CN103751279A - 一种五味子抑菌提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明特别公开了一种五味子抑菌提取物的制备方法。该五味子抑菌提取物的制备方法，包括如下步骤：（1）向五味子中加入蒸馏水，水煎，过滤提取液；（2）将提取液浓缩至使每1毫升提取液中含五味子1克，得浓缩液；（3）加入乙醇，搅拌，过滤，减压浓缩；（4）用氯仿萃取，保留水相；（5）用乙酸乙酯萃取，保留水相；（6）用正丁醇萃取，保留水相；（7）将水相萃取液过D101大孔吸附树脂柱，洗脱，减压浓缩，即得五味子抑菌提取物。本发明的有益效果是：制备工艺简单，制得的五味子抑菌提取物中含有大量的有机酸类成分，其中莽草酸的含量高达13.98%，具有明显的体内外抑菌活性、广谱性和高效性，抗菌活性不产生耐药性。

Description

一种五味子抑菌提取物的制备方法

（一）技术领域

本发明特别涉及一种五味子抑菌提取物的制备方法。

（二）背景技术

传染病是危害人类健康的首要原因，也是导致人类死亡的重要原因，而细菌感染则是传染病的重要组成部分，细菌感染是危害人类健康的大敌。目前，治疗细菌感染的药物主要依赖于抗生素，然而，由于人类抗菌药物的广泛应用，尤其是不合理使用，使得许多细菌在抗菌药物的强大压力下逐渐进化，产生对抗菌药物的强力抗药性，致使抗菌药物对耐药菌株的疗效不断减弱甚至无效，此外细菌的耐药机制多种多样，现在几乎每种有效的抗生素都发现了其相应的耐药菌。这种情况下,在中医药中寻求新的抗菌药物已成为解决细菌耐药性的一种有效途径。

五味子为木兰科植物五味子(Schisandra chimesmsis(Turcz.)Baill.)的干燥成熟果实，收载于《中国药典》2000版，俗称北五味子。北五味子是生长于中国东北，遍布小兴安岭、伊春、桃山、延边等地的一种道地药材。目前对五味子的药理活性研究主要集中于其木质素成分，还没有发现五味子的其他药理活性的研究，因此也没有相关的五味子提取物的制备方法的介绍。

（三）发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种制备工艺简单、制备时间短、制得的五味子抑菌提取物具有明显的体内外抑菌活性、广谱性和高效性、抗菌活性不产生耐药性的五味子抑菌提取物的制备方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种五味子抑菌提取物的制备方法，包括如下步骤：

（1）向五味子中加入蒸馏水，五味子与蒸馏水的重量比为1：2.5，在100℃下水煎两次，每次2小时，合并两次水煎的提取液，经药典9号筛过滤；

（2）将过滤后的提取液在37℃下浓缩至使每1毫升提取液中含五味子1克，得浓缩液；

（3）向浓缩液中缓慢加入体积分数为95%的乙醇，快速搅拌该混合药液，直到混合药液中乙醇的体积分数达到75%-80%，然后过滤，过滤后将滤液在压力为200Pa、温度为50℃的条件下减压浓缩至无醇味，再加蒸馏水补足至使每1毫升浓缩液中含五味子1克；

（4）然后用1/2体积的氯仿萃取3-5次，保留水相；

（5）再用1/2体积的乙酸乙酯萃取水相3-5次，继续保留水相；

（6）最后用1/2体积的正丁醇萃取水相3-5次，继续保留水相；

（7）将萃取后得到的水相萃取液过D101大孔吸附树脂柱，用5倍D101大孔吸附树脂体积的纯水洗脱，收集洗脱液，然后在压力为70Pa、温度为55℃的条件下将洗脱液减压浓缩至使每1毫升洗脱液中含五味子1克，即得五味子抑菌提取物。

五味子具有收敛固涩、益气生津、宁心安神的功效，主治久咳虚喘，梦遗滑精，尿频遗尿，久泻不止，自汗盗汗，津伤口渴，心悸失眠。

本发明五味子抑菌提取物的制备方法的有益效果是：制备工艺简单，制备时间短，制得的五味子抑菌提取物中含有大量的有机酸类成分，该有机酸类成分为以莽草酸为主的抗菌活性成分，其中莽草酸的含量高达13.98%，通过动物体内和体外抗菌试验表明，使用本发明五味子抑菌提取物的制备方法制得的五味子抑菌提取物具有明显的体内外抑菌活性、广谱性和高效性，且其抗菌活性不产生耐药性。

（四）附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为莽草酸标准品（2mg/ml）的液相色谱图；

图2为使用本发明五味子抑菌提取物的制备方法制备的五味子抑菌提取物（20倍稀释）的液相色谱图。

（五）具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于此，实施例中的制备方法均为常规制备方法，不再详述。

实施例1：

该五味子抑菌提取物的制备方法，采用如下步骤：

（1）向2千克五味子中加入5千克蒸馏水，在100℃下水煎两次，每次2小时，合并两次水煎的提取液，经药典9号筛过滤；

（2）将过滤后的提取液在37℃下浓缩至2升，得浓缩液；

（3）向浓缩液中缓慢加入体积分数为95%的乙醇，快速搅拌该混合药液，直到混合药液中乙醇的体积分数达到78%，然后过滤，过滤后将滤液在压力为200Pa、温度为50℃的条件下减压浓缩至无醇味，再加蒸馏水补足至2升；

（4）然后用1/2体积的氯仿萃取4次，保留水相；

（5）再用1/2体积的乙酸乙酯萃取水相4次，继续保留水相；

（6）最后用1/2体积的正丁醇萃取水相4次，继续保留水相；

（7）将萃取后得到的水相萃取液过D101大孔吸附树脂柱，用5倍D101大孔吸附树脂体积的纯水洗脱，收集洗脱液，然后在压力为70Pa、温度为55℃的条件下将洗脱液减压浓缩至2升，即得五味子抑菌提取物。制得的该五味子抑菌提取物具有明显的体内外抑菌活性、广谱性和高效性，且其抗菌活性不产生耐药性，五味子抑菌提取物中的成分含莽草酸（HPLC法），莽草酸含量达13.98%。

实施例2：

该五味子抑菌提取物的制备方法，采用如下步骤：

（1）向3千克五味子中加入7.5千克蒸馏水，在100℃下水煎两次，每次2小时，合并两次水煎的提取液，经药典9号筛过滤；

（2）将过滤后的提取液在37℃下浓缩至3升，得浓缩液；

（3）向浓缩液中缓慢加入体积分数为95%的乙醇，快速搅拌该混合药液，直到混合药液中乙醇的体积分数达到75%，然后过滤，过滤后将滤液在压力为200Pa、温度为50℃的条件下减压浓缩至无醇味，再加蒸馏水补足至3升；

（4）然后用1/2体积的氯仿萃取3次，保留水相；

（5）再用1/2体积的乙酸乙酯萃取水相3次，继续保留水相；

（6）最后用1/2体积的正丁醇萃取水相3次，继续保留水相；

（7）将萃取后得到的水相萃取液过D101大孔吸附树脂柱，用5倍D101大孔吸附树脂体积的纯水洗脱，收集洗脱液，然后在压力为70Pa、温度为55℃的条件下将洗脱液减压浓缩至3升，即得五味子抑菌提取物。制得的该五味子抑菌提取物具有明显的体内外抑菌活性、广谱性和高效性，且其抗菌活性不产生耐药性，五味子抑菌提取物中的成分含莽草酸（HPLC法），莽草酸含量达13.98%。

实施例3：

该五味子抑菌提取物的制备方法，采用如下步骤：

（1）向4千克五味子中加入10千克蒸馏水，在100℃下水煎两次，每次2小时，合并两次水煎的提取液，经药典9号筛过滤；

（2）将过滤后的提取液在37℃下浓缩至4升，得浓缩液；

（3）向浓缩液中缓慢加入体积分数为95%的乙醇，快速搅拌该混合药液，直到混合药液中乙醇的体积分数达到80%，然后过滤，过滤后将滤液在压力为200Pa、温度为50℃的条件下减压浓缩至无醇味，再加蒸馏水补足至4升；

（4）然后用1/2体积的氯仿萃取5次，保留水相；

（5）再用1/2体积的乙酸乙酯萃取水相5次，继续保留水相；

（6）最后用1/2体积的正丁醇萃取水相5次，继续保留水相；

（7）将萃取后得到的水相萃取液过D101大孔吸附树脂柱，用5倍D101大孔吸附树脂体积的纯水洗脱，收集洗脱液，然后在压力为70Pa、温度为55℃的条件下将洗脱液减压浓缩至4升，即得五味子抑菌提取物。制得的该五味子抑菌提取物具有明显的体内外抑菌活性、广谱性和高效性，且其抗菌活性不产生耐药性，五味子抑菌提取物中的成分含莽草酸（HPLC法），莽草酸含量达13.98%。

试验1：

通过体外抑菌试验比较五味子水煎提取、醇提、超声提取三种提取方法的抑菌活性：

1.本发明水煎提取：向五味子中加入蒸馏水，五味子与蒸馏水的重量比为1：2.5，在100℃下水煎两次，每次2小时，合并两次水煎的提取液，经药典9号筛过滤，将过滤后的提取液在37℃下浓缩至使每1毫升提取液中含五味子1克，得浓缩液；

2.体积分数为80%的乙醇提取：向五味子中加入体积分数为80%的乙醇，五味子与乙醇的重量比为1：2.5，煮沸保温提取2次，每次2小时，经药典9号筛过滤，合并提滤液，将过滤后的滤液浓缩至使每1毫升滤液中含五味子1克；

3.超声提取：向五味子中加入水，五味子与水的重量比为1：2.5，超声提取2次，每次2小时，经药典9号筛过滤，合并提滤液，将过滤后的滤液浓缩至使每1毫升滤液中含五味子1克。

试验结果表明本发明水煎提取可获得对大肠杆菌最好的体外抑菌效果，见表1：

表1不同提取方法所得提取物对大肠杆菌标准菌株CMCC44102的抑菌圈大小（

D.n=3）

提取方法	提取物生药浓度（g/mL）	抑菌圈直径（mm）
			水煎提取	1g/mL	27.72±1.33
80%乙醇提取	1g/mL	23.54±2.99
			超声提取	1g/mL	20.07±1.58

试验2：

对试验1所得的水提液进行醇沉处理，采用体外抑菌试验比较最佳乙醇浓度：

向4份等同体积的水提液中分别加入体积分数为95%的乙醇，边加入乙醇边快速搅拌，直至乙醇终浓度分别为80%、60%、40%、20%，滤过，同时保留上清液和沉淀，沉淀放置80℃烘干6h,称重后分别用相同体积的水重新溶解测定各自的体外抑菌活性；将上清液浓缩至无醇味，再加蒸馏水补足至使每1毫升浓缩液中含五味子1克，测定体外抑菌活性。

试验结果表明本发明乙醇浓度为80%时，上清液得到最好的体外抑菌效果，见表2：

表2不同乙醇浓度所得醇沉液对大肠杆菌标准菌株CMCC44102的抑菌圈大小（

D.n=3）

试验3：

通过试验1和试验2得出五味子中抑菌活性成分的水溶性较强，因此采用有机溶剂梯度萃取（极性依次增大）方法来纯化五味子中的抑菌活性成分：

首先使用1/2体积氯仿对上述醇沉后上清液进行萃取3-5次，保留氯仿层和水层进行体外抑菌试验，水层继续使用1/2体积乙酸乙酯萃取3-5次，同样保留乙酸乙酯层和水层进行体外抑菌试验，水层再次使用1/2体积正丁醇萃取3-5次，保留正丁醇层和水层进行体外抑菌试验。

试验结果表明五味子中的抑菌活性成分不溶于氯仿、乙酸乙酯和正丁醇，本发明五味子抑菌提取物的制备方法采用有机溶剂梯度萃取（极性依次增大）的方法可除去没有抑菌活性的脂溶性成分，见表3：

表3不同萃取相对大肠杆菌标准菌株CMCC44102的抑菌圈大小（

D.n=3）

试验4：

通过试验1-3确定五味子中有效抑菌活性成分为亲水性物质，所以本发明采用亲水性分离柱大孔吸附树脂柱进行进一步分离，大孔吸附树脂型号为D101,分别采用100%纯水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、60%乙醇、100%乙醇进行洗脱，洗脱液减压浓缩至使每1毫升洗脱液中含五味子1克，即得五味子抑菌提取物。做体外抑菌试验，试验结果表明只有100%纯水洗脱液具有抑菌活性，见表4：

表4不同洗脱液对大肠杆菌标准菌株CMCC44102的抑菌圈大小

洗脱液

100%纯水

20%乙醇

40%乙醇

60%乙醇

60%乙醇

100%乙醇

抑菌圈直径

26.56±1.18

0

0

0

0

0

试验5：

将上述具有体外抑菌活性的纯水相过0.45μm的滤膜后进行液相检测，见说明书附图1-2，与莽草酸标准品（2mg/ml）对比，实验结果表明使用本发明五味子抑菌提取物的制备方法制得的五味子抑菌提取物中含莽草酸13.98%。

动物体内试验设计：

高致病性大肠杆菌菌株09-29（实验室分离纯化保存）制成10⁸CFU/ml的细菌悬液，腹腔注射7日龄健康雏鸡，每组6只，每只0.5ml,试验组给予本发明制备的五味子提取液（1g/ml）0.3ml/次，2次/天；对照组给予灭菌生理盐水0.3ml/次，各试验组隔离饲养，每天观察3-5次，记录鸡的死亡数和病变，直到接种后7天为止，7天后仍然存活的鸡进行扑杀,观察病变并作细菌分离鉴定：

死亡率=死亡鸡只/试验总鸡只数×100%；

分菌率=分得细菌的鸡只数/试验总鸡只数×100%；

试验结果见表5：

表5

组别	死亡率（%）	分菌率（%）	心包炎（只）
				试验组	33.3%	33.3%	4
对照组	83.3%	83.3%	4

通过动物体内和体外抗菌试验表明，使用本发明五味子抑菌提取物的制备方法制得的五味子抑菌提取物具有明显的体内外抑菌活性、广谱性和高效性，且其抗菌活性不产生耐药性。

Claims (1)

1.一种五味子抑菌提取物的制备方法，其特征是：包括如下步骤：

（1）向五味子中加入蒸馏水，五味子与蒸馏水的重量比为1：2.5，在100℃下水煎两次，每次2小时，合并两次水煎的提取液，经药典9号筛过滤；

（2）将过滤后的提取液在37℃下浓缩至使每1毫升提取液中含五味子1克，得浓缩液；

（3）向浓缩液中缓慢加入体积分数为95%的乙醇，快速搅拌该混合药液，直到混合药液中乙醇的体积分数达到75%-80%，然后过滤，过滤后将滤液在压力为200Pa、温度为50℃的条件下减压浓缩至无醇味，再加蒸馏水补足至使每1毫升浓缩液中含五味子1克；

（4）然后用1/2体积的氯仿萃取3-5次，保留水相；

（5）再用1/2体积的乙酸乙酯萃取水相3-5次，继续保留水相；

（6）最后用1/2体积的正丁醇萃取水相3-5次，继续保留水相；

（7）将萃取后得到的水相萃取液过D101大孔吸附树脂柱，用5倍D101大孔吸附树脂体积的纯水洗脱，收集洗脱液，然后在压力为70Pa、温度为55℃的条件下将洗脱液减压浓缩至使每1毫升洗脱液中含五味子1克，即得五味子抑菌提取物。

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