CN102429962A - 大叶蒟提取物的制备方法、提取物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了经过改进及优化的大叶蒟的提取物制备方法，利用该方法得到的提取物，以及该提取物作为神经递质摄取抑制剂，在治疗和/或预防与单胺递质相关精神神经疾病方面的医疗、保健及食品添加剂等领域的应用。与由现有方法制备得到的大叶蒟提取物相比较，由本发明的方法制备得到的大叶蒟提取物的抗抑郁活性有了明显的提高，同时进一步降低对小鼠的急性毒性，及本发明的方法所获得的提取物，作为医药用途，其安全性有了显著提高，有效性也有了进一步的加强。
Description
技术领域
本发明涉及胡椒属药用植物大叶蒟(Piper laetispicum C.DC.)，具体涉及大叶蒟提取物的制备方法、利用该方法制备得到的提取物，以及该提取物的应用。
背景技术
与5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NA)、多巴胺(DA)等单胺递质代谢相关的疾病目前已经成为妨碍人类健康的最主要疾病之一，根据WHO的资料显示，其所造成的疾病总负担在发达国家已经仅次于冠心病，神经精神疾病在我国疾病总负担中排名首位，约占疾病总负担的1/5。例如，已有众多的社区和医疗研究揭示抑郁和焦虑障碍都有比较高的发病率，全美合病调查发现有17.3％的普通人群遭遇抑郁发作和24.5％的人在终生的某个时段经历过焦虑障碍，这些研究几乎都一致表明，未来还有大量人群将面临抑郁症或焦虑症的困扰。某些特殊群体，例如身体残障人士、慢性躯体疾病患者、药物滥用者、酒精依赖者及独身主义者等，其与5-羟色胺、去甲肾上腺素、多巴胺等单胺递质代谢相关疾病的患病率、发病率就更高，随着人口日益老龄化，老年人的精神疾病发病率越来越高，其中以老年性痴呆、抑郁症和/或焦虑症最为突出。
高发且难以根治的该类疾患已经形成了巨大的5-羟色胺和/或去甲肾上腺素和/或多巴胺(再)摄取抑制剂市场。
大叶蒟有关提取物具有显著的抗抑郁活性，以及一定的抗焦虑、镇痛及镇静等生物活性。
现有的有关制备大叶蒟提取物的相关专利有三项，其中第一项是公开号为CN1291481A、发明名称为“中草药大叶蒟及其提取物在制备药物组合物中的应用”的中国发明专利，其公开了大叶蒟及其提取物在制备药物组合物中的应用；第二项是公开号为CN1532182A、发明名称为“大叶蒟有效部位的制备及其在医疗、保健领域的应用”的中国发明专利，其公开了一种大叶蒟有效部位提取物的制备方法，该方法包括对大叶蒟的地下部分的药材进行前处理、水浴回流进行粗提取以及最后柱层析法分离精制，其中以大孔吸附树脂柱色谱法进行分离、精制的步骤中，先后以40％、55％和80％乙醇溶液洗脱，收集80％乙醇洗脱液，浓缩干燥后得有效部位提取物，从该专利申请公开的强迫性游泳实验的结果，可以得知该提取物的抗抑郁活性不很理想；第三项是公开号为CN1781516A、发明名称为“制备大叶蒟提取物的方法、提取物及其应用”的中国发明专利申请，其公开了一种制备大叶蒟提取物的方法、提取物及其应用，该方法包括对大叶蒟药材进行前处理、常温浸渍或渗漉进行粗提取、柱层析分离精制，其中，采用大孔吸附树脂柱进行精致的步骤中，先后以50％、85％乙醇洗脱，收集85％乙醇洗脱液，经≤70℃浓缩干燥得到精制的提取物。从该专利申请公开的实验结果，可以得知该提取物的抗抑郁活性也不很理想。因此需要对上述大叶蒟提取物的制备方法进行改进。
发明内容
本发明的一个目的即在于克服由现有方法制备获得的大叶蒟提取物的抗抑郁活性较低、无效化学成分及毒副作用化学成分较多的缺点，经过改进及优化实验工艺，更加充分保留了主要有效化学成分，进一步洗脱去除无效化学成分及毒副作用化学成分，从而提高了获得物的有效性及安全性。
大叶蒟的提取物制备方法，包括对大叶蒟的药材进行前处理、粗提取、以及采用大孔吸附树脂对粗提物进行精制，其中所述精制步骤中洗脱剂仅仅采用乙醇，洗脱的顺序为首先采用10-30％乙醇洗去杂质，然后采用60-80％乙醇洗脱。
优选地，所述大叶蒟的药材包括大叶蒟的根、根茎、藤茎、叶及果实或全革。
优选地，所述前处理是切成段状或打粉。
优选地，所述粗提取是在常温条件下以有机溶剂浸渍或渗漉大叶蒟药材获得粗提物溶液，然后减压浓缩获得粗提取物，或者以有机溶剂加热回流获得粗提物溶液，然后减压浓缩获得粗提取物。
本发明的另一个目的在于提供利用所述方法制备得到的大叶蒟提取物。
本发明的又一个目的在于提供所述大叶蒟提取物在制备治疗和/或预防单胺递质代谢相关精神神经疾病的药物、保健品或食品添加剂中的应用。
所述单胺递质代谢相关精神神经疾病包括但不限于：精神分裂症、躁狂症、心境障碍、缄默症、器质性精神综合症、强迫症、抑郁症、焦虑症、睡眠障碍、癫痫、帕金森综合症、头痛、神经痛、老年性痴呆。
所述药物的剂型包括但不限于：胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、滴丸、微丸、注射剂、粉针剂、口服制剂、缓释控释制剂、靶向制剂。
经体外试验及作用机制试验，实验结果显示本发明的方法所获得的大叶蒟提取物具有显著的去甲肾上腺素(NA)和/或5-羟色胺(5-HT)和/或多巴胺(DA)(再)摄取抑制作用。与采用上述现有的方法所制备的提取物相比较，本发明的方法制备得到的大叶蒟提取物的抗抑郁活性明显高于前述专利所述方法制备得到的大叶蒟提取物的抗抑郁活性，具有提高了生物碱含量及提取物生物活性等优势。因此，本发明的大叶蒟提取物可作为去肾上腺素和/或5-羟色胺和/或多巴胺(再)摄取抑制剂开发成为抗抑郁药、抗焦虑药、镇静催眠药以及抗老年性痴呆药等。因此可以作为药品、保健品或食品添加剂的组分或部分组分，用于治疗和/或预防精神分裂症、躁狂症、心境障碍、缄默症、器质性精神综合症、强迫症、抑郁症、焦虑症、睡眠障碍、癫痫、帕金森综合症、头痛、神经痛、老年性痴呆等与NA、5-HT、DA等神经递质代谢失调相关的(精神)疾病。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：1、对现有的大叶蒟的提取物的制备方法进行了改进并优化了工艺条件，进一步充分保留了主要有效活性化学成分，同时尽量的剔除洗脱掉无效化学成分，尤其是有毒副作用的化学成分；2、与由现有方法制备得到的大叶蒟提取物相比较，由本发明的方法制备得到的大叶蒟提取物的抗抑郁活性有了明显的提高，同时进一步降低对小鼠的急性毒性，及本发明的方法所获得的提取物，作为医药用途，其安全性有了显著提高，有效性也有了进一步的加强。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下列本发明实施例中，乙醇的浓度是根据中国国家药典2005版一部的规定，是指在20℃时容量的比例。
实施例1大叶蒟提取物的制备
按表1所示，分别取大叶蒟根、根茎、藤茎、叶及果实或全草，制备大叶蒟提取物，具体如下：
样品1：取大叶蒟的根和藤茎打粗粉，加入约10倍药材的量的70％乙醇，常温下渗漉得粗提物溶液，然后将粗提物溶液于真空条件下浓缩至原体积的约25％，浓缩后的粗提取物溶液搅拌均匀后上非极性型大孔吸附树脂柱进行分离纯化，依次以30％、80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱的液体，经浓缩干燥得到精制的提取物。
样品2：取大叶蒟的藤茎和叶切段，加入约5倍药材的量的70％乙醇，水浴热回流两次得粗提取物溶液，每次1小时，溶液过滤、合并后在真空条件下浓缩至原体积的约30％，浓缩后的粗提取物溶液搅拌均匀后上非极性型大孔吸附树脂柱进行分离纯化，依次以20％、70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱的液体，经浓缩干燥得到精制的提取物。
样品3：取大叶蒟的根和根茎，加入约15倍药材量的70％乙醇，常温下浸渍约48小时，然后放出得粗提取物溶液，将粗提取物溶液于真空条件下适当浓缩至原体积的约20％，浓缩后的粗提取物溶液搅拌均匀后上非极性型大孔吸附树脂柱进行分离纯化，依次以10％、60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱的液体，经浓缩干燥得到精制的提取物。
样品4：取大叶蒟的全草切成段状，加入12倍药材量的60％乙醇常温下浸渍约48小时，然后放出得粗提取物溶液，适当浓缩后上硅胶柱分离纯化，依次以环己烷-乙酸乙酯及石油醚-丙酮为流动相洗脱，收集石油醚-丙酮10∶1至2∶1部分流出液，经浓缩干燥得精制提取物。
样品5：取大叶蒟的全草切成段状，加入10倍药材量的80％乙醇常温下浸渍约48小时，然后放出得粗提取物溶液，适当浓缩后上凝胶柱进行分离纯化，依次收集流出液，经浓缩干燥得精制提取物。
样品6(对照)：取大叶蒟的根和根茎切成段状，加入约80％乙醇常温下浸渍约24小时，然后加入同浓度乙醇至药材量的15倍，进行渗漉得粗提物，渗漉液缓慢加入约等量的60℃温水搅拌混匀，然后将稀释后的渗漉液上D101大孔吸附树脂柱，流穿后依次以50％、85％乙醇洗脱，收集85％乙醇洗脱的液体，经≤70℃浓缩干燥得到精制的提取物(按申请号为200410084791.7的中国专利申请的实施例1的样品1操作)。
样品7(对照)：取大叶蒟的根及根茎打成粗粉，加60％乙醇水浴回流2次，过滤合并滤液，浓缩至原滤液体积的14％，并加30％乙醇溶液得澄清不透明稀溶液，随后以大孔吸附树脂柱色谱法分离精制，依次以40％、55％、80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱的液体经浓缩干燥即得有效部位提取物(按申请号为03115911.7的中国专利申请的实施例1操作)。
表1、大叶蒟提取物的制备
| 样品号 | 药材部位 | 粗提取方法 | 分离纯化 | 除杂溶剂浓度 | 收集溶剂浓度 |
| 1 | 根、藤茎 | 渗漉 | 大孔吸附树脂 | 30％ | 80％ |
| 2 | 藤茎、叶 | 热回流 | 大孔吸附树脂 | 20％ | 70％ |
| 3 | 根、根茎 | 浸渍 | 大孔吸附树脂 | 10％ | 60％ |
| 4 | 全草 | 浸渍 | 硅胶吸附层析 | 10％ | 60％ |
| 5 | 全草 | 浸渍 | 凝胶吸附层析 | 20％ | 80％ |
| 6* | 根、根茎 | 渗漉 | 大孔树脂 | 50％ | 85％ |
| 7* | 根、根茎 | 回流 | 大孔树脂 | 40％、55％ | 80％ |
*：作为对照的采用此前对比专利制备的大叶蒟提取物。
实施例2抗抑郁活性--小鼠强迫游泳试验
取小鼠(KM种小鼠，雄性，22-25g)随机分组，每组10只，各组按所示剂量分别给药A(实施例1的样品1)、B(实施例1的样品2)、C(实施例1的样品6)、D(实施例1的样品7)，每日一次，连续给药14天，同时以生理盐水作为对照，阳性对照为氟西汀。第14天给药后1小时，将小鼠放入Ф14cm×h20cm、水深10cm(水温25℃)的玻璃圆缸内使其游泳。自第2分钟开始，纪录4分钟内的不动累计时间，结果如表2所示。
表2、小鼠强迫游泳试验结果
| 药物 | 剂量(mg/kg/d) | 累计不动时间(s) |
| CK- | - | 161.3±16.4 |
| CK+ | 20 | 54.5±12.6** |
| A | 20 | 49.4±13.3** |
| A | 10 | 63.5±11.2** |
| A | 5 | 115.2±18.8 |
| B | 20 | 53.7±11.4** |
| B | 10 | 62.8±15.2** |
| B | 5 | 109.9±17.5 |
| C | 20 | 61.2±15.8** |
| C | 5 | 133.1±16.2 |
| D | 20 | 69.3±13.8** |
| D | 5 | 137.6±14.5 |
CK-：生理盐水溶液；CK+：氟西汀
**：P＜0.01；与空白对照组相比
结果显示，氟西汀和大叶蒟各提取物均能缩短小鼠的累计不动时间，表明大叶蒟提取物具有显著的抗抑郁活性。其中受试药物A、B的抗抑郁生物活性明显高于同等剂量的对照受试药物C、D，同时受试药物A、B的抗抑郁活性基本相当。
从表2可以得知，本发明所述方法制备得到的提取物(例如受试药物A、B)的剂量为20mg/kg及5mg/kg时的抗抑郁活性均高于同剂量对照受试药物C、D，说明本发明的经过改进和优化的制备工艺所得的提取物的生物活性明显高于上述公开号为CN1781516A的中国发明专利申请所述方法制备的提取物(受试药物C)及公开号为1532182A的中国发明专利所述方法制备的提取物(受试药物D)的活性。
实施例3抗抑郁活性--小鼠尾悬挂试验
取小鼠(KM种小鼠，雄性，22-25g)随机分组，每组10只，各组按所示剂量分别给药A(实施例1的样品1)、B(实施例1的样品2)、C(实施例1的样品6)、D(实施例1的样品7)，每日一次，连续给药14天，同时以生理盐水作为对照，阳性对照为文法拉辛。最后一次给药1hr后进行小鼠尾悬挂试验，持续时间为6min，记录6min内静止不动的时间，结果如表3所示。
表3、小鼠尾悬挂试验结果
| 药物 | 剂量(mg/kg/d) | 累计不动时间(s) |
| CK- | - | 124.8±56.7 |
| CK+ | 50 | 43.7±31.8** |
| A | 10 | 49.1±25.3** |
| A | 5 | 67.4±29.6* |
| B | 10 | 51.5±23.1** |
| B | 5 | 62.7±39.3* |
| C | 10 | 69.5±31.5* |
| C | 5 | 84.4±35.1* |
| D | 10 | 76.3±28.4* |
| D | 5 | 95.2±42.6 |
CK-：生理盐水溶液；CK+：文拉法辛
**：P＜0.01；*：P＜0.05；与空白对照组相比
结果显示，文拉法辛和大叶蒟各提取物均能缩短小鼠的累计停止不动时间，表明大叶蒟提取物具有显著的抗抑郁活性。其中受试药物A、B的抗抑郁活性明显高于同等剂量的对照受试药物C、D，同时受试药物A、B的抗抑郁活性基本相当。
从表3可以得知，本发明所述方法制备得到的提取物(例如受试药物A、B)的剂量为10mg/kg及5mg/kg时的抗抑郁活性均高于同剂量对照受试药物C、D，说明本发明的经过改进和优化的制备工艺所得的提取物的生物活性明显高于上述公开号为CN1781516A的中国发明专利申请所述方法制备的提取物(受试药物C)及公开号为1532182A的中国发明专利所述方法制备的提取物(受试药物D)的活性。
实施例4抗焦虑活性-小鼠四板试验
取小鼠(KM种小鼠，雄性，22-25g)随机分组，每组10只，各组按所示剂量分别给药A(实施例1的样品1)、B(实施例1的样品2)、C(实施例1的样品6)、D(实施例1的样品7)，并以生理盐水作对照，阳性对照组为安定。给药30min后将小鼠置于板上，使其探究15s。此后，小鼠每当从一块板横跨到另一块板时就给予一次电击，电流强度0.35mA，持续0.5s。小鼠每当因此产生明显的逃避反应，通常穿过2块板或3块板。如小鼠继续跑，在此后的3min不给电击。记录10min内的电击数，结果如表4所示。
表4、抗焦虑作用的试验结果
| 药物 | 剂量(mg/kg) | 累计电击数 |
| CK- | - | 5.91±1.35 |
| CK+ | 1 | 14.13±2.52** |
| A | 80 | 10.01±1.96* |
| A | 40 | 7.32±1.24 |
| B | 80 | 9.75±1.62* |
| B | 40 | 6.51±1.19 |
| C | 80 | 7.04±1.92 |
| D | 80 | 7.52±2.13 |
CK-：生理盐水溶液；CK+：安定
**：P＜0.01；*：P＜0.05；与空白对照组相比
结果显示，电击可使小鼠运动活性显著减少，而安定和本发明的大叶蒟提取物(受试药物A、B、C、D)可以增高电击数，说明本发明的大叶蒟提取物具有一定的抗焦虑活性，其中受试药物A、B的活性高于同等剂量的对照受试药物C、D，同时受试药物A、B的抗焦虑活性基本相当。
实施例5镇静活性-开阔法试验
取小鼠(KM种小鼠，雄性，22-25g)随机分组，每组10只，各组按所示剂量给药A(实施例1的样品1)、B(实施例1的样品2)、C(实施例1的样品6)、D(实施例1的样品7)，同时以生理盐水作对照，阳性对照组为卡瓦内酯提取物。30min后将小鼠放入高35cm的圆柱形盒子内，盒底均匀划分为边长为5cm的正方形格子。小鼠适应环境3min后，自第4min起记录此后5min内小鼠爬过的格子数，结果如表5所示。
表5、镇静作用试验结果
| 药物 | 剂量(mg/kg) | 累计爬格子数 |
| CK- | - | 138.63±7.31 |
| CK+ | 100 | 102.15±5.63* |
| A | 80 | 97.90±4.13* |
| A | 40 | 124.11±8.99 |
| B | 80 | 93.15±6.47* |
| B | 40 | 127.87±9.59 |
| C | 80 | 119.86±7.93 |
| D | 80 | 121.04±8.32 |
CK-：生理盐水溶液；CK+：卡瓦内酯提取物
*：P＜0.05；与空白对照组相比
结果显示，卡瓦内酯提取物和本发明的大叶蒟提取物均可以减少小鼠的爬格子次数，说明本发明的大叶蒟提取物具有一定的镇静活性，其中受试药物A、B的活性高于同等剂量的对照受试药物C、D，同时受试药物A、B的活性基本相当。
实施例6镇痛活性-扭体试验
取小鼠(KM种小鼠，雄性，22-25g)随机分组，每组10只，各组按所示剂量给药A(实施例1的样品1)、B(实施例1的样品2)、C(实施例1的样品6)、D(实施例1的样品7)，同时以生理盐水作为对照，阳性对照组为乙酰水杨酸。30min后，分别腹腔注射0.02％苯醌水溶液0.20ml，后立即将小鼠放入四周封闭的盒子内，自小鼠出现第一次扭体反应开始，计时10min，记录此后10min内小鼠扭体次数，结果如表6所示。
表6、镇痛作用试验结果
| 药物 | 剂量(mg/kg) | 累计扭体次数 |
| CK- | - | 23.52±2.98 |
| CK+ | 50 | 8.49±1.92** |
| A | 80 | 11.21±1.44** |
| A | 40 | 16.93±1.47* |
| B | 80 | 12.65±1.90* |
| B | 40 | 18.78±1.23 |
| C | 80 | 17.11±1.47* |
| D | 80 | 16.27±1.63* |
CK-：生理盐水溶液；CK+：乙酰水杨酸
**：P＜0.01；*：P＜0.05；与空白对照组相比
结果显示，乙酰水杨酸和本发明的大叶蒟提取物均可以明显减少小鼠的扭体次数，说明本发明的大叶蒟提取物具有一定的镇痛活性，其中受试药物A、B的活性高于同等剂量的对照受试药物C、D，同时受试药物A、B的活性基本相当。
实施例7安全性评价-小鼠急性毒性试验
取小鼠雌雄各半随机分组，每组10只，各组按根据预试验结果的剂量给药A(实施例1的样品1)、B(实施例1的样品2)、C(实施例1的样品6)、D(实施例1的样品7)。所有小鼠禁食按各试验组应给的药液经口灌胃给药，随后观察小鼠给药后的反应，记录死亡情况，并于每日观察一次，连续14天。14天观察期结束后，存活动物称重后解剖，观察脏器有否异常，结果经过计算如表7所示。
表7、小鼠急性毒性试验结果
| 药物 | 剂量组数 | 给药途径 | LD50(mg/kg) |
| A | 5 | 口服 | 509 |
| B | 5 | 口服 | 518 |
| C | 5 | 口服 | 410 |
| D | 5 | 口服 | 387 |
在相同实验条件下，根据相关实验方法对受试药物A、B、C、D进行小鼠急性毒性研究，结果显示，受试药物A、B的LD50数值高于对照受试药物C、D，同时受试药物A、B的LD50数值基本相当。
从表3可以得知，本发明所述方法制备得到的提取物(例如受试药物A、B)的LD50数值高于对照受试药物C、D，说明本发明的经过改进和优化的制备工艺改进和优化所得的提取物的安全性显著高于上述公开号为CN1781516A的中国发明专利申请所述方法制备的提取物(受试药物C)及公开号为1532182A的中国发明专利所述方法制备的提取物(受试药物D)。
由此可以得知，由本发明的改进并优化的方法制备得到的大叶蒟提取物的抗抑郁活性有了明显的提高，同时进一步降低对小鼠的急性毒性，及本发明的方法所获得的提取物，作为医药用途，其安全性有了显著提高，有效性也有了进一步的加强。
Claims (8)
1.大叶蒟的提取物制备方法，包括对大叶蒟的药材进行前处理、粗提取、以及采用大孔吸附树脂对粗提物进行精制，其特征在于，精制步骤中洗脱剂采用乙醇，洗脱的顺序为首先采用10-30％乙醇洗去杂质，然后采用60-80％乙醇洗脱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大叶蒟的药材包括大叶蒟的根、根茎、藤茎、叶及果实或全草。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述前处理是切成段状或打粉。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述粗提取是在常温条件下以有机溶剂浸渍或渗漉大叶蒟药材获得粗提物溶液，然后减压浓缩获得粗提取物，或者以有机溶剂加热回流获得粗提物溶液，然后减压浓缩获得粗提取物。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法制备得到的大叶蒟提取物。
6.根据权利要求5所述的大叶蒟提取物在制备治疗和/或预防单胺递质代谢相关精神神经疾病的药物、保健品或食品添加剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述单胺递质代谢相关精神神经疾病包括但不限于：精神分裂症、躁狂症、心境障碍、缄默症、器质性精神综合症、强迫症、抑郁症、焦虑症、睡眠障碍、癫痫、帕金森综合症、头痛、神经痛、老年性痴呆。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、滴丸、微丸、注射剂、粉针剂、口服制剂、缓释控释制剂及靶向制剂。
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| CN1532182A (zh) * | 2003-03-20 | 2004-09-29 | 上海海天医药科技开发有限公司 | 大叶蒟有效部位的制备及其在医疗、保健领域的应用 |
| CN1781516A (zh) * | 2004-12-01 | 2006-06-07 | 蒋毅 | 制备大叶蒟提取物的方法、提取物及其应用 |
-
2010
- 2010-09-29 CN CN2010102969740A patent/CN102429962A/zh active Pending
Patent Citations (2)
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