

朝藿定A(EpimedinA)和朝藿定B(Epimedin B)是来自小檗科植物淫羊藿属淫羊藿的有效成分，属于黄酮醇三糖苷类化合物，其结构上的异戊烯基取代修饰和多个糖基修饰基团，赋予了这类化合物良好的生物活性。

朝藿定A的CAS登陆号为110623-72-8，分子式为C₃₉H₅₀O₂₀，相对分子质量为838.8。朝藿定B的CAS登陆号为110623-73-9，分子式为C₃₈H₄₈O₁₉，相对分子质量为808.8。两个化合物均为黄色结晶粉末，可溶于甲醇、乙醇、DMSO等。活性研究表明：朝藿定A和朝藿定B具有雌激素样活性、抗骨质疏松作用和免疫调节作用(Feifei Xu et al.,2016)，均有望成为改善骨质疏松的药物(Xinyue Diao et al.,2021；Ying Liu et al.,2021)。

目前，采用酶促反应合成朝藿定还处于探索阶段，亟待继续研究开发。

发明内容

基于此，有必要提供一种朝藿定合成用淫羊藿糖苷糖基转移酶及其编码基因和应用。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种利用淫羊藿苷作为底物合成朝藿定的淫羊藿糖苷糖基转移酶，其序列如a)和b)所示：

a)如SEQ ID NO.2或者SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)在a)中的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残且具有利用淫羊藿苷作为底物合成朝藿定的酶活性的衍生蛋白质。

所述朝藿定为朝藿定A或者朝藿定B。

本发明还提供一种利用淫羊藿苷作为底物合成朝藿定的淫羊藿糖苷糖基转移酶的编码基因，序列如下c)或者d)所示：

c)如SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

d)在严格条件下与c)限定的DNA序列杂交且编码具有利用淫羊藿苷作为底物合成朝藿定的酶活性的DNA分子。

本发明还提供一种包含编码基因的表达盒、重组载体或者重组菌。

本发明还提供一种制备转基因植物表达淫羊藿糖苷糖基转移酶的方法，将上述编码基因导入植物中；或者，将上述表达盒、重组载体或者重组菌导入植物中。

在其中一些实施例中，所述转基因植物为转基因烟草。

本发明还提供一种利用淫羊藿苷作为底物合成朝藿定的方法，包括如下步骤：获取制备的转基因植物；向所述转基因植物中注射底物淫羊藿苷，反应，产物提取、浓缩，即得。

在其中一些实施例中，所述转基因植物为转基因烟草，向所述转基因烟草的子叶中注射淫羊藿苷。

在其中一些实施例中，所述产物提取、浓缩的工艺条件为：甲醇水溶液，超声提取，离心得上清液，将所述上清液旋蒸浓缩，即得。

本发明提供了淫羊藿糖苷糖基转移酶在利用淫羊藿苷作为底物制备朝藿定中的应用。

本发明的有益效果：

与现有技术相比，本发明首次克隆了淫羊藿中朝藿定A和朝藿定B生物合成途径的糖苷糖基转移酶，通过转基因植物表达并与底物淫羊藿苷反应获得产物。

附图说明

图1为利用苷糖基转移酶合成朝藿定的反应式。

图2为EwGGTa、EwGGTb重组质粒酶切验证电泳图。

图3为转基因烟草表达的糖苷糖基转移酶EwGGTa催化淫羊藿苷生成朝藿定A的一级质谱谱图。

图4为EwGGTa催化淫羊藿苷生成朝藿定A的二级质谱分析谱图。

图5为转基因烟草表达的糖苷糖基转移酶EwGGTb催化淫羊藿苷生成朝藿定B的一级质谱谱图。

图6为EwGGTa催化淫羊藿苷生成朝藿定B的二级质谱分析谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。

以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

关键材料来源说明：

本氏烟草(Nicotiana benthamiana)，种子来自湖北碳元本草生物科技有限公司。

质粒pS1300T-Flag是由pS1300改造而来，获赠自武汉大学生命科学学院实验室。

大肠杆菌TOP10感受态和农杆菌感受态EHA105，购自上海唯地生物。

LB培养基的配方如下:Tryptone:10g/L，Yeast extract:5g/L，NaCl:10g/L。

本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制而得或商购获得。

值得强调的是，发明人团队通过对巫山淫羊藿的转录组数据进行分析，挖掘到了两个糖苷糖基转移酶EwGGTa、EwGGTb。本发明首次克隆了淫羊藿中朝藿定A和朝藿定B生物合成途径最后一步的糖苷糖基转移酶，并利用同源重组技术分别构建了包含编码EwGGTa、EwGGTb的基因的烟草表达载体并进行烟草叶片瞬时表达，喂养底物后，通过LC-MS比较转基因烟草和对照烟草的提取物，找到了差异化合物，并通过标准品对照和HR-MS/MS分别鉴定了产物：

(1)包含糖苷糖基转移酶EwGGTa的编码基因的转基因植物的反应产物为朝藿定A。

(2)包含糖苷糖基转移酶EwGGTb的编码基因的转基因植物的反应产物为朝藿定B。

实施例1淫羊藿糖苷糖基转移酶及编码基因

发明人团队通过大量研究发现：从巫山淫羊藿中挖掘到淫羊藿糖苷糖基转移酶EwGGTa和淫羊藿糖苷糖基转移酶EwGGTb及其编码基因。

其中，编码淫羊藿糖苷糖基转移酶EwGGTa的核苷酸序列为：

atggaaaagcctcctttacatattgctatgtttccatggtttgccatgggccatctgcttacctctctccgcctttcaaacatcttagcagagaaaggccaccaaatctccttttttgtacccacaaaaacccagtccaagttaaaccatctcaattttcgtcccaaactcgtcaatttcattccccttgttgttcctcatgtagaaggccttccatttggttctgaaaccatgtcgaacatctcaatcgaacttgaacccctccttgcaactgccttagaccttatgcaacaaaaggttgaaaaaattcttcaagatctaaaacctgattttgttttctacgacttcgcctactggataccaaaaattgctcgtccccttgggatcaagtccatattctactcaactgtggttgcatcacaatttgttgaacgtgaaatgagcgaaaaggtcgcatcttggcttgagaaaatgtggaaagcattcatccatcttgaatttgggattggggtaacattgcctcaaagacttgctgcctgcatgcaggactgcgatgccattgccttcagagggtgtcatgaaatcgagggtacagcctatgaatcccttgagataaagtatgggaaacaagtactcgtaactggtccagttttggatgaaccatgtagtttccctttggaagagcgttgggataagtggttaagggcatttccagaggaatctgtagtttactgtgcgtttgggagcgagtgggttatgactaaagaagcatttcaggaattggtcttaggtttggagtttactcgattgccattctttgtggcacttaaaccaccacatgggatgacatcagtagaggaagcattcccggctgggttcgcggaaagggtgaagggaagaggggttgtttattcgggctgggtacaacagaagctcatcctaaaccacccatcggtgggatgttttgtgacccattgcggggcttcgtcaatgtgggaatcgttagtgattgattgtcagatagtagccctgccacaagcaggggatcagtttatgaatgctaatttgttgacaaacgaactcaaggttggtgtgaaaattgagcggagggatgaggatgggtggttcacaagggagggagtgcgtcaggctgttgaggctatgatgaaccaagagagcgaagttggtataaaagccagggaaaaccatgctatgttgaaggatactttgttgaagaaaggactagaatcggcttacctgaacaatttcgttgcaaagctgcaagatatggtctga(SEQ ID NO.1)。

淫羊藿糖苷糖基转移酶EwGGTa的氨基酸序列如下：

MEKPPLHIAMFPWFAMGHLLTSLRLSNILAEKGHQISFFVPTKTQSKLNHLNFRPKLVNFIPLVVPHVEGLPFGSETMSNISIELEPLLATALDLMQQKVEKILQDLKPDFVFYDFAYWIPKIARPLGIKSIFYSTVVASQFVEREMSEKVASWLEKMWKAFIHLEFGIGVTLPQRLAACMQDCDAIAFRGCHEIEGTAYESLEIKYGKQVLVTGPVLDEPCSFPLEERWDKWLRAFPEESVVYCAFGSEWVMTKEAFQELVLGLEFTRLPFFVALKPPHGMTSVEEAFPAGFAERVKGRGVVYSGWVQQKLILNHPSVGCFVTHCGASSMWESLVIDCQIVALPQAGDQFMNANLLTNELKVGVKIERRDEDGWFTREGVRQAVEAMMNQESEVGIKARENHAMLKDTLLKKGLESAYLNNFVAKLQDMV(SEQ ID NO.2)。

编码淫羊藿糖苷糖基转移酶EwGGTb的核苷酸序列如下：

atggcgaccccgagcctgcacgtggttatgttcccgtggtttgcgatgggtcacattaccccgttcctgcagctgagcaacaagctggcggaaaaaggccaccgtattagcttcctgatcccgaccaagaccctgagcaaatttcaaaacctgaacctgcacctggacctgatcacctttgttccgctggttgtgccgcatgtggagggtctgccgattggtgcggaaaccatgagcgacgtgccgatcagcatgctgccgctgctgggtaccgcgctggatctgatggagcaccacgtggaaaccaccctgcagaacatcaagccggacttcgttttctttgattttgcgtactggatcccgaacattggtcaacgtctgggcttcaaaagcatcttttacattgtgctgagcgcggcgaccttcagctatcatgcggcgctgtttcagccgattaaggaccaccaattcaccgagagcgatctgatctatccgagcccgggttgcccgcacagcagcagcatgcagctgcaagtttttgaggcgcgtccgttcagctttctgctgcgtgaattcggtaaaagcggcctgacctttcgtgagcgtatgaccatcagcattagcgacagcaacgcgattagcttccgtacctgccgtgagatcgaaggtccgtactgcgattatctggaaagccagtggcgtaagaaaatcctgctgaccggtccggttctgccggatccgagcaacaacctgtgcctggaggaacgttgggagacctggctgggtggcttcaagggtggcagcgttatttactgcgcgtttggtagcgagtgcgtgctggaaaaagaccagttccaagagctggttatcggtctggaacacaccggcttcccgtttctggtggttctgaagccgccgttcggtaccgagaccgtggaaagcgcgctgccggatggctttgaggaacgtgttaagggtcgtggcctggtttacggtggctgggtgcagcaaccgctgattctgaaacacccgagcatcggctgcttcgtgagccactgcggtagcggcagcatgtgggaaagcctgatgaacgactgccagatcgtgctgattccgcacatcagcccgcagtatattgataccaagctgatgagccaagttctgaaagtggcggttgcggtggagcgtggtgaagacggctggtttagccgtgttgatgtgtgcaaaagcgttcaactggtgatgaacgagggtagcgaactgggcaacgaggttaagcgtaaccacgcgatgctgaaaagcatcatgctgagcgagggtttcgaaagcagctacatggacgattttaaccagaacctgtatgacctgctgcaa

(SEQ ID NO.3)。

淫羊藿糖苷糖基转移酶EwGGTb的氨基酸序列如下：

MATPSLHVVMFPWFAMGHITPFLQLSNKLAEKGHRISFLIPTKTLSKFQNLNLHLDLITFVPLVVPHVEGLPIGAETMSDVPISMLPLLGTALDLMEHHVETTLQNIKPDFVFFDFAYWIPNIGQRLGFKSIFYIVLSAATFSYHAALFQPIKDHQFTESDLIYPSPGCPHSSSMQLQVFEARPFSFLLREFGKSGLTFRERMTISISDSNAISFRTCREIEGPYCDYLESQWRKKILLTGPVLPDPSNNLCLEERWETWLGGFKGGSVIYCAFGSECVLEKDQFQELVIGLEHTGFPFLVVLKPPFGTETVESALPDGFEERVKGRGLVYGGWVQQPLILKHPSIGCFVSHCGSGSMWESLMNDCQIVLIPHISPQYIDTKLMSQVLKVAVAVERGEDGWFSRVDVCKSVQLVMNEGSELGNEVKRNHAMLKSIMLSEGFESSYMDDFNQNLYDLLQ(SEQ ID NO.4)。

实施例2表达载体的构建及烟草遗传转化方法

本实施例提供一种表达载体的构建及烟草遗传转化方法，包括如下步骤：

S1，分别针对上述淫羊藿糖苷糖基转移酶EwGGTa、EwGGTb的基因序列合成基因，并设计了烟草表达载体构建所需的扩增引物。引物序列如下表所示：

S2,以合成的基因所在质粒分别为模板，用引物按照下列PCR反应体系和反应程序扩增目的片段：

PCR反应体系

组分	用量(μL)
		10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo	5
2mMdNTPs	5
		25mM MgSO<sub>4</sub>	3
引物(F端)	1.5
		引物(R端)	1.5
模板	1
		distilled water	29
KOD-Plus-Neo	1
		Totol	50

PCR反应程序：94℃预变性2min，95℃变性10s，62℃退火30s，62℃延伸1min，扩增循环30次，68℃最后延伸10min。

PCR反应结束后，取2μL反应产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带大小是否正确。检测正确后，进行琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物。

S3，用限制性内切酶EcoRI和SacI对pS1300T-Flag载体进行线性化，并通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切线性化载体。

S4，重组反应和转化鉴定阳性克隆：

重组反应体系：5μL Hi-Fusion Cloning Mix，2μL线性化pS1300T-Flag，3μLPCR产物基因片段。重组反应体系配制完成后，用移液器轻轻吸打混匀各组分，然后将反应体系置于50℃反应20min。反应结束后将反应液离心管置于冰上冷却，之后进行转化大肠杆菌TOP10感受态。将热击转化和振荡培养45min后的菌液均匀涂布在含有卡那霉素抗生素的平板上，于37℃过夜倒置培养。

挑取培养平板上的单菌落接种至卡那霉素抗性的LB培养基中过夜培养后，提取质粒进行酶切鉴定。

结果如图2所示，验证正确的重组质粒进一步送测序公司进行测序。

S5，重组质粒转化土壤农杆菌：

取冻存的农杆菌EHA105感受态于室温片刻，待其部分融化时插入冰中，加入1μL重组质粒DNA并混匀，依次于冰上静置5min、液氮冻5min、37℃水浴5min、冰浴5min。然后加入700μL无抗生素的LB培养基，于28℃摇床振荡培养2h。培养结束取100μL菌液涂布于含卡那霉素(Kan)和利福平(Rif)抗生素的LB平板，倒置放于28℃培养箱培养2～3天，等待单克隆长出。

S6，农杆菌培养：

挑取转化有重组质粒的EHA105农杆菌单克隆于1mL含有Kan和Rif抗生素的LB培养基中，28℃摇床250rpm培养约24h。然后在5mL含有Kan和Rif抗生素的LB培养基中加入100μL、0.5M的MES溶液，2μL100mM AS溶液，再接种50μL农杆菌菌液，28℃摇床250rpm培养至OD600＝0.8。

确认菌液OD值后，4000rpm常温离心10min收集农杆菌菌体，用10mM MgCl2重悬至OD600＝0.8。

用同样的方法制备含有番茄丛矮病毒基因p19超表达载体的农杆菌，与目的基因的农杆菌等量混合，然后以每毫升菌液加入2μL的比例加入100mMAS，静置5h。

S7，侵染烟草叶片：

取生长4～6周的本生烟草植株，用1mL注射器吸入步骤S6培养获得的农杆菌菌液，去掉针头，以手指抵住叶片正面，将菌液从叶片反面渗透到叶片组织中，用标记笔在注射叶片做好标记，分别培养得到pS1300T-Flag-EwGGTa/EHA105转基因烟草(简称EwGGTa转基因烟草)、pS1300T-Flag-EwGGTb/EHA105转基因烟草(简称EwGGTb转基因烟草)。

此外，同时制备pS1300T-Flag-GFP/EHA105农杆菌进行侵染叶片，培养得到对照烟草叶片。

实施例3鉴定烟草表达EwGGTa、EwGGTb的催化产物

(1)烟草叶片底物注射：

在农杆菌侵染注射后的第四天，将水溶(0.1％DMSO)的底物淫羊藿苷用相同侵染叶片的方式分别注射进侵染了pS1300T-Flag-EwGGTa/EHA105、pS1300T-Flag-EwGGTb/EHA105和pS1300T-Flag-GFP/EHA105农杆菌的烟草叶片。

(2)烟草叶片产物提取：

于侵染注射后第五天剪取烟草叶片样品，加入50％甲醇，按照1:10料液比，超声提取30min，离心去除不溶物，对上清液分别进行旋蒸浓缩，最终样品经少量50％甲醇复溶，0.22μL滤膜过滤后装在带有内衬管的样品瓶中。

(3)烟草叶片产物鉴定分析：

用LC-HR-MS对烟草叶片化合物进行分析，LC-HR-MS平台为Thermo ScientificLTQ XL Orbitrap，ESI离子源。色谱柱为Phenomenex反向C18柱(250×4.6mm)，流速0.6ml/min，流动相A为水(0.1％甲酸)，流动相B为已腈(0.1％甲酸)。

洗脱条件为：

0-5min：B 25％；

5-10min：B 25-28％；

10-30min：B 28-30％；

30-35min：B 30-50％；

35-50min：B 50-90％；

50-53min：B 90％；

53-55min：B 90-25％；

55-65min：B 25％。

从LC-HR-MS检测结果可以看出，与对照GFP烟草相比，EwGGTa转基因烟草中产生了特征离子839.30212(图4)，该化合物的保留时间为19.05min，与标准品朝藿定A的一致，且二级质谱碎片也与标准品朝藿定A的一致(图3)。

从LC-HR-MS检测结果可以看出，与对照GFP烟草相比，EwGGTb转基因烟草中产生了特征离子809.29199(图6)，该化合物的保留时间为21.40min，与标准品朝藿定B的一致，且二级质谱碎片也与标准品朝藿定B的一致(图5)。

在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北碳元本草生物科技有限公司

<120> 朝藿定合成用淫羊藿糖苷糖基转移酶及其编码基因和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1296

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggaaaagc ctcctttaca tattgctatg tttccatggt ttgccatggg ccatctgctt 60

acctctctcc gcctttcaaa catcttagca gagaaaggcc accaaatctc cttttttgta 120

cccacaaaaa cccagtccaa gttaaaccat ctcaattttc gtcccaaact cgtcaatttc 180

attccccttg ttgttcctca tgtagaaggc cttccatttg gttctgaaac catgtcgaac 240

atctcaatcg aacttgaacc cctccttgca actgccttag accttatgca acaaaaggtt 300

gaaaaaattc ttcaagatct aaaacctgat tttgttttct acgacttcgc ctactggata 360

ccaaaaattg ctcgtcccct tgggatcaag tccatattct actcaactgt ggttgcatca 420

caatttgttg aacgtgaaat gagcgaaaag gtcgcatctt ggcttgagaa aatgtggaaa 480

gcattcatcc atcttgaatt tgggattggg gtaacattgc ctcaaagact tgctgcctgc 540

atgcaggact gcgatgccat tgccttcaga gggtgtcatg aaatcgaggg tacagcctat 600

gaatcccttg agataaagta tgggaaacaa gtactcgtaa ctggtccagt tttggatgaa 660

ccatgtagtt tccctttgga agagcgttgg gataagtggt taagggcatt tccagaggaa 720

tctgtagttt actgtgcgtt tgggagcgag tgggttatga ctaaagaagc atttcaggaa 780

ttggtcttag gtttggagtt tactcgattg ccattctttg tggcacttaa accaccacat 840

gggatgacat cagtagagga agcattcccg gctgggttcg cggaaagggt gaagggaaga 900

ggggttgttt attcgggctg ggtacaacag aagctcatcc taaaccaccc atcggtggga 960

tgttttgtga cccattgcgg ggcttcgtca atgtgggaat cgttagtgat tgattgtcag 1020

atagtagccc tgccacaagc aggggatcag tttatgaatg ctaatttgtt gacaaacgaa 1080

ctcaaggttg gtgtgaaaat tgagcggagg gatgaggatg ggtggttcac aagggaggga 1140

gtgcgtcagg ctgttgaggc tatgatgaac caagagagcg aagttggtat aaaagccagg 1200

gaaaaccatg ctatgttgaa ggatactttg ttgaagaaag gactagaatc ggcttacctg 1260

aacaatttcg ttgcaaagct gcaagatatg gtctga 1296

<210> 2

<211> 431

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Lys Pro Pro Leu His Ile Ala Met Phe Pro Trp Phe Ala Met

1 5 10 15

Gly His Leu Leu Thr Ser Leu Arg Leu Ser Asn Ile Leu Ala Glu Lys

20 25 30

Gly His Gln Ile Ser Phe Phe Val Pro Thr Lys Thr Gln Ser Lys Leu

35 40 45

Asn His Leu Asn Phe Arg Pro Lys Leu Val Asn Phe Ile Pro Leu Val

50 55 60

Val Pro His Val Glu Gly Leu Pro Phe Gly Ser Glu Thr Met Ser Asn

65 70 75 80

Ile Ser Ile Glu Leu Glu Pro Leu Leu Ala Thr Ala Leu Asp Leu Met

85 90 95

Gln Gln Lys Val Glu Lys Ile Leu Gln Asp Leu Lys Pro Asp Phe Val

100 105 110

Phe Tyr Asp Phe Ala Tyr Trp Ile Pro Lys Ile Ala Arg Pro Leu Gly

115 120 125

Ile Lys Ser Ile Phe Tyr Ser Thr Val Val Ala Ser Gln Phe Val Glu

130 135 140

Arg Glu Met Ser Glu Lys Val Ala Ser Trp Leu Glu Lys Met Trp Lys

145 150 155 160

Ala Phe Ile His Leu Glu Phe Gly Ile Gly Val Thr Leu Pro Gln Arg

165 170 175

Leu Ala Ala Cys Met Gln Asp Cys Asp Ala Ile Ala Phe Arg Gly Cys

180 185 190

His Glu Ile Glu Gly Thr Ala Tyr Glu Ser Leu Glu Ile Lys Tyr Gly

195 200 205

Lys Gln Val Leu Val Thr Gly Pro Val Leu Asp Glu Pro Cys Ser Phe

210 215 220

Pro Leu Glu Glu Arg Trp Asp Lys Trp Leu Arg Ala Phe Pro Glu Glu

225 230 235 240

Ser Val Val Tyr Cys Ala Phe Gly Ser Glu Trp Val Met Thr Lys Glu

245 250 255

Ala Phe Gln Glu Leu Val Leu Gly Leu Glu Phe Thr Arg Leu Pro Phe

260 265 270

Phe Val Ala Leu Lys Pro Pro His Gly Met Thr Ser Val Glu Glu Ala

275 280 285

Phe Pro Ala Gly Phe Ala Glu Arg Val Lys Gly Arg Gly Val Val Tyr

290 295 300

Ser Gly Trp Val Gln Gln Lys Leu Ile Leu Asn His Pro Ser Val Gly

305 310 315 320

Cys Phe Val Thr His Cys Gly Ala Ser Ser Met Trp Glu Ser Leu Val

325 330 335

Ile Asp Cys Gln Ile Val Ala Leu Pro Gln Ala Gly Asp Gln Phe Met

340 345 350

Asn Ala Asn Leu Leu Thr Asn Glu Leu Lys Val Gly Val Lys Ile Glu

355 360 365

Arg Arg Asp Glu Asp Gly Trp Phe Thr Arg Glu Gly Val Arg Gln Ala

370 375 380

Val Glu Ala Met Met Asn Gln Glu Ser Glu Val Gly Ile Lys Ala Arg

385 390 395 400

Glu Asn His Ala Met Leu Lys Asp Thr Leu Leu Lys Lys Gly Leu Glu

405 410 415

Ser Ala Tyr Leu Asn Asn Phe Val Ala Lys Leu Gln Asp Met Val

420 425 430

<210> 3

<211> 1374

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcgaccc cgagcctgca cgtggttatg ttcccgtggt ttgcgatggg tcacattacc 60

ccgttcctgc agctgagcaa caagctggcg gaaaaaggcc accgtattag cttcctgatc 120

ccgaccaaga ccctgagcaa atttcaaaac ctgaacctgc acctggacct gatcaccttt 180

gttccgctgg ttgtgccgca tgtggagggt ctgccgattg gtgcggaaac catgagcgac 240

gtgccgatca gcatgctgcc gctgctgggt accgcgctgg atctgatgga gcaccacgtg 300

gaaaccaccc tgcagaacat caagccggac ttcgttttct ttgattttgc gtactggatc 360

ccgaacattg gtcaacgtct gggcttcaaa agcatctttt acattgtgct gagcgcggcg 420

accttcagct atcatgcggc gctgtttcag ccgattaagg accaccaatt caccgagagc 480

gatctgatct atccgagccc gggttgcccg cacagcagca gcatgcagct gcaagttttt 540

gaggcgcgtc cgttcagctt tctgctgcgt gaattcggta aaagcggcct gacctttcgt 600

gagcgtatga ccatcagcat tagcgacagc aacgcgatta gcttccgtac ctgccgtgag 660

atcgaaggtc cgtactgcga ttatctggaa agccagtggc gtaagaaaat cctgctgacc 720

ggtccggttc tgccggatcc gagcaacaac ctgtgcctgg aggaacgttg ggagacctgg 780

ctgggtggct tcaagggtgg cagcgttatt tactgcgcgt ttggtagcga gtgcgtgctg 840

gaaaaagacc agttccaaga gctggttatc ggtctggaac acaccggctt cccgtttctg 900

gtggttctga agccgccgtt cggtaccgag accgtggaaa gcgcgctgcc ggatggcttt 960

gaggaacgtg ttaagggtcg tggcctggtt tacggtggct gggtgcagca accgctgatt 1020

ctgaaacacc cgagcatcgg ctgcttcgtg agccactgcg gtagcggcag catgtgggaa 1080

agcctgatga acgactgcca gatcgtgctg attccgcaca tcagcccgca gtatattgat 1140

accaagctga tgagccaagt tctgaaagtg gcggttgcgg tggagcgtgg tgaagacggc 1200

tggtttagcc gtgttgatgt gtgcaaaagc gttcaactgg tgatgaacga gggtagcgaa 1260

ctgggcaacg aggttaagcg taaccacgcg atgctgaaaa gcatcatgct gagcgagggt 1320

ttcgaaagca gctacatgga cgattttaac cagaacctgt atgacctgct gcaa 1374

<210> 4

<211> 458

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Thr Pro Ser Leu His Val Val Met Phe Pro Trp Phe Ala Met

1 5 10 15

Gly His Ile Thr Pro Phe Leu Gln Leu Ser Asn Lys Leu Ala Glu Lys

20 25 30

Gly His Arg Ile Ser Phe Leu Ile Pro Thr Lys Thr Leu Ser Lys Phe

35 40 45

Gln Asn Leu Asn Leu His Leu Asp Leu Ile Thr Phe Val Pro Leu Val

50 55 60

Val Pro His Val Glu Gly Leu Pro Ile Gly Ala Glu Thr Met Ser Asp

65 70 75 80

Val Pro Ile Ser Met Leu Pro Leu Leu Gly Thr Ala Leu Asp Leu Met

85 90 95

Glu His His Val Glu Thr Thr Leu Gln Asn Ile Lys Pro Asp Phe Val

100 105 110

Phe Phe Asp Phe Ala Tyr Trp Ile Pro Asn Ile Gly Gln Arg Leu Gly

115 120 125

Phe Lys Ser Ile Phe Tyr Ile Val Leu Ser Ala Ala Thr Phe Ser Tyr

130 135 140

His Ala Ala Leu Phe Gln Pro Ile Lys Asp His Gln Phe Thr Glu Ser

145 150 155 160

Asp Leu Ile Tyr Pro Ser Pro Gly Cys Pro His Ser Ser Ser Met Gln

165 170 175

Leu Gln Val Phe Glu Ala Arg Pro Phe Ser Phe Leu Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Gly Lys Ser Gly Leu Thr Phe Arg Glu Arg Met Thr Ile Ser Ile Ser

195 200 205

Asp Ser Asn Ala Ile Ser Phe Arg Thr Cys Arg Glu Ile Glu Gly Pro

210 215 220

Tyr Cys Asp Tyr Leu Glu Ser Gln Trp Arg Lys Lys Ile Leu Leu Thr

225 230 235 240

Gly Pro Val Leu Pro Asp Pro Ser Asn Asn Leu Cys Leu Glu Glu Arg

245 250 255

Trp Glu Thr Trp Leu Gly Gly Phe Lys Gly Gly Ser Val Ile Tyr Cys

260 265 270

Ala Phe Gly Ser Glu Cys Val Leu Glu Lys Asp Gln Phe Gln Glu Leu

275 280 285

Val Ile Gly Leu Glu His Thr Gly Phe Pro Phe Leu Val Val Leu Lys

290 295 300

Pro Pro Phe Gly Thr Glu Thr Val Glu Ser Ala Leu Pro Asp Gly Phe

305 310 315 320

Glu Glu Arg Val Lys Gly Arg Gly Leu Val Tyr Gly Gly Trp Val Gln

325 330 335

Gln Pro Leu Ile Leu Lys His Pro Ser Ile Gly Cys Phe Val Ser His

340 345 350

Cys Gly Ser Gly Ser Met Trp Glu Ser Leu Met Asn Asp Cys Gln Ile

355 360 365

Val Leu Ile Pro His Ile Ser Pro Gln Tyr Ile Asp Thr Lys Leu Met

370 375 380

Ser Gln Val Leu Lys Val Ala Val Ala Val Glu Arg Gly Glu Asp Gly

385 390 395 400

Trp Phe Ser Arg Val Asp Val Cys Lys Ser Val Gln Leu Val Met Asn

405 410 415

Glu Gly Ser Glu Leu Gly Asn Glu Val Lys Arg Asn His Ala Met Leu

420 425 430

Lys Ser Ile Met Leu Ser Glu Gly Phe Glu Ser Ser Tyr Met Asp Asp

435 440 445

Phe Asn Gln Asn Leu Tyr Asp Leu Leu Gln

450 455

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gatccggggg gcaatgagat gaattcatga acatggaaaa gcctcc 46

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttgtagtcgg taccaagctt gtcgacgacc atatcttgca gctttg 46

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggggggcaat gagatgaatt catggcgacc ccgagcct 38

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttgtagtcgg taccaagctt gtcgacttgc agcaggtcat acaggt 46

Claims

1.一种利用淫羊藿苷作为底物合成朝藿定的淫羊藿糖苷糖基转移酶，其序列为如SEQID NO.2或者SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的利用淫羊藿苷作为底物合成朝藿定的淫羊藿糖苷糖基转移酶，其特征在于，所述朝藿定为朝藿定A或者朝藿定B。

3.一种权利要求1或2所述利用淫羊藿苷作为底物合成朝藿定的淫羊藿糖苷糖基转移酶的编码基因，其特征在于，基因序列为如SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.3所示的DNA分子。

4.一种包含权利要求3所述的编码基因的表达盒、重组载体或者重组菌。

5.一种制备转基因植物表达淫羊藿糖苷糖基转移酶的方法，其特征在于，将权利要求3所述的编码基因导入植物中；

或者，将权利要求4所述的表达盒、重组载体或者重组菌导入植物中。

6.根据权利要求5所述的制备转基因植物表达淫羊藿糖苷糖基转移酶的方法，其特征在于，所述转基因植物为转基因烟草。

7.一种利用淫羊藿苷作为底物合成朝藿定的方法，其特征在于，包括如下步骤：

获取权利要求5或6制备的转基因植物；

向所述转基因植物中注射底物淫羊藿苷，反应，产物提取、浓缩，即得。

8.根据权利要求7所述的利用淫羊藿苷作为底物合成朝藿定的方法，其特征在于，所述转基因植物为转基因烟草，向所述转基因烟草的子叶中注射淫羊藿苷。

9.根据权利要求8所述的利用淫羊藿苷作为底物合成朝藿定的方法，其特征在于，所述产物提取、浓缩的工艺条件为：甲醇水溶液，超声提取，离心得上清液，将所述上清液旋蒸浓缩，即得。

10.权利要求1所述的淫羊藿糖苷糖基转移酶在利用淫羊藿苷作为底物制备朝藿定中的应用。