JP2002233381A - 脂肪族アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子 - Google Patents
脂肪族アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子Info
- Publication number
- JP2002233381A JP2002233381A JP2001032840A JP2001032840A JP2002233381A JP 2002233381 A JP2002233381 A JP 2002233381A JP 2001032840 A JP2001032840 A JP 2001032840A JP 2001032840 A JP2001032840 A JP 2001032840A JP 2002233381 A JP2002233381 A JP 2002233381A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- leu
- ser
- val
- phe
- thr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
ドする遺伝子の提供。 【解決手段】 例えばダリア由来の遺伝子であって、特
定のアミノ酸配列を有する、フラボノイドの3位にマロ
ニル基を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝
子。
Description
ニル基転移活性を持つ蛋白質をコードする遺伝子および
その利用方法に関するものである。
種の顕花植物を開発することが重要である。なかでも、
花の色は花卉のもっとも重要な形質である。交配に頼っ
た従来の育種法により、さまざまな色の品種が育種され
てきたが、交配可能な植物種の遺伝資源が限定されてい
るため、単一の植物種がすべての色の品種を有すること
はまれである。
ノイドの一群の化合物により表現され、その色は主とし
てアントシアニンの構造に依存していることが多い。植
物には多様なアントシアニンが存在することが知られて
おり、それらの多くの構造が既に決定されている。アン
トシアニンの生合成に関わる酵素や遺伝子に関しても研
究が進んでおり、分子生物学的手法と植物への遺伝子導
入により、アントシアニンの構造を変換し、花の色を変
えた例もある(Plant Cell 1995,7, p.1071, Holton an
d Cornish、Plant Cell Physiol. 1998, 39, P.1119, T
anaka et al.)。アントシアニンの生合成経路において
マロニルCoAとクマロイルCoAからアントシアニジン3−
グルコシドに至るまでの生合成経路はほとんどの顕花植
物で共通である。このアントシアニン3−グルコシドが
種あるいは品種特異的に多様な修飾を受けることで、花
色に多彩な変化が現れる。
化合物であるが、糖やアシル基により修飾されることに
より安定性が向上する。また、配糖化によりアントシア
ニンの色はやや赤くなり、芳香族アシル化により青くな
る。アシル基には、大別すると芳香族アシル基と脂肪族
アシル基がある。脂肪族アシル基は、フラボノイド配糖
体の液胞への輸送、フラボノイドの溶解度の増加、アン
トシアニンの液胞中での分布に寄与しているといわれて
いる。例えば、カーネーションの場合にはアントシアニ
ンの3位のマリル基が付加しないことにより、液胞内で
の分布が変わり、花色が変化することが知られている。
以上から、3位の脂肪族アシル基転移酵素遺伝子の発現
を調節することにより、花色を変化せしめることが可能
であることは合理的に推察されるが、その遺伝子はいま
だに取得されていない。
マロニル基)を転移する酵素の精製やその生化学的性質
は既に報告されている(Biosynthesis of Flavonoids,
1999, 713−748, In Comprehensive Natural Products
Chemistry、Archives of Biochemistry and Biophysic
s, 1981, 208, 233−241 (パセリのフラボノールの3位
の糖にマロニル基を転移する酵素(以下3MaT)とフラ
ボノール/フラボンの7位の糖にマロニル基を転移する
酵素(以下7MaT)の粗精製ならびに分子量や基質特異
性測定) ;
s, 1983, 224, 261−271(パセリフラボノール3MaTとフ
ラボン/フラボノール7MaT活性の組織特異性);Archi
vesof Biochemistry and Biophysics, 1983, 226, 206
−217(パセリの3MaTとフラボノール/フラボンの7MaT
の単一評品の精製と3MaT抗体の作製); Eur. J. Bioch
em. 1983, 133, 439−448 (パセリにマロニル化された
アピゲニン7-O-グルコシドが存在することをNMRなどで
構造確認);Archives of Biochemistry and Biophysic
s, 1984, 234, 513−521(Cicer arientiumのイソフラ
ボン7MaT活性測定);
(キク科のDendranthema morifoliumの花弁粗抽出液に
シアニジン3-O-グルコシドに対する脂肪族アシル基転移
酵素活性が存在すること);Plant Science, 1996, 11
8, 109−118(Ajuga reptansの培養細胞の粗抽出液中の
マロニル基転移酵素活性の測定);Phytochemistry, 19
99, 52, 15−18(ダリア花弁由来のマロニル基転移酵素
の基質特性の決定)。
ル基転移酵素ファミリーに属しており、一次構造によく
保存されている配列が存在することが知られている。フ
ラボノイドのアシル基転移酵素は、フラボノイドのどの
位置(たとえば3位、5位)の糖にアシル基を転移する反
応を触媒するのかが厳密に決まっている。それに対し
て、アシルドナーは、たとえばCicer arientiumのイソ
フラボン7MaTの場合、マロニルCoAのみならず、サクシ
ニルCoA、グルタリルCoA、メチルマロニルCoA、アセチ
ルCoA、プロピオニルCoAでもよいことが報告されている
(Archives of Biochemistry and Biophysics, 1984, 2
34, 513-521)。一方、キク科の3MaTは、基質としてマ
ロニルCoAを認識できるがアセチルCoAを認識できないと
の報告もある(Phytochemistry, 1993, 32, 1425-142
6、Phytochemistry, 1999, 52, 15-18)。
転移活性をもつ蛋白質をコードする遺伝子、好ましくは
アントシアニンにマロニル基転移活性をもつ蛋白質をコ
ードする遺伝子あるいはそのホモログ遺伝子を得ること
を課題とした。本発明で得られたマロニル基転移活性を
もつ蛋白質をコードする遺伝子あるいは同様の遺伝子を
植物に導入し、発現させることで、フラボノイドの輸
送、分布、溶解度を改変し、結果として花色を変換する
ことが可能である。
て、マロニル基転移酵素の精製を行った。さらに、アシ
ル基転移酵素群に保存されているアミノ酸配列に対応す
る合成ヌクレオチドを用いたPCR反応によりアシル基転
移酵素ホモログ遺伝子を取得した。その完全長cDNAを大
腸菌で発現させ、アントシアニンの3位のグルコースに
マロニル基を転移する反応を検出した。
に脂肪族アシル基を転移する活性を有する蛋白質をコー
ドする遺伝子を提供する。より具体的には、本発明は、
フラボノイドの3位の糖にマロニル基を転移する活性を
有する蛋白質をコードする遺伝子を提供する。好ましく
は、上記遺伝子は、配列番号:2又は4に記載のアミノ
酸配列を有し、マロニル基を転移する活性を有する蛋白
質をコードする遺伝子あるいはそれらのアミノ酸配列に
対して1個又は複数個のアミノ酸の付加、欠失及び/ま
たは他のアミノ酸による置換によって修飾されているア
ミノ酸配列をコードする遺伝子である。
は4に記載のアミノ酸配列に対して50%以上の相同性を
示すアミノ酸配列を有し、マロニル基を転移する活性を
有するタンパク質をコードする遺伝子である。他の好ま
しい遺伝子は、配列番号:2又は4に記載のアミノ酸配
列をコードする塩基配列の一部または全部に対して、5
x SSC、50℃の条件下でハイブリダイズして得られる、
マロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコード
する遺伝子である。
ベクターを提供する。本発明はまた、上記の遺伝子を含
んでなるベクターにより形質転換された宿主を提供す
る。本発明はさらに、上記の遺伝子によってコードされ
るタンパク質を提供する。本発明はまた、上記の遺伝子
を含んでなるベクターにより形質転換された宿主を培養
し、又は生育させ、そして当該宿主からマロニル基を転
移する反応を触媒するタンパク質を採取することを特徴
とする当該タンパク質の製造方法を提供する。
植物、もしくはこれと同じ性質を有する該植物の子孫ま
たはそれらの組織を提供する。本発明はさらに、上記の
遺伝子が導入された植物もしくはこれと同じ性質を有す
る該植物の子孫の切り花を提供する。本発明はさらに、
上記の遺伝子を用いて花の色を変える方法を提供する。
本発明はさらに、上記の遺伝子を用いて花の色を青くす
る方法を提供する。本発明はさらに、上記の遺伝子によ
ってコードされるタンパク質を用いて、アントシアニン
の3位の糖に脂肪族アシル基を付加する方法を提供す
る。
配列番号:2又は4に記載するアミノ酸配列をコードす
るものが挙げられる。しかしながら、複数個のアミノ酸
の付加、欠失および/または他のアミノ酸との置換によ
って修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、も
とのタンパク質と同様の酵素活性を維持することが知ら
れている。従って本発明は、フラボノイドの3位の糖に
マロニル基転移活性を維持しているタンパク質である限
り、配列番号:2又は4に記載のアミノ酸配列に対して
1個または複数個のアミノ酸配列の付加、欠失および/
または他のアミノ酸との置換によって修飾されたアミノ
酸配列を有するタンパク質および当該タンパク質をコー
ドする遺伝子も本発明に属する。
の塩基配列もしくはそこに記載のアミノ酸配列をコード
する塩基配列、またはそれらの塩基配列の一部分、例え
ばコンセンサス領域の6個以上のアミノ酸をコードする
塩基配列に対して、例えば5xSSC、50℃の条件下でハイ
ブリダイズし、かつマロニル基転移活性を有するタンパ
ク質をコードする遺伝子に関するものである。なお、適
切なハイブリダイゼーション温度は塩基配列やその塩基
配列の長さによって異なり、例えばアミノ酸6個をコー
ドする18塩基からなるDNAフラグメントをプローブとし
た場合には50℃以下の温度が好ましい。
て選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば
植物由来のもの、例えば、キクやパセリ由来の遺伝子が
挙げられるが、植物以外の由来であってもよい。また、
ハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子はcD
NAであってもよく、ゲノムDNAであってもよい。本発明
はさらに配列番号:2又は4に記載のアミノ酸配列に対
して約20%以上、好ましくは50%以上、例えば60%また
は70%以上、の相同性を有するアミノ酸配列を有し、か
つマロニル基転移活性を示すタンパク質をコードする遺
伝子の花色変換への利用に関するものである。
に具体的に示すように、例えばcDNAライブラリーのスク
リーニングによって得られる。また、修飾されたアミノ
酸配列を有する酵素をコードするDNAは生来の塩基配列
を有するDNAを基礎として、常用の部位特定変異誘発やP
CR法を用いて合成することができる。例えば修飾を導入
したいDNA断片を生来のcDNAまたはゲノムDNAの制限酵素
処理によって得、これを鋳型にして、所望の変異を導入
したプライマーを用いて部位特異的変異誘発またはPCR
法を実施し、所望の修飾を導入したDNA断片を得る。そ
の後、この変異を導入したDNA断片を目的とする酵素の
他の部分をコードするDNA断片と連結すればよい。
らなる酵素をコードするDNAを得るには、例えば目的と
するアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば全長ア
ミノ酸配列をコードするDNAを所望の制限酵素により切
断し、その結果得られたDNA断片が目的とするアミノ酸
配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列
からなるDNA断片を合成し、連結すればよい。
での遺伝子発現系を用いて発現させ、酵素活性を測定す
ることにより、得られた遺伝子がマロニル基転移活性を
示すタンパク質をコードすることを確認することができ
る。さらに、当該遺伝子を発現させることにより、遺伝
子産物であるマロニル基転移活性をもつタンパク質を得
ることができる。あるいはまた、配列番号:2又は4に
記載のアミノ酸配列に対する抗体を用いても、マロニル
基転移酵素のタンパク質を得ることができ、抗体を用い
て他の生物のマロニル基転移酵素遺伝子をクローン化す
ることもできる。
組換えベクター、特に発現ベクター、及び当該ベクター
によって形質転換された宿主に関するものである。宿主
としては、原核生物または真核生物を用いることができ
る。原核生物としては細菌、例えばエシェリヒア(Esch
erichia)属に属する細菌、例えば大腸菌(Escherichia
coli)、バシルス(Bacillus)属微生物、例えばバシ
ルス.スブシルス(Bacillus subtilis)など常用の宿主
を用いることができる。真核性宿主としては、下等真核
生物、例えば真核性微生物、例えば真菌である酵母また
は糸状菌が使用できる。
haromyces)属微生物、例えばサッカロミセス.セレビシ
エ(Saccharomyces cerevisiae)等が挙げられ、また糸状
菌としてはアスペルギルス(Aspergillus)属微生物、
例えばアスペルギルス.オリゼ(Aspergillus oryza
e)、アスペルギルス.ニガー(Aspergillus niger)、
ペニシリウム(Penicillium)属微生物が挙げられる。
さらに動物細胞または植物細胞が使用でき、動物細胞と
しては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞系が
使用される。さらに昆虫細胞、例えばカイコ細胞、また
はカイコの成虫それ自体も宿主として使用される。
き宿主の種類に依存して発現制御領域、例えばプロモー
ターおよびターミネーター、複製起点等を含有する。細
菌用発現ベクターのプロモーターとしては、常用のプロ
モーター、例えばtrcプロモーター、tacプロモーター、
lacプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターと
しては、例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲ
ナーゼプロモーター、PH05プロモーター等が使用され、
糸状菌用プロモーターとしては例えばアミラーゼ、trpC
等が使用される。
ウイルス性プロモーター、例えばSV40アーリープロモー
ター、SV40レートプロモーター等が使用される。発現ベ
クターの作製は制限酵素、リガーゼ等を用いて常用に従
って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主
の形質転換も常法に従って行うことができる。前記の発
現ベクターによって形質転換された宿主を培養、栽培ま
たは飼育し、培養物等から常法に従って、例えば、濾
過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー等により目的とする
タンパク質を回収、精製することができる。
つ蛋白質をコードする遺伝子のみに限定されるものでは
なく、マロニル基転移活性を持つ蛋白質をコードする遺
伝子の利用に関するものである。マロニル基転移活性を
持つ蛋白質の起源としては、植物でも動物でも微生物で
あってもよく、マロニル基転移活性を持っていれば、同
様に花色変換へ利用できる。さらに本発明は、マロニル
基転移活性を持つ蛋白質をコードする遺伝子を導入する
ことにより、色合いが調節された植物もしくはその子孫
又はこれらの組織に関するものであり、その形態は切り
花であってもよい。
白質をコードする遺伝子を用いると、液胞内に蓄積して
いるアントシアニンをマロニル化することで色を変える
ことができ、結果として花の色を変えることができる。
現在の技術水準をもってすれば、植物に遺伝子を導入
し、その遺伝子を構成的あるいは組織特異的に発現させ
ることは可能であるし、またアンチセンス法やコサプレ
ッション法によって目的の遺伝子の発現を抑制すること
も可能である。
キク、カーネーション、金魚草、シクラメン、ラン、ト
ルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、
カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラ
ニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ、イネ、
オオムギ、小麦、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バ
ナナ、ユーカリ、サツマイモ、タイズ、アルファルフ
ァ、ルーピン、トウモロコシなどがあげられるがこれら
に限定されるものではない。
分子生物学的手法はとくに断らない限り、Molecular Cl
oning(Sambrook et al., 1989)に依った。実施例1.マロニル基転移酵素の活性測定 ダリアのアントシアニンマロニル基転移酵素(以下D3Ma
T)の活性測定は、山口らの方法(Phytochemistry, 199
9, 52, 15−18)を改変して行った。10μlの酵素液、
10μlの1mg/mlシアニジン3-グルコシド水溶液、10μl
の2mg/mlマロニルCoA水、10mM L-システインを含む70μ
lの0.1Mリン酸カリウム緩衝液を混和し、酵素反応を行
った(30度、1時間)。氷冷0.5%トリフルオロ酢酸(TF
A)水溶液200 μlの添加により反応を停止した。これを
高速液体クロマトグラフィーで、反応産物のシアニジン
3−(マロニル)グルコシド(Cy3MG)と未反応のシアニ
ジン3−グルコシド(Cy3G)とに分離し、定量した。
NAMAX HPLCシステム(UV-VIS検出器はSHIMADZU SPD-10A
VPを使用)を用い、カラムはShodex Asahipak ODP50 4
Eを用いた。展開はA液(0.5% TFA水溶液)、B液 0.5% T
FA水溶液, 50% アセトニトリルを用い、O分から3分まで
は、A液:B液=65:35、その後17分にA液:B液=45:55に
なるように直線濃度勾配溶出を行った。18分から23分ま
ではB液のみを流し、その後24分からはA液:B液=65:35
とした。測定波長は、510nmとした。この条件で、Cy3G
は10.5分に、Cy3MGは13.5分に溶出される。
けて栽培した。収穫したダリアの蕾(赤色および紫色、
蕾1個あたり約10 g)は−40℃で保存し、2,200 gを出
発材料としてD3MaTの精製を行った。なお全精製工程は4
℃にて行った。
EX(100 mM リン酸カリウム pH 7.0、30 mM 2-メルカプ
トエタノール、5 mM EDTA)2,000 mlおよび終濃度0.5 m
M PMSFを加え、HEAVY DUTY BLENDER(WARING)にてホモ
ジェナイズ(middle speed、30 sec)した。得られたホ
モジェネートを遠心分離(7,500×g、20 min)し、沈殿
物に500mlのBufferEXを加えてサスペンドした後再び同
じ遠心分離を行なった。得られた上清は吸引ろ過(What
man 114ろ紙)により浄化して粗酵素液として回収し
た。上記の操作をくりかえし行い、ダリア蕾2,200 gか
ら総量9,000 mlの粗酵素液を調製した。
和画分の沈殿を回収した。得られた沈殿をBuffer AS(1
00 mM リン酸カリウム pH 7.0、30 mM 2-メルカプトエ
タノール、1 mM EDTA、0.1 mM PMSF)に溶解させて硫安
画分液2,000 mlを得た。
iotech)250 mlを加え、静かに攪拌しながら終濃度30%
飽和の硫安を徐々に添加した。よく撹拌したあと数十分
間静置し、上清にD3MaT活性が残っていないことを確認
後、泥漿液中のゲルを吸引ろ過(Whatman 114)により
回収した。ゲルをBuffer A for HIC(20mM リン酸カリ
ウム pH 7.0、30 mM 2-メルカプトエタノール、20%飽和
硫安)で吸引ろ過しながら十分に洗浄した。
(20 mM リン酸カリウム pH 7.0、15 mM 2-メルカプト
エタノール、50% エチレングリコール、0.05% CHAPS)3
00 mlを加え30 min静かに攪拌した後、吸引ろ過にてD3M
aT溶出液を回収した。この溶出操作を10回繰り返し行い
活性画分を集めて、Pellicon(Biomax 8K, MILLIPORE)
により濃縮し100 mlの酵素液1を得た。
×120 cm)に100 ml充填しBuffer A for MR3(10 mM リ
ン酸カリウム pH 7.0、30 mM 2-メルカプトエタノール,
1.01 mS/cm)で平衡化した。酵素液1全量をアプライ
後、Buffer A for MR3にてカラムを洗浄した。活性画分
(素通りと洗浄画分)を集めてPelliconおよび限外ろ過
(YM-10、MILLIPORE)により濃縮し、44 mlの酵素液2を
得た。
ーカラムクロマトグラフィー MIMETIC Red 3をカラム(ψ1.0 cm×30 cm)に20 ml充
填してBuffer A for MR3-2(5 mM リン酸カリウム pH
7.0、30 mM 2-メルカプトエタノール、0.62 mS/cm)で
平衡化した. 脱塩(Buffer A for MR3-2)した酵素液2
全量をアプライ後Buffer A for MR3-2にてカラムを洗浄
した。つづいてBuffer B for MR3-2(5 mMリン酸カリウ
ム pH 7.0、30 mM 2-メルカプトエタノール、0.1mM AcC
oA)により、カラムに結合したD3MaTを特異的を溶出し
た。精製度の高かった活性画分を集めて限外ろ過および
セントリコン(YM-10、MILLIPORE)により濃縮し4.0 ml
の酵素液3を得た。
ィー 酵素液3中のアセチルCoAをPhenyl Superoseクロマトグ
ラフィーにより除去した。Mono Q 5/20カラム(Pharmac
ia Biotech)をBuffer A for IEX(20 mM リン酸カリウ
ム pH 7.0、30 mM 2-メルカプトエタノール)で平衡化
した。酵素液3全量をアプライし(流速 0.5 ml/min)、
Buffer A for IEXにてカラムを洗浄した(流速 0.5 ml/
min、時間 120 min)。Buffer B for IEX(20 mM リン
酸カリウム pH 7.0、30 mM 2-メルカプトエタノール、1
M NaCl)の0〜15%直線濃度勾配(流速 0.5 ml/min、時
間 100 min)の後、15%一定(流速 0.5 ml/min、時間 8
00 min)としカラムに結合したタンパク質を溶出した。
精製度の高かった活性画分を集めセントリコンにて濃縮
し2.8 mLの酵素液4を得た。
ィー CHT2-I(Bio-Rad)をBuffer A for IEXで平衡化した
後、脱塩(Buffer A forIEX)した酵素液4全量をアプラ
イ(流速 0.1 ml/min)した。Buffer A forにてカラム
を洗浄(流速 0.02 ml/min、時間 200 min)した後、Bu
ffer B for CHT(500 mM リン酸カリウム pH 7.0、30 m
M 2-メルカプトエタノール)の0〜100%直線濃度勾配
(流速 0.1 ml/min、時間 200 min)により、カラムに
結合したタンパク質を溶出した。精製度の高かった活性
画分を集めセントリコンにて濃縮し0.4 mlの酵素液5を
得た。これをSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
分子量を調べたところ、約5万Daの一本のバンドが観察
された。
トグラフィー D3MaTの分子量を推定するために、Superdex 200 HR 10/
30(Pharmacia Biotech)ゲルろ過カラムクロマトグラ
フィーを行った。Buffer C(20 mM リン酸カリウム pH
7.0、30 mM 2-メルカプトエタノール、0.15 M NaCl)で
平衡化した後、酵素液200 μlをアプライ(流速 0.3 ml
/min)し、溶出液を分別回収した。各画分におけるマロ
ニル基転移酵素活性のアッセイ結果よりマロニル基転移
酵素の溶出時間を求め、分子量マーカー(GEL FILTRATI
ON CALIBRATION KIT、PharmaciaBiotech)の溶出時間と
比較した。分子量は約5万Da程度であった。
ミノ酸配列はすでにいくつか報告されている(特願平8
−046534)。それらの配列の比較により、 配列1:Asn-Tyr-Phe-Gly-Asn-Cys(配列番号:5)
と、 配列2:Asp-Phe-Gly-Trp-Gly-Lys(配列番号:6)が
保存されていることに着目した。
オチド、 配列3: AA(C/T)TA(C/T)TT(C/T)GGIAA(C/T)TG(配列番
号:7)と配列2に対応するアンチセンス方向の合成ヌ
クレオチド 配列4: (C/T)TTICCCCAICC(A/G)AA(A/G)TC(配列番
号:8)を合成した。
(ストラタジーン社のcDNAライブラリー合成キットを使
用)を鋳型として総量100μlとして、以下の反応液組成
でPCRを行った;1xTAKARA PCR buffer、200 mM dNTPs、
ダリアcDNA 100 ng、合成ヌクレオチド配列3 1pmol/μ
l、合成ヌクレオチド配列4 1pmol/μl、TAKARA rTaq2.
5 unit。反応は96度で1分反応させた後、96度、1分、42
度2分、72度、3分で30サイクル反応させ、さらに72度で
7分間反応させた。
2 primerを用いて上記と同様の反応液組成でnested PCR
を行った。反応は96度で1分反応させた後、96度、1分、
50度2分、72度、3分で30サイクル反応させ、さらに72度
で7分反応させた。得られたPCR産物をサブクローニング
してシークエンスを行ったところ、アントシアニンアシ
ル基転移酵素にホモロジーのある蛋白質をコードするDN
Aを2種得ることができた。それぞれをpSPB927およびp
SPB 928とした。
載の方法で作製し、実施例3で取得したcDNA2種をプ
ローブとしてそれぞれ赤ダリア花弁cDNA library (20万
プラーク)をスクリーニングを行った。すなわち、30%
ホルムアミドを含有するハイブリダイゼーションバッフ
ァー中で37℃で18時間ハイブリダイゼーションを行い、
一定の洗浄条件(0.1×SSC、0.1% SDS、55℃、15min)
で二回洗浄を行うことにより、それぞれのプローブにつ
いて10個の陽性クローンを得た。
のものをAT927、AT929とした。配列解析の結果、AT927
は完全長のD3MaT遺伝子を含み、AT929は5'-側が一部欠
けていることが推定された。AT927のDNA配列は配列番
号:1にアミノ酸配列は配列番号:2、また、AT929のD
NA配列は配列番号:3にアミノ酸配列は配列番号:4に
それぞれ示した。
o excisionを行うことによりpBluescript SK−にサブク
ローニングした。挿入 D3MaT遺伝子が、上流のlacZ遺伝
子に対してin frameとなるように制限酵素サイトを利用
してlacZ遺伝子に連結し直した。得られたプラスミドで
大腸菌XL1-Blue株を形質転換し、形質転換隊をアンピシ
リン(50 ppm)を含有するLB培地(100 ml)にて30℃で
攪拌培養を行った。
た時点で、イソプロピル-β-D-チオガラクトシドを終濃
度1 mMとなるように添加し、さらに8時間、同条件で培
養した。培養液を遠心分離(8,000 rpm x 15 min)する
ことにより集菌し、菌体に緩衝液(100 mM KPB pH 7.
0、0.2% 2-ME、 5 mM EDTA、0.5 mM PMSF)2 mLを添
加、超音波破砕を行った。破砕物を遠心分離(8,000 rp
m x 15 min)して上清を回収した。この酵素液を用いて
マロニル基転移酵素の活性を測定した。その結果、AT92
7及びAT929のいずれについてもCy3GからCy3MGの酵素的
な生成が認められ、それぞれの遺伝子がマロニル基転移
酵素をコードしていることが示された。
にマロニル基を転移する酵素遺伝子を取得することがで
き、当該遺伝子を植物に導入することにより花色を変え
る事ができる。
Claims (14)
- 【請求項1】 フラボノイドの3位の糖に脂肪族アシル
基を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子。 - 【請求項2】 フラボノイドの3位の糖にマロニル基を
転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子。 - 【請求項3】 配列番号:2又は4に記載のアミノ酸配
列を有し、マロニル基を転移する活性を有する蛋白質を
コードする遺伝子あるいはそれらのアミノ酸配列に対し
て1個又は複数個のアミノ酸の付加、欠失及び/または
他のアミノ酸による置換によって修飾されているアミノ
酸配列をコードする請求項1又は2に記載の遺伝子。 - 【請求項4】 配列番号:2又は4に記載のアミノ酸配
列に対して50%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有
し、マロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコ
ードする請求項1〜3のいずれか1項に記載の遺伝子。 - 【請求項5】 配列番号:2又は4に記載のアミノ酸配
列をコードする塩基配列の一部または全部に対して、5
x SSC、50℃の条件下でハイブリダイズして得られる、
マロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコード
する請求項1〜4のいずれか1項に記載の遺伝子。 - 【請求項6】 請求項1〜5のいずれか1項に記載の遺
伝子を含んでなるベクター。 - 【請求項7】 請求項1〜5のいずれか1項に記載の遺
伝子を含んでなるベクターにより形質転換された宿主。 - 【請求項8】 請求項1〜5のいずれか1項に記載の遺
伝子によってコードされるタンパク質。 - 【請求項9】 請求項1〜5のいずれか1項に記載の遺
伝子を含んでなるベクターにより形質転換された宿主を
培養し、又は生育させ、そして当該宿主からマロニル基
を転移する反応を触媒するタンパク質を採取することを
特徴とする当該タンパク質の製造方法。 - 【請求項10】 請求項1〜5のいずれか1項に記載の
遺伝子が導入された植物、もしくはこれと同じ性質を有
する該植物の子孫またはそれらの組織。 - 【請求項11】 請求項1〜5のいずれか1項に記載の
遺伝子が導入された植物もしくはこれと同じ性質を有す
る該植物の子孫の切り花。 - 【請求項12】 請求項1〜5に記載のいずれか1項に
記載の遺伝子を用いて花の色を変える方法。 - 【請求項13】 請求項1〜5に記載のいずれか1項に
記載の遺伝子を用いて花の色を青くする方法。 - 【請求項14】 請求項1〜5のいずれか1項に記載の
遺伝子によってコードされるタンパク質を用いて、アン
トシアニンの3位の糖に脂肪族アシル基を付加する方
法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2001032840A JP2002233381A (ja) | 2001-02-08 | 2001-02-08 | 脂肪族アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2001032840A JP2002233381A (ja) | 2001-02-08 | 2001-02-08 | 脂肪族アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002233381A true JP2002233381A (ja) | 2002-08-20 |
JP2002233381A5 JP2002233381A5 (ja) | 2008-02-21 |
Family
ID=18896704
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001032840A Pending JP2002233381A (ja) | 2001-02-08 | 2001-02-08 | 脂肪族アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2002233381A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114790460A (zh) * | 2021-12-09 | 2022-07-26 | 西藏自治区农牧科学院农业研究所 | 一种青稞矢车菊素丙二酰基转移酶基因及其用途 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996025500A1 (fr) * | 1995-02-17 | 1996-08-22 | Suntory Limited | Genes codant pour des proteines ayant une activite acyltransferase |
-
2001
- 2001-02-08 JP JP2001032840A patent/JP2002233381A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996025500A1 (fr) * | 1995-02-17 | 1996-08-22 | Suntory Limited | Genes codant pour des proteines ayant une activite acyltransferase |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114790460A (zh) * | 2021-12-09 | 2022-07-26 | 西藏自治区农牧科学院农业研究所 | 一种青稞矢车菊素丙二酰基转移酶基因及其用途 |
CN114790460B (zh) * | 2021-12-09 | 2023-09-15 | 西藏自治区农牧科学院农业研究所 | 一种青稞矢车菊素丙二酰基转移酶基因及其用途 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5598830B2 (ja) | アントシアニンの3’位への芳香族アシル基転移酵素をコードする遺伝子を用いたアントシアニン色素の安定化ならびに青色化方法 | |
US20050257291A1 (en) | Genes coding for a protein having a glycoside transfer activity | |
CA2213082C (en) | Genes coding for proteins having acyl transferase activity | |
JP6147195B2 (ja) | 新規糖転移酵素遺伝子及びその使用 | |
JP4853853B2 (ja) | 新規芳香族アシル基転移酵素遺伝子 | |
US6596927B1 (en) | Genes coding for flavone synthases | |
JP5936553B2 (ja) | 新規糖転移酵素遺伝子及びその使用 | |
JP6602291B2 (ja) | 新規糖転移酵素遺伝子及びその使用 | |
JP4641945B2 (ja) | フラボノイド合成系の制御による黄色の花の作製方法 | |
JP4982782B2 (ja) | 新規糖転移酵素遺伝子 | |
JP2002233381A (ja) | 脂肪族アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子 | |
JP4259886B2 (ja) | 新規糖転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子 | |
JP4691720B2 (ja) | 新規アントシアニジングルコシル基転移酵素遺伝子 | |
JP4827043B2 (ja) | 新規脂肪族アシル基転移酵素遺伝子 | |
JP7146754B2 (ja) | マロニル基転移酵素遺伝子の使用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20061130 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080104 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080104 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100824 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110208 |