WO2009149621A1 - 淫羊藿次苷在制备用于预防或治疗男性或女性性功能障碍的产品中用途 - Google Patents

淫羊藿次苷在制备用于预防或治疗男性或女性性功能障碍的产品中用途 Download PDF

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WO2009149621A1
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WO
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icariin
epimedium
cells
activity
sildenafil
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PCT/CN2009/000650
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辛钟成
辛华
田贞姬
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北京东方百奥医药开发有限公司
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    • A61K36/296—Epimedium
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    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/10—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for impotence

Definitions

  • the present invention relates to the use of icariin II or an extract containing icariin II for the preparation of a product for preventing or treating male or female sexual dysfunction, in particular for improving the pathology or function of an erectile function patient
  • Icariin II is a known compound whose structure is as follows:
  • icariin has a skin whitening effect (WO2008/035918).
  • Male sexual function is mainly caused by a variety of sexual stimuli, a series of hemodynamic changes in the corpus cavernosum caused by the nervous system to cause penile erection.
  • the brain and spinal cord erectile modulating central regulation the efferent nerves emitted by the pelvic ganglion cells regulate the function of the corpus cavernosum, and the parasympathetic nerve endings in the efferent nerve release acetylcholine, which activates vascular endothelial cells.
  • Endothelial nitric oxide synthase promotes nitric oxide (NO) production, and non-adrenergic non-cholinergic nerve endings activate penile cavernosal smooth muscle neuronal nitric oxide synthase (nNOS), promoting NO production, NO Activation of soluble guanylate cyclization in smooth muscle cells
  • the enzyme sGC promotes the increase of cGMP synthesis.
  • cGMP-activated proteinase G PKG
  • the intracellular calcium ion can be read to induce dilatation of the corpus cavernosum and sinus expansion of the corpus cavernosum.
  • the blood perfusion of the penis is rapidly increased, the penis
  • the cavernous body expands and the volume increases to oppress the subdural vein and block the venous outflow to increase the pressure in the penis sponge to induce a hard erection of the penis.
  • the cGMP in the corpus cavernosum is inactivated by phosphodiesterase type V (PDE5), and the sympathetic nerve excitability increases during ejaculation, which causes the smooth muscle to contract and turn into a weak state.
  • sildenafil and other phosphodiesterase (PDE5) inhibitor drugs are inhibited by PDE5, and sexual life can be used to enhance erectile function at one time, nearly 20% of severe organic erectile dysfunction has no effect, and It has no therapeutic effect on the pathophysiological changes of erectile dysfunction, and has various side effects such as flushing, headache, visual disturbance, hypotension, low back pain, etc., especially for patients with cardiovascular disease, and Nitrous acid drugs are strictly contraindicated.
  • vascular drugs with smooth muscle relaxation such as paparvar in, Phentolamine, prostaglandin El (pros ta landin El), etc.
  • local injection of these drugs directly into the corpus cavernosum can induce the function of penis.
  • this therapy has no effect on nearly 20% of severe organic erectile dysfunction, and has no therapeutic effect on the pathophysiological changes of erectile dysfunction, and can reduce the side effects such as headache and dizziness caused by blood pressure, causing local pain, Sustained penile erection, penile fibrosis and other serious side effects are often restricted in clinical use.
  • Raw medicine Epimedium is often used as a component in the prescriptions used to nourish strong agents in the traditional medicine industry, but its mechanism of action has not yet been clarified.
  • Recent studies on the active ingredients of Epimedium have proven that Epimedium contains many ingredients, such as icariin, icariin I, icariin II, volatile oil, wax alcohol, stearyl alcohol, phytosterols, Tannin, linoleic acid, etc. More recently isolated a trace of magnof lor in, epimedos ide A, epimedin A, B, C 3 ⁇ 4 querecet in, anhydroicar i in-3-0-rhamnos ide and the like.
  • Epimedium 3 ⁇ 4 Glycoside is currently only used as a standard reagent for the analysis of Epimedium.
  • Previous studies have found that Epimedium II has a selective PDE5 inhibitory effect, but its in vivo strength is found to be significantly lower than that of sildenafil and other chemically synthesized PDE5 inhibitors, preliminary clinical observation of volunteers under informed consent.
  • the invention thus relates to the use of icariin I I or an extract containing Icariin I I for the preparation of a product for the prevention or treatment of male or female sexual dysfunction.
  • the present invention further relates to a product for preventing or treating a male or female sexual dysfunction comprising icariin I I or an extract containing Epimedium I I and a carrier or an excipient.
  • the present invention also relates to a method for preventing or treating male or female sexual dysfunction comprising administering a prophylactically or therapeutically effective amount of icariin II or an extract containing icariin II to a male to be prevented or treated or Female sexual dysfunction patients.
  • the present invention relates to the use of epimedium quinone glucoside or an extract containing the same for the preparation of a product for improving pathological/organic tissue in a patient with erectile dysfunction.
  • the term "product” means a product usable for a person such as, but not limited to, a health food or a medicine.
  • icianin II refers to an extract or mixture of icariin II or icariin II, wherein the extract or mixture is icariin
  • the II content is not less than 50% by weight.
  • the term "carrier or excipient” means an edible or pharmaceutically acceptable excipient or carrier.
  • the invention relates to the prevention and treatment of extracts of icariin and icariin II The use of erectile dysfunction.
  • pathological/organic erectile dysfunction accounting for 50% of patients with erectile dysfunction, is caused by damaging changes in the corpus cavernosum, smooth muscle and vascular endothelial cells, and its pathophysiological mechanism and nitric oxide synthase (N0S) Activity and gene protein expression levels are significantly reduced. Therefore, drugs that have a repairing effect on neurological function and smooth muscle function and endothelial cell dysfunction to regulate and repair N0S function and gene protein expression can prevent and treat erectile dysfunction.
  • N0S nitric oxide synthase
  • the extracts of icariin II and icariin II promote the regeneration of nerve cells, improve the NOS activity of corpus cavernosum smooth muscle and vascular endothelial cells, and the expression of NOS enzyme protein. Moreover, these effects are related to the activating growth factor (EGFR) signaling pathway and thus have an improved, prophylactic or therapeutic effect on the pathological/organic tissue of patients with erectile dysfunction.
  • the extract of icariin saponin and icariin 11 used in the present invention may be used singly or in the form of a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition comprises as an active ingredient an extract of icariin II and icariin II and a medicinal carrier.
  • the extract of icariin saponin and icariin II in the present invention can be used alone or in the form of a pharmaceutical composition for preventing and treating erectile dysfunction, nerve damage disease, endothelial cell function. Prevention and treatment of obstacles.
  • the extract of icariin saponin and icariin 11 used in the present invention may be used singly or in the form of a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition comprises as an active ingredient an extract of icariin II and icariin II, and the extract of icariin II and icariin II in various dosage forms ranges from 5 mg to 500mg.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared by a known method in the art and can be administered orally or parenterally or locally.
  • Oral preparations include, for example, tablets, chewables, capsules, suspensions, solutions and the like, and parenteral preparations include, for example, injection solutions.
  • Formulations for topical administration include, for example, creams, chondric preparations, patches, sprays and the like.
  • the extracts of icariin and icariin II are extracted from a mixture of epimedium and a mixture of an organic solvent or an organic solvent and water, or may be obtained by enzymatic digestion biosynthesis. Extracted from icariin.
  • Organic solvents which may be used include alcohols such as methanol, ethanol, etc., 3 ⁇ 4 generation alkanes such as dichloromethane, chloroform, ethers such as diethyl ether, ketones such as acetone, lipids such as decyl acetate, ethyl acetate, hydrocarbons such as Alkane or the like, digestive enzymes include various glucohydrolases or cellulolytic enzymes such as ⁇ -glucose and P-glucose.
  • Fig. 3 Effect of icariin I I and sildenafil on NOS activity of vascular endothelial cells (PAE)
  • Fig. 4 Effect of nitric oxide synthase inhibitor (LNM) treatment on the activity of ectopic saponins I I on vascular endothelial cells (PAE) N0S
  • Fig. 5 Effect of icariin I I and sildenafil on N0S activity of corpus cavernosum smooth muscle cells
  • Figure 6 Effect of nitric oxide synthase inhibitor (LNM) on the activity of icariin II in the corpus cavernosum smooth muscle cells
  • Fig.7 Effect of epimedium saponins II and sildenafil on cGMP biosynthesis in corpus cavernosum smooth muscle cells
  • mice 24 male SD rats aged 24 months old; all animals were smashed Cheng Jun was formally approved by the Animal Protection and Use Committee. Rats were euthanized by intraperitoneal injection of sodium pentobarbital (200 mg/kg) followed by a lower abdominal incision to expose the pelvic ganglion nerve node (MPG) around the prostate. MPG culture and treatment: The MPG of both sides of each rat was obtained by anatomical and complete isolation. After rinsing with phosphate buffered saline (PBS), the MPG was further peeled off to obtain a DCR, which was cut into three pieces of approximately the same size.
  • PBS phosphate buffered saline
  • RGFM was diluted 3 times in serum-free RPMI-1640 medium in 35 mm culture on ice. The diluted RGFM is tiled onto a cold sterilized glass lid. It was then incubated in a 35 mm Petri dish at 37 for 1 hour to reinforce the RGFM. Subsequently, 40 microdrops of pre-chilled RGFM were added to each MPG block. Incubate for 5 minutes to polymerize the basement membrane, and then add 3 ml of RPMI1640 medium containing no serum containing lx/cyanin, and incubate in a saturated humidity, 5% CO 2 , environment.
  • the cultured MPG tissue blocks were randomly divided into 3 groups: blank control group, icariin II and sildenafil group.
  • the drug was added to the medium at a concentration gradient of 0, 10, 100 and ⁇ .
  • MPGs from 3 younger groups of MGP and 3 older groups were cultured at the indicated doses for 48-72 hours.
  • axon growth At 48 and 72 hours, a Nikon DXM1200 digital camera was attached to the Zeiss Axiovert microscope and ACT-1 software to amplify the growth of axons on the MPG 20 times. The digitized image was analyzed using the Chemi Imager 4000 and the longest axon length was calculated. Result
  • Porcine vascular endothelial cells were provided by the Institute of Urology, Peking University, and the activity of icariin II on endothelial cells was determined.
  • NOS activity was analyzed by NOS reagent: ⁇ (Cayman Chemical company, Ann Arbor, MI, USA) NOS activity (units/mg) - [(val U6-value NO s ) ⁇ (38.3 106)] ⁇ [( 2.15 + The amount of the supernatant) ⁇ (15 ⁇ supernatant volume)] ⁇ [Each cultured egg White concentration].
  • PAE 3 ⁇ 4 6.
  • 03 ⁇ 0. 61 8.
  • 65 ⁇ 0. 87 10.
  • 71 ⁇ 0. 98 16.
  • 63 19. 1 ⁇ 1.
  • 9 18.
  • 66 ⁇ 1. 79 Glycoside ⁇
  • PAE 03 ⁇ 0. 60 5. 76 ⁇ 0. 56 5. 85 ⁇ 0. 579 6. 32 ⁇ 0. 63 5. 99 ⁇ 0. 58 6. 66 ⁇ 0. 65
  • Epimedium saponins II can significantly increase the NOS activity of endothelial cells, and the effect of icariin II on the increase of intracellular NOS activity in EGFR expression, and the effect of icariin II on NOS activity Inhibited by NOS specific inhibitors. This result suggests that icariin I I has a preventive and therapeutic effect on endothelial dysfunction, while sildenafil does not regulate NOS activity.
  • Example 4 Mechanism of regulation of eNOS expression in vascular endothelial cells (PAE) by Icariin I I
  • pGFP-EGFR was transfected into PAE cells using Qigen's lipofection reagent Ef f ectene. The transfected cells were screened at 800 ug/mL of G418, and single cell clones were obtained and expanded. The expression of EGFR was positive by wes tern blot, and the stable expression of PAE-EGFR was obtained.
  • PAE cells and PAE-EGFR cells were plated to 35 mm culture - ⁇ -, 4 disks each. After 12 hours, the final concentration of 12. 5 ⁇ ⁇ icariin I I and sildenafil were treated with PAE-EGFR cells for 24 hr. Subsequently, the drug-treated PAE and PAE-EGFR cells were lysed with RIPA buffer, and the expression of eNOS protein was detected by 8% SDS-PAGE electrophoresis and Wes tern blot. After exposure to the super ECL luminescent substrate, the strip on the X-ray film is scanned by optical density and calibrated with P-act in to form a bar graph.
  • PAE cells and PAE-EGFR cells were plated to 35 mm culture medium, 4 plates each. After 12 hours, PAE and PAE-EGFR cells were treated with a final concentration of 12. 5 ⁇ ⁇ icariin I I and sildenafil alone or with 100 ⁇ g/ ⁇ L EGF for 24 hr. Subsequently, the drug-treated PAE and PAE-EGFR cells were lysed with RIPA buffer, and the expression of eNOS protein was detected by 8% SDS-PAGE electrophoresis and Wes tern blot. After exposure to the super ECL luminescent substrate, the bands on the X-ray film were scanned by optical density and calibrated with ⁇ -actin to form a bar graph.
  • Icariin I I may activate EGFR to regulate the expression of eNOS enzyme protein in endothelial cells, while sildenafil has no significant effect on eNOS protein expression.
  • etoposide I I regulates eNOS expression in endothelial cells and may be related to the activity of growth factor (EGFR) signaling pathway, which needs further study.
  • EGFR growth factor
  • CCSMCs Primary cultured human corpus cavernosum smooth muscle
  • N0S activity [( va lue N0S - measure_ va lue NOS-blank) ⁇ (38. 3 ⁇ 106) ] ⁇ [ (2. 15+ supernatant volume) ⁇ (15 S supernatant) Liquid volume)] ⁇ [protein concentration in each well].
  • the NOS activity in CCSMCs was 0.46 units/mg without drug treatment.
  • concentration reached 10-8 M
  • the icariin produced a significant effect (P ⁇ 0.05), and the N0S activity was 1. 59 units / mg protein, respectively.
  • concentration reached 10-6 M
  • the effect of Icariin I I peaked, and the N0S activity at this time was 4.19 units/mg protein, respectively.
  • the statistical difference was more significant at concentrations of 10-7, 10-6 and 10- 5 M (P ⁇ 0.01). Prior to reaching 10-6 M, the effect of Icariin I I on N0S activity was dose-dependent. However, there is no statistical difference in the sildenafil group.
  • the N0S activity in CCSMCs decreased to an average of 0.3 units/mg protein.
  • icariin I I was able to increase N0S activity in a dose-dependent manner until the concentration reached 10-6 M.
  • the increase of N0S activity in the LMA group was not significant (P ⁇ 0.05); the peak of N0S activity decreased to 2.67 units/mg. There were statistical differences in concentrations between 10-7, 10-6 and 10-5 M.
  • CCSMCs Primary cultured human corpus cavernosum smooth muscle
  • cGMP concentration [pmol/(mg prot - min)] [cGMP or cAMP concentration x supernatant volume] ⁇ reaction time X protein concentration per well X supernatant volume].
  • the concentrations of cGMP and cAMP in CCSMCs were 0. 42 and 5. 16 pmol/(mg prot ⁇ min), respectively, without drug treatment. Icariin I I and sildenafil had no significant effect on the concentration of cAMP (P>0.05).
  • Icariin II and sildenafil have a significant effect on cGMP biosynthesis in corpus cavernosum smooth muscle cells, and icariin II is significantly less effective against cGMP than sildenafil. Icariin II and sildenafil did not significantly affect cAMP biosynthesis in corpus cavernosum smooth muscle cells. This result suggests that Epimedium II has a certain inhibitory effect on PDE5.
  • Example 6 Effect of Epimedium Glucoside on Regulation of N0S Subtype Gene and Protein Expression in Corpus Cavernous Smooth Muscle Cells
  • RESULTS The results of RT-PCR showed that icariin saponins treated corpus cavernosum smooth muscle cells significantly increased nNOS ' mRNA levels after 1 day and 2 days (P ⁇ 0.05, P ⁇ 0.01), and iNOS also increased slightly. ( ⁇ 0.05), while eNOS mRNA did not change. The PDE5a mRNA level was significantly decreased ( ⁇ 0.05). Sildenafil treatment significantly reduced PDE5a mRNA levels at 1 and 2 days (P ⁇ 0, 05, P ⁇ 0.01), and iNOS also after 2 days. There was a slight increase, but no significant changes in eNOS and nNOS mRNA were observed at 1 and 2 days.
  • I IEF International Functional Assessment Form
  • the experimental drug Icariin I I extract (containing Icariin I I 51%) was made into a capsule (containing 200% of Icariin I per gum), similar to the packaging of the placebo group. Both the illuminant and the medicinal agent did not know the conditions of the drug information.
  • the selected volunteers were not randomly divided into two groups, the icariin I I challenge group and the placebo group.
  • the patients took placebo or experimental drugs (1 capsule/time) before going to sleep for 4 weeks.
  • the patients were given a sexual function evaluation questionnaire (5 in total, 5 degrees each) before and after taking the drug. The sexual function changes before and after the drug were compared by the Student t test.
  • the results of the study were evaluated before the treatment of the patient's sexual function score (I IEF5) in the treatment group and the placebo group, 12, 6 and 13. 2, after treatment, the treatment group and the placebo group I IEF5
  • the scores were 19.54 ⁇ 3. 67 and 14.23 ⁇ 2. 97, and the placebo was significantly improved by taking the icariin II capsule group (p ⁇ 0.05).
  • the overall clinical effect of the icariin II capsule group and the placebo group were 71.41% and 41.48%, respectively. No significant side effects were found except for 3 patients with mild gastrointestinal reactions. There were no significant differences in clinical outcomes and side effects between patients with diabetes, hypertension, and heart disease.

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Description

淫羊藿次苷在制备用于预防或治疗 男性或女性性功能障碍的产品中用途 发明领域
本发明涉及淫羊藿次苷 I I或含淫羊藿次苷 I I的提取物在制 备用于预防或治疗男性或女性性功能障碍的产品中用途， 尤其是 在改善勃起功能患者的病理性或器质性组织的用途。 背景技术
淫羊藿次苷 II是一种已知化合物， 其结构如下所示：
Figure imgf000002_0001
据报道， 淫羊藿次苷具有皮肤增白作用 （WO2008/035918 ) 。 男性的性功能主要是在有各种性刺激下时， 在神经系统的调 节下阴茎海绵体发生一系列血液动力学变化引起阴茎勃起。首先， 性刺激或性沖动时， 大脑和脊髓勃起调节中枢调节下， 盆腔神经 节细胞发出的传出神经调节阴茎海绵体组织功能， 传出神经中副 交感神经末梢释放乙酰胆碱， 乙酰胆碱激活血管内皮细胞内皮性 一氧化氮合成酶（eNOS)促进一氧化氮（NO)生成， 而且非腎上腺素 非胆碱能神经末梢激活阴茎海绵体平滑肌神经性一氧化氮合成酶 (nNOS)， 促进 NO生成， NO激活平滑肌细胞内可溶性鸟苷酸环化 酶（sGC)， 促使 cGMP合成增加，通过激活 cGMP激活蛋白酶 G (PKG) 而降低次保内钙离子能读诱发阴茎海绵体动脉扩张和阴茎海绵体 窦膨胀， 阴茎海绵体内血液灌注量迅速增加， 阴茎海绵体膨胀而 体积增加压迫白膜下静脉而阻断静脉流出而提高阴茎海绵体内压 力诱导阴茎坚硬勃起。 阴茎海绵体内的 cGMP 又被磷酸二酯酶 V 型（PDE5)调节失去活性， 而且射精时交感神经兴奋性增加而促使 平滑肌收缩而转入疲软状态。 因此， 启动阴茎勃起反应主要依赖 调节勃起神经结构和功能的完整性十分重要， 而且阴茎海绵体结 构和功能的完整性保证正常勃起功能， 其中， 阴茎海绵体平滑肌 和内皮细胞的结构和功能以及 N0S活性和基因和蛋白结构具有关 键性作用。
随着现代科学技术的发达 已经明确了在 50%以上的性功能 障碍患者中发现患有脑脊髓以及周围神经损伤、 高血压动脉粥样 硬化、 糖尿病等。 而且， 这些疾病引起阴茎海绵体神经损伤， 阴 茎海绵体平滑肌和内皮细胞功能障碍.研究表明，糖尿病、 高血压 动脉粥样硬化、 神经损伤等疾病引起的器质性勃起功能障碍的主 要病理生理变化是阴茎海绵体神经损伤性变化及功能障碍， 阴茎 海绵体平滑肌和血管内皮细胞损伤性病理变化变化及功能障碍， 其中其分子生学学研究结果表明， 阴茎海绵体中 N0S活性或基因 蛋白表达水平显著降低密切相关。
尽管西地那非等磷酸二酯酶（PDE5)抑制剂药物通过 PDE5 的 抑制作用， 性生活需要时服用可一次性增强勃起功能， 但是接近 20%的重度器质性勃起功能障碍没有效果，而且对勃起功能障碍的 病理生理学变化没有治疗性效果， 并有不同程度的副作用， 如面 红、 头痛、 视觉障碍、 低血压， 腰痛等， 特别是对有心血管疾病 的患者具有潜在危险性，而且与亚硝酸类药物严格配伍禁忌使用。 利用具有平滑肌松弛作用的血管药物如罂束碱 ( paparvar in ) 、 酚妥拉明（phentolamine)、 前列腺素 El ( pros ta landin El ) 等， 这些药物直接阴茎海綿体内局部注射可诱发阴茎勃起作用。但是， 这种疗法对接近 20%的重度器质性勃起功能障碍没有效果， 而且 对勃起功能障碍的病理生理学变化没有治疗性效果， 而且可以降 低血压引起头痛头晕等副作用外， 引起局布疼痛、 持续性阴茎勃 起、 阴茎纤维化等严重副作用故临床上常被限制使用。
因此， 促进神经修复， 调节勃起功能障碍患者阴茎海绵体平 滑肌和血管内皮细胞功能， 特别是调节 N0S活性及基因蛋白表达 作用的药物， 对勃起功能障碍的病理生理变化具有预防和治疗性 作用。 但是， 目前还没有真正对勃起功能障碍的病理学变化具有 预防和治疗作用的药物。
生药淫羊藿在传统医学界里用来滋补强壮剂的处方中常常作 为一种成份，但是其作用机制尚未弄清。近来的对淫羊藿有效成份 研究证明淫羊藿中含有许多成份， 如淫羊藿苷、 淫羊藿次苷 I， 淫羊藿次苷 I I， 挥发油、 蜡醇、 州一烷、 植物甾醇、 鞣质、 亚油 酸等。 近来又分离出微量的 magnof lor in、 epimedos ide A、 epimedin A, B, C¾ querecet in, anhydroicar i in-3-0-rhamnos ide 等。 其中淫羊¾次苷 Π 目前仅被用做淫羊藿成份分析用标准试 剂。 前期研究发现淫羊藿次苷 I I具有选择性 PDE5抑制作用， 但 是体外实脸发现其药效强度显著低于西地那非等化学合成 PDE5 抑制剂， 对知情同意下的志愿者初步临床实验观察生活前一次性 口服后淫羊藿次苷 I I提取物 （含淫羊藿次苷 I I 500mg/次）对勃 起功能障碍的效果， 但是没有观察到显著效果。 这种结果进一步 说明羊藿次苷 Π对 PDE5抑制效果轻微， 性生活前一次性口服淫 羊藿次香 I I不足于诱导出类似西地那非有效勃起。 发明内容 本发明人在研究工作中现出人意料地发现淫羊藿次苷勃起功 能障碍患者连续临睡前口服淫羊藿次苷 I I提取物（及淫羊藿次苷 I I 200mg/日）四周后， 显著改善勃起功能， 药理药效研究结果表 明， 淫羊藿次苷 I I不仅具有轻微的 PDE5抑制作用， 而且具有促 进神经细胞再生修复作用， 提高阴茎海绵体平滑肌和血管内皮细 胞 N0S活性， 以及 N0S酶蛋白表达， 并且这些作用与激活生长因 子（EGFR)信号通路有关， 因此对勃起功能障碍的病理生理变化具 有改善或治疗性效果。
本发明因此涉及淫羊藿次苷 I I或含淫羊藿次苷 I I的提取物 在制备用于预防或治疗男性或女性性功能障碍的产品中用途。
本发明进一步涉及一种用于预防或治疗男性或女性性功能障 碍的产品， 其包括淫羊藿次苷 I I或含淫羊藿次普 I I的提取物及 栽体或赋形剂。
本发明还涉及预防或治疗男性或女性性功能障碍的方法， 其 包括将预防或治疗有效量的淫羊藿次苷 I I或含淫羊藿次苷 I I的 提取物给予需预防或治疗的男性或女性性功能障碍患者。
本发明涉及淫羊藿次苷 Π 或含其的提取物在制备用于改善 勃起功能障碍患者的病理性 /器质性组织的产品中用途。
根据本发明， 术语 "产品" 是指可用于人的产品， 例如但不 限于： 保健食品或药物。
根据本发明， 术语 "淫羊藿次苷 I I" 是指淫羊藿次苷 I I单 体或含淫羊藿次苷 I I的提取物或混合物，其中所述提取物或混合 物中淫羊藿次苷 I I含量不低于 50% (重量） 。
根据本发明， 术语 "载体或赋形剂" 是指可食用或药用的赋 形剂或栽体。 本发明涉及淫羊藿次苷 Π及淫羊藿次苷 I I提取物在预防治 疗勃起功能障碍的用途。 研究表明病理性 /器质性勃起功能障碍， 占勃起功能障碍患者 50%， 是由于阴茎海绵体神经， 平滑肌和血 管内皮细胞损伤性变化引起， 其病理生理学机制与一氧化氮合成 酶 (N0S)活性和基因蛋白表达水平显著降低密切相关。 因此，对神 经功能和平滑肌功能及内皮细胞功能障碍具有修补性作用而调节 和修复 N0S功能及基因蛋白表达的药物， 可对勃起功能障碍具有 预防和治疗作用。 本发明人经多年研究出人意料的发现淫羊藿次 苷 I I及淫羊藿次苷 II提取物具有促进神经细胞再生修复作用， 提高阴茎海绵体平滑肌和血管内皮细胞 N0S活性， 以及 N0S酶蛋 白表达， 并且这些作用与激活生长因子（EGFR)信号通路有关， 因 此对勃起功能障碍患者的病理性 /器质性组织具有改善、预防或治 疗性效果。 根据本发明， 本发明中使用的淫羊藿次苷 Π 及淫羊藿次苷 11提取物可以单独使用或以药物组合物形式使用。 药物组合物包 括作为活性成份的淫羊藿次苷 I I及淫羊藿次苷 I I提取物及药用 栽体。 根据本发明， 本发明中使用的淫羊藿次苷 Π 及淫羊藿次苷 I I 提取物可以单独使用或以药物组合物形式使用于预防和治疗 勃起功能障碍， 神经损伤性疾病， 内皮细胞功能障碍的预防和治 疗。 根据本发明， 本发明中使用的淫羊藿次苷 Π 及淫羊藿次苷 11提取物可以单独使用或以药物组合物形式使用。 药物组合物包 括作为活性成份的淫羊藿次苷 I I及淫羊藿次苷 I I提取物， 各种 剂型中淫羊藿次苷 I I 及淫羊藿次苷 I I 提取物含量范围 5mg到 500mg。 根据本发明， 本发明的药物组合物， 可按本领域以知方法制 备并可以通过口服或非肠道或局部途经给药。 口服制剂包括如片 剂、 口嚼剂， 胶囊、 悬浮液、 溶液等， 非肠道给药制剂包括如注 射液。 局部给药制剂包括如霜剂、 软骨剂、 贴剂， 喷雾剂等。 根椐本发明， 淫羊藿次苷 Π及淫羊藿次苷 II提取物是从淫 羊藿生药中通过有机溶剂或有机溶剂与水的混合物提取得到， 也 可以通过酶消化法生物合成法从淫羊藿苷中提取得到。 可使用的 有机溶剂包括醇类如甲醇、 乙醇等、 ¾代烷类如二氯甲烷、 氯仿、 醚类如乙醚、 酮类如丙酮、 脂类如乙酸曱脂、 乙酸乙脂、 烃类如 已烷等， 消化酶包括 α葡萄糖酶以及 P葡萄糖酶等各种糖类水解 酶或纤维素水解酶。 附图说明
图 1 HPLC检测的淫羊藿次苷 I I的纯度
图 2 淫羊藿次苷 I I和西地那非促进老年大鼠 MPG神经轴索 再生的效果
图 3 淫羊藿次苷 I I和西地那非对血管内皮细胞（PAE )NOS 酶 活性的影响
图 4 一氧化氮合成酶抑制剂（LNM)处理对淫羊藿次苷 I I对 血管内皮细胞（PAE ) N0S 酶活性的影响
图 5 淫羊藿次苷 I I和西地那非对阴茎海绵体平滑肌细胞 N0S 活性效果
图 6 —氧化氮合成酶抑制剂（LNM)对淫羊藿次苷 I I对阴茎 海绵体平滑肌细胞 N0S活性影响 图 7 淫羊藿次苷 II 和西地那非对阴茎海绵体平滑肌细胞 cGMP生物合成效果
图 8 SNP刺激下淫羊藿次苷 II和西地那非对阴茎海绵体平滑 肌细胞 cGMP生物合成效果
图 9 淫羊藿次苷 II和西地那非对 N0S亚型、 PDE5mRNA表达 的影响
图 10 淫羊藿次苷 II和西地那非对 N0S亚型、 PDE5、 PKG 和 sGC 蛋白表达的影响 下面的实施例用来更详细的说明本发明， 但不意味着本发明 仅限于此。 实施例 1 淫羊藿次苷 II提取物及淫羊藿次苷 II的制备 提取方法 （1)
淫羊藿次苷 II提取物
取千燥淫羊藿 （地上部分） 500克加 EtOH 10升， 80C。加温 汇流提取 3次， 每次 1小时， 共 3回。 过滤， 减压回收乙醇浓缩 成浆状。 加 4倍量水分散后静止 3小时除去叶绿素几蜡脂等， 正 丁醇翠取 4次后合并滤液，减压浓缩。用 40-60目聚酰氨柱吸附， 30%乙醇洗脱至无色， 洗脱液减压浓缩。 加 70%乙醇 （1: 20)溶 解，静止 8小时，过滤得淫羊藿总苷。淫羊藿总苷与无水乙醇（1: 15)反复洗脱重结晶， 获得褐色淫羊藿次苷 II提取物。 HPLC分 析法测定结果淫羊藿次苷 Π含量 50. n。 提取方法 （2)
淫羊藿次苷 II分离提纯并检测 淫羊藿次苷 I I提取物溶化在 MeOH, 吸附在 s i l ica gel千 燥， 再加入已备好的 s i l ica gel column (8x60cm)中， 以 CHC1： MeOH = 5 ： 1, 4 ： 1, 3 ： 1, 2 ： 1 的顺序溶出， 各溶出的分 液浓缩，再用 MeOH/H20 混和液析出淡黄色结晶。该结晶在 UV 发 色， pauly试剂显阳性反映， HPLC分析法测定结果淫羊藿次苷 II 含量为 99. 8%. 图 1： 提取方法 （3 )
淫羊藿次苷 Π提取物提取并检测
取淫羊藿苷提取物 50克， 加入磷酸二氢钠-磷酸氢二钠緩冲 液（ PH5. 5 ) , 加入 P葡萄糖酶 100 毫升。 加热至 40度搅拌 24 小时水解除去葡萄糖苷。 停止加热， 用乙酸乙酯反复萃取， 合并 乙酸乙酯层， 回收溶剂制干后利用甲醇溶解反复萃取， 回收甲醇 浓缩获得 HPLC分析法测定结果淫羊藿次苷 I I含量为 50. 1%, 获 得淫羊藿次苷 I I提取物。 提取方法 （4 )
淫羊藿次苷 Π分离提纯并检测
淫羊藿次苷 Π提取物曱醇溶解反复萃取，反复浓缩结晶 5-8 次， 获得提纯淫羊藿次苷 Π 淡黄色结晶。 该结晶在 UV 发色， pauly 试剂显阳性反映， HPLC 分析法测定结果淫羊藿苷含量为 99. 8%。 实施例 2 淫羊藿次苷 II促进老年大鼠阴茎神经再生的效果 材料与方法
实验动物： 24月龄雄性老年 SD大鼠 24只； 所有动物实猃过 程均获得了动物保护和利用委员会的正式批准。 腹腔注射戊巴比 妥钠 （ 200毫克 /千克）对大鼠进行安乐死， 紧接着下腹部切口， 暴露前列腺周围盆腔神经节神经结 （MPG) 。 MPG培养和处理： 解 剖完整地分离获取每只大鼠双侧的 MPG。经磷酸盐緩沖液（ PBS ) 沖洗后， 进一步剥离 MPG以获得 DCR, 并将其切成大小大致相同 的 3块。
在冰上将 RGFM用不含血清的 RPMI- 1640培养基稀释 3倍于 35毫米培养 中。 将稀释过的 RGFM平铺在冷灭菌过的玻璃盖单 上。然后将其放于 35毫米培养皿中于 37 孵育 1小时，以使 RGFM 加固。随后，每个 MPG块中加入 40微滴预冷的 RGFM。 孵育 5 分钟以使基底膜聚合， 再加入 3毫升不含血清含 lx的青 /链霉素 的 RPMI1640培养基， 置于饱和湿度、 5% C02、 环境下培养。
将培养的 MPG组织块随机分为 3組： 空白对照组， 淫羊藿次 苷 II和西地那非组。 将药物按 0， 10, 100和 ΙΟΟΟΟηΜ的浓度梯 度加入到培养基中。 3块年轻组的 MGP和 3块老龄组的 MPG均按 指定剂量进行培养， 培养时间为 48-72小时。
神经轴索生长的测量： 在 48和 72小时， 应用尼康 DXM1200 数码相机连接到 Zeiss Axiovert显微镜和 ACT-1软件， 放大 20 倍观察 MPG上神经轴索的生长。应用 Chemi Imager 4000分析数字 化图像， 并计算最长神经轴索长度。 结果
不同浓度的淫羊藿次苷 II ( ΙΟηΜ, ΙΟΟηΜ, ΙΟΟΟηΜ)显著促进 了老年大鼠 MPG上神经轴索的浓密生长（见表 1， 图 2)， MPG上 神经轴索生长的测量结果， 淫羊藿次普 II (ΙΟηΜ, ΙΟΟηΜ, ΙΟΟΟηΜ) 处理组比较对照组和显著延长（p<0.01), 而不同浓度西地那非却 对 MPG 上神经轴索的生长却没有显著影响（p>0.05).这种结果提 示， 淫羊藿次苷 II具有良好的促进神经再生修复作用，可能对老 年男性、 糖尿病、 高血压动脉粥样硬化、 神经损伤等疾病引起勃 起功能障碍神经损伤性变化引起的勃起功能障碍具有预防和治疗 效果。 表 1.淫羊藿次苷 II和西地那非促进老年大鼠 MPG神经轴索 再生的效果
Figure imgf000011_0001
*:P Value <0.01 实施例 3 淫羊藿次苷 II 对血管内皮细胞（PAE) N0S 酶活 性的影响 材料与方法
猪血管内皮细胞（PAE)由北京大学泌尿外科研究所提供 淫羊藿次苷 II对内皮细胞的 N0S活性测定
利用 N0S 试剂盒 ( Cayman Chemical company, Ann Arbor, MI, USA) ， 分别将不同浓度（0， 10—9， 10Λ 1(Γ7， 10— 6， 10— 5和 10— 4Μ) 的羊藿次苷 II (西地那非作为对照组） 处理内皮细胞（ΡΑΕ)。 每 个培养孔加 180 μΐ裂解液。 20 μΐ上清液用 BCA蛋白检测试剂盒 分析蛋白质浓度和 100 μ 1上清液用 N0S试剂: ^(Cayman Chemical company, Ann Arbor, MI, USA)分析 NOS的活性。 NOS活性 （单 位 /毫克） - [(val U6 一 valueNOs ) ÷ ( 38.3 106)] χ [( 2.15 +上清量） ÷ ( 15 χ上清体积） ] ÷ [每个培养亚的蛋 白浓度]. 结果
为了观察淫羊藿次苷 II对内皮细胞功能的影响，检测了淫羊 藿次苷 II处理前后细胞内 N0S的酶活性， 西地那非作为对照组。 检测内皮细胞 PAE中 N0S的酶活性基线为 6.03±0.54 u/mg, 而表 达 EGFR的 PAE-EGFR细胞中 N0S的酶活性基线为 8.34±0.83 u/mg. 当药物浓度达到 10"8 M 时 N0S活性 10.71+1.09 u/mg, 开始 PAE 细胞中淫羊藿次苷 II显著增加 N0S活性， （P<0.05)。 当淫羊 ¾ 次苷 II浓度达到 10— 6 M 时， N0S活性为 19.1+1.891 u/mg, 显著 增加 N0S活性（ P<0.01)。 当淫羊藿次苷 II 浓度在 10—7， 1(Τ和 10"5Μ时，显著增加 N0S活性 (Ρ<0.01)。在表达 EGFR的 PAE-EGFR 细胞中， 当淫羊藿次苷 II 浓度达到 10— 8 M 时， N0S活性增加到 15.37±1.49 u/mg, 比 PAE细胞中高 4.66 u/mg. 在药物浓度达到 I!)—7, 10— 6和 10—5 M时， 淫羊藿次苷 II对 PAE-EGFR细胞 N0S活性 的影响比较 PAE细胞显著增加（P<0.01)。 这种结果提示淫羊藿次 苷 II对 N0S酶活性影响可能被 EGFR激活作用相关。 这些结果表 明， 淫羊藿次苷 II可增加内皮细胞内 N0S活性（p<0.05)， 而西地 那非对内皮细胞 N0S活性却无显著影响（ρ>0· 05)。 这种结果提示 淫羊藿次苷 Π对 N0S酶活性的调节可能和 EGFR激活相关。
利用一氧化氮合成酶抑制剂 LNNA 处理内皮细胞时， 在 PAE 和 PAE-EGFR 中 N0S 活性基线下降到 2.74±0.269 u/mg 和 3.27±0.319 u/mg。而且发现，用一氧化氮合成酶抑制剂 LNNA(10"5 M)处理后，显著抑制了淫羊藿次苷 II对内皮细胞 N0S活性的调节 作用， 并呈剂量依赖的关系（ρ<0· 05)。 表 2: 淫羊藿次苷 II和西地那非对血管内皮细胞（PAE) N0S 酶活性的影响
0 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5
PAE ¾ 藿次 6. 03±0. 61 8. 65±0. 87 10. 71±0. 98 16. 46±1. 63 19. 1±1. 9 18. 66±1. 79 苷 Π
PAE-EGFR 淫 8. 35±0. 84 11. 72±1. 21 15. 37±1. 51 22. 79±2. 45 23. 91±2. 36 22. 74±2. 27 羊 次苷 II
PAE 6. 03±0. 60 5. 76±0. 56 5. 85±0. 579 6. 32±0. 63 5. 99±0. 58 6. 66±0. 65
PAE-EGFR 西 8. 35±0. 79 8. 48±0. 85 8. 37±0. 82 8. 53±0. 84 8. 4±0. 84 8. 99±0. 87
活性的影响 结论： 淫羊藿次苷 I I可以显著增加内皮细胞 N0S活性，且在 EGFR表达时淫羊藿次苷 I I增加细胞内 N0S活性作用显著增强， 而且淫羊藿次苷 I I对 N0S活性作用被 N0S特异性抑制剂所抑制。 这种结果提示淫羊藿次苷 I I 对内皮细胞功能障碍具有预防和治 疗作用， 而西地那非却没有对 N0S活性的调节作用。 实施例 4 淫羊藿次苷 I I对血管内皮细胞（PAE ) eNOS表达 的调节作用机理研究
研究背景
发明者前期研究发现， 糖尿病性勃起功能障碍患者阴茎海绵 体组织中 EGFR与 eNOS的表达水平比健康者显著降低， 同时伴随 着 ERK磷酸化水平降低， 具有相关性。 这些结果提示 EGF信号通 路和 NOS信号通路间存在 Cros s ta lk, 在勃起功能障碍的发生发 展中具有重要意义。
研究目的
研究淫羊藿次苷 Π 对血管内皮细胞 eNOS表达的调节作用机 制。
研究方法
1. 将 EGFR基因插入 pGFP质粒中， 构建 pGFP-EGFR表达载 体。 用 Qigen公司的脂质体转染试剂 Ef f ectene把 pGFP- EGFR转 染到 PAE细胞中。 以 800ug/mL的 G418筛选转染细胞， 获得单细 胞克隆后扩大培养。 经 wes tern blot臉证为 EGFR表达阳性， 即 获得 PAE-EGFR稳定表达株。
2. 5 X 105 的 PAE细胞和 PAE-EGFR细胞分盘至 35mm培养 -ΠΠ- , 各 4盘。 12小时后分别用终浓度 12. 5 μ Μ 淫羊藿次苷 I I和 西地那非处理 ΡΑΕ与 PAE-EGFR细胞 24hr。随后将药物处理的 PAE 和 PAE- EGFR细胞用 RIPA buffer裂解， 8%SDS- PAGE电泳， Wes tern blot检测 eNOS蛋白表达。 经 super ECL发光底物曝光后， X -光 片上的条带经光密度扫描， 与 P -act in校准后绘成柱形图。
3. 5 X 105 的 PAE细胞和 PAE-EGFR细胞分盘至 35mm培养 亚， 各 4盘。 12小时后分别用终浓度 12. 5 μ Μ 淫羊藿次苷 I I和 西地那非单独或与 100 μ g/ μ L EGF联合处理 PAE与 PAE-EGFR细 胞 24hr。随后将药物处理的 PAE和 PAE-EGFR细胞用 RIPA buffer 裂解， 8%SDS-PAGE电泳， Wes tern blot检测 eNOS蛋白表达。 经 super ECL 发光底物曝光后， X-光片上的条带经光密度扫描， 与 β -肌动蛋白校准后绘成柱形图。
结果
研究发现淫羊藿次苷 Π处理引起 PAE-EGFR稳定株和不稳定 株中 eNOS表达水平比分别为 1. 16和 2. 08 , 在 PAE-EGFR稳定株 中 eNOS 表达水平比较空白对照组和不稳定比较株显著增加 (p<0. 05)， 而西地那非处理 PAE-EGFR稳定株和不稳定株中 eNOS 表达水平比分别为 1. 12和 1. 38 , 比较空白对照组和不稳定比较 株却没有显著影响（P>0. 05)。
对照 淫羊藿次苷 I I 西地那非
PAE 1. 01±0. 08 1. 08±0. 09 1. 12+0. 09
PAE-EGFR 1. 40±0. 14 2. 08±0. 02 1. 38+0. 013 结论
根据以上实猃结果， 淫羊藿次苷 I I可能激活 EGFR参与调节 内皮细胞 eNOS酶蛋白表达水平显著提高， 而西地那非对 eNOS酶 蛋白表达水平却没有显著影响。 这种结果提示， 淫羊藿次苷 I I 调节内皮细胞 eNOS 表达可能通过生长因子（EGFR)信号通路活性 有关， 有待于进一步深入研究。 实施例 5 淫羊藿次苷 I I对阴茎海绵体平滑肌细胞 N0S活性 和细胞内 cGMP的浓度影响
1. 淫羊藿次苷 I I对阴茎海綿体平滑肌细胞 N0S活性效果 实验方法：
原代培养人阴茎海綿体平滑肌（CCSMCs ) 由北京大学男科中 心提供。将第三代 CCSMCs细胞种植到六孔板培养两天后，将细胞 分为 淫羊藿次苷 I I 组和西地那非组， 药物浓度为 ( 0， 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 ) M, 药物一 LNNA 组分为淫羊藿 次苷 I I ( 0, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 M )和 LNNA (4 10-4 Μ)， 对照组加 DMEM培养， 分别培养 24小时后， 将细胞冲洗 3次， 在 每孔中加入 180 μ 1溶解液，取细胞悬液 60 μ 1用 BCA蛋白检测试 剂盒分析蛋白浓度； 取细胞悬液 100 μ 1分析 N0S活性。 N0S活性 (单位 /毫克蛋白 ) = [ ( va lue N0S - measure— va lue NOS-blank) ÷ (38. 3 χ 106) ] χ [ (2. 15+上清液体积) ÷ (15 S 上清液体积）] ÷ [每孔中的蛋白浓度] 。
在不添加药物处理的情况下， CCSMCs中的 N0S活性为 0. 46 单位 /毫克。 当浓度达到 10-8 M, 淫羊藿次苷产生明显的影响 ( P<0. 05)， N0S活性分别为 1. 59单位 /毫克蛋白。 当浓度达到 10-6 M, 淫羊藿次苷 I I的影响达到高峰， 此时的 N0S活性分别为 4. 19单位 /毫克蛋白。 浓度为 10-7， 10-6 和 10- 5 M时， 统计学 差异更加显着（P<0. 01)。 在达到 10-6 M之前， 淫羊藿次苷 I I对 N0S 活性的影响呈剂量依赖效应。 然而对于西地那非组， 没有统 计学上的差异。 LNNA处理组， CCSMCs 中的 N0S活性平均下降到 0. 3 单位 /毫克蛋白。 分别加入 N0S抑制剂 LNNA (10-5 M)处理后， 我们注意到， 淫羊藿次苷 I I在浓度达到 10-6 M之前， 仍然能够 增加 N0S活性并呈剂量依赖效应。 与非 LNNA处理组相比， LMA 组 N0S活性的增加并不明显（P<0. 05 )； N0S活性的高峰下降到 2. 67单位 /毫克。 浓度在 10-7， 10-6 和 10- 5 M时有统计学上的 差异。
2. 淫羊藿次苷 I I对阴茎海绵体平滑肌细胞 cGMP/cAMP生物 合成效果
实猃方法：
原代培养人阴茎海绵体平滑肌（CCSMCs ) 由北京大学男科中 心提供。将第三代 CCSMCs细胞种植到六孔板培养两天后，进行实 验处理。 药物组分为淫羊藿次苷 I I组和西地那非组， 药物浓度为 (0, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5, 10-4 M) , 处理 4小时； 药物一 SNP 組 分 为 淫 羊 藿 次 苷 I I 组 和 西 地 那 非 组 (0, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5, 10-4 M) ,处理 4小时， SNP (10-5 M)处理 30分钟； 对照组加 DMEM培养。 然后在每孔中加入 0. 4 mL 0. 1 M HC1 , 室温孵育 20分钟， 收获裂解细胞， 将细胞悬液收集 到离心管， 1000g离心 10分钟。 取细胞悬液 60 μ 1用 BCA蛋白检 测试剂盒分析蛋白浓度； 取细胞悬液 100 μ 1 分析 cGMP或 cAMP 的浓度。 cGMP 浓度 [pmol/ (mg prot - min) ] = [cGMP or cAMP 浓度 x上清液体积] ÷反应时间 X每孔中蛋白浓度 X上清液体 积]。
结果
在不添加药物处理的情况下， CCSMCs培养基中 cGMP 和 cAMP 的浓度分别为 0. 42 和 5. 16 pmol/ (mg prot · min)。 淫羊藿次苷 I I和西地那非对 cAMP的浓度无显著影响（P>0. 05)。
SNP (10-5 M)处理下， CCSMCs培养基中 cGMP的浓度为 2. 03 pmol/ (mg prot - min) , 增加了 4. 8倍。 加入 SNP后， 淫羊藿次苷 I I组和西地那非组均剂量依赖性地显著增加了 cGMP的浓度， EC50 分别为 1. 02和 0. 27 μ Μ。 SNP的处理与否， 淫羊藿次苷 I I和西地 那非在浓度为 10-7 M, 10-6 M, 10-5 M 和 10-4 M时， 对 cGMP浓 度的影响具有显著差异（P<0. 01)。 结论
淫羊藿次苷 II和西地那非对阴茎海绵体平滑肌细胞 cGMP生 物合成效果具有显著增强效果， 而且淫羊藿次苷 I I对 cGMP的效 果显著弱于西地那非。淫羊藿次苷 I I和西地那非对阴茎海绵体平 滑肌细胞 cAMP生物合成却没有显著影响。这种结果提示淫羊藿次 苷 I I对 PDE5具有一定的抑制作用有关。 实施例 6 淫羊藿次苷 Π调节阴茎海绵体平滑肌细胞 N0S 亚 型基因和蛋白表达的影响
1. 淫羊藿次苷 Π调节阴茎海绵体平滑肌细胞 N0S 亚型和 PDE5a的 mRNA表达的影响
方法：人阴茎海绵体平滑肌细胞种植至 60mm培养亚，分为淫 羊藿次香 Π組合西地那非组， 12 小时后分别用终浓度 12. 5 μ Μ 淫羊藿次苷 Π和西地那非分别处理细胞分别处理 0天、 1天和 2 天。 随后将药物处理的 CCSMCs用 Tr izol裂解， 提取总 RNA， 反 转录成 cDNA ， 用针对 eN0S、 iN0S、 nNOS和 PDE5a特异引物进行 PCR扩增， 通过检测特异 PCR产物反映 mRNA水平。
结果： RT-PCR的结果表明淫羊藿次苷 Π处理阴茎海綿体平滑 肌细胞 1 天和 2 天后能显著增加 nNOS ' mRNA 水平（P<0. 05， P<0. 01) , iNOS也有少许增加（Ρ<0. 05)， 而 eNOS mRNA则无变化。 而 PDE5a mRNA水平显著降低（Ρ<0· 05) . 西地那非处理 1 天和 2 天能显著降低 PDE5a的 mRNA水平（P<0, 05, P<0. 01)， iNOS在 2 天后也有轻微增加， 但在 1天和 2天时均未观察到 eNOS和 nNOS mRNA有明显变化。
2.淫羊藿次苷 Π调节阴茎海绵体平滑肌细胞 N0S亚型和 PDE5 蛋白表达的影响 方法： 阴茎海绵体平滑肌细胞种植至 60mm培养 ，分为淫羊 藿次苷 Π组合西地那非组， 12小时后分别用终浓度 12. 5 μ Μ 淫 羊藿次香 I I和西地那非分别处理细胞分别处理 0天、 1天和 2天。 随后将药物处理的 CCSMCs用 RIPA buffer裂解， 8%SDS-PAGE电 泳， Wes tern blot检测 eNOS等蛋白表达。 经 super ECL发光底 物曝光后， X-光片上的条带经光密度扫描， 与 P -act in校准后绘 成柱形图。
结果： Wes tern blot结果表明 Icari s ide Π处理阴茎海绵体 平滑肌细胞 1天和 2天后， nN0S、 sGC和 PKG的蛋白表达均显著 增加（P<0. 05， P<0. 01)， iNOS 也有所增加（P<0, 05)， eNOS 在 2 天时也有增加（P<0. 05)， PDE5a的蛋白在 1天和 2天时均显著降 低（P<0. 05， P<0. 01)。 西地那非处理能使 PDE5a得蛋白水平显著 降低（P<0. 01)， PKG增加 (P<0. 01)， 但对 eN0S、 iNOS, nNOS 和 sGC无影响。 实施例 7 淫羊藿次苷 I I对勃起功能障碍患者临床效果初步 观察
为了了解淫羊藿次苷 I I 对勃起功能障碍患者临床效果观 察，在 28名性功能障碍为主述并自愿受试者为对象利用国际性功 能评价表 ( Internat ional Index for Sexual Funct ion, I IEF-V ) 进行了安慰剂对照， 二重双盲预备临床实验。 被试者平均年龄为 48+5. 12 岁， 勃起功能障碍发病期间为 3. 42+3. 12年。 其中患轻 度糖尿病 12例， 外伤性 ED 6例。
实验药品淫羊藿次苷 I I提取物（含淫羊藿次苷 I I 51% )制 成胶囊剂 （每胶嚢含淫羊藿次苷 I I 200mg ) ，和安慰剂组包装类 似。 透药者和服药者均不知道药品情报的条件下进行实猃。 被选 的自愿者不随机的分成两组， 淫羊藿次苷 I I胶袭组和安慰剂组， 患者临睡前服用安慰剂或实验药品（1粒/次） ， 连续口服 4周。 患者在服药前和服药完了后分别添写性功能评价询问表 (共 5项， 各项 5度评分）， 比较用药前后的性功能变化通过 Student t test 分析来评价药效。
实验结果，在治疗前受试者性功能评价分数（I IEF5)治疗组和 安慰剂组分别为， 12， 6和 13. 2， 治疗后治疗组和安慰剂组 I IEF5 评分分别为 19. 54±3. 67和 14. 23±2. 97，服用淫羊藿次苷 I I胶囊 组比较安慰剂显著改善勃起功能（p<0. 05)。 总体临床效果淫羊藿 次苷 I I胶囊组和安慰剂组分别为 71. 41%和 41. 48%。 除 3名患者 有轻微的胃肠道反应外未发现明显的副作用。 患糖尿病， 高血压 和心脏病患者在临床效果和副作用方面无显著差异。
结论： 本临床预备试验结果提示， 连续服用淫羊藿次苷 I I 提取物对勃起功能患者的病理性或器质性组织具有改善作用， 进 而对勃起功能障碍具有治疗作用， 临床使用安全。

Claims

1. 淫羊藿次普 II 或含其提取物在制备用于预防或治疗男性 或女性性功能障碍的产品中用途。
2. 一种用于预防或治疗男性或女性性功能障碍的产品， 其包 括淫羊藿次苷 II或含其提取物及栽体或赋形剂。
3. 预防或治疗男性或女性性功能障碍的方法， 其包括将预防 或治疗有效量的淫羊藿次苷 II 或含其提取物给予需预防或治疗 的男性或女性性功能障碍患者。
4. 淫羊藿次普 II或含淫羊藿次苷 II的提取物在制备用于改 善勃起障碍患者的病理性或器质性组织的产品中用途。
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