JP2002233381A - 脂肪族アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 新規なフラボノイドアシル基転移酵素をコー
ドする遺伝子の提供。 【解決手段】 例えばダリア由来の遺伝子であって、特
定のアミノ酸配列を有する、フラボノイドの３位にマロ
ニル基を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝
子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はフラボノイドにマロ
ニル基転移活性を持つ蛋白質をコードする遺伝子および
その利用方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】花卉産業においては多様性に富んだ新品
種の顕花植物を開発することが重要である。なかでも、
花の色は花卉のもっとも重要な形質である。交配に頼っ
た従来の育種法により、さまざまな色の品種が育種され
てきたが、交配可能な植物種の遺伝資源が限定されてい
るため、単一の植物種がすべての色の品種を有すること
はまれである。

【０００３】花の色はアントシアニンと総称するフラボ
ノイドの一群の化合物により表現され、その色は主とし
てアントシアニンの構造に依存していることが多い。植
物には多様なアントシアニンが存在することが知られて
おり、それらの多くの構造が既に決定されている。アン
トシアニンの生合成に関わる酵素や遺伝子に関しても研
究が進んでおり、分子生物学的手法と植物への遺伝子導
入により、アントシアニンの構造を変換し、花の色を変
えた例もある（Plant Cell 1995,7, p.1071, Holton an
d Cornish、Plant Cell Physiol. 1998, 39, P.1119, T
anaka et al.）。アントシアニンの生合成経路において
マロニルCoAとクマロイルCoAからアントシアニジン３−
グルコシドに至るまでの生合成経路はほとんどの顕花植
物で共通である。このアントシアニン３−グルコシドが
種あるいは品種特異的に多様な修飾を受けることで、花
色に多彩な変化が現れる。

【０００４】アントシアニンは中性溶液中では不安定な
化合物であるが、糖やアシル基により修飾されることに
より安定性が向上する。また、配糖化によりアントシア
ニンの色はやや赤くなり、芳香族アシル化により青くな
る。アシル基には、大別すると芳香族アシル基と脂肪族
アシル基がある。脂肪族アシル基は、フラボノイド配糖
体の液胞への輸送、フラボノイドの溶解度の増加、アン
トシアニンの液胞中での分布に寄与しているといわれて
いる。例えば、カーネーションの場合にはアントシアニ
ンの3位のマリル基が付加しないことにより、液胞内で
の分布が変わり、花色が変化することが知られている。
以上から、3位の脂肪族アシル基転移酵素遺伝子の発現
を調節することにより、花色を変化せしめることが可能
であることは合理的に推察されるが、その遺伝子はいま
だに取得されていない。

【０００５】アントシアニンに脂肪族アシル基（例えば
マロニル基）を転移する酵素の精製やその生化学的性質
は既に報告されている（Biosynthesis of Flavonoids,
1999, 713−748, In Comprehensive Natural Products
Chemistry、Archives of Biochemistry and Biophysic
s, 1981, 208, 233−241 (パセリのフラボノールの3位
の糖にマロニル基を転移する酵素（以下３MaT）とフラ
ボノール／フラボンの７位の糖にマロニル基を転移する
酵素（以下７MaT）の粗精製ならびに分子量や基質特異
性測定) ；

【０００６】Archives of Biochemistry and Biophysic
s, 1983, 224, 261−271（パセリフラボノール3MaTとフ
ラボン／フラボノール７MaT活性の組織特異性）；Archi
vesof Biochemistry and Biophysics, 1983, 226, 206
−217（パセリの３MaTとフラボノール/フラボンの７MaT
の単一評品の精製と３MaT抗体の作製）; Eur. J. Bioch
em. 1983, 133, 439−448 （パセリにマロニル化された
アピゲニン7-O-グルコシドが存在することをNMRなどで
構造確認）；Archives of Biochemistry and Biophysic
s, 1984, 234, 513−521（Cicer arientiumのイソフラ
ボン7MaT活性測定）；

【０００７】Phytochemistry, 1993, 32, 1425−1426
（キク科のDendranthema morifoliumの花弁粗抽出液に
シアニジン3-O-グルコシドに対する脂肪族アシル基転移
酵素活性が存在すること）；Plant Science, 1996, 11
8, 109−118（Ajuga reptansの培養細胞の粗抽出液中の
マロニル基転移酵素活性の測定）；Phytochemistry, 19
99, 52, 15−18（ダリア花弁由来のマロニル基転移酵素
の基質特性の決定）。

【０００８】フラボノイドのアシル基転移酵素は、アシ
ル基転移酵素ファミリーに属しており、一次構造によく
保存されている配列が存在することが知られている。フ
ラボノイドのアシル基転移酵素は、フラボノイドのどの
位置（たとえば3位、5位）の糖にアシル基を転移する反
応を触媒するのかが厳密に決まっている。それに対し
て、アシルドナーは、たとえばCicer arientiumのイソ
フラボン7MaTの場合、マロニルCoAのみならず、サクシ
ニルCoA、グルタリルCoA、メチルマロニルCoA、アセチ
ルCoA、プロピオニルCoAでもよいことが報告されている
（Archives of Biochemistry and Biophysics, 1984, 2
34, 513-521）。一方、キク科の3MaTは、基質としてマ
ロニルCoAを認識できるがアセチルCoAを認識できないと
の報告もある（Phytochemistry, 1993, 32, 1425-142
6、Phytochemistry, 1999, 52, 15-18）。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、マロニル基
転移活性をもつ蛋白質をコードする遺伝子、好ましくは
アントシアニンにマロニル基転移活性をもつ蛋白質をコ
ードする遺伝子あるいはそのホモログ遺伝子を得ること
を課題とした。本発明で得られたマロニル基転移活性を
もつ蛋白質をコードする遺伝子あるいは同様の遺伝子を
植物に導入し、発現させることで、フラボノイドの輸
送、分布、溶解度を改変し、結果として花色を変換する
ことが可能である。

【００１０】

【課題を解決するための手段】ダリアの花を材料とし
て、マロニル基転移酵素の精製を行った。さらに、アシ
ル基転移酵素群に保存されているアミノ酸配列に対応す
る合成ヌクレオチドを用いたPCR反応によりアシル基転
移酵素ホモログ遺伝子を取得した。その完全長cDNAを大
腸菌で発現させ、アントシアニンの3位のグルコースに
マロニル基を転移する反応を検出した。

【００１１】従って本発明は、フラボノイドの3位の糖
に脂肪族アシル基を転移する活性を有する蛋白質をコー
ドする遺伝子を提供する。より具体的には、本発明は、
フラボノイドの3位の糖にマロニル基を転移する活性を
有する蛋白質をコードする遺伝子を提供する。好ましく
は、上記遺伝子は、配列番号：２又は４に記載のアミノ
酸配列を有し、マロニル基を転移する活性を有する蛋白
質をコードする遺伝子あるいはそれらのアミノ酸配列に
対して１個又は複数個のアミノ酸の付加、欠失及び／ま
たは他のアミノ酸による置換によって修飾されているア
ミノ酸配列をコードする遺伝子である。

【００１２】好ましくは、上記遺伝子は配列番号：２又
は４に記載のアミノ酸配列に対して50%以上の相同性を
示すアミノ酸配列を有し、マロニル基を転移する活性を
有するタンパク質をコードする遺伝子である。他の好ま
しい遺伝子は、配列番号：２又は４に記載のアミノ酸配
列をコードする塩基配列の一部または全部に対して、5
x SSC、50℃の条件下でハイブリダイズして得られる、
マロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコード
する遺伝子である。

【００１３】本発明はまた、上記の遺伝子を含んでなる
ベクターを提供する。本発明はまた、上記の遺伝子を含
んでなるベクターにより形質転換された宿主を提供す
る。本発明はさらに、上記の遺伝子によってコードされ
るタンパク質を提供する。本発明はまた、上記の遺伝子
を含んでなるベクターにより形質転換された宿主を培養
し、又は生育させ、そして当該宿主からマロニル基を転
移する反応を触媒するタンパク質を採取することを特徴
とする当該タンパク質の製造方法を提供する。

【００１４】本発明はまた、上記の遺伝子が導入された
植物、もしくはこれと同じ性質を有する該植物の子孫ま
たはそれらの組織を提供する。本発明はさらに、上記の
遺伝子が導入された植物もしくはこれと同じ性質を有す
る該植物の子孫の切り花を提供する。本発明はさらに、
上記の遺伝子を用いて花の色を変える方法を提供する。
本発明はさらに、上記の遺伝子を用いて花の色を青くす
る方法を提供する。本発明はさらに、上記の遺伝子によ
ってコードされるタンパク質を用いて、アントシアニン
の3位の糖に脂肪族アシル基を付加する方法を提供す
る。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明の遺伝子としては、例えば
配列番号：２又は４に記載するアミノ酸配列をコードす
るものが挙げられる。しかしながら、複数個のアミノ酸
の付加、欠失および／または他のアミノ酸との置換によ
って修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、も
とのタンパク質と同様の酵素活性を維持することが知ら
れている。従って本発明は、フラボノイドの3位の糖に
マロニル基転移活性を維持しているタンパク質である限
り、配列番号：２又は４に記載のアミノ酸配列に対して
１個または複数個のアミノ酸配列の付加、欠失および／
または他のアミノ酸との置換によって修飾されたアミノ
酸配列を有するタンパク質および当該タンパク質をコー
ドする遺伝子も本発明に属する。

【００１６】本発明はまた、配列番号：１又は３に記載
の塩基配列もしくはそこに記載のアミノ酸配列をコード
する塩基配列、またはそれらの塩基配列の一部分、例え
ばコンセンサス領域の６個以上のアミノ酸をコードする
塩基配列に対して、例えば5xSSC、50℃の条件下でハイ
ブリダイズし、かつマロニル基転移活性を有するタンパ
ク質をコードする遺伝子に関するものである。なお、適
切なハイブリダイゼーション温度は塩基配列やその塩基
配列の長さによって異なり、例えばアミノ酸６個をコー
ドする18塩基からなるDNAフラグメントをプローブとし
た場合には50℃以下の温度が好ましい。

【００１７】このようなハイブリダイゼーションによっ
て選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば
植物由来のもの、例えば、キクやパセリ由来の遺伝子が
挙げられるが、植物以外の由来であってもよい。また、
ハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子はcD
NAであってもよく、ゲノムDNAであってもよい。本発明
はさらに配列番号：２又は４に記載のアミノ酸配列に対
して約20％以上、好ましくは50％以上、例えば60％また
は70％以上、の相同性を有するアミノ酸配列を有し、か
つマロニル基転移活性を示すタンパク質をコードする遺
伝子の花色変換への利用に関するものである。

【００１８】これらの塩基配列を有する遺伝子は実施例
に具体的に示すように、例えばcDNAライブラリーのスク
リーニングによって得られる。また、修飾されたアミノ
酸配列を有する酵素をコードするDNAは生来の塩基配列
を有するDNAを基礎として、常用の部位特定変異誘発やP
CR法を用いて合成することができる。例えば修飾を導入
したいDNA断片を生来のcDNAまたはゲノムDNAの制限酵素
処理によって得、これを鋳型にして、所望の変異を導入
したプライマーを用いて部位特異的変異誘発またはPCR
法を実施し、所望の修飾を導入したDNA断片を得る。そ
の後、この変異を導入したDNA断片を目的とする酵素の
他の部分をコードするDNA断片と連結すればよい。

【００１９】あるいはまた、短縮されたアミノ酸配列か
らなる酵素をコードするDNAを得るには、例えば目的と
するアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば全長ア
ミノ酸配列をコードするDNAを所望の制限酵素により切
断し、その結果得られたDNA断片が目的とするアミノ酸
配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列
からなるDNA断片を合成し、連結すればよい。

【００２０】また、得られた遺伝子を大腸菌および酵母
での遺伝子発現系を用いて発現させ、酵素活性を測定す
ることにより、得られた遺伝子がマロニル基転移活性を
示すタンパク質をコードすることを確認することができ
る。さらに、当該遺伝子を発現させることにより、遺伝
子産物であるマロニル基転移活性をもつタンパク質を得
ることができる。あるいはまた、配列番号：２又は４に
記載のアミノ酸配列に対する抗体を用いても、マロニル
基転移酵素のタンパク質を得ることができ、抗体を用い
て他の生物のマロニル基転移酵素遺伝子をクローン化す
ることもできる。

【００２１】従って本発明はまた、前述の遺伝子を含む
組換えベクター、特に発現ベクター、及び当該ベクター
によって形質転換された宿主に関するものである。宿主
としては、原核生物または真核生物を用いることができ
る。原核生物としては細菌、例えばエシェリヒア（Esch
erichia）属に属する細菌、例えば大腸菌（Escherichia
coli）、バシルス（Bacillus）属微生物、例えばバシ
ルス.スブシルス（Bacillus subtilis）など常用の宿主
を用いることができる。真核性宿主としては、下等真核
生物、例えば真核性微生物、例えば真菌である酵母また
は糸状菌が使用できる。

【００２２】酵母としては例えばサッカロミセス（Sacc
haromyces）属微生物、例えばサッカロミセス.セレビシ
エ(Saccharomyces cerevisiae)等が挙げられ、また糸状
菌としてはアスペルギルス（Aspergillus）属微生物、
例えばアスペルギルス.オリゼ（Aspergillus oryza
e）、アスペルギルス.ニガー（Aspergillus niger）、
ペニシリウム（Penicillium）属微生物が挙げられる。
さらに動物細胞または植物細胞が使用でき、動物細胞と
しては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞系が
使用される。さらに昆虫細胞、例えばカイコ細胞、また
はカイコの成虫それ自体も宿主として使用される。

【００２３】本発明の発現ベクターはそれらを導入すべ
き宿主の種類に依存して発現制御領域、例えばプロモー
ターおよびターミネーター、複製起点等を含有する。細
菌用発現ベクターのプロモーターとしては、常用のプロ
モーター、例えばtrcプロモーター、tacプロモーター、
lacプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターと
しては、例えばグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲ
ナーゼプロモーター、PH05プロモーター等が使用され、
糸状菌用プロモーターとしては例えばアミラーゼ、trpC
等が使用される。

【００２４】また動物細胞宿主用プロモーターとしては
ウイルス性プロモーター、例えばSV40アーリープロモー
ター、SV40レートプロモーター等が使用される。発現ベ
クターの作製は制限酵素、リガーゼ等を用いて常用に従
って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主
の形質転換も常法に従って行うことができる。前記の発
現ベクターによって形質転換された宿主を培養、栽培ま
たは飼育し、培養物等から常法に従って、例えば、濾
過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー等により目的とする
タンパク質を回収、精製することができる。

【００２５】本発明はダリアのマロニル基転移活性を持
つ蛋白質をコードする遺伝子のみに限定されるものでは
なく、マロニル基転移活性を持つ蛋白質をコードする遺
伝子の利用に関するものである。マロニル基転移活性を
持つ蛋白質の起源としては、植物でも動物でも微生物で
あってもよく、マロニル基転移活性を持っていれば、同
様に花色変換へ利用できる。さらに本発明は、マロニル
基転移活性を持つ蛋白質をコードする遺伝子を導入する
ことにより、色合いが調節された植物もしくはその子孫
又はこれらの組織に関するものであり、その形態は切り
花であってもよい。

【００２６】本発明で得たマロニル基転移活性を持つ蛋
白質をコードする遺伝子を用いると、液胞内に蓄積して
いるアントシアニンをマロニル化することで色を変える
ことができ、結果として花の色を変えることができる。
現在の技術水準をもってすれば、植物に遺伝子を導入
し、その遺伝子を構成的あるいは組織特異的に発現させ
ることは可能であるし、またアンチセンス法やコサプレ
ッション法によって目的の遺伝子の発現を抑制すること
も可能である。

【００２７】形質転換可能な植物の例としては、バラ、
キク、カーネーション、金魚草、シクラメン、ラン、ト
ルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、
カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラ
ニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ、イネ、
オオムギ、小麦、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バ
ナナ、ユーカリ、サツマイモ、タイズ、アルファルフ
ァ、ルーピン、トウモロコシなどがあげられるがこれら
に限定されるものではない。

【００２８】

【実施例】以下実施例に従って、発明の詳細を述べる。
分子生物学的手法はとくに断らない限り、Molecular Cl
oning（Sambrook et al., 1989）に依った。実施例１．マロニル基転移酵素の活性測定 ダリアのアントシアニンマロニル基転移酵素（以下D3Ma
T）の活性測定は、山口らの方法（Phytochemistry, 199
9, 52, 15−18）を改変して行った。１0μlの酵素液、
１0μlの1mg/mlシアニジン3-グルコシド水溶液、１0μl
の2mg/mlマロニルCoA水、10mM L-システインを含む70μ
lの0.1Mリン酸カリウム緩衝液を混和し、酵素反応を行
った（30度、1時間）。氷冷0.5%トリフルオロ酢酸（TF
A）水溶液200 μlの添加により反応を停止した。これを
高速液体クロマトグラフィーで、反応産物のシアニジン
3−（マロニル）グルコシド（Cy3MG）と未反応のシアニ
ジン3−グルコシド（Cy3G）とに分離し、定量した。

【００２９】高速液体クロマトグラフィーの条件は、DY
NAMAX HPLCシステム（UV-VIS検出器はSHIMADZU SPD-10A
VPを使用）を用い、カラムはShodex Asahipak ODP50 4
Eを用いた。展開はA液（0.5% TFA水溶液）、B液 0.5% T
FA水溶液, 50% アセトニトリルを用い、O分から3分まで
は、A液：B液＝65:35、その後17分にA液：B液＝45:55に
なるように直線濃度勾配溶出を行った。18分から23分ま
ではB液のみを流し、その後24分からはA液：B液＝65:35
とした。測定波長は、510nmとした。この条件で、Cy3G
は10.5分に、Cy3MGは13.5分に溶出される。

【００３０】実施例２．マロニル基転移酵素の精製 本発明で用いたダリアは、宮崎県において春から夏にか
けて栽培した。収穫したダリアの蕾（赤色および紫色、
蕾1個あたり約10 g）は−４０℃で保存し、2,200 gを出
発材料としてD3MaTの精製を行った。なお全精製工程は4
℃にて行った。

【００３１】（１）粗酵素液の調製 ダリア蕾 500 gにポリビニルピロリドン100 g、Buffer
EX（100 mM リン酸カリウム pH 7.0、30 mM 2-メルカプ
トエタノール、5 mM EDTA）2,000 mlおよび終濃度0.5 m
M PMSFを加え、HEAVY DUTY BLENDER（WARING）にてホモ
ジェナイズ（middle speed、30 sec）した。得られたホ
モジェネートを遠心分離（7,500×g、20 min）し、沈殿
物に500mlのBufferEXを加えてサスペンドした後再び同
じ遠心分離を行なった。得られた上清は吸引ろ過（What
man 114ろ紙）により浄化して粗酵素液として回収し
た。上記の操作をくりかえし行い、ダリア蕾2,200 gか
ら総量9,000 mlの粗酵素液を調製した。

【００３２】（２）硫安分画 粗酵素液9,000 mlについて硫安分画を行い、20〜50%飽
和画分の沈殿を回収した。得られた沈殿をBuffer AS（1
00 mM リン酸カリウム pH 7.0、30 mM 2-メルカプトエ
タノール、1 mM EDTA、0.1 mM PMSF）に溶解させて硫安
画分液2,000 mlを得た。

【００３３】（３）Octyl-Sepharoseバッチ法 硫安画分液にOctyl Sepharose Fast Flow（Pharmacia B
iotech）250 mlを加え、静かに攪拌しながら終濃度30%
飽和の硫安を徐々に添加した。よく撹拌したあと数十分
間静置し、上清にD3MaT活性が残っていないことを確認
後、泥漿液中のゲルを吸引ろ過（Whatman 114）により
回収した。ゲルをBuffer A for HIC（20mM リン酸カリ
ウム pH 7.0、30 mM 2-メルカプトエタノール、20%飽和
硫安）で吸引ろ過しながら十分に洗浄した。

【００３４】ゲルをビーカーに移し、Buffer B for HIC
（20 mM リン酸カリウム pH 7.0、15 mM 2-メルカプト
エタノール、50% エチレングリコール、0.05% CHAPS）3
00 mlを加え30 min静かに攪拌した後、吸引ろ過にてD3M
aT溶出液を回収した。この溶出操作を10回繰り返し行い
活性画分を集めて、Pellicon（Biomax 8K, MILLIPORE）
により濃縮し100 mlの酵素液1を得た。

【００３５】（４）MIMETIC Red 3 による精製 MIMETIC Red 3（ナカライテスク）をカラム（ψ1.0 cm
×120 cm）に100 ml充填しBuffer A for MR3（10 mM リ
ン酸カリウム pH 7.0、30 mM 2-メルカプトエタノール,
1.01 mS/cm）で平衡化した。酵素液1全量をアプライ
後、Buffer A for MR3にてカラムを洗浄した。活性画分
（素通りと洗浄画分）を集めてPelliconおよび限外ろ過
（YM-10、MILLIPORE）により濃縮し、44 mlの酵素液2を
得た。

【００３６】（５）MIMETIC Red 3によるアフィニティ
ーカラムクロマトグラフィー MIMETIC Red 3をカラム（ψ1.0 cm×30 cm）に20 ml充
填してBuffer A for MR3-2（5 mM リン酸カリウム pH
7.0、30 mM 2-メルカプトエタノール、0.62 mS/cm）で
平衡化した. 脱塩（Buffer A for MR3-2）した酵素液2
全量をアプライ後Buffer A for MR3-2にてカラムを洗浄
した。つづいてBuffer B for MR3-2（5 mMリン酸カリウ
ム pH 7.0、30 mM 2-メルカプトエタノール、0.1mM AcC
oA）により、カラムに結合したD3MaTを特異的を溶出し
た。精製度の高かった活性画分を集めて限外ろ過および
セントリコン（YM-10、MILLIPORE）により濃縮し4.0 ml
の酵素液3を得た。

【００３７】（６）Mono Q FPLCカラムクロマトグラフ
ィー 酵素液3中のアセチルCoAをPhenyl Superoseクロマトグ
ラフィーにより除去した。Mono Q 5/20カラム（Pharmac
ia Biotech）をBuffer A for IEX（20 mM リン酸カリウ
ム pH 7.0、30 mM 2-メルカプトエタノール）で平衡化
した。酵素液3全量をアプライし（流速 0.5 ml/min）、
Buffer A for IEXにてカラムを洗浄した（流速 0.5 ml/
min、時間 120 min）。Buffer B for IEX（20 mM リン
酸カリウム pH 7.0、30 mM 2-メルカプトエタノール、1
M NaCl）の0〜15%直線濃度勾配（流速 0.5 ml/min、時
間 100 min）の後、15%一定（流速 0.5 ml/min、時間 8
00 min）としカラムに結合したタンパク質を溶出した。
精製度の高かった活性画分を集めセントリコンにて濃縮
し2.8 mLの酵素液4を得た。

【００３８】（７）CHT2-I FPLCカラムクロマトグラフ
ィー CHT2-I（Bio-Rad）をBuffer A for IEXで平衡化した
後、脱塩（Buffer A forIEX）した酵素液4全量をアプラ
イ（流速 0.1 ml/min）した。Buffer A forにてカラム
を洗浄（流速 0.02 ml/min、時間 200 min）した後、Bu
ffer B for CHT（500 mM リン酸カリウム pH 7.0、30 m
M 2-メルカプトエタノール）の0〜100%直線濃度勾配
（流速 0.1 ml/min、時間 200 min）により、カラムに
結合したタンパク質を溶出した。精製度の高かった活性
画分を集めセントリコンにて濃縮し0.4 mlの酵素液5を
得た。これをSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
分子量を調べたところ、約5万Daの一本のバンドが観察
された。

【００３９】（８）Superdex 200 HR FPLCカラムクロマ
トグラフィー D3MaTの分子量を推定するために、Superdex 200 HR 10/
30（Pharmacia Biotech）ゲルろ過カラムクロマトグラ
フィーを行った。Buffer C（20 mM リン酸カリウム pH
7.0、30 mM 2-メルカプトエタノール、0.15 M NaCl）で
平衡化した後、酵素液200 μlをアプライ（流速 0.3 ml
/min）し、溶出液を分別回収した。各画分におけるマロ
ニル基転移酵素活性のアッセイ結果よりマロニル基転移
酵素の溶出時間を求め、分子量マーカー（GEL FILTRATI
ON CALIBRATION KIT、PharmaciaBiotech）の溶出時間と
比較した。分子量は約5万Da程度であった。

【００４０】実施例３．D3MaTの遺伝子断片の増幅 アントシアニンアシル基転移酵素およそのホモログのア
ミノ酸配列はすでにいくつか報告されている（特願平8
−046534）。それらの配列の比較により、 配列１：Asn-Tyr-Phe-Gly-Asn-Cys（配列番号：５）
と、 配列２：Asp-Phe-Gly-Trp-Gly-Lys（配列番号：６）が
保存されていることに着目した。

【００４１】配列１に対応するセンス方向の合成ヌクレ
オチド、 配列３： AA(C/T)TA(C/T)TT(C/T)GGIAA(C/T)TG（配列番
号：７）と配列２に対応するアンチセンス方向の合成ヌ
クレオチド 配列４： (C/T)TTICCCCAICC(A/G)AA(A/G)TC（配列番
号：８）を合成した。

【００４２】ダリア花弁由来のRNAから調製したcDNA
（ストラタジーン社のcDNAライブラリー合成キットを使
用）を鋳型として総量100μlとして、以下の反応液組成
でPCRを行った；1xTAKARA PCR buffer、200 mM dNTPs、
ダリアcDNA 100 ng、合成ヌクレオチド配列３ 1pmol/μ
l、合成ヌクレオチド配列４ 1pmol/μl、TAKARA rTaq2.
5 unit。反応は96度で1分反応させた後、96度、1分、42
度2分、72度、3分で30サイクル反応させ、さらに72度で
7分間反応させた。

【００４３】この反応産物を鋳型としてMTT20-3、ATCRr
2 primerを用いて上記と同様の反応液組成でnested PCR
を行った。反応は96度で1分反応させた後、96度、1分、
50度2分、72度、3分で30サイクル反応させ、さらに72度
で7分反応させた。得られたPCR産物をサブクローニング
してシークエンスを行ったところ、アントシアニンアシ
ル基転移酵素にホモロジーのある蛋白質をコードするDN
Aを2種得ることができた。それぞれをｐSPB927およびｐ
SPB 928とした。

【００４４】実施例４．D3MaTｃDNAの単離 赤ダリア花弁cDNAライブラリーを特願平8−046534に記
載の方法で作製し、実施例３で取得したｃDNA２種をプ
ローブとしてそれぞれ赤ダリア花弁cDNA library (20万
プラーク)をスクリーニングを行った。すなわち、30%
ホルムアミドを含有するハイブリダイゼーションバッフ
ァー中で37℃で18時間ハイブリダイゼーションを行い、
一定の洗浄条件（0.1×SSC、0.1% SDS、55℃、15min）
で二回洗浄を行うことにより、それぞれのプローブにつ
いて10個の陽性クローンを得た。

【００４５】それぞれのプローブについて得られた最長
のものをAT927、AT929とした。配列解析の結果、AT927
は完全長のD3MaT遺伝子を含み、AT929は5'-側が一部欠
けていることが推定された。AT927のDNA配列は配列番
号：１にアミノ酸配列は配列番号：２、また、AT929のD
NA配列は配列番号：３にアミノ酸配列は配列番号：４に
それぞれ示した。

【００４６】実施例５．D3MaTｃDNAの活性測定について 得られた陽性クローン（AT927, AT929）につき、in viv
o excisionを行うことによりpBluescript SK−にサブク
ローニングした。挿入 D3MaT遺伝子が、上流のlacZ遺伝
子に対してin frameとなるように制限酵素サイトを利用
してlacZ遺伝子に連結し直した。得られたプラスミドで
大腸菌XL1-Blue株を形質転換し、形質転換隊をアンピシ
リン（50 ppm）を含有するLB培地（100 ml）にて30℃で
攪拌培養を行った。

【００４７】600 nmにおける培養液の濁度が0.5に達し
た時点で、イソプロピル-β-D-チオガラクトシドを終濃
度1 mMとなるように添加し、さらに８時間、同条件で培
養した。培養液を遠心分離（8,000 rpm x 15 min）する
ことにより集菌し、菌体に緩衝液（100 mM KPB pH 7.
0、0.2% 2-ME、 5 mM EDTA、0.5 mM PMSF）2 mLを添
加、超音波破砕を行った。破砕物を遠心分離（8,000 rp
m x 15 min）して上清を回収した。この酵素液を用いて
マロニル基転移酵素の活性を測定した。その結果、AT92
7及びAT929のいずれについてもCy3GからCy3MGの酵素的
な生成が認められ、それぞれの遺伝子がマロニル基転移
酵素をコードしていることが示された。

【００４８】

【発明の効果】本発明により、フラボノイドの3位の糖
にマロニル基を転移する酵素遺伝子を取得することがで
き、当該遺伝子を植物に導入することにより花色を変え
る事ができる。

【００４９】

【配列表】 SEQUENCE LISTINGS <110> SUNTORY LIMITED <120> Gene encoding protein having acyl group transfering activity <130> 1013204 <160> 8 <210> 1 <211> 1647 <212> DNA <213> Dahlia hybrid <223> DNA encoding malonyl transferase <400> 1 g gca cga ggc acc cat ctt cta acc ccc att ctt ttc tcc ata aat aga 49 Ala Arg Gly Thr His Leu Leu Thr Pro Ile Leu Phe Ser Ile Asn Arg 1 5 10 15 tcc aac aca cat cac cac cac cgt acc acc aat tcc atg gac aac att 97 Ser Asn Thr His His His His Arg Thr Thr Asn Ser Met Asp Asn Ile 20 25 30 ccc aat cta aca att cta gaa cat tct aga ata tcc cca cca ccg tcc 145 Pro Asn Leu Thr Ile Leu Glu His Ser Arg Ile Ser Pro Pro Pro Ser 35 40 45 acc atc ggc cac cgt tca ttg cca ctc act ttc ttc gac att gca tgg 193 Thr Ile Gly His Arg Ser Leu Pro Leu Thr Phe Phe Asp Ile Ala Trp 50 55 60 cta ctc ttc cca ccc gtc cat cat ctt tac ttc tac cac ttc cct tat 241 Leu Leu Phe Pro Pro Val His His Leu Tyr Phe Tyr His Phe Pro Tyr 65 70 75 80 tcc aaa tcc cat ttc acg gaa acc gtt att cca aac ctt aaa cac tca 289 Ser Lys Ser His Phe Thr Glu Thr Val Ile Pro Asn Leu Lys His Ser 85 90 95 tta tca atc aca ctt caa cac tat ttc cca ttt gtt ggc aaa ctt att 337 Leu Ser Ile Thr Leu Gln His Tyr Phe Pro Phe Val Gly Lys Leu Ile 100 105 110 gta tat cca aac cct cat gat tcc act agg aaa ccc gaa atc cga cac 385 Val Tyr Pro Asn Pro His Asp Ser Thr Arg Lys Pro Glu Ile Arg His 115 120 125 gtg gaa ggt gat tcc gtc gcg ctt act ttc gca gaa act act ctt gat 433 Val Glu Gly Asp Ser Val Ala Leu Thr Phe Ala Glu Thr Thr Leu Asp 130 135 140 ttc aac gat ctg tca gca aat cat cct cgg aaa tgt gaa aac ttt tat 481 Phe Asn Asp Leu Ser Ala Asn His Pro Arg Lys Cys Glu Asn Phe Tyr 145 150 155 160 ccg ctt gtc cct ccg tta ggt aat gcc gtt aaa gaa tcc gat tac gtc 529 Pro Leu Val Pro Pro Leu Gly Asn Ala Val Lys Glu Ser Asp Tyr Val 165 170 175 aca ctc ccg gtt ttc tcg gtc caa gtg acg tat ttt ccg aac tcg ggt 577 Thr Leu Pro Val Phe Ser Val Gln Val Thr Tyr Phe Pro Asn Ser Gly 180 185 190 atc tct att ggc ttg aca aat cat cat agc ctc agt gac gcc aac act 625 Ile Ser Ile Gly Leu Thr Asn His His Ser Leu Ser Asp Ala Asn Thr 195 200 205 cgg ttc ggt ttc ctg aag gcg tgg gct tcg gtt tgt gaa aca ggt gaa 673 Arg Phe Gly Phe Leu Lys Ala Trp Ala Ser Val Cys Glu Thr Gly Glu 210 215 220 gat cag cca ttc ttg aaa aac gga tct cca cct gtt ttt gat aga gtg 721 Asp Gln Pro Phe Leu Lys Asn Gly Ser Pro Pro Val Phe Asp Arg Val 225 230 235 240 gtt gtc aac cca caa cta tat gaa aac agg ttg aac caa aca aga ctc 769 Val Val Asn Pro Gln Leu Tyr Glu Asn Arg Leu Asn Gln Thr Arg Leu 245 250 255 gga act ttt tat caa gct ccg agc ctt gtt ggt tct tct tct gat agg 817 Gly Thr Phe Tyr Gln Ala Pro Ser Leu Val Gly Ser Ser Ser Asp Arg 260 265 270 gtt cgg gcc aca ttt gtt ttg gcc cga acc cat atc agt gga ctt aag 865 Val Arg Ala Thr Phe Val Leu Ala Arg Thr His Ile Ser Gly Leu Lys 275 280 285 aaa caa gtc ctg acc caa ctc cca atg ctg gag tat aca tcc tcc ttt 913 Lys Gln Val Leu Thr Gln Leu Pro Met Leu Glu Tyr Thr Ser Ser Phe 290 295 300 acg gta acg tgt ggt tat ata tgg agt tgt att gtg aag tca tta gtc 961 Thr Val Thr Cys Gly Tyr Ile Trp Ser Cys Ile Val Lys Ser Leu Val 305 310 315 320 aac atg ggg gaa aag aaa ggt gaa gac gag tta gaa cag ttt ata gtg 1009 Asn Met Gly Glu Lys Lys Gly Glu Asp Glu Leu Glu Gln Phe Ile Val 325 330 335 tcg gtg ggt tgt cga tca cgt ttg gat ccg cca ctt cct gaa aac tat 1057 Ser Val Gly Cys Arg Ser Arg Leu Asp Pro Pro Leu Pro Glu Asn Tyr 340 345 350 ttt ggt aac tgt agc gcg ccg tgt att gtg acc ata aaa aat ggt gtg 1105 Phe Gly Asn Cys Ser Ala Pro Cys Ile Val Thr Ile Lys Asn Gly Val 355 360 365 tta aaa ggt gaa aat gga ttt gtt atg gct gct aaa ttg att gga gag 1153 Leu Lys Gly Glu Asn Gly Phe Val Met Ala Ala Lys Leu Ile Gly Glu 370 375 380 ggg ata agc aaa atg gtg aac aag aag ggg gga ata ttg gaa tat gcc 1201 Gly Ile Ser Lys Met Val Asn Lys Lys Gly Gly Ile Leu Glu Tyr Ala 385 390 395 400 gac cga tgg tat gat ggt ttc aag att ccg gct agg aag atg ggg atc 1249 Asp Arg Trp Tyr Asp Gly Phe Lys Ile Pro Ala Arg Lys Met Gly Ile 405 410 415 tcg ggt aca ccg aaa ctc aac ttc tat gac att gat ttt ggg tgg gga 1297 Ser Gly Thr Pro Lys Leu Asn Phe Tyr Asp Ile Asp Phe Gly Trp Gly 420 425 430 aag gcg atg aaa tac gaa gtt gtt tca atc gac tat agc gcg tcg gtt 1345 Lys Ala Met Lys Tyr Glu Val Val Ser Ile Asp Tyr Ser Ala Ser Val 435 440 445 tct tta agt gcg tgc aag gaa tca gca caa gat ttt gaa att gga gtg 1393 Ser Leu Ser Ala Cys Lys Glu Ser Ala Gln Asp Phe Glu Ile Gly Val 450 455 460 tgc ttt ccg agt atg caa atg gaa gca ttt ggt aaa atc ttt aat gat 1441 Cys Phe Pro Ser Met Gln Met Glu Ala Phe Gly Lys Ile Phe Asn Asp 465 470 475 480 gga tta gaa agt gca att gcg tcg tagtttatta tcacttttgt ctgtgtacca 1495 Gly Leu Glu Ser Ala Ile Ala Ser 485 ttgtttgcag ttttcttttt ttagtttgtt ggaatgaggt tggtgtgatt cgggtggaac 1555 atgtttaata tgtttttctc gtacttatcg tgcgttgtca tttgaacaat aaattccctt 1615 tggttcttca attaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1647

【００５０】 <210> 2 <211> 488 <212> PRT <213> Dahlia hybrid <223> Amino asid sequence of malonyl transferase <400> 2 Ala Arg Gly Thr His Leu Leu Thr Pro Ile Leu Phe Ser Ile Asn Arg 1 5 10 15 Ser Asn Thr His His His His Arg Thr Thr Asn Ser Met Asp Asn Ile 20 25 30 Pro Asn Leu Thr Ile Leu Glu His Ser Arg Ile Ser Pro Pro Pro Ser 35 40 45 Thr Ile Gly His Arg Ser Leu Pro Leu Thr Phe Phe Asp Ile Ala Trp 50 55 60 Leu Leu Phe Pro Pro Val His His Leu Tyr Phe Tyr His Phe Pro Tyr 65 70 75 80 Ser Lys Ser His Phe Thr Glu Thr Val Ile Pro Asn Leu Lys His Ser 85 90 95 Leu Ser Ile Thr Leu Gln His Tyr Phe Pro Phe Val Gly Lys Leu Ile 100 105 110 Val Tyr Pro Asn Pro His Asp Ser Thr Arg Lys Pro Glu Ile Arg His 115 120 125 Val Glu Gly Asp Ser Val Ala Leu Thr Phe Ala Glu Thr Thr Leu Asp 130 135 140 Phe Asn Asp Leu Ser Ala Asn His Pro Arg Lys Cys Glu Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Leu Val Pro Pro Leu Gly Asn Ala Val Lys Glu Ser Asp Tyr Val 165 170 175 Thr Leu Pro Val Phe Ser Val Gln Val Thr Tyr Phe Pro Asn Ser Gly 180 185 190 Ile Ser Ile Gly Leu Thr Asn His His Ser Leu Ser Asp Ala Asn Thr 195 200 205 Arg Phe Gly Phe Leu Lys Ala Trp Ala Ser Val Cys Glu Thr Gly Glu 210 215 220 Asp Gln Pro Phe Leu Lys Asn Gly Ser Pro Pro Val Phe Asp Arg Val 225 230 235 240 Val Val Asn Pro Gln Leu Tyr Glu Asn Arg Leu Asn Gln Thr Arg Leu 245 250 255 Gly Thr Phe Tyr Gln Ala Pro Ser Leu Val Gly Ser Ser Ser Asp Arg 260 265 270 Val Arg Ala Thr Phe Val Leu Ala Arg Thr His Ile Ser Gly Leu Lys 275 280 285 Lys Gln Val Leu Thr Gln Leu Pro Met Leu Glu Tyr Thr Ser Ser Phe 290 295 300 Thr Val Thr Cys Gly Tyr Ile Trp Ser Cys Ile Val Lys Ser Leu Val 305 310 315 320 Asn Met Gly Glu Lys Lys Gly Glu Asp Glu Leu Glu Gln Phe Ile Val 325 330 335 Ser Val Gly Cys Arg Ser Arg Leu Asp Pro Pro Leu Pro Glu Asn Tyr 340 345 350 Phe Gly Asn Cys Ser Ala Pro Cys Ile Val Thr Ile Lys Asn Gly Val 355 360 365 Leu Lys Gly Glu Asn Gly Phe Val Met Ala Ala Lys Leu Ile Gly Glu 370 375 380 Gly Ile Ser Lys Met Val Asn Lys Lys Gly Gly Ile Leu Glu Tyr Ala 385 390 395 400 Asp Arg Trp Tyr Asp Gly Phe Lys Ile Pro Ala Arg Lys Met Gly Ile 405 410 415 Ser Gly Thr Pro Lys Leu Asn Phe Tyr Asp Ile Asp Phe Gly Trp Gly 420 425 430 Lys Ala Met Lys Tyr Glu Val Val Ser Ile Asp Tyr Ser Ala Ser Val 435 440 445 Ser Leu Ser Ala Cys Lys Glu Ser Ala Gln Asp Phe Glu Ile Gly Val 450 455 460 Cys Phe Pro Ser Met Gln Met Glu Ala Phe Gly Lys Ile Phe Asn Asp 465 470 475 480 Gly Leu Glu Ser Ala Ile Ala Ser 485

【００５１】 <210> 3 <211> 1545 <212> DNA <213> Dahlia hybrid <223> DNA encoding malonyl transferase <400> 3 g gtt tta gaa aaa tgt cat atc tca gca ccg ccc aac acc gtc ggc gag 49 Val Leu Glu Lys Cys His Ile Ser Ala Pro Pro Asn Thr Val Gly Glu 1 5 10 15 agg acc ctg cca ctt act ctc ttc gac ttg gta tgg ctg att ttc cat 97 Arg Thr Leu Pro Leu Thr Leu Phe Asp Leu Val Trp Leu Ile Phe His 20 25 30 cca att cat cag ctt ttc ttt tat gat ttc ccc tac ccc aaa tcc cat 145 Pro Ile His Gln Leu Phe Phe Tyr Asp Phe Pro Tyr Pro Lys Ser His 35 40 45 ttc att gat aca att atc ccc aaa ctc aaa cac tcc ttg tcc gta act 193 Phe Ile Asp Thr Ile Ile Pro Lys Leu Lys His Ser Leu Ser Val Thr 50 55 60 ctt caa cac ttc ttc ccg ttt gct ggt aac tta atc gtc ttt cct tct 241 Leu Gln His Phe Phe Pro Phe Ala Gly Asn Leu Ile Val Phe Pro Ser 65 70 75 80 gct aat cat tca gga aaa ccc gaa atc cgt cac gtg gag ggc gat tca 289 Ala Asn His Ser Gly Lys Pro Glu Ile Arg His Val Glu Gly Asp Ser 85 90 95 gtc gcc ctt act ttt gca gaa agc gat ctt gat ttc aat tat ctg aaa 337 Val Ala Leu Thr Phe Ala Glu Ser Asp Leu Asp Phe Asn Tyr Leu Lys 100 105 110 caa aat cat cct cgc gat tgt aac aag ttt cac gct ctc gta cca tta 385 Gln Asn His Pro Arg Asp Cys Asn Lys Phe His Ala Leu Val Pro Leu 115 120 125 ctc gaa act cca ttt aaa gta tcc ggt ctt gtt aaa atc cca gtt ttt 433 Leu Glu Thr Pro Phe Lys Val Ser Gly Leu Val Lys Ile Pro Val Phe 130 135 140 tcg att caa gtt acg ttc ttc ccg aac tct ggg atc acg atc ggg ctc 481 Ser Ile Gln Val Thr Phe Phe Pro Asn Ser Gly Ile Thr Ile Gly Leu 145 150 155 160 acg aat cat cac tcc ctt tgt gat gcg aga acg agg tat gat ttc tta 529 Thr Asn His His Ser Leu Cys Asp Ala Arg Thr Arg Tyr Asp Phe Leu 165 170 175 atg gcg tgg act tcg att gcc aaa cat ggt aca gat gag ttg ttc tta 577 Met Ala Trp Thr Ser Ile Ala Lys His Gly Thr Asp Glu Leu Phe Leu 180 185 190 gct agc gga tcg ctt ccg ttt tac gac agg gtt atc gaa tac cct agt 625 Ala Ser Gly Ser Leu Pro Phe Tyr Asp Arg Val Ile Glu Tyr Pro Ser 195 200 205 tat tta gat aac ttg atc cta gat tta cca ccg gtt caa gct att aat 673 Tyr Leu Asp Asn Leu Ile Leu Asp Leu Pro Pro Val Gln Ala Ile Asn 210 215 220 gaa agt tat aga gca cag cag ctt gat ccc caa acc gat aaa gtt cgg 721 Glu Ser Tyr Arg Ala Gln Gln Leu Asp Pro Gln Thr Asp Lys Val Arg 225 230 235 240 ttc aca ctt gtg ttg acc cgg tca cag ata aat aag ata aag aaa tgg 769 Phe Thr Leu Val Leu Thr Arg Ser Gln Ile Asn Lys Ile Lys Lys Trp 245 250 255 ctg ttg gtt caa ttg cct aca ctg gaa tat gtg tct tcc ttt gtt gtc 817 Leu Leu Val Gln Leu Pro Thr Leu Glu Tyr Val Ser Ser Phe Val Val 260 265 270 gct tgt ggt tat gtg tgg agt tgc cta gcg aaa tcg cga gtt caa gtt 865 Ala Cys Gly Tyr Val Trp Ser Cys Leu Ala Lys Ser Arg Val Gln Val 275 280 285 gaa gga gcc aag ggc gag tat gaa gtc gac cgg ttt tca tgt gtc gcc 913 Glu Gly Ala Lys Gly Glu Tyr Glu Val Asp Arg Phe Ser Cys Val Ala 290 295 300 gat tgg agg act cgt ttg aat cca ccg gtt cct caa act tat ttc ggt 961 Asp Trp Arg Thr Arg Leu Asn Pro Pro Val Pro Gln Thr Tyr Phe Gly 305 310 315 320 aac tgt acg ggg tta tgt atg gcg aca aca aaa aca aca tta ata acg 1009 Asn Cys Thr Gly Leu Cys Met Ala Thr Thr Lys Thr Thr Leu Ile Thr 325 330 335 gga agc aaa ggg ttt caa acc gcg gtc gag tta gta gga acg ggg ata 1057 Gly Ser Lys Gly Phe Gln Thr Ala Val Glu Leu Val Gly Thr Gly Ile 340 345 350 agg gaa ggg gtg aac agt aaa caa ggg ttg gct gaa gac gct aag tca 1105 Arg Glu Gly Val Asn Ser Lys Gln Gly Leu Ala Glu Asp Ala Lys Ser 355 360 365 tgg ctg gag aaa atc ttg ata caa gcc cca acc ata ggt gtg gct gga 1153 Trp Leu Glu Lys Ile Leu Ile Gln Ala Pro Thr Ile Gly Val Ala Gly 370 375 380 aca cca aaa ctc aat gtt tac gac atc gat ttc ggg tgg ggg aag ccg 1201 Thr Pro Lys Leu Asn Val Tyr Asp Ile Asp Phe Gly Trp Gly Lys Pro 385 390 395 400 gaa aag tac gag act ata tcg tta gat tac gcg gat gcg ata tct gtt 1249 Glu Lys Tyr Glu Thr Ile Ser Leu Asp Tyr Ala Asp Ala Ile Ser Val 405 410 415 aat gca agc aaa gaa tca tct gat gat ctt gaa att ggt ttg tgc ctt 1297 Asn Ala Ser Lys Glu Ser Ser Asp Asp Leu Glu Ile Gly Leu Cys Leu 420 425 430 ccc gct gaa caa atg gat gct ttt att acc ata tct aca aat gaa cta 1345 Pro Ala Glu Gln Met Asp Ala Phe Ile Thr Ile Ser Thr Asn Glu Leu 435 440 445 gag agt ata ctt tct cat cac ttt tgatatatca atctcgttca tttaccttac 1399 Glu Ser Ile Leu Ser His His Phe 450 455 ggaacgagat tgtgtgcgaa gattagactt cattttcaat aatgtctacc cactaacatt 1459 cattcatgta tgccaccaac accatctccg atgacgagtt gggtttgaaa tgatttaata 1519 ttttcgtcaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1545

【００５２】 <210> 4 <211> 456 <212> PRT <213> Dahlia hybrid <223> Amino asid sequence of malonyl transferase <400> 4 Val Leu Glu Lys Cys His Ile Ser Ala Pro Pro Asn Thr Val Gly Glu 1 5 10 15 Arg Thr Leu Pro Leu Thr Leu Phe Asp Leu Val Trp Leu Ile Phe His 20 25 30 Pro Ile His Gln Leu Phe Phe Tyr Asp Phe Pro Tyr Pro Lys Ser His 35 40 45 Phe Ile Asp Thr Ile Ile Pro Lys Leu Lys His Ser Leu Ser Val Thr 50 55 60 Leu Gln His Phe Phe Pro Phe Ala Gly Asn Leu Ile Val Phe Pro Ser 65 70 75 80 Ala Asn His Ser Gly Lys Pro Glu Ile Arg His Val Glu Gly Asp Ser 85 90 95 Val Ala Leu Thr Phe Ala Glu Ser Asp Leu Asp Phe Asn Tyr Leu Lys 100 105 110 Gln Asn His Pro Arg Asp Cys Asn Lys Phe His Ala Leu Val Pro Leu 115 120 125 Leu Glu Thr Pro Phe Lys Val Ser Gly Leu Val Lys Ile Pro Val Phe 130 135 140 Ser Ile Gln Val Thr Phe Phe Pro Asn Ser Gly Ile Thr Ile Gly Leu 145 150 155 160 Thr Asn His His Ser Leu Cys Asp Ala Arg Thr Arg Tyr Asp Phe Leu 165 170 175 Met Ala Trp Thr Ser Ile Ala Lys His Gly Thr Asp Glu Leu Phe Leu 180 185 190 Ala Ser Gly Ser Leu Pro Phe Tyr Asp Arg Val Ile Glu Tyr Pro Ser 195 200 205 Tyr Leu Asp Asn Leu Ile Leu Asp Leu Pro Pro Val Gln Ala Ile Asn 210 215 220 Glu Ser Tyr Arg Ala Gln Gln Leu Asp Pro Gln Thr Asp Lys Val Arg 225 230 235 240 Phe Thr Leu Val Leu Thr Arg Ser Gln Ile Asn Lys Ile Lys Lys Trp 245 250 255 Leu Leu Val Gln Leu Pro Thr Leu Glu Tyr Val Ser Ser Phe Val Val 260 265 270 Ala Cys Gly Tyr Val Trp Ser Cys Leu Ala Lys Ser Arg Val Gln Val 275 280 285 Glu Gly Ala Lys Gly Glu Tyr Glu Val Asp Arg Phe Ser Cys Val Ala 290 295 300 Asp Trp Arg Thr Arg Leu Asn Pro Pro Val Pro Gln Thr Tyr Phe Gly 305 310 315 320 Asn Cys Thr Gly Leu Cys Met Ala Thr Thr Lys Thr Thr Leu Ile Thr 325 330 335 Gly Ser Lys Gly Phe Gln Thr Ala Val Glu Leu Val Gly Thr Gly Ile 340 345 350 Arg Glu Gly Val Asn Ser Lys Gln Gly Leu Ala Glu Asp Ala Lys Ser 355 360 365 Trp Leu Glu Lys Ile Leu Ile Gln Ala Pro Thr Ile Gly Val Ala Gly 370 375 380 Thr Pro Lys Leu Asn Val Tyr Asp Ile Asp Phe Gly Trp Gly Lys Pro 385 390 395 400 Glu Lys Tyr Glu Thr Ile Ser Leu Asp Tyr Ala Asp Ala Ile Ser Val 405 410 415 Asn Ala Ser Lys Glu Ser Ser Asp Asp Leu Glu Ile Gly Leu Cys Leu 420 425 430 Pro Ala Glu Gln Met Asp Ala Phe Ile Thr Ile Ser Thr Asn Glu Leu 435 440 445 Glu Ser Ile Leu Ser His His Phe 450 455

【００５３】 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 5 Asn Tyr Phe Gly Asn Cys 1 5

【００５４】 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 6 Asp Phe Gly Trp Gly Lys 1 5

【００５５】 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 aaytayttyg giaaytg 17

【００５６】 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 ytticcccai ccraartc 18

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ 9/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/48 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD12 CA06 CA17 CA19 CB03 CD03 CD07 CD09 4B024 AA08 BA10 CA04 DA01 DA02 DA05 DA11 EA04 GA11 HA20 4B050 CC01 CC03 DD13 FF04E FF11E FF12E FF14E LL10 4B063 QA01 QQ26 4B065 AA01X AA57X AA87X AA89Y AB01 BA02 CA29 CA53

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 フラボノイドの3位の糖に脂肪族アシル
   基を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子。
2. 【請求項２】 フラボノイドの3位の糖にマロニル基を
   転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子。
3. 【請求項３】 配列番号：２又は４に記載のアミノ酸配
   列を有し、マロニル基を転移する活性を有する蛋白質を
   コードする遺伝子あるいはそれらのアミノ酸配列に対し
   て１個又は複数個のアミノ酸の付加、欠失及び／または
   他のアミノ酸による置換によって修飾されているアミノ
   酸配列をコードする請求項１又は２に記載の遺伝子。
4. 【請求項４】 配列番号：２又は４に記載のアミノ酸配
   列に対して50%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有
   し、マロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコ
   ードする請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子。
5. 【請求項５】 配列番号：２又は４に記載のアミノ酸配
   列をコードする塩基配列の一部または全部に対して、5
   x SSC、50℃の条件下でハイブリダイズして得られる、
   マロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコード
   する請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺
   伝子を含んでなるベクター。
7. 【請求項７】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺
   伝子を含んでなるベクターにより形質転換された宿主。
8. 【請求項８】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺
   伝子によってコードされるタンパク質。
9. 【請求項９】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺
   伝子を含んでなるベクターにより形質転換された宿主を
   培養し、又は生育させ、そして当該宿主からマロニル基
   を転移する反応を触媒するタンパク質を採取することを
   特徴とする当該タンパク質の製造方法。
10. 【請求項１０】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の
    遺伝子が導入された植物、もしくはこれと同じ性質を有
    する該植物の子孫またはそれらの組織。
11. 【請求項１１】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の
    遺伝子が導入された植物もしくはこれと同じ性質を有す
    る該植物の子孫の切り花。
12. 【請求項１２】 請求項１〜５に記載のいずれか１項に
    記載の遺伝子を用いて花の色を変える方法。
13. 【請求項１３】 請求項１〜５に記載のいずれか１項に
    記載の遺伝子を用いて花の色を青くする方法。
14. 【請求項１４】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の
    遺伝子によってコードされるタンパク質を用いて、アン
    トシアニンの3位の糖に脂肪族アシル基を付加する方
    法。