JP2003289884A - 新規糖転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 フラボノイドの３位の糖にグルコースを転移
する活性を有する新規な蛋白質をコードする遺伝子及び
その使用方法の提供。 【解決手段】 例えば、アサガオに由来する、特定のア
ミノ酸配列を有する、アントシアニンの３位の糖にグル
コースを転移する蛋白質をコードする遺伝子、及びこの
遺伝子によりコードされる蛋白質が提供される。この遺
伝子が導入された植物は、この遺伝子の発現により、天
然植物とは異なる色を有する花などをもたらす。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はフラボノイドを配糖
化する酵素遺伝子及びその利用方法に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】花卉産業においては顕花植物の新規なあ
るいは多様性に富んだ新品種の開発が重要である。なか
でも、花の色は花卉のもっとも重要な形質である。交配
に頼った従来の育種により、さまざまな色の品種が育種
されてきたが、交配可能な植物種の遺伝資源が限定され
ているため、単一の植物種がすべての色の品種を有する
ことはまれである。

【０００３】花の色の主な成分は、アントシアニンと総
称されるフラボノイドの一群の化合物である。植物には
多様なアントシアニンが存在することは知られており、
それらの多くの構造が既に決定されている。アントシア
ニンの色は主としてその構造に依存している。アントシ
アニンの生合成に関わる酵素や遺伝子に関しても研究が
進んでおり、分子生物学的手法と植物への遺伝子導入に
より、アントシアニンの構造を変換し、花の色を変えた
例もある（Holton et al. (1995) Plant Cell,7, p.107
1、Tanaka et al. (1998) Plant Cell Physiol. 39. p1
119）。

【０００４】アントシアニンの生合成はアントシアニジ
ン3−グルコシドに至るまではほとんどの顕花植物で共
通である。アントシアニジン3−グルコシドは種・品種
に特異的な多様な修飾を受ける。この多様性が花色の多
彩さの一因となっている。アントシアニンは中性溶液中
では不安定な化合物であるが、糖やアシル基により修飾
されることにより安定性が向上する。また、これら修飾
がアントシアニンの溶解度に影響する。

【０００５】また、これら修飾がアントシアニンの細胞
内での分布、液胞内での分布にも影響し、結果として花
色に影響する（Markham et al. Phytochem. 55, p327-3
36.(2000), Markham et al. Phytochem. 58, p403-413.
(2001), Raymond Brouillardand Olivier Dangles. Fla
vonoids and Flower colour, p565-588. in The Flavon
oids. J. B. Harborne(ED))。アシル基は、アントシア
ニジン骨格に直接結合するのではなく、その糖に結合す
るため、アントシアニンをアシル化するためには、アン
トシアニンが配糖化されている必要がある。

【０００６】フラボノイドの配糖化に関してはいくつか
の報告がある。アントシアニジンの3位の水酸基にグル
コースを転移する反応を触媒する酵素の遺伝子は、キン
ギョソウ、リンドウ、バラ、オオムギ、トウモロコシな
どからクローン化されている（Tanaka et al. (1998) P
lant Cell Physiol. 39. p1119）。また、アントシアニ
ジンの3位の水酸基にガラクトースを転移する反応を触
媒する酵素の遺伝子はケツルアズキ(Vigna mungo)とペ
チュニアからクローン化されている（Mato et al. (199
8) Plant Cell Physiol. 39, p1145; Miller et al.(19
99) J. Biol. Chem. 273, p34011）。

【０００７】さらに、アントシアニンの5位の水酸基に
グルコースを転移する反応を触媒する酵素の遺伝子は、
シソ、バーベナ、トレニアなどからクローン化されてい
る（WO 99/05287公報）。アントシアニジン3−グルコシ
ドの3位のグルコースの６位の水酸基にラムノースを転
移する反応を触媒する酵素（UDP-ラムノース：アントシ
アニジン3-グルコシド ラムノシルトランスフェラー
ゼ）の遺伝子はペチュニアからクローン化されている(B
rugliera et al. (1994) Plant J. 5, p81)。

【０００８】フラボノイドの7位の水酸基にグルコース
を転移する反応を触媒する酵素の遺伝子は、オウゴンか
らクローン化されており、これを大腸菌で発現させた蛋
白質はフラボノイドの7位にグルコースを転移する反応
を触媒することが報告されている（Hirotani et al. (2
000) Planta 210, p1006）。ベタニジンの5位の水酸基
にグルコースを転移する反応を触媒する酵素の遺伝子が
リビングストンデージーからクローン化されており、こ
れを大腸菌で発現させた蛋白質はフラボノイドの4’位
と7位の水酸基にグルコースを転移する反応を触媒する
ことが示された（Vogt et al. (1999) Plant J. 19:509
-519）。

【０００９】また、アラビドプシスのゲノム配列が解明
されたことにより、植物ゲノム中には多数の糖転移酵素
遺伝子が存在することも明らかとなった（J Biol Chem
2001276 p4344）。また、糖転移酵素のアミノ酸配列
は、程度は異なるが、相同性があり、スーパーファミリ
ーを形成していること、同じ機能を持つ糖転移酵素のア
ミノ酸配列は植物種が異なっていても相同性が高くスー
パーファミリーの中でファミリーを形成していること、
一つのファミリーの中で異なる植物種由来の糖転移酵素
のアミノ酸配列の同一性は30〜50%以上であることが示
されている（J Biol Chem 2001 276 p4344、Planta 200
1 213 p164）。

【００１０】アントシアニジン3−グルコシドの糖に、
グルコースを転移する酵素の活性が確認されたことはあ
る（Forkmann (1999) Comprehensive natural products
chemistry Vol 1. p.713-748, Ed. Sankawa, Pergamo
n）が、酵素が精製されたこともないし、遺伝子がクロ
ーン化されたことはない。アサガオは(Ipomea nil)は日
本において育種され、多種多様な変種が得られている。
また、その連鎖地図も作成されており、花色や形態形成
に関する遺伝子座が同定されている。そのうち、いくつ
かの遺伝子、たとえば、カルコン合成酵素、フラバノン
3-水酸化酵素、ジヒドロフラボノール4-還元酵素等の遺
伝子がクローン化されている(Annual. New York Acad.
Sci. 1999, 870, p265)。

【００１１】アサガオ花弁に含まれる主なアントシアニ
ンはヘブンリーブルーアントシアニンと呼ばれる複雑に
修飾されたアントシアニンであるペオニジン3-[2-[6-(3
-グルコシルカフェイル）グルコシル]-6-(4-[6-(3-グル
コシルカフェイル）グルコシル]カフェイル）グルコシ
ド]-5-グルコシド（Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 199
1, 30, 17）で、その構造からアントシアニジン3−グル
コシドの糖に、グルコースを転移する酵素が存在するこ
とは示唆されるが、その酵素活性が確認されたり、酵素
が単離されたり、遺伝子がクローン化されたこともな
い。

【００１２】

【特許文献１】WO 99/05287公報

【００１３】

【非特許文献１】Holton et al. (1995) Plant Cell,
7, p.1071

【非特許文献２】Tanaka et al. (1998) Plant Cell Ph
ysiol. 39. p1119

【非特許文献３】Markham et al. Phytochem. 55, p327
-336.(2000)

【非特許文献４】Markham et al. Phytochem. 58, p403
-413.(2001)

【非特許文献５】Raymond Brouillard and Olivier Dan
gles. Flavonoids and Flowercolour, p565-588. in Th
e Flavonoids. J. B. Harborne(ED)

【非特許文献６】Tanaka et al. (1998) Plant Cell Ph
ysiol. 39. p1119

【００１４】

【非特許文献７】Mato et al. (1998) Plant Cell Phys
iol. 39, p1145

【非特許文献８】Miller et al.(1999) J. Biol. Chem.
273, p34011

【非特許文献９】Brugliera et al. (1994) Plant J.
5, p81

【非特許文献１０】Hirotani et al. (2000) Planta 21
0, p1006

【非特許文献１１】Vogt et al. (1999) Plant J. 19:5
09-519

【非特許文献１２】J Biol Chem 2001 276 p4344

【００１５】

【非特許文献１３】Planta 2001 213 p164

【非特許文献１４】Forkmann (1999) Comprehensive na
tural products chemistry Vol 1. p.713-748, Ed. San
kawa, Pergamon

【非特許文献１５】Annual. New York Acad. Sci. 199
9, 870, p265

【非特許文献１６】Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 199
1, 30, 17

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、フラボノイ
ドの３位の糖にグルコースを転移する活性を有する蛋白
質をコードする遺伝子、およびその用途、特に花色の調
節方法を提供しようとするものである。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決すべく種々研究した結果、アサガオのフラボノ
イドの３位の糖にグルコースを転移する活性を有する蛋
白質をコードする遺伝子のクローニングに成功し、さら
にこの遺伝子を植物に導入し、植物中で発現させる事に
成功した。従って本発明は、フラボノイドの３位の糖に
グルコースを転移する活性を有する蛋白質をコードする
遺伝子を提供する。好ましくは、フラボノイドはアント
シアニンである。

【００１８】また、本発明は、配列番号：２又は配列番
号：14に記載のアミノ酸配列を有するフラボノイドの3
位の糖にグルコースを転移する活性を有する蛋白質をコ
ードする遺伝子；配列番号：２又は配列番号：14に記載
のアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸の付
加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換によって修
飾されているアミノ酸配列を有し、且つフラボノイドの
3位の糖にグルコースを転移する活性を有する蛋白質を
コードする遺伝子を提供する。

【００１９】更に、本発明は、配列番号：２又は配列番
号：14に記載のアミノ酸配列に対して30％以上の同一性
を有するアミノ酸配列を有し、且つフラボノイドの3位
の糖にグルコースを転移する活性を有する蛋白質をコー
ドする遺伝子を提供する。更に、本発明は、配列番号：
２又は配列番号：14に記載のアミノ酸配列をコードする
塩基配列の全部または一部に対して、5 x SSC、50℃の
条件下でハイブリダイズにより得られ、且つフラボノイ
ドの3位の糖にグルコースを転移する活性を有する蛋白
質をコードする遺伝子；或いは、配列番号：１又は配列
番号：13に記載の塩基配列の全部または一部に対して、
5 x SSC、50℃の条件下でハイブリダイズにより得ら
れ、且つフラボノイドの3位の糖にグルコースを転移す
る活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を提供する。

【００２０】本発明はまた、前記何れかの遺伝子を含ん
でなるベクター、例えば発現ベクター又は遺伝子移行用
（トランスファー）ベクター；及び該ベクターにより形
質転換された宿主、例えば微生物宿主、またはトランス
ジェニック植物を提供する。本発明は更に、上記何れか
の遺伝子が導入された植物と同じ性質を有する該植物の
子孫またはそれらの組織もしくは器官、例えば切り花を
提供する。

【００２１】本発明は更に、上記何れかに記載の遺伝子
によってコードされる蛋白質、或いは上記の形質転換さ
れた宿主、例えば微生物宿主又はトランスジェニック植
物により生産される蛋白質を提供する。本発明は又、上
記何れかの遺伝子を用いてフラボノイドの3位を修飾す
る方法を提供する。本発明はまた、上記何れかの遺伝子
を用いる花色の調節方法、さらに、本発明は前記宿主を
培養し、又は生育させ、そして該宿主からフラボノイド
の３位の糖にグルコースを転移する活性を有する蛋白質
を採取することを特徴とする該蛋白質の製造方法を提供
する。また、本発明は、３位に糖を有するフラボノイド
に、前記蛋白質を作用せしめて３位の糖にグルコースが
転移したフラボノイドを製造する方法を提供する。

【００２２】

【発明の実施の形態】本発明の遺伝子としては、例えば
配列表の配列番号：２又は配列番号：14に記載するアミ
ノ酸配列をコードするものが挙げられる。しかしなが
ら、複数個のアミノ酸の付加、欠失および／又は他のア
ミノ酸との置換によって修飾されたアミノ酸配列を有す
る蛋白質も、もとの蛋白質と同様の酵素活性を維持する
ことが知られている。従って本発明は、フラボノイドの
３位の糖にグルコースを転移する活性を有している蛋白
質である限り、配列番号：２又は配列番号：14に記載の
アミノ酸配列に対して１個または複数個のアミノ酸配列
の付加、欠失および／又は他のアミノ酸との置換によっ
て修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質および当該蛋
白質をコードする遺伝子も本発明に属する。複数個のア
ミノ酸とは、例えば数個のアミノ酸である。

【００２３】本発明はまた、配列番号：２又は配列番
号：14に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列の全
部またはその一部、例えばコンセンサス領域の６個以上
のアミノ酸をコードする塩基配列、より具体的には配列
番号：１又は配列番号：13に示す塩基配列の全部又は一
部、例えばコンセンサス領域の６個以上のアミノ酸に対
応する部分に対して、例えば5xSSC、50℃の条件下でハ
イブリダイズし、且つフラボノイドの３位の糖にグルコ
ースを転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子
に関するものである。なお、適切なハイブリダイゼーシ
ョン温度は塩基配列やその塩基配列の長さによって異な
り、例えばアミノ酸６個をコードする18塩基からなるDN
Aフラグメントをプローブとした場合には50℃以下の温
度が好ましい。

【００２４】このようなハイブリダイゼーションによっ
て選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば
植物由来のもの、例えば、ダイコン、アカキャベツ、キ
キョウ、コーンソリダ、カンパニュラ、ラークスパー、
ニンジン、ロベリア、ヤマノイモ、西洋アサガオ、サツ
マイモ、チョウマメ、エンドウマメ由来の遺伝子が挙げ
られるが、植物以外の由来であってもよい。また、ハイ
ブリダイゼーションによって選択される遺伝子はcDNAで
あってもよく、ゲノムDNAであってもよい。

【００２５】また、ナス科に属するペチュニアとナス由
来のフラボノイドの３位の糖転移酵素遺伝子は高い相同
性（72％）を示し、種が異なっても同一機能を有するフ
ラボノイド糖転移酵素遺伝子は高い配列同一性を示すこ
とが知られている。本発明はさらに配列番号：２又は配
列番号：14に記載のアミノ酸配列に対して約30％以上、
好ましくは約50％以上、より好ましくは約60％または約
70％以上、さらに好ましくは約90％以上の同一性を有す
るアミノ酸配列を有し、且つフラボノイドの３位の糖に
グルコースを転移する活性を有する蛋白質をコードする
遺伝子の花色変換への利用に関するものである。

【００２６】生来の塩基配列を有する遺伝子は実施例に
具体的に示すように、例えばcDNAライブラリーのスクリ
ーニングによって得られる。また、修飾されたアミノ酸
配列を有する酵素をコードするDNAは生来の塩基配列を
有するDNAを基礎として、常用の部位特定変異誘発やPCR
法を用いて合成することができる。例えば修飾を導入し
たいDNA断片を生来のcDNAまたはゲノムDNAの制限酵素処
理によって得、これを鋳型にして、所望の変異を導入し
たプライマーを用いて部位特異的変異誘発またはPCR法
を実施し、所望の修飾を導入したDNA断片を得る。その
後、この変異を導入したDNA断片を目的とする酵素の他
の部分をコードするDNA断片と連結すればよい。

【００２７】あるいはまた、短縮されたアミノ酸配列か
らなる酵素をコードするDNAを得るには、例えば目的と
するアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば全長ア
ミノ酸配列をコードするDNAを所望の制限酵素により切
断し、その結果得られたDNA断片が目的とするアミノ酸
配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列
からなるDNA断片を合成し、連結すればよい。

【００２８】また、得られた遺伝子を大腸菌および酵母
での遺伝子発現系を用いて発現させ、酵素活性を測定す
ることにより、得られた遺伝子がフラボノイドの３位の
糖にグルコースを転移する活性を有する蛋白質をコード
することを確認することができる。さらに、当該遺伝子
を発現させることにより、遺伝子産物であるフラボノイ
ドの３位の糖にグルコースを転移する活性を有する蛋白
質を得ることができる。あるいはまた、配列番号：２又
は配列番号：14に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質に
対する抗体を用いても、フラボノイドの３位の糖にグル
コースを転移する活性を有する蛋白質を得ることがで
き、抗体を用いて他の生物からも、フラボノイドの３位
の糖にグルコースを転移する活性を有する蛋白質をクロ
ーン化することもできる。

【００２９】従って本発明はまた、前述の遺伝子を含む
組換えベクター、特に発現ベクター、及び当該ベクター
によって形質転換された宿主に関するものである。宿主
としては、原核生物または真核生物を用いることができ
る。原核生物としては細菌、例えばエシェリヒア（Esch
erichia）属に属する細菌、例えば大腸菌（Escherichia
coli）、バシルス（Bacillus）属微生物、例えばバシ
ルス・スブチリス（Bacillus subtilis）など常用の宿
主を用いることができる。真核性宿主としては、下等真
核生物、例えば真核性微生物、例えば真菌である酵母ま
たは糸状菌が使用できる。

【００３０】酵母としては、例えばサッカロミセス（Sa
ccharomyces）属微生物、例えばサッカロミセス・セレ
ビシエ(Saccharomyces cerevisiae)等が挙げられ、また
糸状菌としてはアスペルギルス（Aspergillus）属微生
物、例えばアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryz
ae）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus nige
r）、ペニシリウム（Penicillium）属微生物が挙げられ
る。さらに動物細胞または植物細胞が使用でき、動物細
胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞
系が使用される。さらに昆虫細胞、例えばカイコ細胞、
またはカイコの成虫それ自体も宿主として使用される。

【００３１】本発明の発現ベクターはそれらを導入すべ
き宿主の種類に依存して発現制御領域、例えばプロモー
ターおよびターミネーター、複製起点等を含有する。細
菌用発現ベクターのプロモーターとしては、常用のプロ
モーター、例えばtrcプロモーター、tacプロモーター、
lacプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターと
しては、例えばグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲ
ナーゼプロモーター、PH05プロモーター等が使用され、
糸状菌用プロモーターとしては例えばアミラーゼプロモ
ーター、trpCプロモーター等が使用される。

【００３２】また動物細胞宿主用プロモーターとしては
ウイルス性プロモーター、例えばSV40アーリープロモー
ター、SV40レートプロモーター等が使用される。発現ベ
クターの作製は制限酵素、リガーゼ等を用いて常法に従
って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主
の形質転換も常法に従って行うことができる。前記の発
現ベクターによって形質転換された宿主を培養、栽培ま
たは生育し、培養物等から常法に従って、例えば、濾
過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー等により目的とする
蛋白質を回収、精製することができる。

【００３３】さらに本発明は、３位に糖を有するフラボ
ノイドに、前記蛋白質を作用せしめて３位の糖にグルコ
ースが転移したフラボノイドを製造する方法に関するも
のである。例えば、得られた遺伝子を発現させた植物、
酵母、大腸菌等から、本酵素を取得し、それらにUDP-グ
ルコースとフラボノイド３配糖体を加え、酵素反応を行
うことでフラボノイド３位の糖にグルコースが付加され
たフラボノイド３−ソフォロシドを製造することができ
る。

【００３４】本明細書においてはアサガオ由来の遺伝子
について述べているが、本発明はアサガオ由来の本遺伝
子のみに限定されるものではなく、フラボノイドの３位
の糖にグルコースを転移する活性を有する蛋白質をコー
ドする遺伝子であれば、いずれの由来でもよい。すなわ
ち本発明の遺伝子の由来としては、植物でも動物でも微
生物であってもよく、フラボノイドの３位の糖にグルコ
ースを転移する活性を有していれば同様に花色変換へ利
用できる。さらに本発明は、本発明の遺伝子を導入する
ことによる、色合いが調節された植物もしくはその子孫
又はこれらの組織に関するものであり、その形態は切り
花であってもよい。

【００３５】本発明で得られた遺伝子を用いると、アン
トシアニンの3位の糖にグルコースを転移する反応を促
進したり、あるいはアントシアニンの3位の糖にグルコ
ースを転移する反応を抑制することができ、結果として
花の色を調節することができる。この際3位のソフォロ
ースにアシル基を転移する活性を有する蛋白質をコード
する遺伝子と併せて利用することもできる。本発明の遺
伝子を、アシル基を転移する活性を有する蛋白質をコー
ドする遺伝子と併用することにより、本発明の遺伝子に
より付加された糖にさらにアシル基を転移することがで
きる。アシル基が付加することにより、安定性が向上す
るので、本発明の遺伝子単独で用いるよりも、より青い
花色を有する植物を作出することもできる。

【００３６】また、植物に遺伝子を導入し、該遺伝子を
構成的あるいは組織特異的に発現させることは可能であ
り、またアンチセンス法やコサプレッション法などによ
って目的の遺伝子の発現を抑制することも可能である。
形質転換可能な植物の例としては、バラ、キク、カーネ
ーション、金魚草、シクラメン、ラン、トルコギキョ
ウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソ
ウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、
ペチュニア、トレニア、チューリップ、イネ、オオム
ギ、小麦、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、
ユーカリ、サツマイモ、タイズ、アルファルファ、ルー
ピン、トウモロコシ、カリフラワーなどがあげられるが
これらに限定されるものではない。

【００３７】

【実施例】以下実施例に従って、発明の詳細を述べる。
分子生物学的手法はとくに断らない限り、Molecular Cl
oning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)に
依った。

【００３８】実施例１．アサガオDNA断片の増幅 アサガオ系統KK/ZSK-2（Inagaki Y., et al. Plant Cel
l 6, 375-383）のツボミからRNAを回収し、プライマーN
otIｄ（T）18 (5’-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAATTTTT
TTTTTTTTTTTTT-3’)（配列番号：３）をプライマーとし
て、逆転写反応を行った。逆転写物を鋳型とし、プライ
マーATC(5’-GA(CT)TT(CT)GGITGGGGIAA-3’)（配列番
号：４）とプライマーNotI(5’-AACTGGAAGAATTCGCGGCCG
CAGGAA-3’)（配列番号：５）とをプライマーにしてPCR
反応を行った。反応は、94℃にて1分間保持した後、94
℃にて30秒、55℃にて30秒、72℃にて1分からなるサイ
クルを30サイクル行い、さらに72℃で1分間保持した。
これにより得られたDNA断片をKAT5とした。その配列
を、配列番号：６に示す。

【００３９】実施例２．遺伝子のスクリーニング KK/FP-39 (マルバアサガオの系統（Iida S., et al. Mo
dification of Gene Expression and Non-Mendelian In
heritance, NIAR/STA, Tsukuba, p.23-40）)からmRNAを
抽出し、λZAPIIをベクターとするdirectional cDNAラ
イブラリー作製キット（ストラタジーン社）を用いて製
造者の推奨する方法でcDNAライブラリーを作製した。5.
0×10⁶のプラークをP³²でラベルしたKAT5でスクリーニ
ングした。ハイブリダイゼーションは、6×SSC、0.5%の
SDS、40%ホルムアミド中で37℃にて15時間行った。その
後、3×SSC、0.5%のSDS中で5分間室温にて洗浄し、同じ
洗浄液で室温にて15分間洗浄した。

【００４０】洗浄液を3×SSC、0.5%のSDSに変更し、37
℃で45分間洗浄した後、3×SSC, 0.5% SDS 中でさらに6
0℃で45分間洗浄した。しかしながら、明瞭にプローブ
にハイブリダイズしたクローンは得ることができなかっ
た。かすかにハイブリダイズした12クローンを単離し、
DNA塩基配列を決定した。その内の一つのクローンKAT5-
1は、ペチュニアの遺伝子座RtにコードされるUDP-ラム
ノース：アントシアニジン3−グルコシドラムノシル転
移酵素遺伝子(以下、RT)(Plant J. 1994 5 p69 Plant
J. 1994 5 p81)と弱い相同性が見られた。アミノ酸の同
一性は37%であった。

【００４１】KAT5-1のcDNA部分の塩基配列を配列表の配
列番号：１に示し、塩基配列から推定されるアミノ酸配
列を配列表の配列番号：２に示す。アサガオのアントシ
アニンの構造からは、アントシアニンラムノシル基転移
酵素が存在するとは考えられず、本遺伝子の機能を決定
するために、鋭意研究を行った。

【００４２】実施例３．実施例２で得られた遺伝子の大
腸菌での発現 以下の手順でKAT5-1にコードされる糖転移酵素遺伝子を
大腸菌で発現した。KAT5-1を鋳型とし、プライマー 3GG
T NcoＩ (5'-CCCCATGGGTTCTCAAGCAACAACTTAC-3')（配列
番号：７）とプライマー2GT 500R (5'-CGGGAAACTGGCCG
GAGC-3')（配列番号：８）とをプライマーとし、Taqポ
リメラーゼ（TaKaRa）を用いて、PCR（反応条件：94℃
にて30秒、60℃にて30秒、72℃にて30秒を1サイクルと
した反応を30回繰り返した後、 72℃で7分間保持。）を
行った。

【００４３】得られた約500bpのDNA断片をNcoIとHaeII
とで消化して得たDNA断片と、KAT5-1をHaeIIとKpnＩと
で消化して得られた約1200bpのDNA断片と、NcoIとKpnI
で消化した大腸菌発現ベクターpQE61(QIAGEN)とをライ
ゲーションし、得られた大腸菌用発現プラスミドをpQE6
1KAT5−1とした。

【００４４】pQE61KAT5−1を大腸菌JM105株に導入し、
この大腸菌を37℃で一晩前培養した後、前培養液の一部
を400mLの本培養液に植菌し、27℃でOD₆₀₀=0.6になるま
で培養した。KAT5-1遺伝子の発現誘導のため、最終濃度
0.4mMとなるようにイソプロピルベータチオガラクトシ
ド（IPTG）を加え、さらに27℃で一晩培養した。菌体を
集菌し、洗浄後、20mlの破砕用緩衝液（25mM Tris-HCl
(pH7.5), 250mM NaCl,1mM EDTA, 0.5％ ２-メルカプト
エタノール）に懸濁し、そして懸濁液を超音波処理する
ことによって菌体を破壊した。菌体破壊液の上清をKAT5
-1粗抽出液として以下で述べる反応に用いた。

【００４５】実施例４．KAT5−1遺伝子産物による糖付
加活性能の確認 20μlの実施例３で得られたKAT5-1粗抽出液、10μlの0.
5M リン酸カリウム（pH7.5）、20μlの5mM UDP-グルコ
ース、30μlの蒸留水、及び20μlのデルフィニジン3-グ
ルコシド（1.5 mg/ml）を混合し、30℃にて15分間保持
した。その後、１N-HClを最終濃度0.16Nとなるように添
加し、反応を停止した。反応液に90％ CH₃CN/1% TFAを5
0μl加え高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で分析し
た。HPLCカラムは、Asahipak-ODP-50（6mmφX250mm、昭
和電工）、移動相として、A液 0.5%トリフルオロ酢酸
（TFA）水溶液、B液0.5％TFA を含む50％アセトニトリ
ルを用いた。

【００４６】溶出は、A液:B液＝９：１の混合液からA
液:B液＝5:5 の混合液の直線濃度勾配を20分で行った。
流速は、0.6ml/分とした。また、検出は520nmの吸光度
を用いた。その結果、基質であるデルフィニジン3-グル
コシドのピーク（リテンションタイム：13.2分）に加
え、リテンションタイムが11.7分である新しいピークが
検出された。従って、この化合物は、デルフィニジン3-
グルコシドに糖が付加されたものであると考えられる。
また、基質にシアニジン3−グルコシド（リテンション
タイム：14.1分）を用いた場合においても新たなピーク
（リテンションタイム：12.6分）が得られたことから、
KAT5-1遺伝子産物は、デルフィニジンおよびシアニジン
3-グルコシドを基質として利用できる糖転移能を持つ酵
素であると考えられる。

【００４７】実施例５．植物での発現 KAT5-1遺伝子産物の植物体での機能を明らかにするため
に、KAT5-1遺伝子を構成的に発現するためのバイナリー
ベクター（ｐSPB1002）を構築し、花弁にシアニジン 3-
グルコシドを含有するペチュニア（品種：バカラレッ
ド、サカタのタネ社）を形質転換し、その結果得られた
形質転換体の花弁を用いて色素分析を行った。ｐSPB100
2の作製は以下のように行った。

【００４８】バイナリーベクターpBE2113-GUS（Mitsuha
ra et al. Plant Cell Physiol. 37, p49）をSnaBIで消
化し、BamHIリンカーを挿入した。生じたプラスミドをS
acIで消化し、平滑末端化し、さらにSalIリンカーを挿
入した。生じたプラスミドをEcoRIとHindIIIで消化し、
得られる約2kbのDNA断片をバイナリーベクターｐBINPLU
S（van Engelen et al. Plant Mol. Biol. 15, p373）
のEcoRI−HindIII部位に挿入し、プラスミドpSPB176を
得た。一方、クローンKAT5-1のプラスミドをBamHIとXho
Iで消化し、約1.64kbのDNA断片を得た。この断片を、pS
PB176のBamHI−SalI部位に挿入し、pSPB1002とした。

【００４９】次に、pSBP1002を用いて、リーフディスク
を用いるアグロバクテリウム法により、ペチュニア（品
種バカラレッド、サカタのタネ社）を形質転換し、約５
０系統の形質転換個体を得た。形質転換の方法は公知の
方法（Plant J. 1994 5 p81)によった。

【００５０】得られた個体が形質転換体であることを調
べるために、ぞれぞれの形質転換体からゲノミックDNA
を抽出し、DNA20μgをBamHIで消化し、電気泳動後、Hyb
ond N+メンブレン(Amersham)にブロッティングを行い、
ジゴキシゲニン（DIG）で標識したKAT5-1遺伝子をプロ
ーブに用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。
DIGシステムを用いたサザンハイブリダイゼ−ション法
は製造業者（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会
社）が推奨する条件に倣った。その結果、得られた個体
が独立した形質転換体であることを確認した。

【００５１】次に導入したKAT5-1遺伝子の発現レベルを
確認するために定量的RT-PCR解析を行った(Plant J. 19
98 13, p475.)。独立した形質転換体の花弁から全RNAを
抽出した後、この全RNA 1μgを鋳型として逆転写を行
い、cDNAを得た。ｃDNA合成は、SuperScriptTM First-S
trand Synthesis System for RT-PCR(GIBCO BRL）を利
用し、合成条件は本システム製造業者が推奨する条件に
倣った。

【００５２】得られたｃDNAを鋳型にして、KAT５−１特
異的プライマーであるPn3GGT-F; 5’-atg ggt tct caa
gca aca act tac（配列番号：９）及びPn3GGT-R; 5’-t
tatat cgc cac cga act tca tta（配列番号：10）を用
いて、PCR反応を行った。また、導入遺伝子（KAT5-1）
発現量と内在遺伝子発現量とを比較するために、比較対
象としてペチュニアのグリセルアルデヒド-3-リン酸脱
水素酵素(Pet GAPDH)遺伝子を採用し、それを特異的に
増幅するプライマーとしてPet Gapdh-F；ggt cgtttg gt
t gca aga gt（配列番号：11）及びPet Gapdh-R；ctg g
tt att cca ttacaa cta（配列番号：12）を用いた。

【００５３】PCR反応としては、94℃4分の熱変性の後
に、94℃にて1分、55℃にて1分、及び72℃にて2分の反
応を12サイクル行った。PCR産物を、前述のサザンハイ
ブリダイゼーションの際と同様の方法でメンブレンにブ
ロッティングし、DIGラベルのKAT5-1またはPetGAPDHを
プローブに用いてハイブリダイゼーションを行った。そ
の結果、独立した形質転換体においてKAT5-1の過剰発現
を確認した。

【００５４】形質転換体からの花弁約0.5gを、50%アセ
トニトリル、0.1%TFAで抽出しアントシアニンをHPLCで
分析した結果、9.5-47.5％（A520nmにおける全アントシ
アニン量に対する割合）のシアニジン 3-ソフォロシド
（ポリフェノールラボラトリリーズ社）と同じ15.0分に
溶出する物質のピークが検出された。なおアントシアニ
ンのHPLC分析条件は以下の通りである。

【００５５】カラムはShodex DE-413L（4.6mm*250mm）
を用いて、移動相として0.5%TFA含有、アセトニトリル1
0%から50%のグラジエント15分の後、50%アセトニトリル
10分間溶出を行った。また、流速は0.6ml/minで行っ
た。検出は島津photo diode array検出器SPD-M10AVPを
用いて250-600nmのスペクトルをとり、A520nmで定量し
た。また、このシアニジン 3-ソフォロシドの量は形質
転換体におけるKAT5-1の発現量と正の相関があった。

【００５６】HPLCで同定した生成物のピークがシアニジ
ン3−ソフォロシドであることを確認するため、同ピー
クを分取し、そしてMSによる分析を行った。MSはThermo
quest社のLC-Qシステムを用い、ESI、ポジティブモード
で測定した。その結果、KAT5-1形質転換体花弁で生成さ
れた物質は分子量が611（[M]⁺ m/z）であり、シアニジ
ン 3−ソフォロシドが生成していることが確認された。
以上により、KAT5-1はアントシアニジン 3-グルコシド
のグルコースに対してグルコースを転移し、アントシア
ニジン 3-ソフォロシドを生成する糖転移酵素をコード
する遺伝子であることが示された。

【００５７】実施例6.アサガオ蕾由来ライブラリー：KK
/ZSK-2 buds cDNA library （Gene 226 (1999) 181-18
8.）に対してKAT5-1をプローブに実施例２と同様のスク
リーニングを行った。その結果、50000プラークあたり
約25のポジティブなシグナルが得られ、このうち単離を
行ったクローンの中から、もっとも長い5’非翻訳領域
をもつPNGT1-7の塩基配列の解析を行った。PNGT1-7の塩
基配列を配列表の配列番号：１３に示し、塩基配列から
推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号：１４に示
す。

【００５８】PNGT1-7にコードされる遺伝子および遺伝
子産物はマルバアサガオ由来KAT5-1と比べ、DNAレベル
で97％の同一性、アミノ酸レベルで99％の同一性を示
し、両者は極めて類似しておりPNGT1-7はKAT5-1同様の
機能を有するものと考えられる。また、ノザンハイブリ
ダイゼーションにより野生型系統KK/ZSK-2の蕾みに於い
てPNGT1-7mRNAの蓄積を示す結果が得られた。

【００５９】さらに、花の色素合成遺伝子群の発現に異
常（減少）が見られるアサガオの変異体において、PNGT
1-7遺伝子の発現も同様に発現が低下している結果が得
られた。従って、PNGT1-7遺伝子は、花の色素合成系に
関わる遺伝子と同じ発現制御下にあることが類推され、
KAT5-1との相同性からしても、デルフィニイン及びシア
ニジン３−グルコシドを基質として利用できる糖転移酵
素であると考えられる。

【００６０】

【発明の効果】本発明により、アントシアニジン3−グ
ルコシドにグルコースを転移する反応を触媒する活性を
有する蛋白質をコードする遺伝子をはじめてクローン化
でき、花弁で発現させることができた。本蛋白質を花弁
で発現させたり、コサプレッション法等を用いて、活性
を抑制することにより、アントシアニンの構造と花色を
変えたりすることができる。

【００６１】

【配列表】 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ <110> Suntory Limited <120> Gene encoding a novel protein having transglycosylation activity <130> 1015025 <160> 12 <210> 1 <211> 1665 <212> DNA <213> Ipomoea purpurea <220> <221> SDS <222> (31)…(1407) <223> Nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of a protein h aving an activity to transfer glucose to sugar at position 3 of flavonoi ds <400> 1 cagaaagcta gctagcttgg tataggaagt atg ggt tct caa gca aca act tac 54 Met Gly Ser Gln Ala Thr Thr Tyr 1 5 cac atg gct atg tat ccc tgg ttt ggt gtc ggc cat ctc acc ggt ttc 102 His Met Ala Met Tyr Pro Trp Phe Gly Val Gly His Leu Thr Gly Phe 10 15 20 ttc cgc ctc gcc aac aaa cta gcc ggt aag ggt cat cgc atc tcc ttc 150 Phe Arg Leu Ala Asn Lys Leu Ala Gly Lys Gly His Arg Ile Ser Phe 25 30 35 40 ttg atc ccc aaa aac act caa tcc aag ctt gaa tct ttc aat ctt cac 198 Leu Ile Pro Lys Asn Thr Gln Ser Lys Leu Glu Ser Phe Asn Leu His 45 50 55 cca cac ctc att tcc ttt gtt ccc atc gtc gtg cca tcc att ccc ggc 246 Pro His Leu Ile Ser Phe Val Pro Ile Val Val Pro Ser Ile Pro Gly 60 65 70 ctc cct ccc ggc gcc gag acc act tcc gat gtc ccc ttt cct tcc acc 294 Leu Pro Pro Gly Ala Glu Thr Thr Ser Asp Val Pro Phe Pro Ser Thr 75 80 85 cat cta ctc atg gag gct atg gac aaa acc cag aac gac att gag atc 342 His Leu Leu Met Glu Ala Met Asp Lys Thr Gln Asn Asp Ile Glu Ile 90 95 100 atc ctc aaa gat ctc aaa gtg gac gtt gtg ttc tat gat ttt acc cac 390 Ile Leu Lys Asp Leu Lys Val Asp Val Val Phe Tyr Asp Phe Thr His 105 110 115 120 tgg cta ccc agc ctg gca cgg aag atc ggg atc aaa tca gta ttc tac 438 Trp Leu Pro Ser Leu Ala Arg Lys Ile Gly Ile Lys Ser Val Phe Tyr 125 130 135 agc acc att agt ccg ctc atg cat ggc tac gct tta tcc ccg gag cgg 486 Ser Thr Ile Ser Pro Leu Met His Gly Tyr Ala Leu Ser Pro Glu Arg 140 145 150 aga gtc gtc ggg aaa cag tta act gaa gcc gac atg atg aaa gct ccg 534 Arg Val Val Gly Lys Gln Leu Thr Glu Ala Asp Met Met Lys Ala Pro 155 160 165 gcc agt ttc ccg gac ccg tct atc aag ctc cat gct cac gag gcg cgg 582 Ala Ser Phe Pro Asp Pro Ser Ile Lys Leu His Ala His Glu Ala Arg 170 175 180 gga ttt act gct agg acg gta atg aag ttc ggc ggc gat ata act ttc 630 Gly Phe Thr Ala Arg Thr Val Met Lys Phe Gly Gly Asp Ile Thr Phe 185 190 195 200 ttt gac cgg atc ttt act gcg gtg agt gaa agt gat ggt ttg gcg tac 678 Phe Asp Arg Ile Phe Thr Ala Val Ser Glu Ser Asp Gly Leu Ala Tyr 205 210 215 agt act tgc cgg gag att gaa ggc caa ttc tgc gac tac ata gaa acc 726 Ser Thr Cys Arg Glu Ile Glu Gly Gln Phe Cys Asp Tyr Ile Glu Thr 220 225 230 cag ttt caa aaa cct gtc cta ctc gcc ggc cca gct tta cca gtc cca 774 Gln Phe Gln Lys Pro Val Leu Leu Ala Gly Pro Ala Leu Pro Val Pro 235 240 245 tcc aaa tcc acc atg gaa cag aaa tgg tcg gat tgg ctg ggg aaa ttc 822 Ser Lys Ser Thr Met Glu Gln Lys Trp Ser Asp Trp Leu Gly Lys Phe 250 255 260 aag gaa ggc tct gtt ata tac tgc gca ttt ggg agc gaa tgc acc ctg 870 Lys Glu Gly Ser Val Ile Tyr Cys Ala Phe Gly Ser Glu Cys Thr Leu 265 270 275 280 cgc aag gat aag ttc cag gaa tta ctc tgg ggt tta gag ctc aca gga 918 Arg Lys Asp Lys Phe Gln Glu Leu Leu Trp Gly Leu Glu Leu Thr Gly 285 290 295 atg cca ttc ttt gct gcc ctg aaa cca cca ttc gaa acc gag tca gtc 966 Met Pro Phe Phe Ala Ala Leu Lys Pro Pro Phe Glu Thr Glu Ser Val 300 305 310 gaa gca gcc atc ccg gag gag ctg aag gag aaa ata caa gga aga ggg 1014 Glu Ala Ala Ile Pro Glu Glu Leu Lys Glu Lys Ile Gln Gly Arg Gly 315 320 325 atc gta cat ggc gaa tgg gtt caa cag caa ctg ttt ctc cag cac cca 1062 Ile Val His Gly Glu Trp Val Gln Gln Gln Leu Phe Leu Gln His Pro 330 335 340 tcc gtg ggc tgc ttt gtg agc cac tgc ggg tgg gct tct ctg tca gaa 1110 Ser Val Gly Cys Phe Val Ser His Cys Gly Trp Ala Ser Leu Ser Glu 345 350 355 360 gca ctg gtt aat gat tgc caa atc gtg ctc ttg ccg cag gta gga gat 1158 Ala Leu Val Asn Asp Cys Gln Ile Val Leu Leu Pro Gln Val Gly Asp 365 370 375 caa att atc aac gca aga atc atg agt gtg agc ctg aaa gtt ggg gtg 1206 Gln Ile Ile Asn Ala Arg Ile Met Ser Val Ser Leu Lys Val Gly Val 380 385 390 gag gtg gag aaa ggg gaa gaa gat ggg gtg ttt tca aga gag agt gta 1254 Glu Val Glu Lys Gly Glu Glu Asp Gly Val Phe Ser Arg Glu Ser Val 395 400 405 tgc aag gca gtg aaa gct gtg atg gat gaa aag agt gag ata ggg aga 1302 Cys Lys Ala Val Lys Ala Val Met Asp Glu Lys Ser Glu Ile Gly Arg 410 415 420 gaa gta aga ggc aac cat gac aag tta aga ggt ttc ttg atg aat gca 1350 Glu Val Arg Gly Asn His Asp Lys Leu Arg Gly Phe Leu Met Asn Ala 425 430 435 440 gat ctg gat tca aag tac atg gac tct ttc aat cag aaa ctg cag gat 1398 Asp Leu Asp Ser Lys Tyr Met Asp Ser Phe Asn Gln Lys Leu Gln Asp 445 450 455 ctc ctt gga tgaatataat ataatataat attaattggt atcactgccc 1447 Leu Leu Gly tgagctagaa tggttttagc tagggttttg gttttcttga aaaaatgcat aataagaagt 1507 gcaagctaat taagagaata tatatatata tatatatata tgcatgcagg tgtggtgtgt 1567 ttgagcttga tctgtataat aaaggaattt atttatcaat gaaagcaact gatatttagg 1627 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1665 <210> 2 <211> 459 <212> PRT <213> Ipomoea purpurea <220> <223> An amino acid sequence of a protein having an activity to transfer glucose to sugar at position 3 of flavonoids <400> 2 Met Gly Ser Gln Ala Thr Thr Tyr His Met Ala Met Tyr Pro Trp Phe 1 5 10 15 Gly Val Gly His Leu Thr Gly Phe Phe Arg Leu Ala Asn Lys Leu Ala 20 25 30 Gly Lys Gly His Arg Ile Ser Phe Leu Ile Pro Lys Asn Thr Gln Ser 35 40 45 Lys Leu Glu Ser Phe Asn Leu His Pro His Leu Ile Ser Phe Val Pro 50 55 60 Ile Val Val Pro Ser Ile Pro Gly Leu Pro Pro Gly Ala Glu Thr Thr 65 70 75 80 Ser Asp Val Pro Phe Pro Ser Thr His Leu Leu Met Glu Ala Met Asp 85 90 95 Lys Thr Gln Asn Asp Ile Glu Ile Ile Leu Lys Asp Leu Lys Val Asp 100 105 110 Val Val Phe Tyr Asp Phe Thr His Trp Leu Pro Ser Leu Ala Arg Lys 115 120 125 Ile Gly Ile Lys Ser Val Phe Tyr Ser Thr Ile Ser Pro Leu Met His 130 135 140 Gly Tyr Ala Leu Ser Pro Glu Arg Arg Val Val Gly Lys Gln Leu Thr 145 150 155 160 Glu Ala Asp Met Met Lys Ala Pro Ala Ser Phe Pro Asp Pro Ser Ile 165 170 175 Lys Leu His Ala His Glu Ala Arg Gly Phe Thr Ala Arg Thr Val Met 180 185 190 Lys Phe Gly Gly Asp Ile Thr Phe Phe Asp Arg Ile Phe Thr Ala Val 195 200 205 Ser Glu Ser Asp Gly Leu Ala Tyr Ser Thr Cys Arg Glu Ile Glu Gly 210 215 220 Gln Phe Cys Asp Tyr Ile Glu Thr Gln Phe Gln Lys Pro Val Leu Leu 225 230 235 240 Ala Gly Pro Ala Leu Pro Val Pro Ser Lys Ser Thr Met Glu Gln Lys 245 250 255 Trp Ser Asp Trp Leu Gly Lys Phe Lys Glu Gly Ser Val Ile Tyr Cys 260 265 270 Ala Phe Gly Ser Glu Cys Thr Leu Arg Lys Asp Lys Phe Gln Glu Leu 275 280 285 Leu Trp Gly Leu Glu Leu Thr Gly Met Pro Phe Phe Ala Ala Leu Lys 290 295 300 Pro Pro Phe Glu Thr Glu Ser Val Glu Ala Ala Ile Pro Glu Glu Leu 305 310 315 320 Lys Glu Lys Ile Gln Gly Arg Gly Ile Val His Gly Glu Trp Val Gln 325 330 335 Gln Gln Leu Phe Leu Gln His Pro Ser Val Gly Cys Phe Val Ser His 340 345 350 Cys Gly Trp Ala Ser Leu Ser Glu Ala Leu Val Asn Asp Cys Gln Ile 355 360 365 Val Leu Leu Pro Gln Val Gly Asp Gln Ile Ile Asn Ala Arg Ile Met 370 375 380 Ser Val Ser Leu Lys Val Gly Val Glu Val Glu Lys Gly Glu Glu Asp 385 390 395 400 Gly Val Phe Ser Arg Glu Ser Val Cys Lys Ala Val Lys Ala Val Met 405 410 415 Asp Glu Lys Ser Glu Ile Gly Arg Glu Val Arg Gly Asn His Asp Lys 420 425 430 Leu Arg Gly Phe Leu Met Asn Ala Asp Leu Asp Ser Lys Tyr Met Asp 435 440 445 Ser Phe Asn Gln Lys Leu Gln Asp Leu Leu Gly 450 455 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer NotId(T) <400> 3 aactggaaga attcgcggcc gcaggaattt tttttttttt ttttt 45 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer ATC <400> 4 gayttyggit ggggiaa 17 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer NotI <400> 5 aactggaaga attcgcggcc gcaggaa 27 <210> 6 <211> 472 <212> DNA <213> 472 <220> <223> Nucleotide sequence cloned from Ipomoea nil <400> 6 gactttgggt gggggaagcc aagactggtg gtcaatatgc tcgataattc atgggtgctt 60 ttcttagacg ccattaatgg agcagtagaa gtgtggatga aattgcctaa gcaagttatg 120 cacacattaa cgcaagaccg ccactttctt gcctatgttt ctgcctttcc taaaccaaag 180 ctttgaatac aatgaattaa acaacgtaac tggtcatttg cggaaaccag ggtggttagg 240 aagctcttat ctggctaaag gcacgcgaca ttaattctgt agtcgtggaa tctgattgct 300 tgaatctgtg ttctattttg aattctttta tgtcgtgatt ttttctatgt aggtactatt 360 attaagcaat gttgatcaat tgctatggat attagtgact ttgttgtcaa aaaaaaaaaa 420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaattcct gcggccgcga attcttccag tt 472 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer 3GGT NcoI <400> 8 ccccatgggt tctcaagcaa caacttac 28 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer 2GT 500R <400> 8 cgggaaactg gccggagc 18 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer Pn3GGT-F <400> 9 atgggttctc aagcaacaac ttac 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer Pn3GGT-R <400> 10 ttatatcgcc accgaacttc atta 24 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer Pet Gapdh-F <400> 11 ggtcgtttgg ttgcaagagt 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer Pet Gapdh-R <400> 12 ctggttattc cattacaact a 21 <210> 13 <211> 1603 <212> DNA <213> Ipomoea nil <220> <221> SDS <222> (31)…(1407) <223> Nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of a protein h aving an activity to transfer glucose to sugar at position 3 of flavonoi ds <400> 13 cagaaagcta gctagctagg tataggaagt atg ggt tct caa gca aca act tac 54 Met Gly Ser Gln Ala Thr Thr Tyr 1 5 cac atg gct atg tat ccc tgg ttt ggc gtc ggc cat ctc acc ggt ttc 102 His Met Ala Met Tyr Pro Trp Phe Gly Val Gly His Leu Thr Gly Phe 10 15 20 ttc cgc ctc gcc aat aaa cta gcc ggt aaa ggt cac cgc atc tcc ttc 150 Phe Arg Leu Ala Asn Lys Leu Ala Gly Lys Gly His Arg Ile Ser Phe 25 30 35 40 ttg atc ccc aaa aac act caa tcc aag ctt gaa tct ttc aac ctt cac 198 Leu Ile Pro Lys Asn Thr Gln Ser Lys Leu Glu Ser Phe Asn Leu His 45 50 55 cca cac ctc att tcc ttt gtt ccc atc gtc gta ccg tcc att ccc ggc 246 Pro His Leu Ile Ser Phe Val Pro Ile Val Val Pro Ser Ile Pro Gly 60 65 70 ctc cct ccc ggc gcc gag acc act tcc gat gtc ccc ttt cct tcc acc 294 Leu Pro Pro Gly Ala Glu Thr Thr Ser Asp Val Pro Phe Pro Ser Thr 75 80 85 cat cta ctc atg gag gcc atg gac aaa acc cag aac gac att gag atc 342 His Leu Leu Met Glu Ala Met Asp Lys Thr Gln Asn Asp Ile Glu Ile 90 95 100 atc ctc aaa gat ctc aaa gtg gat gtt gtg ttc tat gat ttt acc cac 390 Ile Leu Lys Asp Leu Lys Val Asp Val Val Phe Tyr Asp Phe Thr His 105 110 115 120 tgg cta ccc agc ctg gca cgg aag atc ggg atc aaa tca gta ttc tac 438 Trp Leu Pro Ser Leu Ala Arg Lys Ile Gly Ile Lys Ser Val Phe Tyr 125 130 135 agc acc atc agt ccg ctc atg cat ggc tac gct tta tcc ccg gag cgg 486 Ser Thr Ile Ser Pro Leu Met His Gly Tyr Ala Leu Ser Pro Glu Arg 140 145 150 aga gtc gtc ggg aaa cag tta act gaa gcc gac atg atg aaa gct ccg 534 Arg Val Val Gly Lys Gln Leu Thr Glu Ala Asp Met Met Lys Ala Pro 155 160 165 gcc agt ttc ccg gac ccg tcg atc aag ctc cat gct cac gag gcg cgg 582 Ala Ser Phe Pro Asp Pro Ser Ile Lys Leu His Ala His Glu Ala Arg 170 175 180 ggg ttt act gct agg acg gta atg aag ttc ggt ggc gat ata act ttc 630 Gly Phe Thr Ala Arg Thr Val Met Lys Phe Gly Gly Asp Ile Thr Phe 185 190 195 200 ttt gac cgg att ttc acg gcg gtg agt gaa agt gat ggt ttg gcg tac 678 Phe Asp Arg Ile Phe Thr Ala Val Ser Glu Ser Asp Gly Leu Ala Tyr 205 210 215 agt act tgc cgg gag att gaa ggc caa ttc tgt gac tac ata gaa acc 726 Ser Thr Cys Arg Glu Ile Glu Gly Gln Phe Cys Asp Tyr Ile Glu Thr 220 225 230 cag ttt caa aaa cct gtc cta ctc gcc ggc cca gct tta cca gtc cca 774 Gln Phe Gln Lys Pro Val Leu Leu Ala Gly Pro Ala Leu Pro Val Pro 235 240 245 tcc aaa tcc acc atg gaa cag aaa tgg tcg gat tgg ctg ggg aaa ttc 822 Ser Lys Ser Thr Met Glu Gln Lys Trp Ser Asp Trp Leu Gly Lys Phe 250 255 260 aag gaa ggc tct gtt ata tac tgc gca ttt ggg agc gaa tgc acc ctg 870 Lys Glu Gly Ser Val Ile Tyr Cys Ala Phe Gly Ser Glu Cys Thr Leu 265 270 275 280 cgc aag gat aag ttc cag gaa tta ctc tgg ggt tta gag ctc aca gga 918 Arg Lys Asp Lys Phe Gln Glu Leu Leu Trp Gly Leu Glu Leu Thr Gly 285 290 295 atg cca ttc ttt gct gcc ctg aaa cca cca ttc gaa gcc gaa tca atc 966 Met Pro Phe Phe Ala Ala Leu Lys Pro Pro Phe Glu Ala Glu Ser Ile 300 305 310 gaa gca gcc atc ccc gag gag ctg aag gag aaa ata caa gga aga ggg 1014 Glu Ala Ala Ile Pro Glu Glu Leu Lys Glu Lys Ile Gln Gly Arg Gly 315 320 325 atc gta cat ggc gaa tgg gtt caa cag caa ctg ttt ctc cag cat cca 1062 Ile Val His Gly Glu Trp Val Gln Gln Gln Leu Phe Leu Gln His Pro 330 335 340 tct gtc ggc tgc ttt gtg agc cac tgc ggg tgg gct tca ctg tca gaa 1110 Ser Val Gly Cys Phe Val Ser His Cys Gly Trp Ala Ser Leu Ser Glu 345 350 355 360 gca ctg gta aat gat tgc caa atc gtg ctt ttg ccg cag gta gga gat 1158 Ala Leu Val Asn Asp Cys Gln Ile Val Leu Leu Pro Gln Val Gly Asp 365 370 375 caa att atc aac gca aga atc atg agt gtg agc ctg aaa gtt ggg gtg 1206 Gln Ile Ile Asn Ala Arg Ile Met Ser Val Ser Leu Lys Val Gly Val 380 385 390 gag gtg gag aaa ggg gaa gaa gat ggg gtg ttt tca aga gag agt gta 1254 Glu Val Glu Lys Gly Glu Glu Asp Gly Val Phe Ser Arg Glu Ser Val 395 400 405 tgc aag gca gtg aaa gct gtg atg gat gaa aag agt gag ata ggg aga 1302 Cys Lys Ala Val Lys Ala Val Met Asp Glu Lys Ser Glu Ile Gly Arg 410 415 420 gaa gta aga ggc aac cat gac aag tta aga ggt ttc ttg ttg aat gca 1350 Glu Val Arg Gly Asn His Asp Lys Leu Arg Gly Phe Leu Leu Asn Ala 425 430 435 440 gat ctg gat tca aag tac atg gac tct ttc aat cag aaa ctg cag gat 1398 Asp Leu Asp Ser Lys Tyr Met Asp Ser Phe Asn Gln Lys Leu Gln Asp 445 450 455 ctc ctt gga tgaatataat ataatataat attaattggt atcactgcct tgagctagaa 1457 Leu Leu Gly tggttttagc tagggttttg gttttcttga aaaaatgcat aataagaagt gcaagctaat 1517 taagagaata tatatatata tatgcatgca ggtgtggtgt gtttgagctt gatctgtaaa 1577 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1603 Ipomoea purpurea <210> 14 <211> 459 <212> PRT <213> Ipomoea nil <220> <223> An amino acid sequence of a protein having an activity to transfer glucose to sugar at position 3 of flavonoids <400> 14 Met Gly Ser Gln Ala Thr Thr Tyr His Met Ala Met Tyr Pro Trp Phe 1 5 10 15 Gly Val Gly His Leu Thr Gly Phe Phe Arg Leu Ala Asn Lys Leu Ala 20 25 30 Gly Lys Gly His Arg Ile Ser Phe Leu Ile Pro Lys Asn Thr Gln Ser 35 40 45 Lys Leu Glu Ser Phe Asn Leu His Pro His Leu Ile Ser Phe Val Pro 50 55 60 Ile Val Val Pro Ser Ile Pro Gly Leu Pro Pro Gly Ala Glu Thr Thr 65 70 75 80 Ser Asp Val Pro Phe Pro Ser Thr His Leu Leu Met Glu Ala Met Asp 85 90 95 Lys Thr Gln Asn Asp Ile Glu Ile Ile Leu Lys Asp Leu Lys Val Asp 100 105 110 Val Val Phe Tyr Asp Phe Thr His Trp Leu Pro Ser Leu Ala Arg Lys 115 120 125 Ile Gly Ile Lys Ser Val Phe Tyr Ser Thr Ile Ser Pro Leu Met His 130 135 140 Gly Tyr Ala Leu Ser Pro Glu Arg Arg Val Val Gly Lys Gln Leu Thr 145 150 155 160 Glu Ala Asp Met Met Lys Ala Pro Ala Ser Phe Pro Asp Pro Ser Ile 165 170 175 Lys Leu His Ala His Glu Ala Arg Gly Phe Thr Ala Arg Thr Val Met 180 185 190 Lys Phe Gly Gly Asp Ile Thr Phe Phe Asp Arg Ile Phe Thr Ala Val 195 200 205 Ser Glu Ser Asp Gly Leu Ala Tyr Ser Thr Cys Arg Glu Ile Glu Gly 210 215 220 Gln Phe Cys Asp Tyr Ile Glu Thr Gln Phe Gln Lys Pro Val Leu Leu 225 230 235 240 Ala Gly Pro Ala Leu Pro Val Pro Ser Lys Ser Thr Met Glu Gln Lys 245 250 255 Trp Ser Asp Trp Leu Gly Lys Phe Lys Glu Gly Ser Val Ile Tyr Cys 260 265 270 Ala Phe Gly Ser Glu Cys Thr Leu Arg Lys Asp Lys Phe Gln Glu Leu 275 280 285 Leu Trp Gly Leu Glu Leu Thr Gly Met Pro Phe Phe Ala Ala Leu Lys 290 295 300 Pro Pro Phe Glu Ala Glu Ser Ile Glu Ala Ala Ile Pro Glu Glu Leu 305 310 315 320 Lys Glu Lys Ile Gln Gly Arg Gly Ile Val His Gly Glu Trp Val Gln 325 330 335 Gln Gln Leu Phe Leu Gln His Pro Ser Val Gly Cys Phe Val Ser His 340 345 345 Cys Gly Trp Ala Ser Leu Ser Glu Ala Leu Val Asn Asp Cys Gln Ile 350 355 360 Val Leu Leu Pro Gln Val Gly Asp Gln Ile Ile Asn Ala Arg Ile Met 365 370 375 Ser Val Ser Leu Lys Val Gly Val Glu Val Glu Lys Gly Glu Glu Asp 380 385 390 395 Gly Val Phe Ser Arg Glu Ser Val Cys Lys Ala Val Lys Ala Val Met 400 405 410 Asp Glu Lys Ser Glu Ile Gly Arg Glu Val Arg Gly Asn His Asp Lys 415 420 425 Leu Arg Gly Phe Leu Leu Asn Ala Asp Leu Asp Ser Lys Tyr Met Asp 430 435 440 Ser Phe Asn Gln Lys Leu Gln Asp Leu Leu Gly 445 450

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 19/18 9/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 19/18 5/00 Ａ (72)発明者 小埜 栄一郎 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 サントリー株式会社研究センター内 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB04 AD12 CA17 CB03 CG05 4B024 AA08 BA10 BA79 CA01 DA01 DA02 DA05 DA06 DA11 EA04 GA11 GA17 HA08 4B050 CC03 DD13 EE10 LL10 4B064 AF52 BG00 CA02 CA05 CA10 CA11 CA19 CB30 CC24 DA11 4B065 AA01X AA26X AA57X AA87X AA89Y AB01 AC14 AC20 BA02 CA53

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 フラボノイドの3位の糖にグルコースを
   転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子。
2. 【請求項２】 フラボノイドがアントシアニンである請
   求項１に記載の遺伝子。
3. 【請求項３】 配列番号：２又は配列番号：14に記載の
   アミノ酸配列を有するフラボノイドの3位の糖にグルコ
   ースを転移する活性を有する蛋白質をコードする請求項
   １または２に記載の遺伝子。
4. 【請求項４】 配列番号：２又は配列番号：14に記載の
   アミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸の付
   加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換によって修
   飾されているアミノ酸配列を有し、且つフラボノイドの
   3位の糖にグルコースを転移する活性を有する蛋白質を
   コードする請求項１または２記載の遺伝子。
5. 【請求項５】 配列番号：２又は配列番号：14に記載の
   アミノ酸配列に対して30％以上の同一性を有するアミノ
   酸配列を有し、且つフラボノイドの3位の糖にグルコー
   スを転移する活性を有する蛋白質をコードする請求項１
   または２記載の遺伝子。
6. 【請求項６】 配列番号：２又は配列番号：14に記載の
   アミノ酸配列をコードする塩基配列の全部または一部に
   対して、5 x SSC、50℃の条件下でハイブリダイズによ
   り得られ、且つフラボノイドの3位の糖にグルコースを
   転移する活性を有する蛋白質をコードする請求項１また
   は２記載の遺伝子。
7. 【請求項７】 配列番号：１又は配列番号：13に記載の
   塩基配列の全部または一部に対して、5 x SSC、50℃の
   条件下でハイブリダイズにより得られ、且つフラボノイ
   ドの3位の糖にグルコースを転移する活性を有する蛋白
   質をコードする請求項１または２記載の遺伝子。
8. 【請求項８】 フラボノイドの３位の糖がグルコースで
   ある請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子。
9. 【請求項９】 請求項１〜８のいずれか１項に記載の遺
   伝子を含んでなるベクター。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載のベクターにより形質
    転換された宿主。
11. 【請求項１１】 請求項１〜８のいずれか１項に記載の
    遺伝子によってコードされる蛋白質。
12. 【請求項１２】 請求項１〜９のいずれか１項に記載の
    遺伝子が導入された植物もしくはこれと同じ性質を有す
    る該植物の子孫またはそれらの組織もしくは器官。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の植物又はこれと同
    じ性質を有するその子孫の切り花。
14. 【請求項１４】 請求項１〜８のいずれか１項に記載の
    遺伝子を用いてフラボノイドの3位を修飾する方法。
15. 【請求項１５】 請求項１〜８のいずれか１項に記載の
    遺伝子を用いる花色の調節方法。
16. 【請求項１６】 請求項１０に記載の宿主を培養し、又
    は生育させ、そして該宿主からフラボノイドの３位の糖
    にグルコースを転移する活性を有する蛋白質を採取する
    ことを特徴とする該蛋白質の製造方法。
17. 【請求項１７】 ３位に糖を有するフラボノイドに、請
    求項１１に記載の蛋白質を作用せしめて３位の糖にグル
    コースが転移したフラボノイドを製造する方法。