JP2008521839A - 大葉（叶）蒟抽出物の調製方法、抽出物及びその応用 - Google Patents

Abstract

【課題】
【解決手段】 本発明は、１種の薬用植物の大葉蒟Ｐｉｐｅｒ ｌａｅｔｉｓｐｉｃｕｍ Ｃ．ＤＣ．の中から抽出、精製抽出物の方法、この方法により獲得した抽出物、及びこの抽出物が５−ヒドロキシトリプタミンと／或いはノルアドレナリンと／或いはドーパミン（再度）摂取の抑制剤として、５−ヒドロキシトリプタミン、ノルアドレナリンとドーパミンなどのモノアミン神経伝達物質と関係ある（精神）疾病方面の医療、保健及び食品添加剤などの領域での応用を公開した。

Description

本発明は、中国産の薬用植物である大葉（叶）蒟Ｐｉｐｅｒ ｌａｅｔｉｓｐｉｃｕｍ Ｃ．ＤＣ．に関する。具体的に言えば、大葉蒟Ｐｉｐｅｒ ｌａｅｔｉｓｐｉｃｕｍ Ｃ．ＤＣ．抽出物の調製方法、及び該方法を利用して調製した抽出物、該抽出物の応用に関している。

５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、ノルアドレナリン（ＮＡ）、ドーパミン（ＤＡ）などのモノアミン神経伝達物質代謝に関する疾病は、すでに人類の健康を妨害する最も主要な病気になっている。ＷＨＯの資料によると、先進国で、それがもたらしてきた疾病総負担は冠状動脈心臓病に続いている。神経精神病は我が国の疾病総負担で首位に並び、およそ疾病総負担の１／５を占めている。例えば、多くのコミュニティや医療研究が、憂鬱と焦慮障害はすべてわりに高い発病率があることを表して、全米合病調査では、１７．３％の普通の人は憂鬱が現れ、２４．５％の人は一生のある時期に焦慮障害を経験したことがあるそうである。これらの研究は、未来で鬱病または焦慮症の悩みに直面する人が多くいると一致して表している。身体障害者、慢性疾病患者、薬物濫用者、アルコール依存者及び独身主義者などいくつかの特殊な人の群れは、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、ノルアドレナリン（ＮＡ）、ドーパミン（ＤＡ）などのモノアミン神経伝達物質代謝に関する疾病の疾病率、発病率はもっと高い。老齢化社会に従い、老人の精神病発病率はますます高くなり、その中は、老年性痴呆、鬱病と／或いは焦慮症が最も際立っている。

高発かつ根治しにくいこの疾患は、すでに巨大な５−ヒドロキシトリプタミンと／或いはノルアドレナリンと／或いはドーパミン（再度）の摂取抑制剤市場を形成した。

大葉蒟の応用に関しては、めったに記録がなくて、「中国植物志」、「中華本草」（２０００版）などに少量の植物学専門について記述がある。「中華本草」において、「この漢方薬材料は性が暖かく、味が辛くて、血行をよくし、腫れを直して痛みを止めるのに用いて、主に捻挫、鬱血、はれ、痛みを治療し、煎じて内服するか酒に浸漬……」という関連記録がある。

発明者は、長年の系統的な研究を経て、実験により、その関連抽出物は著しい憂鬱抵抗活性を持ち、その上、一定の焦慮抵抗、鎮痛及び鎮静などの生物活性を持っていることを発見した。

この前、発明者はすでに２項の大葉蒟と関係がある中国発明特許を申請したことがある。その中、第一項（申請番号は００１１９４５２．６）は大葉蒟及びその抽出物の薬物調製組合物での応用を公布し、第二項（申請番号は０３１１５９１１．７）は１種の大葉蒟有効部位抽出物の調製方法を公布して、この方法によって調整した抽出物は鬱病或いはその他の感情障害性疾病の治療と予防などに用いることができる。

しかし、後続研究の中では、もとの抽出過程中で採用していた逆流法は、加熱、濾過、濃縮などの操作がなければならないので、措置は煩瑣になり、時間がわりに長く、しかも実施するにも一定の難度があることを発見した。もっと重要なのは、逆流法は抽出物の中の有効成分に対する破壊性がわりに大きくて、抽出物の薬理活性と安全性をよくなくするので、改善する必要がある。

本発明の最も重要な目的は、以前の大葉蒟抽出物の調製方法に存在する欠点を克服して、それによって１種の改善された高効率の大葉蒟抽出物の調製方法を提供することにある。抽出過程中での高温加熱が活性成分に対する破壊を免れるだけでなく、また調製技術を簡便で実行でき、操作しやすくなる。
本発明の別の一つの目的は、上述した方法を利用して調製した大葉蒟抽出物を提供することである。
本発明のまた一つの目的は、上述した大葉蒟抽出物の応用を提供することである。

上述の目的を達成するため、本発明の大葉蒟抽出物の調製方法は以下の手順を含んでいる。
まず、大葉（叶）蒟薬材（根、根茎、藤茎、葉と果実又は全草を含む）に前処理をし、それから有機溶剤で常温又は≦７０℃の条件でディップ或いはしみることによって粗抽出物溶液を獲得してから、≦７０℃の条件で濃縮し乾燥して、抽出物を獲得する。

また、上述の手順中の粗抽出物溶液を精製してから、≦７０℃の条件で濃縮し乾燥し、精製した抽出物を獲得することもできる。精製の方法は、大孔吸着樹脂法、ポリアミド柱法、シリカゲル柱法、イオン交換法、エタノール抽出水沈殿法及び酸抽出アルカリ沈殿法などを含んでこれに限らない。

或いは大葉蒟薬材に前処理をした後に直接超臨界流体抽出法（ＳＦＥ）で調整をし抽出物を獲得する。

上述の方法によって獲得する本発明の大葉蒟粗抽出物又は精製抽出物は膏状の半分固体で、粘着、色は薄茶色から黒褐色、水に溶けない。その中に含んでいるアルカロイドは：Ｎ−イソブチル癸−反−２−反−４−ジエンジオレフィン酸アミド、 １−［（２Ｅ， ４Ｅ）−２， ４−癸ジエンジオレフィンアシル基］ ピロリジン、３’、 ４’−メチレン２オキシ桂皮酸−イソブチル酸アミド、５’−メトキシ−３’、 ４’−メチレン２オキシ桂皮酸−イソブチル酸アミド、ピペロニ酸アシドＣ５：１（２Ｅ）、５’−メトキシ−３’、 ４’−メチレン２オキシ桂皮酸−ピロリジンル、４、 ５−２水素ピパーロングミニン、ピペロニ酸アシドなどである。

精製抽出物の有効分量として小ネズミはＥＤ_５０：４．５６ ｍｇ／ｋｇ（ＦＳＴ），３．４９ ｍｇ／ｋｇ（ＦＨＴ）。大ネズミはＥＤ_５０：１．８５ ｍｇ／ｋｇ（ＦＳＴ）。精製抽出物の安全性として小ネズミはＬＤ５０／ＥＤ５０＝１１６−１２４（ＦＳＴ）である。

体外試験及び作用構造試験は、本発明の方法により獲得した大葉蒟抽出物には著しいノルアドレナリン（ＮＡ）と／或いは５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）と／或いはドーパミン（ＤＡ）（再度）の摂取抑制作用を持ち、その上、従来の逆流法によって調整した抽出物と比較したら、アルカロイドの含有量及び抽出物の生物活性を高めたなどの優位を持っていることを表している。そのため、本発明による大葉蒟抽出物は、ノルアドレナリン（ＮＡ）と／或いは５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）と／或いはドーパミン（ＤＡ）（再度）の摂取抑制剤として、憂鬱抵抗薬、焦慮抵抗薬、鎮静催眠薬及び老年性痴呆抵抗薬などに開発される可能性がある。そのため、薬品、健康食品或いは食品添加剤の成分または部分成分として、精神分裂症、躁病、心境障害、沈黙症、器質的精神症候群、強迫症、鬱病、焦慮症、睡眠障害、てんかん、パーキンソン病、頭痛、神経痛、老年性痴呆などＮＡ、５−ＨＴ、ＤＡなどの神経伝達物質代謝不調と関係がある（精神）疾病の治療と／或いは予防にすることができる。

次は、具体的な実施例を用いて、本発明についてさらなる説明を行う。下記の実施例は当発明の説明に用いているが、本発明の範囲を制限するものではない。

大葉蒟抽出物の調製
表１により、それぞれ大葉蒟の根、根茎、藤茎、葉と果実或いは全草を取って、大葉蒟抽出物を調製する。具体的には次の通りである。

サンプル１−１：大葉蒟の乾燥している根と根茎を１ｋｇ取り、段状に切って、約９０％アルコールをプラスし、常温で約４８時間浸漬してから、２０Ｌ（リットル）まで同等濃度のアルコールをプラスして、濾過によって粗抽出物を獲得し、濾過液にぬるま湯を１５Ｌプラスし平均に攪拌し混じって、それから希釈された濾過液を、Ｄ１０１大孔吸着樹脂（天津市大鈞科技開発有限公司樹脂支社）の配したガラス柱に注入し、該柱から注出した後は順次に４０％、９０％のアルコールで洗い、９０％のアルコール洗脱液を収集して、≦７０℃の濃縮、乾燥を経て精製した抽出物を獲得する。

サンプル１−２：大葉蒟の根と根茎を１ｋｇ取って段状に切り、約８０％のアルコールをプラスし、常温で約４８時間浸漬してから、１０Ｌまで同等濃度のアルコールをプラスし、微熱で５０℃まで加熱し、熱濾過により粗抽出物を獲得する。それから粗抽出物溶液を６０℃真空で２Ｌまで濃縮し、そして１０Ｌまで４０％のアルコールをプラスし平均に攪拌する。それから溶液を、ＨＰＤ１００大孔吸着樹脂（河北宝恩生物科技有限公司）の配したガラス柱に注入し、該柱から注出した後は順次に５０％、８０％のアルコールで洗い、８０％のアルコール洗脱液を収集して、≦７０℃の濃縮、乾燥を経て精製した抽出物を獲得する。

サンプル２：大葉蒟の藤茎と葉を１ｋｇ取り、粉末にして、約９０％のアルコールをプラスし、常温で約２４時間浸漬してから、１６Ｌまで同等濃度のアルコールをプラスし、濾過により粗抽出物溶液を獲得する。それから粗抽出物を６０℃で総体積の１／３まで減圧し濃縮して、等量の生水をプラスし攪拌して、３日冷蔵してから沈殿物に濾過し、最後に≦７０℃の濃縮、乾燥を経て精製した抽出物を獲得する。

サンプル３：大葉蒟の全草を１ｋｇ取り、段状に切って、０．５％の酢酸溶液を１０Ｌプラスし、２４時間浸漬してから、濾過により粗抽出物を獲得する。それから２％のアンモニア水を２Ｌプラスしてそっと揺動してから、クロロフォルムをプラスし抽出をして、抽出液を≦７０℃の濃縮、乾燥を経て精製した抽出物を獲得する。

サンプル４：大葉蒟の根と根茎を１ｋｇ取り、段状に切って、５５％のアルコールをプラスし常温で約２４時間浸漬してから、２０Ｌまで同等濃度のアルコールをプラスし、微熱で６０℃まで加熱し、熱濾過により粗抽出物を獲得する。濃縮し乾燥してからシリカゲル（シリカゲルＨ、山東青島海洋化工集団公司）の配したガラス柱に注入して分離し、順次にシクロヘキサン−酢酸エチル及び石油エーテル−アセトンをガラス柱に流して互いに洗い、石油エーテル−アセトンの１０：１〜２：１部分の流出液を収集し、≦７０℃の濃縮、乾燥を経て精製した抽出物を獲得する。

サンプル５：大葉蒟の根と藤茎を１ｋｇ取り、粉末にして、エーテルを５Ｌプラスし、密封して常温で約２４時間浸漬し、それから抽出液を収集して、３回繰り返す。抽出液を合併しエーテルを回収して、それからアセトンで溶解し、ポリアミド（湘潭市昭潭化学製品工場）の配したガラス柱に注入処理して、≦７０℃の濃縮、乾燥を経て精製した抽出物を獲得する。

サンプル６：大葉蒟の根と根茎を１ｋｇ取り、段状に切って、０．５％の酢酸水を５Ｌプラスして２４時間冷却して浸漬してから、≦７０℃条件の下で口を開いて微熱で加熱し、それから水溶液を、イオン交換（７３２陽イオン交換樹脂、鶴壁市向陽樹脂工場）樹脂の配したガラス柱に注入して交換処理をし、集結した後で２％のアンモニア水で洗脱し、洗脱液を≦７０℃の濃縮、乾燥を経て精製した抽出物を獲得する。

サンプル７：大葉蒟の根と藤茎を１ｋｇ取り、粉末にして、クロロフォルムをプラスし、密封して常温で約２４時間浸漬し、それから１０Ｌまでクロロフォルムをプラスし濾過により粗抽出物を獲得する。クロロフォルムを回収してから直接に≦７０℃の濃縮、乾燥を経て精製した抽出物を獲得する。

サンプル８：大葉蒟の全草を１ｋｇ取り、粉末にして、適量の酢酸エチルをプラスし常温で約２４時間浸漬してから、１０Ｌまで酢酸エチルをプラスして粗抽出物を獲得する。酢酸エチルを回収してから、アルコールをプラスして溶解し、それからアルコール溶液を、Ｄ８６００２１大孔吸着樹脂（山東魯抗医薬株式有限公司）の配したガラス柱に注入し、かつ注出して精製し、順次に４０％、９０％のアルコールで洗脱し、９０％のアルコール洗脱液を収集し、≦７０℃の濃縮、乾燥を経て精製した抽出物を獲得する。

サンプル９：大葉蒟の根を１ｋｇ取り、段に切って、０．５％アンモニア水を２Ｌプラスして２４時間浸漬し、エーテルをプラスし３回抽出して、抽出液を合併しエーテルを回収して、≦７０℃の濃縮、乾燥を経て精製した抽出物を獲得する。

サンプル１０（対比）：大葉蒟の根と根茎を１ｋｇ取り、大きい粉にして、６０％のアルコールをプラスして２回水浴び逆流をし、濾過し濾液を合併して、原の濾液体積の１４％まで濃縮して、そして３０％のアルコール溶液をプラスして透明しなく、澄ましてまばらな溶液を獲得する。それから大孔吸着樹脂の配したガラス柱で分離し精製して、順次に４０％、５５％、８０％のアルコールで洗脱し、８０％のアルコールの洗脱液を収集して、濃縮、乾燥を経て有効部位の抽出物を獲得する（出願番号０３１１５９１１．７の中国特許出願の実施例１によって操作する）。

サンプル１１：大葉蒟の全草を取り、超臨界抽出法によって抽出物を調製する。具体的には次の通りである。
大葉蒟薬材を取り、大きい粉にして抽出缶に詰めて、それぞれの抽出分離缶を予定の状態まで加熱し、圧力を予定値まで上がってから、流動抽出を始める。一回ごとに材料を２００ｇ投入し、採用される抽出条件は：圧力３０ＭＰａ、温度４０℃、抽出時間２ｈｒ、ＣＯ_２流量の２０ ｍ^２／ｈ。分離缶が減圧バルブを通して常圧まで減圧し、獲得した物が抽出物である。

大葉蒟抽出物の薬物調製への応用
実施例１によって獲得した大葉蒟抽出物を薬物の原料として、薬学分野の常規生産方法によってカプセル剤、錠剤、粒剤、散薬、ピルス、微丸、注射剤、粉注射薬、内服液調合剤、持続リリース調合剤、コントロールリリース調合剤、標的調合剤などに調製できる。各薬剤の形の生産方法は現有技術の常規方法に属していることにかんがみて、本実施例では実施例１によって獲得した大葉蒟精製抽出物のサンプル１−１を例にして、カプセル剤、粒剤と錠剤だけを調製する。

２．１、カプセル剤
− 処方：
大葉蒟抽出物１０ｇ、トウモロコシ澱粉 ８０ｇ、ステアリン酸マグネシウム ８ｇ、酸化防止剤 ２ｇ。
− 調製方法：
抽出物とでんぷん、ステアリン酸マグネシウム、酸化防止剤を平均に混合し、ふるいにかけて、平均的に予め支度された１０００粒の空カプセル中に入れ、口を閉めて出来上がる。一粒ごとに入れる材料の重さは１００ｍｇ、その中、精製抽出物の量は１０ｍｇとする。

２．２、粒剤
− 処方：
大葉蒟抽出物２０ｇ、可溶性澱粉 ３８０ｇ、デキストリン２００ｇ。
− 調製方法：
抽出物、可溶性澱粉及びデキストリンを平均に混合して大きい片で押し、それから粒を整え、ふるいにかけて、乾燥して、分けて１０００袋に詰める。

２．３、錠剤
− 処方：
大葉蒟抽出物３０ｇ、澱粉 １００ｇ、デキストリン ３０ｇ、蔗糖２０ｇ、タルク１２ｇ、ステアリン酸マグネシウム５ｇ、酸化防止剤３ｇ。
− 調製方法：
抽出物を乾燥する前に澱粉、糊精、蔗糖をプラスして、顆粒にし、乾燥してからタルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化防止剤をプラスし平均に混じり、１０００粒におさえて、衣服を包んで出来上がる。

体外の５−ヒドロキシトリプタミン及びノルアドレナリン、ドーパミン再度摂取に対する抑制作用
研究によると、シナプスの中のノルアドレナリンの除去及び消滅について、最も主要な生理構造は末梢神経の再摂取であり、コカイン、いくつかのベンゼンエチル・アミン類の化合物と憂鬱抵抗薬は全てその再摂取過程を抑えることができて、憂鬱抵抗薬がアドレナリン受体降下を引き起こす最も重要な構造である。５−ヒドロキシトリプタミン及びドーパミンの神経機能の生理構造は５−ヒドロキシトリプタミンと相似の場所がある。臨床では、多くの効き目がある憂鬱抵抗薬はノルアドレナリンと／或いは５−ヒドロキシトリプタミンと／或いはドーパミンの再摂取を抑えることができる。本実験は、化合物が大きいネズミの脳シナプスの再摂取機能を抑えられるかどうか及び憂鬱抵抗薬などのモノアミン神経伝達物質（再度）摂取抑制剤にする潜在価値の検査・測定に用いられる。
まず、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒなどの方法（のＷｈｉｔｔａｋｅｒ ＶＰ ＆ Ｂａｒｋｅｒ ＬＡを参考にします． Ｔｈｅ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ． Ｉｎ： Ｆｒｉｅｄ Ｒ． ｅｄ． Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｍａｒｃｅｌ Ｄａｋｋｅｒ， Ｉｎｃ， １９７２）を参考にして脳シナプスを調製し、具体的は次の通りである。大きいネズミの首を切断した後、迅速に大脳を取り出し、予冷した生理食塩水に置いて、軟脳膜と血管組織を取り除く。大脳皮質を取って、冷蔗糖溶液に入れる。超音波細胞粉砕器でホモゲネート、遠心をし、精製した脳シナプスを得て置く。
「現代医学実験方法」（汪謙 編集長、北京人民衛生出版社、１９９７）と「現代薬理実験方法学」（張均田 編集長、北京医科大学中国協和医科大学聯合出版社、１９９８）の方法を参考し、まず試験管の中にＴｒｉｓ−Ｋｒｅｂｓ緩衝液を入れ、それからシナプス小体懸液を入れて、それから大葉蒟抽出物（サンプル番号１−１）を１０μｌ入れて、平均に混合し、３７℃の水浴で暖かく浴びる。４℃の環境で１０μｌの底物（^３Ｈ−^５ＨＴ、^３Ｈ−ＮＡ或いは^３Ｈ−ＤＡ。終反応濃度：３００ｎＭ）をプラスし、平均に混じり、３７℃の水浴で５ｍｉｎ暖かく浴る。それから、試験管ごとに予冷されたＴｒｉｓ−Ｋｒｅｂｓ緩衝液を入れて反応を停止し、そして迅速に多端細胞収集器でガラス繊維濾過膜を通じて抽出濾過し、また、同等体積の相同溶液で試験管と濾過器を洗い流す。濾過膜を取り外して火あぶりをして、濾過膜を明滅瓶内に入れ、トルエン明滅液を入れて、β−液明滅カウンターで数を数え、結果は表３の通りである。

表３の結果によって、正常体温（３７℃）で（この条件で、それぞれのモノアミンに対する摂取は正常で、自発的な摂取である）の３種類モノアミンの再摂取量値（ＣＰＭ値）と比べて、本発明による大葉蒟抽出物は０．０６４μｇ／ｍｌの濃度を超えた場合、すぐ３種類のモノアミンの自発的摂取に対する抑制作用が現して（ＣＰＭ値が正常値より低い）、４０μｇ／ｍｌの濃度では、完全に脳シナプスの５−ＨＴに対する摂取を抑制し、その作用は０．１ｍＭのフルオキセチンと相当する。濃度が約２００〜１０００μｇ／ｍｌに増加された場合、ＣＰＭ値は０℃におけるＣＰＭ値より低くて、シナプスが５−ＨＴに対する非特異性拡散も抑えられて、そのＩＣ_５０は４．２μｇ／ｍｌ（終反応濃度）。また、そのＮＡに対する抑制作用はもっと強くて、ただ１．６μｇ／ｍｌの場合にさえほとんど完全に脳シナプスのＮＡに対する摂取を抑制し、その作用強度は０．１ｍＭのデシプラミンと相当する。同様で、濃度が約２００μｇ／ｍｌ以上に増加される場合、シナプスのＮＡに対する非特異性拡散も完全に抑えられて、そのＩＣ_５０は０．３４μｇ／ｍｌ（終反応濃度）。受験薬物ＡのＤＡに対する抑制作用は５−ＨＴとＮＡ間に介在して、そのＩＣ_５０は１．１μｇ／ｍｌ（終反応濃度）。

そのため、本発明による大葉蒟抽出物は、大きいネズミの脳シナプスの５−ＤＡＨＴ、ＮＡ（再度）摂取に対して明らかな抑制作用があり、５−ヒドロキシトリプタミン、ノルアドレナリンとドーパミンなどのモノアミン神経伝達物質代謝と関係ある（精神）疾病を治療と／或いは予防する薬物、健康食品又は食品添加剤の調製に用いられる。

５−ヒドロキシトリプタミン酸に誘導される小ネズミの頭振り行為
５−ヒドロキシトリプタミン酸（５−ＨＴＰ）は５−ＨＴの前体物質で、モノアミン酸化酵素抑制剤であるパルギリンはその代謝を抑えることができ、その上憂鬱抵抗薬を与えれば、小ネズミの特徴性病状の頭振り行為を観察できる。

小ネズミをランダムにグループに分け、各グループは表４に示している相応分量によって胃に薬を与えて、受験薬物Ａは実施例で獲得した大葉蒟抽出物のサンプル１−１である。毎日一回、７日続いて薬を与えて、同時に生理食塩水で対照する。最後の一回で薬を与えた１時間の後、４グループのすべての小ネズミに塩酸アパルシリンを皮下注射し、９０ ｍｉｎの後ですべての小ネズミに５−ＨＴＰを尾静脈注射をして、給薬後の動物の反応を観察し記録して、結果は表４の通りである。

表４の結果は、５−ＨＴＰ を１５ｍｉｎ与えた後、小ネズミは異なった程度の頭振り反応が現れ、その中、分量は２０ｍｇ／ｋｇのグループの頭振り病状が最も明らかで、しかも陽性反応を現れた動物数が最も多く、空白対照グループの病状が最も軽い。２ｈｒの後、空白対照グループは皆正常に回復し、３つの分量の受験薬物Ａを与えられたグループは依然として異なる程度の頭振り病状があると表明しました。本発明による大葉蒟抽出物は、５−ＨＴＰに誘導される小ネズミの頭振り行為を強めることができ、それによって体内でその５−ＨＴ摂取の抑制作用を検証した。

小ネズミヨヒンビン増強モデル
ヨヒンビンはα_２受体拮抗剤であるため、α_２受体と結合することができ、それによってＮＡの受体との結合を阻止した。ＮＡの再度摂取とＮＡの活性失いを抑制する憂鬱抵抗薬は、ヨヒンビンと共同使用したらＮＡの濃度を増加するため、動物を中毒させて死亡させることができる。そのため、本実験の目的が体内実験を通して本発明による大葉蒟抽出物のＮＡの再摂取を抑制する作用を検証する。

小ネズミをランダムにグループに分け、各グループは表５に示している相応分量によって胃に薬を与えて、受験薬物Ａは実施例で獲得した大葉蒟抽出物のサンプル１−１である。毎日一回、７日続いて薬を与えて、同時に生理食塩水で対照する。最後の一回で薬を与えた１時間の後、４グループのすべての小ネズミにヨヒンビンを皮下注射し、ヨヒンビンを与えた１、２、４、５と２４時間の各グループの動物の死亡率を観察し記録して、結果は表５の通りである。

各グループの動物にヨヒンビンを与えた２０ ｍｉｎの後、皆異なる程度の中枢神経系の興奮性向上の現象が現れ、表現は短気、筋肉震えなどの病状で、一部で小ネズミは鼻血があり、２０ ｍｇ／ｋｇのＡＤＰグループの動物は最も反応が強烈である。表５の結果によって、１時間後、２０ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇの受験薬物Ａ分量のグループに死亡の発生があると示している。本発明による大葉蒟抽出物はヨヒンビンの毒性作用を強めることができると説明して、それによって体内で本発明による大葉蒟抽出物のをＮＡの摂取抑制作用を検証した。

小ネズミ脳内におけるモノアミンオキシダーゼに対する抑制作用
モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）の生物学作用は体内の内因性アミン（ノルアドレナリン、ドーパミン及び５−ヒドロキシトリプタミン）と外因性アミンの物質レベルを調節することである。その底物と抑制剤の特異性によって、モノアミンオキシナーゼを２つのタイプ（ＭＡＯ−Ａ、ＭＡＯ−Ｂ）に分けられる。ドーパミンとチラミンは２種類のＭＡＯ底物であり、５−ＨＴとノルアドレナリンはＡ型底物で、b−ベンエチラミンとベンジルアミンはＢ型底物で、イソプロピル・リミフォンとトラニルシプロミンはＭＡＯの非選択性抑制剤である。ｃｌｏｒｇｙｌｉｎｅはＭＡＯ−Ａの選択性抑制剤で、ｄｅｐｒｅｎｙｌとパルギリンはＭＡＯ−Ｂの選択性抑制剤である。ＭＡＯ抑制剤は憂鬱抵抗の作用があるので、本抽出物の憂鬱抵抗作用構造をできるだけ多く了解するため、それに対してＭＡＯ作用を抑制するかどうかの研究をしなければならない。
小ネズミをランダムにグループに分け、各グループは表６に示している相応分量によって胃に受験薬物Ａ（実施例１のサンプル１−１）を与える。毎日一回、１４日続き、同時に生理食塩水で対照し、陽性対照はアパルシリンとする。最後の一回で薬を与えた１時間の後、頸椎を脱いで動物を殺し、迅速に脳を取って置き、ＭＡＯ活性を測るのに用意する。鄭莉などの方法（貫葉連翹抽出物のモノアミンオキシダーゼとモノアミン神経伝達物質に対する影響、中国薬科大学学報、２００２、３３（２）：１３８−１４１）によって紫外分光光度計で光の密度値を測定し、結果は表６の通りである。

表６の結果によって、受験薬物Ａの３つの分量グループは小ネズミ脳内のＭＡＯ−ＡとＢの活性に対してすべて抑制作用がないと表している。本発明による大葉蒟抽出物の憂鬱抵抗作用はＭＡＯ−ＡとＢの活性と関係がないと説明している。

小ネズミの水泳試験
Ｐｏｒｓｏｌｔなどが提出した行為絶望試験は、憂鬱抵抗薬作用の評価モデルにすることができる。このモデルでは、小ネズミ或いは大ネズミを１つの制限されて逃げ出されない空間に置いて泳がせ、動物を誘導して動かない状態を現すことができる。この状態は動物の絶望行為を反映して、この状態はいくつかの効き目がある憂鬱抵抗薬に抑制られることができる。

表７に示しているように、小ネズミをランダムにグループに分け、各グループにそれぞれ示した分量によって薬Ａ（実施例１のサンプル１−１）、Ｂ（実施例１のサンプル１０）、Ｃ（実施例１のサンプル７）、Ｄ（実施例１のサンプル３）、Ｅ（実施例１のサンプル５）、Ｆ（実施例１のサンプル９）とＧ（実施例１のサンプル１１）を胃に給薬し、毎日一回、１４日続き、同時に生理食塩水で対照とし、陽性対照はフルオキセチンとする。１４日目に薬を与えた１時間の後、動物を１０×２０ｃｍ、水深８〜１０ｃｍのガラス円筒内に置いて、水温は２２〜２４℃とする。第２分間から、４分以内の動かない累計時間を記録して、結果は表７の通りである。

結果は、フルオキセチンと受験薬物Ａの２０、１０と５ｍｇ／ｋｇの３つの分量のグループは皆明らかに小ネズミの水泳の時の動かない時間を短縮し、空白対照と比較したら、Ｐ値は皆０．０１より小さくて、５ ｍｇ／ｋｇの分量でさえ良好なの憂鬱抵抗作用を表して、しかもその薬の効果は良好な量−効果の関係が現れている。受験薬物のＣ−Ｇが３０ｍｇ／ｋｇの分量で受験薬物Ａの活性と相当し、同時に同等分量の受験薬物Ｂより明らかに優れている。

以上から、本発明による大葉蒟抽出物（受験薬物Ａ、Ｃ−Ｇ）はもっと著しい憂鬱抵抗作用を持ち、しかも濾過によって精製した抽出物の活性は、明らかに現有の逆流技術により調製して得た大葉蒟抽出物（受験薬物Ｂ）より高いことをわかることができる。

大ネズミの水泳試験
大ネズミを４ｈｒ断食させた後、４０×１８ｃｍ、水深１５ｃｍ（水温２５℃）のガラス円筒内に１５ｍｉｎ水泳をさせて、水泳の後は熱ドライヤーで吹き乾す。それから表８に示し手いるように大ネズミをランダムに６グループに分け、各グループは表８によって相応分量の薬Ａ（実施例１のサンプル１−１）、Ｂ（実施例１のサンプル１０）を胃に入れて、毎日一回、１４日続き、そして生理食塩水で対照とし、陽性対照はベンラファシンとする。最後の一回に薬を与えた１ｈｒの後、大ネズミの水泳試験を行い、水泳の持続時間は５ｍｉｎとし、５ｍｉｎ内の水泳を停止して動かない時間を記録し、結果は表８の通りである。

結果によると、ベンラファシンと受験薬物Ａの１０、５と２．５ｍｇ／ｋｇの３つの分量のグループは皆明らかに大ネズミの水泳を停止して動かない時間を短縮し、空白対照グループと比較して、Ｐ値は皆０．０５より小さく、２．５ ｍｇ／ｋｇの分量でさえ良好なの憂鬱抵抗作用を表して、しかもその薬の効果は良好な量−効果の関係が現れている。

対比によると、本発明による大葉蒟抽出物（受験薬物Ａ）の分量が２．５ｍｇ／ｋｇにある時の生物活性は、受験薬物Ｂ（逆流法調製）の２０ｍｇ／ｋｇより明らかに高いことを発見して、本発明の濾過精製調製技術により獲得した大葉蒟抽出物の生物活性は明らかに逆流技術調製によって獲得した大葉蒟抽出物（受験薬物Ｂ）より高いと示している。

小ネズミの尾掛け試験
尾掛け試験はＳｔｅｒｎなどが１９８５年に紹介した憂鬱抵抗薬を評価する簡単で行いやすい実験方法である。逃れられないストレス条件で、齧歯類動物が表した動かない状態はその行為絶望を反映し、人類の憂鬱状態を模擬できる。臨床で有効な憂鬱抵抗薬は、小ネズミが尾を掛けられた後に、努力しても逃れられない場合の動かない時間を減らすことができる。

小ネズミをランダムにグループに分け、各グループに相応の分量によって薬Ａ（実施例１のサンプル１−１）、Ｂ（実施例１のサンプル１０）、Ｃ（実施例１のサンプル７）、Ｄ（実施例１のサンプル３）、Ｅ（実施例１のサンプル５）を胃に入れ、毎日一回、１４日続き、そして生理食塩水を対照とし、陽性対照はベンラファシンとする。最後の一回に薬を与えた１ｈｒの後、小ネズミの尾掛け試験を行い、持続時間は６ｍｉｎとし、６ｍｉｎ内の静止で動かない時間を記録して、結果は表９の通りである。

結果によると、ベンラファシンと受験薬物Ａの２０、１０、と５ｍｇ／ｋｇの３つの分量のグループは皆明らかに小ネズミの停止して動かない時間を短縮し、空白対照グループと比較したら、Ｐ値は皆０．０５より小さく、３つの分量のグループの薬効果強度の違いが明らかではなく、５ ｍｇ／ｋｇの分量でさえ良好なの憂鬱抵抗作用を表して、しかもその薬の効果は良好な量−効果の関係が現れている。３つの分量グループの受験薬物Ａの薬効果強度は５０ｍｇ／ｋｇのベンラファシンより少し弱いが、統計学での著しい相違がない。受験薬物Ｃ−Ｅは２０ｍｇ／ｋｇの分量での活性は受験薬物Ａと相当し、同時に明らかに同等分量の受験薬物Ｂより優れている。

対比によると、本発明による提出物（例えば受験薬物Ａ）の分量が２．５ｍｇ／ｋｇにある時さえ、生物活性が受験薬物Ｂの２０ｍｇ／ｋｇより高いことを発見した。本発明の濾過精製調製技術により獲得した抽出物の生物活性は、明らかに以前の特許０３１１５９１１．７の逆流に関する技術により獲得した抽出物（受験薬物Ｂ）の活性より明らかに高いと示している。

焦慮抵抗作用−小ネズミ４板試験
小ネズミをランダムにグループに分け、それぞれ表１０によって受験薬物Ａ（実施例１のサンプル１−１）、Ｂ（実施例１のサンプル１０）、Ｃ（実施例１のサンプル７）、Ｆ（実施例１のサンプル９）とＧ（実施例１のサンプル１１）を与え、そして生理食塩水を対照とし、陽性対照グループはジアゼパムとする。給薬３０ｍｉｎの後、小ネズミを板の上に置き、それに１５ｓ探究させる。それから、小ネズミが一つの板から別の一つの板まで一回またがると、電撃を与え、電流強度は０．３５ｍＡ、０．５ｓを続ける。小ネズミがそのため明らかな逃れる反応を生じて、通常２つの板或いは３つの板を横切る。もし小ネズミが引き続き走るならば、その以後の３ｍｉｎは電撃しない。１０ｍｉｎ内の電撃回数を記録して、結果は表１０の通りである。

表１０の結果によると、電撃は小ネズミの運動活性を著しく減らすことができ、ジアゼパムと本発明による大葉蒟抽出物（受験薬物Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ）は電撃回数を高めることができて、本発明による大葉蒟抽出物はより強い焦慮抵抗作用を持ち、しかも同等分量で生物活性は現有の逆流技術調製により獲得した大葉蒟抽出物（受験薬物Ｂ）より高いと示している。

鎮静作用−開闊法試験
小ネズミをランダムにグループに分け、それぞれ表１１によって受験薬物Ａ（実施例１のサンプル１−１）、Ｃ（実施例１のサンプル７）とＢ（実施例１のサンプル１０）を給薬し、同時に生理食塩水を対照とし、陽性対照グループはカバラクトネスとする。３０ｍｉｎの後、小ネズミを高３５ｃｍの円柱形箱内に入れ、箱底を平均的に辺の長さが５ｃｍの正方形格子に区分する。小ネズミが環境に適応した３ｍｉｎの後、第４ｍｉｎからそれ以後の５ｍｉｎ内の小ネズミが這った格子数を記録して、結果は表１１の通りである。

表１１の結果によると、カバラクトネスと本発明による大葉蒟抽出物は皆小ネズミの格子を這う回数を減らすことができて、本発明による大葉蒟抽出物（受験薬物Ａ、Ｃ）はより強い鎮静作用を持ち、しかも生物活性は現有の逆流技術調製により獲得した大葉蒟抽出物（受験薬物Ｂ）より高いと示している。

鎮痛作用−変体試験
一定の溶剤と濃度の化学刺激物質を小ネズミの腹腔内を注ぎ込み、臓層と壁層の腹膜を刺激し、深い部のわりに大きい面積の長時間炎性疼痛を引き起こして、小ネズミに腹部へこみ、胴と後肢が広げ、臀部が高くなるなどの行為を反応させるのを、変体反応と称する。この反応は注射後１５ｍｉｎ内に出現する頻度が高いため、注射後１５ｍｉｎ内の発生した変体回数又は反応が発生したネズミの数量を疼痛の定量指標とする。

小ネズミをランダムにグループに分けて、それぞれ表１２によって受験薬物Ａ（実施例１のサンプル１−１）、Ｃ（実施例１のサンプル７）とＢ（実施例１のサンプル１０）を給薬し、同時に生理食塩水を対照として、陽性対照グループはアセチル・サリチル酸とする。３０ｍｉｎ．後、それぞれ０．０２％のキノン水溶液を０．２０ｍｌ腹腔注射してから、直ちに小ネズミを周りが閉鎖した箱内に入れ、小ネズミが現れた第１回の変体反応から、１０ｍｉｎ続いて、１０ｍｉｎ内の小ネズミ変体回数を記録し、結果は表１２の通りである。

表１２の結果によると、アセチル・サリチル酸と本発明による大葉蒟抽出物（受験薬物Ａ、Ｃ）は皆明らかに小ネズミ変体回数を減らすことができ、本発明による大葉蒟抽出物はより強い鎮痛作用を持って、しかも生物活性は現有の逆流技術調製により獲得した大葉蒟抽出物（受験薬物Ｂ）より高いと示している。

この前で出願者が申請した申請号はそれぞれ００１１９４５２．６と０３１１５９１１．７の中国特許出願の中に公開した大葉蒟抽出物について、逆流法を採用して調整するため、その過程中に採用した相対的な高温操作は抽出物の中の活性成分に対する破壊がわりに大きく、抽出物の薬理活性と安全性がよくなくならせてしまう。本発明の方法は浸漬、濾過及び低温濃縮乾燥などの方式を採用したので、抽出物の中の活性成分に対する破壊はより小さくなり、とても大きい程度でアルカロイドとリグナンなどの成分を保存して、現有の逆流法により調整して得た抽出物と比べて、本発明による大葉蒟抽出物は生理活性の上で明らかに高まっている。

上述の実施例から、本発明の方法により調整して獲得した大葉蒟抽出物は、効果的に５−ヒドロキシトリプタミン、ノルアドレナリン、ドーパミンなどのモノアミン神経伝達物質の再摂取を抑制することができるので、モノアミン神経伝達物質と関係ある精神病を治療と／或いは予防する薬物、健康食品又は食品添加剤の調製に用いられると明らかになった。これらのモノアミン神経伝達物質代謝と関係ある疾病は下記を含むが、これに限らない。精神分裂症、躁病、心境障害、沈黙症、器質的精神症候群、強迫症、鬱病、焦慮症、睡眠障害、てんかん、パーキンソン病、頭痛、神経痛、老年性痴呆等に適応できる。

Claims (11)

1. 大葉蒟薬材を取り、前処理を行ってから有機溶剤をプラスし浸漬か濾過により抽出物を獲得する手順を含むことを特徴とする大葉蒟抽出物の調製方法。
2. 前記大葉蒟薬材は、大葉蒟の根、根茎、藤茎、葉と果実或いは全草を含むことを特徴とする請求項１記載の大葉蒟抽出物の調製方法。
3. 前記浸漬或いは前記濾過に用いる有機溶剤は、アルコール、メチル・アルコール、クロロフォルム、酢酸エチル、エーテルを含むが、これらに限らないことを特徴とする請求項１記載の大葉蒟抽出物の調製方法。
4. 浸漬或いは濾過により獲得した粗抽出物を精製する手順を含むことを特徴とする請求項１、２あるいは３記載の大葉蒟抽出物の調製方法。
5. 前記精製方法は、大孔吸着樹脂処理、シリカゲル柱処理、ポリアミド処理、イオン交換法、エタノール抽出水沈殿法、塩基潤有機溶剤抽出法及び酸抽出アルカリ沈殿法を含むが、これらに限らないことを特徴とする請求項４記載の大葉蒟抽出物の調製方法。
6. 大葉蒟薬材を取り、前処理を行った後、超臨界流体抽出法で調製し抽出物を獲得する手順を含むことを特徴とする大葉蒟抽出物の調製方法。
7. 請求項１−６の中の任一項に記載した方法により調製して獲得した大葉蒟抽出物。
8. 請求項７に記載した大葉蒟抽出物をモノアミン神経伝達物質と関係ある（精神）疾病を治療と／或いは予防する薬物、健康食品又は食品添加剤の調製に応用することを特徴とする大葉蒟抽出物の応用物。
9. 前記モノアミン神経伝達物質単は、５−ヒドロキシトリプタミン、ノルアドレナリンとドーパミンを含むことを特徴とする請求項８記載の大葉蒟抽出物の応用物。
10. 前記モノアミン神経伝達物質と関係ある疾病は、精神分裂症、躁病、心境障害、沈黙症、器質的精神症候群、強迫症、鬱病、焦慮症、睡眠障害、てんかん、パーキンソン病、頭痛、神経痛、老年性痴呆を含むが、これらに限らないことを特徴とする請求項８記載の大葉蒟抽出物の応用物。
11. 前記薬物の形式は、カプセル剤、錠剤、粒剤、散薬、ピルス、微丸、注射剤、粉注射薬、内服液調合剤、持続リリース調合剤、コントロールリリース調合剤、標的調合剤を含むが、これらに限らないことを特徴とする請求項８記載の大葉蒟抽出物の応用物。