KR101456953B1

KR101456953B1 - 이카리시드 ｉｉ의 남성 또는 여성 성기능장애의 예방 또는 치료제 제조에서의 용도

Info

Publication number: KR101456953B1
Application number: KR1020117000360A
Authority: KR
Inventors: 종성 신; 화 신; 전지 톈
Original assignee: 비조-바이오메드 엘티디
Priority date: 2008-06-13
Filing date: 2009-06-12
Publication date: 2014-10-31
Also published as: US20110301106A1; EP2305273A1; US8530433B2; EP2305273A4; EP2305273B1; KR20110025961A; WO2009149621A1

Abstract

본 발명은 이카리시드 II와 이카리시드 II 함유 추출물을 남성 및 여성 성기능장애의 예방 및 치료제 제조에 사용하는 용도, 특히 남성 성기능장애 환자에서 기질적 또는 병리학적인 기능부전에 대한 예방 및 치료제 제조에서 사용하는 용도에 관한 것이다.

Description

이카리시드 ＩＩ의 남성 또는 여성 성기능장애의 예방 또는 치료제 제조에서의 용도{USE OF ICARISIDE II IN MANUFACTURE OF PRODUCTS FOR PREVENTING OR TREATING MALE OR FEMALE SEXUAL DYSFUNCTION}

본 발명은 이카리시드 II 및 이카리시드 II 함유 추출물을 남성 및 여성 성기능장애의 예방 및 치료제 제조에 사용하는 용도, 특히 남성 성기능장애 환자에서 기질적 또는 병리학적인 변화에 대한 개선 및 치료제 제조에 사용하는 용도에 관한 것이다.

이카리시드 II는 이미 알려진 화합물이며 그 구조는 다음과 같다:

보고에 따르면, 이카리시드 II는 피부미백효과를 갖고 있다 (WO 2008/035918).

남성 성기능은 일련의 과정으로 구성되며, 여러 가지 성적 자극에 의해 신경계의 조절하에 음경해면체에서 혈액동력학적 변화가 일어나 음경이 발기되는 것을 포함한다. 우선 성적자극이나 성충동이 일어나면 뇌와 척추의 발기조절센터의 조절하에 골반신경을 통해 음경해면체 기능이 조절되는데, 그중 부교감 신경 말초에서 방출되는 아세틸콜린이 혈관내피세포의 산화질소 합성효소 (eNOS)를 활성화시켜 산화질소 (NO)를 생성한다. 또한 비아드레날린성 비콜린성 (Non-adrenergic non-cholinergic; NANC) 신경 말초에서 신경원성 산화질소 합성효소 (nNOS)의 활성을 촉진하여 산화질소 (NO)를 생성하며, 이 산화질소(NO)는 음경 해면체 평활근세포에서 사이클릭GMP (cGMP)의 합성을 촉진한다. 증가된 cGMP는 프로테인 키나제 G(PKG)를 활성화하여 세포 내의 칼슘농도를 감소시켜 음경해면체의 동맥 및 해면체 평활근을 이완시켜 음경해면체동맥을 확장시키고, 해면체 내의 동맥 혈액 유입량의 증가에 의해 해면체가 팽창하고 체적증가에 따라 백막 아래 정맥유출이 차단되고 음경해면체내 압력이 증가되어 발기가 유발된다. 음경 해면체 내에서 생성된 cGMP는 포스포디에스테라제 5(phosphodiesterase 5; PDE5)에 의해 분해되어 활성이 상실되며, 사정시 교감신경의 활동의 증가로 해면체 동맥과 평활근이 수축되어 동맥 혈액 유입량이 급속히 감소시켜 음경이 이완된다. 때문에 음경발기에서 음경해면체의 조직학적 구조와 기능은 정상적으로 음경발기를 유발하는 기본적 원인이 되며, 신경계통의 조절은 음경발기를 유발하는데 중요한 역할을 한다. 또한 음경해면체 및 내피세포의 미세구조와 NO-cGMP 신호전달 통로와 관여되는 유전자 및 단백질 표현 및 활성화가 중요한 역할을 한다.

최근 연구에 의하면, 50 % 이상의 성기능장애 환자에서 중추신경과 말초신경 손상, 고혈압동맥경화증 및 당뇨병 등이 음경 해면체 조직에 병리학적 변화를 일으켜 발기부전을 유발하는 기질적인 원인으로 보고되었다. 연구에 의하면 신경 손상, 당뇨병, 고혈압, 동맥경화 등의 질병으로 유발된 기질적 발기장애의 중요한 병리학적 변화는 음경 해면체 신경의 손상과 기능장애, 음경 해면체 평활근과 내피세포의 손상과 기능장애에 의해 이루어진다. 또한 분자생물학적 연구결과에 의하면 음경해면체내의 NO-cGMP신호전달통로와 관여되는 유전자 및 단백질의 활성 혹은 발현수준과 밀접한 관계를 갖는다. 최근 연구에서 여성 성기능의 기전 또한 남성 성기능 기전과 유사함이 보고되었다.

현재 발기부전의 치료에 있어서, 실데나필 등과 같은 여러 PDE5 활성 억제제 약물들이 성생활에 필요시 복용 되어 발기기능을 증진하는 우수한 효과가 관찰되고 있긴 하나, 약 20% 이상의 중증 발기부전 환자에는 효과가 없으며, 발기부전 환자의 음경조직에 발생하는 병리 생리학적 변화에 치료적 효과가 없다. 또한 홍조, 두통, 시각장애, 저혈압, 요통 등의 부작용을 일으키고, 특히 심혈관 질환이 있는 환자에는 잠재적 위험을 가지며, 또한 질소(Nitrogen) 유사약물을 복용하는 환자는 엄격히 사용이 금지되어 있다. 따라서 파파베린(paparvarin), 펜톨아민(phentolamine), 프로스타글란딘(prostalandin) E1 등 혈관 이완작용이 있는 약물들을 음경 해면체내에 주사하는 요법을 발기부전치료에 사용하고 있으나, 이러한 치료도 20%의 중증 발기부전환자에는 효과가 없으며, 또한 저혈압을 유발하고 두통, 현기증 등 부작용을 발생하고, 국부통증과 지속적인 음경발기 및 음경섬유화 등 부작용을 일으키는 것으로 알려져 임상에서 그 사용이 제한되고 있으며, 발기부전환자의 음경조직의 병리 생리학적 변화에는 치료적 효과가 없다.

현재까지도, 발기부전 환자의 음경 해면체의 신경, 평활근 및 혈관 내피세포의 병리생리학 변화에 치료작용이 있는 치료제는 아직 없다.

최근 연구에서 전통의학 분야에서 정력제로 흔히 사용되는 생약인 음양곽 (Epimedii Herba)은 이카린(icariin), 이카리시드(icarisid) I, 이카리시드 II, 휘발성 오일(volatile oil), 왁스 알콜(wax alcohol), 알칸(alkanes), 피토스테롤(phytosterols), 탄닌(tannins), 리놀레산(linoleic acid) 등 많은 성분을 함유하고 있으며, 또한 마그노플로린(magnoflorin), 에피메도사이드(epimedoside) A, 에피메딘(epimedin) A, B, C, 쿼세틴(querecetin)과 안하이드로이카린-3-O-람노사이드(anhydroicariin-3-O-rhamnoside) 등 여러 가지 성분을 미량으로 함유하는 것으로 밝혀졌다. 그 중 이카린이 음양곽의 주요 악리학적 성분으로 알려져 있다. 이카리시드 II는 음양곽에 미량으로 함유되어 있으나 현재 음양곽 성분연구에서 표준 시약제로 사용되고 있으며, 다른 연구자의 보고에 의하면 이카리시드 II는 피부에 대한 미백효과가 있다. 발명자 등의 이전 연구결과에서 이카리시드 II는 PDE5의 활성을 미약하게 억제하는 효과가 추정되었으나, 실제적으로 발기부전 자원자에서 성생활 전에 이카리시드 II (이카리시드 II 500mg/1회)를 일차적으로 복용하였을 때 비아그라와 같은 유의적인 일차적인 발기부전 치료효과는 관찰되지 않았다. 이러한 결과로부터 이카리시드 II는 PDE5에 대한 억제작용이 너무 미약하여 비아그라와 같이 일차적으로 성생활 전에 복용하여 치료하는 방법으로는 발기부전에 대한 치료효과를 기대할 수 없다고 판단되었다.

본 발명에서, 이카리시드 II (200mg/정/일)를 매일 연속 4주 복용하면 발기부전이 많이 개선되었음을 관찰하였고, 약리학 연구에서도 이카리시드 II가 PDE5를 미약하게 억제하는 효과 외에, 해면체 신경세포의 재생을 촉진시키고 해면체평활근과 혈관내피세포의 NOS 활성과 NOS 효소 단백질 발현을 증가시키며, 이러한 작용은 성장인자(EGFR) 신호통로와 관련 있음을 발견하였다. 때문에 발기부전환자의 병리생리변화에 근본적 치료효과가 있음을 증명하였다.

본 발명은 이카리시드 II 또는 이카리시드 II 함유 추출물을 남성과 여성의 성기능장애 예방과 치료 효과가 있는 제품의 제조에 사용하는 용도에 관한 것이다.

본 발명은 이카리시드 II 또는 이카리시드 II 함유 추출물 및 담체 (vector) 또는 부형제(carrier)를 포함하는 남성과 여성 성기능장애 예방과 치료효과가 있는 제품에 관한 것이다.

본 발명은 유효량의 이카리시드 II 또는 이카리시드 II 함유 추출물을 남성 혹은 여성 성기능장애의 치료 및 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하여, 남성 및 여성 성기능장애를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 이카리시드 II 또는 이카리시드 II 함유 추출물을 성기능장애환자의 기질적 또는 병리학적 변화를 개선하는 제품의 제조에 사용하는 용도에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "제품"은 사람들에 사용할 수 있는 제품으로서, 건강식품이나 약물에 한정되지 않는다.

본 발명에서 용어 "이카리시드 II"는 이카리시드 II 단량체 혹은 이카리시드 II를 함유하는 추출물 또는 혼합물을 지칭하며, 이들 중 이카리시드 II의 함량은 50 중량% 이상이다.

본 발명에서 용어 "담체 또는 부형제" 는 식품 혹은 약제에 사용되는 담체 또는 부형제를 지칭한다.

본 발명은 이카리시드 II과 이카리시드 II를 함유하는 추출물을 남성과 여성의 성기능장애 치료와 예방에 사용하는 용도에 관한 것이다. 연구에 의하면 성기능장애 환자는 심리적 혹은 기질적 성기능장애로 분류되는데 그 중 기질적 성기능장애가 50%를 차지하며, 그 병리학적 변화는 음경 해면체의 신경, 평활근 및 내피세포 손상에 의하여 일어나고, 분자생리학적 기전은 NO-cGMP신호전달 통로와 관여되는 유전자 및 단백질의 활성 혹은 발현수준과 밀접한 관계가 있다. 때문에 음경해면체 신경기능과 평활근기능 및 내피세포 기능장애에 복원작용 있고 또한 NOS 기능 및 NOS 유전자 단백질 발현을 복원하는 약물은 발기부전 환자들에게 예방과 치료목적으로 사용할 수 있다. 본 발명자는 수년간의 연구를 거쳐 이카리시드 II와 이카리시드 II 추출물이 신경세포의 재생을 촉진하고 해면체 평활근과 내피세포 NOS 활성과 NOS 효소 단백질 표현을 증가시키며 성장인자 (EGFR) 신호 경로를 활성화함으로써, 성기능장애 환자의 음경해면체 조직학적 변화를 개선하거나 예방하고, 또는 치료 효과를 가지는 것을 발견했다.

본 발명에 의하면 이카리시드 II 및 이카리시드 II 추출물은 단독으로 사용되거나 또는 다른 약물과 같이 사용할 수 있다. 약물 조합 조성은 활성성분이 있는 이카리시드 II과 이카리시드 II 추출물이나 약물 담체 등이 포함 된다.

본 발명에 의하면 이카리시드 II과 이카리시드 II 추출물은 단독사용이나 다른 약물과 혼합사용으로 발기부전 예방과 치료에 사용할 수 있고 또한 신경손상 질병이나 내피세포 기능장애 환자에 예방이나 치료제로 사용할 수 있다.

본 발명에 의하면 이카리시드 II과 이카리시드 II 추출물은 단독으로 사용하든가 다른 약물과 혼합사용으로 발기부전 예방과 치료에 사용할 수 있고 약물 조합부분에서 활성성분의 이카리시드 II과 이카리시드 II 추출물 함량이 5 mg에서 500 mg 이다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 경구 복용 혹은 장관 흡수 외에 주사 혹은 국소도포를 통해 약물이 흡수될 수 있다. 경구 제형으로는 정제, 츄잉제, 캡슐제, 현탁제, 액제 등이 있고, 비경구 제형으로는 좌제 및 주사제 등이 있다. 국소도포제로는 크림, 연고, 경피 패치, 스프레이 등이 있다.

본 발명에 따른 이카리시드 II 와 이카리시드 II의 추출물은 유기 용매 또는 물과 유기용매의 혼합물로 추출하거나, 또는 효소 생화학 합성법으로 얻을 수도 있다. 사용할 수 있는 유기용매로는 메탄올, 에탄올 등과 같은 알콜, 디클로로메탄, 클로로포름 등과 같은 할로겐화 알칸, 디에틸에테르 등과 같은 에테르, 아세톤 등과 같은 케톤, 아세트산메틸에스테르, 에틸아세테이트 등과 같은 지질, 헥산등과 같은 탄화수소를 포함하며, 소화 효소로는, 예컨대, α 및 β 글루코스 효소를 포함하여, 여러 종류의 당 또는 셀룰로스 가수분해 효소 등이 포함된다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 본 발명은 하기 실시예에 한정되지 않는다.

도 1은 HPLC로 이카리시드 II의 순도를 검증한 것을 나타낸 것이다.
도 2는 노화 쥐에서 골반신경절(MPG) 신경재생에 대한 이카리시드 II의 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 혈관 내피 세포(PAE) NOS 효소활성에 대한 이카리시드 II와 실데나필의 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 이카리시드 II를 처치한 혈관 내피 세포에서 NOS 효소활성에 대한 산화질소 합성효소 저해제 (LNNA)의 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 음경 해면체 평활근에서 NOS 활성에 대한 이카리시드 II 및 실데나필의 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 이카리시드 II로 치료한 음경 해면체 평활근세포에서 NOS 활성에 대한 산화질소 합성효소 저해제 (LNNA)의 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 음경해면체 평활근세포에서 cGMP 합성에 대한 이카리시드 II와 실데나필의 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 이카리시드 II와 실데나필을 처치한 음경해면체 평활근세포에서 cGMP 합성에 대한 SNP의 효과를 나타낸 것이다.
도 9는 NOS 이소형과 PDE5 mRNA 발현에 대한 이카리시드 II와 실데나필의 효과를 나타낸 것이다.
도 10은 NOS, PDE5, PKG 과 sGC 단백질 발현에 대한 이카리시드 II 와 실데나필의 효과를 나타낸 것이다.

실시예 1 이카리시드 II 및 이카리시드 II 함유 추출물의 제조

추출 방법 (1) 이카리시드 II 의 추출

건조한 음양곽 지상 부분 500g을 10L 에탄올로 80℃에서 1 시간씩 세 번 회로 환류 추출하였다. 다음 감압 농축을 통해 에탄올을 회수하고 잔액에 4배 량의 물을 가하여 엽록소 등을 제거하였다. 부탄올로 4번 추출한 다음 감압 농축을 통해 부탄올을 회수하고 농축하였다. 40-60 헤드 폴리아미드 칼럼으로 정제한 다음 30% 에탄올로 용출하고 감압 농축하였다. 70% 에탄올(1:15)로 여러 번 세척하여 이카리시드 II 추출물을 획득하였다. HPLC 분석결과에 의하면 이카리시드 II 함량이 50.2%로 측정되었다.

추출 방법 (2) 이카리시드 II 의 분리와 정제

이카리시드 II 추출물을 메탄올로 용해한 다음 실리카겔에 건조하고 CHCl₃: 메탄올=5 : 1, 4 : 1, 3 : 1, 2 : 1 비율로 실리카 겔 칼럼(8x60cm)에서 스트리핑을 진행하여 농축하였다. 다음 MeOH/H₂O 혼합액으로 세척하여 황색 결정을 얻었다. 결정체는 UV에서 발색하고 폴리(pauly)시약에서 양성반응을 보였다. HPLC 분석결과 이카리시드 II는 순도 99.8 %로 확인되었다 (도 1 참조).

추출 방법 (3) 이카리시드 II 추출물의 추출 및 검출

이카린 50 그람에 소듐 디하이드로겐 포스페이트-디소듐 하이드로겐 포스페이트 완충 용액 (pH 5.5) 과 100 ml β-글루코스를 넣고 40 ℃에서 24시간 가수분해를 진행하여 글루코시드를 제거하였다. 가열을 정지하고 에틸 아세테이트로 반복적으로 추출한 다음 에틸 아세테이트층을 회수하였다. 회수한 용매를 건조후 메탄올용액으로 반복적으로 추출하였다. 회수한 메탄올용액을 HPLC로 분석한 결과 순수한 이카리시드 II 50.1% 임을 확인했다.

추출 방법 (4) 이카리시드 II 추출물의 분리정제 및 검출

이카리시드 II 추출물을 메탄올로 5-8번 반복 추출하여 결정을 얻었다. 취득한 이카리시드 II는 UV에서 발색하며, 폴리 시약에서 양성반응을 보이고 HPLC로 측정한 결과 함량이 99.8%로 측정되었다.

실시예 2 이카리시드 II 의 노화 쥐의 음경 신경에 대한 재생 효과

재료와 방법

실험동물: 24개월 된 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 쥐 24마리: 이 연구에 사용된 실험동물은 동물보호위원회의 승인을 받았다. 소듐 펜토바비탈(200ml/g)를 복강주사하여 쥐를 안락사한 후 복부를 절개하여 전립선 부근의 골반 신경절(MPG)을 분리하였다.

골반 신경절(MPG) 배양과 치료: 완전히 MPG를 분리한 다음 PBS로 세척하여 진일보 분리를 통해 MPG에서 DCR를 취득하여 3조각의 같은 크기로 잘랐다.

얼음 위에서 RGFM을 35mm 페트리 접시에서 3배의 RPMI-1640 배양액에 희석한 다음 소독된 슬립커버에 PGFM를 놓고 37℃에서 페트리 접시에서 1시간 배양하였다. MPG를 40㎕의 RGFM에 넣고 37℃에서 5분간 배양한 다음 3ml의 1 % 페니실린-스트렙토마이신 함유한 RPMI1640 배양액으로 5% CO₂, 37℃ 포화습도 환경에서 배양하였다.

배양한 MPG조직을 각각 대조군(control), 이카리시드 II와 실데나필 처치그룹으로 나누었다. 각 배양액의 약물농도는 0，10，100와 10000 nM로 하였다. 세 젊은 MGP 그룹과 노년 MPG 그룹은 일정 농도에서 48 시간 및 72 시간 배양을 진행하였다.

신경축삭 성장의 측정: 48시간 및 72시간 배양한 다음 니콘 DXM1200 디지털 카메라를 자이스 액시버트 (Zeiss Axiovert) 현미경과 ACT-1 프로그램을 연결해서 20배 배율에서 MPG상에 신경축삭 성장을 관찰하고, 신경축삭 길이는 디지털 이미지 ChemiImager 4000로 측정하였다.

결과

서로 다른 농도의 이카리시드 II (10 nM, 100 nM, 1000 nM)는 노화된 쥐의 MPG상에 신경 축삭 성장을 현저하게 촉진하였다（표 1，도 2 참조). 이카리시드 II（10 nM,100 nM,1000 nM）처치군은 대조군에 비하여 MPG의 신경축삭돌기 성장이 현저히 증가하였다(p<0.01). 반면, 서로 다른 농도의 실데나필은 MPG의 신경축삭돌기 성장에 현저한 효과가 없었다(p>0.05). 이런 결과로부터 이카리시드 II는 우수한 신경재생 효과를 가지고 있으며, 노인, 당뇨병, 고혈압 동맥경화, 신경 손상 등 질병에 의한 발기 기능장애 및 신경 손상적 질병에 예방과 치료효과가 있다고 판단된다. 하기 표 1은 이카리시드 II 및 실데나필의 노화된 쥐에서의 MPG 신경 축삭 성장에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

	대조군(n=9)	이카리시드II (n=9)	실데나필 (n=9)
10nM	122±4.1 nM	295±5.3 nM*	215±2.6 nM
100nM	111±3.3 nM	325±4.1 nM*	238±3.5 nM
1000nM	125±4.2 nM	406±4.3 nM*	219±3.2 nM

*:P Value <0.01

실시예 3 이카리시드 II 의 혈관내피세포 ( PAE ) NOS 효소활성에 대한 영향

재료와 방법

돼지 혈관 내피 세포는(PAE)는 북경대학 비뇨기 연구소에서 제공받았다. 이카리시드 II가 내피세포 NOS 활성에 미치는 영향은 NOS 키트 （Cayman Chemical company, Ann Arbor, MI, USA)로 측정하였으며, 서로 다른 농도(0, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6, 10^-5및10^-4 M)의 이카리시드 II (실데라필 대조군)로 내피세포(PAE)를 처리하였다. 각각에 180 ㎕의 용해(lysate) 버퍼가 추가되었으며, BCA 단백질 키트로 20 ㎕ 상등액에 대해 단백질 농도를 어세이하였다. 또한, NOS 키트(캐어먼 화학사, 앤아버, MI, 미국)로 100 ㎕ 상등액에 대해 NOS 활성을 분석하였다. NOS 활성 (units / mg) = [(value_NOS _-측정시－value_NOS _-블랭크)÷ (38.3 × 106)]×[(2.15 + 상등액의 부피) ÷ (15 × 상등액의 부피)] ÷ [각 페트리 접시의 단백질 농도].

결과

이카리시드 II가 내피세포의 NOS활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 이카리시드 II로 처리 후 NOS의 활성을 측정하였으며, 대조군에는 실데나필을 처리하였다. 그 결과 내피세포(PAE) 중 NOS의 초기 효소활성은 6.03±0.54 u/mg이었다. EGFR를 발현하는 PAE 중 NOS의 효소활성은 8.34±0.83 u/mg이었고, 이카리시드 II 농도가 10^-8 M 일 때 NOS의 활성은 10.71±1.09 u/mg 이며, PAE 세포에서 NOS활성을 활발히 증가시켰다(P<0.05). 이카리시드 II 농도가 10^-6 M 때 NOS 활성은 19.1±1.891 u/mg이었고, 이카리시드 II 농도가 10^-7, 10^-6및10^-5M 때 현저하게 NOS의 활성을 증가시켰다(P<0.01). EGFR를 발현하는 PAE-EGFR 중 이카리시드 II 농도가 10^-8 M 때 NOS활성은 15.37±1.49 u/mg 로서 PAE세포보다 4.66 u/mg 증가 되었다. 이카리시드 II 농도가 10^-7, 10^-6및 10^-5M 때에도 PAE-EGFR세포 NOS 활성이 PAE세포에 비해 현저히 증가하였다(P<0.01).

이 결과는 NOS 활성에 대한 이카리시드 II의 영향이 EGFR 활성화와 관련 있음 교시한다. 이러한 결과는 이카리시드 II는 내피세포에서 NOS 활성을 증가시키나(P<0.05), 실데나필은 내피세포에서 NOS 활성에 유의적인 효과를 나타내지 않음을 보여준다(P>0.05). 상기 결과는 이카리시드 II의 NOS 활성 조절에 대한 영향이 EGFR 활성화와 관련 있음을 교시한다.

NO 합성효소 억제제인 LNNA로 내피세포를 처리하였을 때 PAE 와 PAE-EGFR 중 NOS 활성은 각각 2.74±0.269 u/mg와 3.27±0.319 u/mg로 감소했다. 또한 LNNA (10^-5 M)로 처리했을 때, 이카리시드 II의 내피세포 NOS 활성에 대한 작용을 농도 의존적으로 현저히 감소시켰다(P<0.05). 하지만 실데나필로 처치한 군에서 이러한 변화가 관찰되지 않았다. 이카리시드 II 및 실데나필이 내피세포(PAE) NOS 효소활성에 미치는 영향을 하기 표 2에 나타내었다.

	0	10^-9	10^-8	10^-7	10^-6	10^-5
PAE 이카리시드II	6.03±0.61	8.65±0.87	10.71±0.98	16.46±1.63	19.1±1.9	18.66±1.79
PAE-EGFR 이카리시드II	8.35±0.84	11.72±1.21	15.37±1.51	22.79±2.45	23.91±2.36	22.74±2.27
PAE 실데나필	6.03±0.60	5.76±0.56	5.85±0.579	6.32±0.63	5.99±0.58	6.66±0.65
PAE-EGFR 실데나필	8.35±0.79	8.48±0.85	8.37±0.82	8.53±0.84	8.4±0.84	8.99±0.87

결론적으로 이카리시드 II는 현저하게 내피세포의 NOS활성을 증가시키고 EGFR 발현할 때 현저하게 NOS의 활성을 증가시킨다. 또한 이카리시드 II의 NOS에 대한 활성은 NOS 특이적 억제제에 의하여 억제된다. 이러한 결과로부터 이카리시드 II는 내피세포 기능에 예방과 치료효과가 있고 실데나필은 NOS 활성에 대해 작용이 없는 것으로 나타났다.

실시예 4 이카리시드 II 의 내피세포( PAE ) eNOS 발현 조절에 대한 영향 및 기전 연구

연구배경

연구보고에서 당뇨병으로 인한 음경발기기능장애 환자들에서 음경 해면체 중EGFR과 eNOS의 발현수준은 건강한 사람에 비해 현저히 낮은 것으로 알려졌고 또한 ERK 인산화 감소와 연관이 있다. 이런 결과에서 EGF 신호 경로와 NOS 신호 경로 사이에 혼선(Crosstalk)이 존재하는 것을 확인할 수 있으며, 이는 발기기능장애의 발생과 발전에 중요한 의의가 있다.

연구방법

1. EGFR유전자를 pGFP 플라즈미드에 주입하여 pGFP-EGFR 발현 벡터를 만든다. 이펙턴(Effectene, Qigen사)로 pGFP-EGFR을 PAE세포에 트랜스펙션을 하고 800 ㎍/mL의 G418로 단일 세포 클론을 선택하고 확장 배양하였다. 웨스턴 블롯으로 EGFR의 양성 발현을 검증하고 또한 PAE-EGFR의 안정한 발현 균주(expression strain)를 얻었다.

2. 5×10⁵의 PAE세포와 PAE-EGFR 세포를 35mm 페트리 접시에 분주하고, 12 시간후에 12.5μM 이카리시드 II와 실데나필로 PAE와 PAE-EGFR 세포를 24시간 처리한 후, RIRA 버퍼로 크래킹하고, 8% SDS-PAGE로 전기영동(electrophoresis)을 진행한 다음 웨스턴 블롯으로 eNOS 단백질의 표현을 측정하였다. X-ray로 밀도를 측정한 다음 β-액틴으로 대비하여 결과를 얻었다.

3. 5×10⁵의 PAE 세포와 PAE-EGFR 세포를 35mm 페트리 접시에 분주하고 12시간 후에 12.5μM 이카리시드 II와 실데나필로 단독 혹은 100μg/μL EGF와 함께 PAE와 PAE-EGFR 세포을 24시간 처리하고 RIRA 버퍼로 크래킹하고 8%SDS-PAGE로 전기영동을 진행한 다음 웨스턴 블롯으로 eNOS 단백질표현을 측정하였다.

결과

연구결과 이카리시드 II 로 PAE-EGFR 안정 균주와 불안정 균주를 처리했을 때, eNOS 발현 수준은 1.16 및 2.08로서 PAE-EGFR 안정 균주의 eNOS발현이 불안정 균주에 비해 현저히 증가하였다(p<0.05). 하지만 실데나필로 처리한 안정 균주와 불안정 균주의 eNOS 발현수준은 각각 1.12 와 1.38로서, 비교되는 불안정 균주에 비해 현저한 차이를 보이지 않았다.

결론

연구결과에 의하면 이카리시드 II는 EGFR를 활성화시켜 내피세포의 eNOS 효소 단백질의 발현을 현저하게 증가시키지만 실데나필은 eNOS 효소 단백질의 발현수준에 현저한 변화를 주지 못했다. 이런 결과는 이카리시드 II의 내피세포 eNOS 발현에 대한 효과가 EGFR 시그널 경로를 통하여 일어나는 것을 교시한다.

실시예 5 이카리시드 II 의 음경 해면체 평활근세포 NOS 활성과 세포내 cGMP 의 농도에 대한 영향

1. 이카리시드 II 의 음경 해면체 평활근 세포 NOS 에 대한 효과

실험방법:

분리 배양한 사람의 음경 해면체 평활근 세포(CCSMCs)는 북경대학 남성학과센터로부터 제공받았다. 제3대 CCSMCs 세포를 6웰 플레이트에서 48시간 배양하고 세포를 이카리시드 II 그룹과 실데나필 그룹으로 나누어, 상이한 농도（0, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6 및 10^-5M）로 처리하고 약물 LNNA그룹은 이카리시드 II (0, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6및10^-5 M）와 LNNA (4×10^-4 M) 로 대조그룹은 DMEM으로 24시간 배양하고 세포를 3번 세척하고 매개 웰에 180μl 용해(lysate) 버퍼를 첨가하고 현탁액 60μl를 취하여 BCA 단백질 검출 키트로 단백질 농도를 측정하였다. 현탁액을 100μl 취하여 NOS활성을 측정하였다. NOS 활성 (units / mg 단백질) = [(value _NOS _-측정시－value _NOS _-블랭크)÷ (38.3 × 106)]×[(2.15 + 상등액의 부피) ÷ (15 × S 상등액의 부피)] ÷ [각 웰의 단백질 농도].

실험결과:

약물을 첨가하지 않을 경우에 CCSMCs 중 NOS 활성은 0.46 단위/mg이고 농도가 10^-8M일 때 이카리시드 II는 현저한 효과를 나타내며 (P<0.05), NOS활성은 1.59단위/mg이었다. 농도가 10^-6M일 때 이카리시드 II는 최고 효과를 나타내고 NOS활성은 4.19 단위/mg이었다. 농도가 10^-7, 10^-6 와 10^-5 M일 때 통계학적으로 현저한 차이를 나타내고(P<0.01), 이카리시드 II와 NOS활성은 농도 의존적 관계를 나타냈다.

LNNA 처치한 CCSMCs에서 NOS활성은 평균적으로 0.3 단위/mg 감소했고, LNNA(10^-5M)로 처리했을 때 이카리시드 II 농도가 10^-6 M로 도달하기 전에 여전히 농도 의존적으로 NOS 활성에 영항을 미치는 것으로 관찰되였다. LNNA 처리한 그룹에서는, LNNA로 처리하지 않은 그룹에 비해 NOS활성에 현저한 차이가 관찰되었으며（P<0.05）, NOS 활성이 2.67 단위/mg 감소했고 농도 10^-7, 10^-6 와 10^-5 M에서 통계학적 차이가 있었다. 하지만 실데나필을 처치한 그룹에서의 변화는 통계학적으로 차이를 나타내지 않았다.

2. 이카리시드 II 의 음경 해면체 평활근세포의 cGMP / cAMP 생화학적 효과

실험방법:

분리배양한 사람의 음경 해면체 평활근 세포 (CCSMCs)는 북경대학 남성학과센터로부터 제공받았다. 제3대 CCSMCs 세포를 6웰 플레이트에서 48시간 배양하고 약물그룹을 이카리시드 II 조와 실데나필 조로 하여, 농도 (0, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6, 10^-5 및 10^-4 M)로 4시간 처리하였다; 약물 SNP로 자극한 그룹은 이카리시드 II 그룹과 실데나필 그룹으로 농도 (0, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6, 10^-5, 10^-4M)로 4시간 처리한 후 SNP (10^-5 M)로 30분간 처리하였다. 대조그룹은 DMEM로 처리하였다. 다음 매개 웰에 0.4mL의 0.1M HCl로 실온에서 20분 배양한 후 용해된 세포를 얻었다. 현탁액 60μl를 취하여 BCA 단백질 검출 키트로 단백질 농도를 측정하였다. 현탁액 100μl 취하여 cGMP와cAMP의 농도를 측정하였다. cGMP 혹은 cAMP 농도 [pmol / (mg prot·min)] = [cGMP 또는 cAMP 농도 × 상등액 부피] ÷ 반응시간 × 각 웰당 단백질 농도 × 상등액 부피].

결과

약물을 첨가하지 않은 조건에서 CCSMCs 배양액의 cGMP 와 cAMP 농도는 각각 0.42와 5.16 pmol/ (mg prot·min)이고, 이카리시드 II와 실데나필은 cAMP 농도변화에 영향을 일으키지 못하였다 (p>0.05).

SNP (10^-5 M)로 처리할 때 CCSMs 배양액의 cGMP농도는 2.03 pmol/(mg prot·min)로 4.8배 증가했고 SNP 첨가후 이카리시드 II와 실데나필 그룹에서 농도 의존적으로 cGMP농도가 증가했고 EC₅₀는 각각 1.02 및 0.27μM이었다. SNP 처리와 관계없이 이카리시드 II 와 실데나필은 농도 10^-7 M, 10^-6 M, 10^-5 M 와 10^-4 M 일 때 cGMP농도에 대해 현저한 차이를 나타냈다(P<0.01).

결론

이카리시드 II와 실데나필은 음경해면체 평활근 세포 cGMP 합성에 대해 현저히 증가 효과를 나타냈다. 또한 이카리시드 II의 cGMP 합성효과는 실데나필에 비해 현저히 낮았다. 이카리시드 II 와 실데나필은 cAMP에 대해서는 영향을 주지 못하였다. 이러한 결과는 이카리시드 II가 PDE5 억제와 연관됨을 암시한다.

실시예 6 이카리시드 II 의 음경 해면체 평활근 세포 NOS 유전자와 단백질 발현에 대한 영향

1. 이카리시드 II 의 음경해면체평활근 NOS 와 PDE5a 의 mRNA 발현에 대한 영향

방법: 사람의 음경 해면체 평활근 세포를 60mm 페트리 접시에서 배양하였다. 이카리시드 II 그룹과 실데나필 그룹으로 나누어 12시간 후 농도 12.5μM로 0, 1일, 2일 처리하고 트리졸로 용해를 진행하여 총 RNA를 얻었다. RT-PCR로 eNOS, nNOS와 PDE5a mRNA 을 측정하였다.

결과: RT-PCR의 결과로부터 이카리시드 II로 음경 해면체 평활근 세포를 1일 및 2일간 처리 후 nNOS mRNA는 현저히 증가하였고 (P<0.05, P<0.01), iNOS도 증가하였다(P<0.05), 하지만 eNOS mRNA는 현저한 변화를 보이지 않았고 PDE5a mRNA 는 현저히 감소하였다(P<0.05). 실데나필로 1일 및 2일간 처리 후 PDE5a mRNA는 현저히 감소하고 (P<0.05, P<0.01), iNOS는 48시간 후 미약하게 증가하지만, eNOS와 nNOS mRNA는 1일 및 2일 후에도 변화를 관찰하지 못했다.

2. 이카리시드 II 의 음경 해면체 평활근 NOS 서브타입과 PDE5 단백질 발현에 대한 영향

방법: 음경 해면체 평활근 세포을 60mm 페트리 접시에서 배양하였다. 이카리시드 II 그룹과 실데나필 그룹으로 나누어 12시간 후 농도 12.5μM로 0, 1일, 2일 처리하고 RIPA 버퍼를 이용하여 용해를 진행하였다. 웨스턴블롯으로 eNOS 단백질 발현을 검출하고 X-ray로 밀도를 측정한 다음 β-액틴에 비교하여 결과를 얻었다.

결과: 웨스턴블롯결과 이카리시드 II로 해면체 평활근 세포를 1일 및 2일 각각 처리했을 때 nNOS, sGC와PKG의 단백발현이 현저히 증가했고(P<0.05, P<0.01), iNOS는 미약하게 증가하였으며(P<0.05)，eNOS도 2일 후 증가했으나(P<0.05), PDE5a단백질은 1일 및 2일 처리후 에 현저히 감소하였다(P<0.05, P<0.01). 실데나필은PDE5a단백수준을 현저히 감소시키고(P<0.01)，PKG를 증가시키지만(P<0.01), eNOS, iNOS, nNOS와 sGC에는 영향을 미치지 못하였다.

실시예 7 Icariside II 의 발기기능장애 환자들의 임상효과에 대한 관찰

이카리시드 II의 발기기능장애 환자들에 대한 임상효과을 관찰하기 위하여, 28명 발기기능장애 지원자들을 국제 성적 기능 지표(International Index for Sexual Function; IIEF-V)를 사용하여 플라시보 그룹과 더블 블라인드(double blind)그룹으로 임상실험을 진행했다. 실험자의 평균연령은 48 + 5.12년으로 발기기능장애를 발생한 시간은 3.42 + 3.12년으로 그 중 당뇨병환자는 12명 외상 ED는 6명이었다.

이카리시드 II 추출물 (이카리시드 II 함량 51%)을 캡슐(이카리시드 II 200mg/캡슐)로 제조하고 포장은 플라시보와 비슷하게 하였다. 플라시보 그룹과 이카리시드 II 그룹은 모두 복용 내용물을 모르는 조건에서 실험을 진행하였다. 플라시보 그룹과 이카리시드 II 그룹은 잠자기 전에 플라시보 혹은 이카리시드 II(1알/회) 4주간 복용하였다. 환자는 복용전과 복용후에 IIEF5 평가를 진행하고 Student t test로 효과를 통계처리하였다. 실험결과 치료 전 IIEF5 평가에서 플라시보 그룹과 이카리시드 II 그룹은 수치 12.6 및 13.2를 나타냈고 치료 후 IIEF5 평가에서 19.54±3.67 및 14.23±2.97를 나타냈다. 이카리시드 II를 4주 복용한 그룹은 플라시보를 복용한 그룹에 비해 현저한 발기기능 개선을 가져왔다(p<0.05). 총체적 임상효과에서 이카리시드 II와 플라시브 그룹은 71.41%와 41.48% 효과를 나타냈다. 그중 3명의 환자는 미약한 위장관 반응 외 다른 부작용은 발견하지 못했다. 당뇨병, 고혈압과 심혈관질병 환자들에서 임상효과나 부작용은 현저한 차이를 나타내지 않았다.

결론: 임상실험 결과로부터 연속적으로 이카리시드 II 를 4주 복용하였을 때 발기기능장애 환자들의 성기능을 현저하게 증진효과가 있으며 발기기능장애 환자들의 병리학적 또는 기관조직적인 변화를 개선하는 효과가 있고, 따라서 발기기능장애 환자 치료에 유효하게 사용할 수 있음을 확인할 수 있다.

Claims

이카리시드 II를 포함하는 남성 또는 여성 성기능장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
이카리시드 II 및 담체 또는 부형제를 포함하는 남성 또는 여성 성기능장애 예방 또는 치료제.
유효량의 이카리시드 II를 치료 및 예방이 필요한 인간을 제외한 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 인간을 제외한 동물의 성기능장애의 치료 또는 예방 방법.
제1항에 있어서, 성기능 장애가 발기부전인 약학적 조성물.