이하 구체적인 실시예를 결합하여, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 이하 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐으로서, 본 발명의 범위를 한정짓고자 하는 것이 아님을 이해하여야 한다.
실시예 1. 대엽구약 추출물의 조제
표 1에 도시된 바에 따라, 각각 대엽구약 근, 뿌리줄기, 넝쿨줄기, 잎사귀 및 과실 또는 전초를 취하여 대엽구약 추출물을 조제한다. 구체적으로는 다음과 같다:
샘플 1-1: 대엽 구약의 건조 뿌리와 뿌리줄기 1kg을 도막 형태로 잘라, 약 90%의 에틸알코올을 첨가하고 상온에서 약 48시간 동안 침적한 다음, 동일한 농도의 에틸알코올을 20L까지 첨가하여 여과를 거쳐 초기 추출물을 얻는다. 여과액에 온수 15L를 첨가하여 고르게 저어준 후, 희석 후의 여과액을 D101 대공흠착수지(天津市 大鈞 科技開發 有限公司 수지 지사) 컬럼을 실행하고, 통과시킨 후 순서대로 40%, 90%의 에틸알코올로 세척한 다음, 90%의 에틸알코올로 세척한 액체를 수집하여, ≤70℃에서 농축 건조시켜 정제된 추출물을 얻는다.
샘플 1-2: 대엽구약의 뿌리와 뿌리줄기 1kg을 취하여 도막 형태로 잘라, 약 80%의 에틸알코올을 첨가한 후 상온에서 약 48시간 동안 침적한 다음, 동일한 농도의 에틸알코올을 10L까지 첨가한 후 50℃로 약하게 가열하여 열 여과를 진행하여 조추출물을 얻는다. 그런 다음 조추출물 용액을 60℃에서 2L로 진공 농축하고, 40%의 에틸알코올을 10L까지 첨가하여 고르게 섞은 후, 용액을 HPD100 대공흡착수지(河北 寶恩 生物科技有限公司)로 컬럼을 실행하여, 통과시킨 후 순서대로 50%, 80%의 에틸알코올로 세척한 다음, 80%의 에틸알코올로 세척한 액체를 수집하여, ≤70℃에서 농축 건조시켜 정제된 추출물을 얻는다.
샘플 2: 대엽구약의 넝쿨줄기와 잎사귀 1kg을 가루 내어, 약 90%의 에틸알코 올을 첨가한 후 상온에서 약 24시간 동안 침적한 다음, 동일한 농도의 에틸알코올을 16L까지 첨가하고, 여과를 진행하여 조 추출물 용액을 얻는다. 그런 다음 초기 추출물을 60℃에서 감압 농축하여 총 체적의 1/3으로 농축시키고, 등량의 냉수를 첨가하여 섞어준 후, 3일 동안 냉장한 후 침전물을 걸러내고, 마지막으로 ≤70%에서 농축 건조시켜 정제된 추출물을 얻는다.
샘플 3: 대엽구약의 전초 1kg을 도막 형태로 잘라, 0.5%의 초산용액 10L를 첨가하여 24시간 동안 침적하고, 여과하여 초기 추출물을 얻은 다음, 2%의 암모니아수 2L를 첨가하여 가볍게 흔들어준 후, 클로로포름을 첨가하여 추출하고, 추출액을 ≤70℃에서 농축 건조시켜 정제된 추출물을 얻는다.
샘플 4: 대엽구약의 뿌리 및 뿌리줄기 1kg을 취하여 도막 형태로 자르고, 55%의 에틸알코올을 첨가하여 24시간 동안 침적한 다음, 동일한 농도의 에틸알코올을 20L까지 첨가한 후, 50%까지 약하게 가열하여 열 여과를 진행하여 조추출물을 얻는다. 농축 건조 후 실리카겔 컬럼(실리카겔H, 山東 靑島 海洋化工集團公司)을 진행하여 분리시킨 후, 순서대로 시클로헥실-에틸 아세테이트 및 페트롤레움 에테르-아세톤을 유동상(mobile phase)으로 세척하여, 페트롤레움 에테르-아세톤의 10: 1 내지 2: 1 의 부분 유출액을 수집하고, ≤70℃에서 농축 건조시켜 정제 추출물을 얻는다.
샘플 5: 대엽구약의 뿌리와 넝쿨줄기 1kg을 가루 내어, 에틸에테르 5L를 참가한 후 상온에서 밀봉하여 약 24시간 동안 침적한 다음 추출액을 수집하며, 이를 3회 중복한다. 추출액을 합하여 에틸에테르를 회수한 후, 아세톤으로 용해시켜, 폴 리아미드(湘潭市 昭潭化工廠) 컬럼 처리를 하여, ≤70℃에서 농축 건조시켜 정제된 추출물을 얻는다.
샘플 6: 대엽구약의 뿌리 및 뿌리줄기 1kg을 취하여 도막형태로 잘라, 0.5%의 초산수 5L를 넣어 24시간 동안 냉침적한 후, ≤70℃의 조건 하에서 뚜껑을 연 채로 약하게 가열한 다음, 수용액에 이온교환컬럼(732 양이온 교환수지, 鶴壁市 向暘樹脂廠) 처리를 하여 수집한 후 2%의 암모니아수로 세척하고, 세척액을 ≤70℃에서 농축 건조시켜 정제된 추출물을 얻는다.
샘플 7: 대엽구약의 뿌리 및 넝쿨줄기 1kg을 가루 내어, 클로로포름을 첨가하여 상온 상태에서 약 24시간 동안 밀봉 침적시킨 다음, 클로로포름을 10L까지 첨가하여 여과를 거쳐 조추출물을 얻는다. 클로로포름을 회수한 후 직접 ≤70℃에서 농축 건조시켜 얻는다.
샘플 8: 대엽구약의 전초 1kg을 가루 내어, 적량의 에틸아세테이트를 첨가하여 상온에서 약 24시간 동안 침적한 후, 에틸아세테이트를 10L까지 첨가하여 여과를 거쳐 초기 추출물을 얻는다. 에틸아세테이트를 회수한 후, 에틸알코올을 넣어 용해시킨 다음, 에틸알코올 용액을 D860021 대공흡착수지(山東 魯抗醫藥股分有限公司) 컬럼으로 정제하고, 순차적으로 40%, 90%의 에틸알코올로 세척하여, 90%의 에틸알코올로 세척한 세척액을 수집하고, ≤70℃에서 농축 건조시켜 정제된 추출물을 얻는다.
샘플 9: 대엽구약의 뿌리 1kg을 도막 형태로 잘라, 2L의 0.5% 암모니아수 등에 24시간 동안 침윤한 후, 에틸에테르를 첨가하여 3회 추출하고, 추출액을 합하여 에틸에테르를 회수한 다음, ≤70℃에서 농축 건조시켜 정제된 추출물을 얻는다.
샘플 10(대조): 대엽구약의 뿌리 및 뿌리줄기 1kg을 취하여 입자가 굵은 분말로 만든 후, 60%의 에틸알코올을 첨가하여 2회 수욕 회류시키고, 여과하여 합병한 여과액을 원 여과액 부피의 14%가 될 때까지 농축하고, 30%의 에틸알코올 용액을 첨가하여 맑고 불투명한 희석 용액을 얻은 다음, 이를 대공흡착수지 컬럼으로 분리 정제하여, 순차적으로 40%, 55%, 80%의 에틸알코올로 세척한 후, 80%의 에틸알코올로 세척한 액체를 수집하여 농축 건조시켜 유효부위 추출물을 얻는다(출원번호 03115911.7의 중국 특허 출원 중 실시예 1에 따라 조작한다).
샘플 11: 대엽구약의 전초를 취하여 초임계추출법으로 추출물을 조제한다. 구체적으로는 다음과 같다:
대엽구약 약재를 입자가 굵은 분말로 만들어 추출 캔에 담고, 각 추출 분리 캔을 예정된 상태까지 가열한 다음, 압력을 예정값까지 올려 유동 추출을 시작하며, 매 회 재료를 200g 투여한다. 사용된 추출 조건은 압력 300MPa, 온도 40℃, 추출시간 2hr, CO2 유량 20m2/h이다. 분리캔은 감압밸브를 통하여 상압까지 압력을 내린 후 추출물을 얻는다.
대엽 구약 추출물의 조제
샘플번호 |
약재 |
전처리방식 |
유기용제 |
추출방식 |
정제방식 |
1-1 |
뿌리, 뿌리줄기 |
자르기 |
에틸알코올 |
여과 |
대공수지 |
1-2 |
뿌리, 뿌리줄기 |
자르기 |
에틸알코올 |
열여과 |
대공수지 |
2 |
뿌리줄기,잎사귀 |
가루내기 |
에틸알코올 |
여과 |
알코올추출 물침전법 |
3 |
전초 |
자르기 |
산성수 |
침적 |
산 추출 알칼리 침전법 |
4 |
뿌리, 뿌리줄기 |
자르기 |
에틸알코올 |
열여과 |
실리카겔 컬럼 |
5 |
뿌리, 넝쿨줄기 |
가루내기 |
에틸에테르 |
침적 |
폴리아미드 컬럼 |
6 |
뿌리, 뿌리줄기 |
자르기 |
산성수 |
여과 |
이온교환 |
7 |
뿌리,넝쿨줄기 |
가루내기 |
클로로포름 |
여과 |
- |
8 |
전초 |
가루내기 |
에틸아세테이트 |
여과 |
대공수지 |
9 |
뿌리 |
자르기 |
알칼리수 |
침적 |
유기용제추출 |
10* |
뿌리, 뿌리줄기 |
가루내기 |
에틸알코올 |
회류 |
대공수지 |
11 |
전초 |
가루내기 |
초임계유체추출 |
*: 대조 용도로 사용하기 위해 회류법으로 조제한 대엽 구약 추출물
실시예 2. 대엽구약 추출물로 약물을 조제하는 방법
실시예 1로 얻은 대엽구약 추출물을 약물 원료로 하여, 약학 분야의 일반적인 생산 방법에 따라 캡슐제, 알약, 과립제, 산제, 점적 환제, 미립 환제, 주사제, 분말주사제, 내복액체제제, 서방제제, 제어방출제제, 표적제제 등 각종 약제 형태로 조제할 수 있다.
2.1 캡슐제
- 처방:
대엽구약 추출물 10g; 옥수수전분 80g; 마그네슘 스테아레이트 8g; 항산화제 2g.
- 조제 방법:
추출물을 전분, 마그네슘 스테아레이트, 항산화제와 고르게 섞어 체에 거르고, 미리 제조된 1000립 빈 캡슐에 고르게 채운 후 밀봉한다. 1립 당 충전재료 중량은 100mg이고, 그 중 정제 추출물의 양은 10mg이다.
2.2 과립제
- 처방:
대엽구약 추출물 20g; 가용성 전분 380g; 덱스트린 200g.
- 조제 방법:
추출물을 가용성 전분 및 덱스트린과 고르게 섞은 후 눌러 큰 덩어리로 만든 다음, 다시 체에 내리고, 건조시켜 1000봉으로 나누어 담는다.
2.3 정제
- 처방:
대엽구약 추출물 30g; 전분 100g; 덱스트린 30g; 자당 20g; 활석분 12g; 마그네슘 스테아레이트 5g; 항산화제 3g.
- 조제 방법:
추출물을 건조시키기 전 전분, 덱스트린, 자당을 첨가하여 과립으로 만들고, 건조 후 활석분, 마그네슘 스테아레이트, 항산화제를 정제 1000립에 고르게 섞어, 당의를 입힌다.
실시예 3. 체외의 5-HT, 노르아드레날린 및 도파민 재섭취에 대한 억제작용
연구 결과, 시냅스 간극 중 노르아드레날린의 제거와 불활화의 가장 주요한 생리 기전은 신경말초의 재섭취로서, 코카인, 모종의 페닐에틸아민 화합물과 항우울제는 모두 그 재섭취 과정을 억제할 수 있으며, 항우울제는 아드레날린 수용체의 하향조절(down regulation)을 일으키는 가장 중요한 기전 중 하나임을 나타내었다. 세로토닌성(serotonergic)및 도파민 신경 기능의 생리기전은 5-HT와 유사한 점이 있다. 임상 실험에서 유효한 많은 항우울제는 노르아드레날린과/또는 5-HT/ 또는 도파민의 재섭취를 차단할 수 있었다. 본 실험은 화합물이 큰쥐의 뇌 시냅스의 재섭취 기능을 억제하는지 여부 및 항우울제 등 모노아민 전달물질(재)섭취 억제제로서의 잠재적 가치를 검측하는데 이용될 수 있다.
먼저, Whittacker 등의 방법(Whittaker VP & Barker LA. The subcellular tractionation of brain tissue with special reference to the preparation of syaptosomes and their component organelles. In: Fried R. ed. In Methods in Neurochemistry, Vol. New York: Marcel Dakker, Inc, 1972)을 참고하여 뇌 시냅스를 조제한다. 구체적으로는 큰 쥐의 머리를 자른 후 신속하게 대뇌를 추출하여, 예냉된 생리 식염수에 담고, 연뇌막 및 혈관조직을 제거한다. 대뇌피질층을 취하여, 차가운 자당 용액에 담근다. 초음파 세포 분쇄기로 균질화, 원심분리하여, 정제된 뇌 시냅스를 준비해둔다.
《현대의학실험방법》(왕겸 책임 편집, 북경 인민 위생 출판사, 1997) 및 《현대약리실험방법학》(장균전 책임 편집, 북경 의과대학 중국협화의과대학 연합출판사, 1998)의 방법을 참고하여, 실험관에 먼저 트리스-크랩스(Tris-Krebs) 완충액을 첨가하고, 이어서 시냅스 소형체 현탁액을 첨가한 후, 대엽구약 추출물(샘플 1-1) 10㎕을 첨가하여 고르게 혼합하고, 37℃의 수조에서 온욕시킨다. 4℃의 환경에서 10㎕의 바탕물질(3H-5HT, 3H-NA 또는 3H-DA; 종결반응농도: 300nM)을 넣어 고르게 섞고, 37℃의 수조에서 5min 동안 온욕시킨다. 그런 다음 각 실험관마다 예냉한 Tris-Krebs 완충액을 주입하여 반응을 종결시키고, 신속하게 멀티헤드 세포 수집기를 사용하여 유리섬유여과필름으로 여과한 다음, 동일한 체적의 동일한 용액을 이용하여 실험관과 여과기를 세척한다. 여과필름을 떼어내어 건조시키고, 여과필름을 섬광 플라스크에 넣어 톨루엔 섬광액을 주입한 후, β-액체 섬광계수기로 계수한다. 결과는 표 3에 도시된 바와 같다.
대엽구약 추출물의 뇌 시냅스의 5-HT, 노르아드레날린 및 도파민 섭취에 대한 억제 작용
샘플1-1 (종결반응농도) |
양성 대조약 |
모노아민 재섭취에 대한 억제작용(CPM) |
5-HT |
노르아드레날린 |
도파민 |
|
0℃ |
1114 |
1519 |
1265 |
|
37℃ |
1362 |
1671 |
1606 |
|
플루오세틴(0.1mM) |
1101 |
|
|
|
데시프라민(0.1mM) |
|
1499 |
|
|
파르길린(0.1mM) |
|
|
1197 |
0.064㎍/ml |
|
1341 |
1674 |
1587 |
0.32㎍/ml |
|
1329 |
1580 |
1326 |
1.6㎍/ml |
|
1261 |
1490 |
1201 |
8㎍/ml |
|
1191 |
1159 |
1003 |
40㎍/ml |
|
927 |
1144 |
956 |
200㎍/ml |
|
692 |
975 |
735 |
1000㎍/ml |
|
465 |
680 |
487 |
표 3의 결과에서, 정상체온(37℃) 하에서의(이 조건 하에, 각 모노아민에 대한 섭취는 정상적인 주동 섭취이다) 세 가지 모노아민의 재섭취량값(CPM값)과 비교해보면, 본 발명인 대엽구약 추출물은 0.064㎍/ml의 농도를 초과한 상태에서 세 가지 모노아민 주동 섭취에 대한 억제작용이 나타났고(CPM 값이 정상치보다 낮다), 40㎍/ml의 농도에서는 즉 뇌 시냅스의 5-HT에 대한 섭취 작용을 완전히 억제했으며, 그 작용 강도는 0.1mM의 플루오세틴과 맞먹는다는 것을 알 수 있다.
농도가 200~1000㎍/ml까지 증가했을 때, CPM값은 0℃의 CPM 값보다 낮아 시냅스의 5-HT에 대한 비특이성 확산 역시 억제되었음을 알 수 있으며, 그 IC50은 4.2㎍/ml(종결반응농도)이다. 그리고 NA에 대한 억제작용은 더욱 강하여, 1.6㎍/ml일 때 거의 완전하게 뇌 시냅스의 NA에 대한 섭취 작용을 억제하였다. 그 작용 강도는 0.1mM의 데시프라민과 맞먹는다. 마찬가지로, 농도가 200㎍/ml 이상까지 증가했을 때, 시냅스의 NA에 대한 비특이성 확산 또한 완전히 억제되었으며, 그 IC50은 0.34㎍/ml(종결반응농도)이다. 실험약물 A의 DA에 대한 억제작용은 5-HT와 NA 사이이며, 그 IC50은 1.1㎍/ml(종결반응농도)이다.
따라서 본 발명인 대엽구약 추출물은 큰쥐의 뇌 시냅스의 5-HT, NA와 DA(재)섭취에 대하여 모두 뚜렷한 억제작용을 지니고 있어, 5-HT, 노르아드레날린 및 도파민 등 모노아민 전달물질 대사와 관련된 (정신)질병을 치료하거나/ 또는 예방하는 약물, 건강보조식품 또는 식품첨가제로 이용할 수 있다.
실시예 4. 5-하이드록시트립토판이 유도하는 작은쥐의 머리 흔들기 행위
5-하이드록시트립토판(5-HTP)은 5-HT의 전구물질로서, 모노아민 산화효소 억제제인 파르길린이 그 대사를 억제할 수 있으며, 항우울제를 더 투여하면 작은쥐의 특징적 증상인 머리 흔들기 행위를 관찰할 수 있다.
작은 쥐를 무작위로 그룹을 나누어, 각 그룹마다 표 4에 도시된 상응하는 약제량을 위에 주입한다. 실험약물 A는 실시예로 얻어진 대엽구약 추출물 샘플 1-1이며, 매일 1회 연속 7일 동안 투여하며, 동시에 생리식염수그룹과 대조한다. 마지막 1회 투여한지 1시간 후, 모든 4그룹의 작은 쥐에 염산 파르길린을 피하주사하고, 90min 이후에 모든 4 그룹의 작은 쥐의 꼬리정맥에 5-HTP를 주사하여, 동물 투약 후의 반응을 관찰하고 기록한다. 결과는 표 4와 같다.
작은 쥐의 위장 투약의 5-HTP 증강작용에 대한 실험 결과(n = 10, Ridit 검사)
약물 |
약제량(mg/kg/d) |
머리흔들기 반응 정도 |
|
0 |
Ⅰ |
Ⅱ |
Ⅲ |
Ⅳ |
CK- |
- |
6 |
4 |
0 |
0 |
0 |
A |
20 |
0 |
3 |
1 |
2 |
4 |
A |
10 |
0 |
3 |
3 |
2 |
2 |
A |
5 |
2 |
5 |
3 |
0 |
0 |
CK-: 생리식염수 용액
정상대조군과 A의 약제량 비교: R = 2.05 P<0.05
정상대조군과 A의 약제량 비교: R = 2.05 P<0.05
정상대조군과 A의 약제량 비교: R = 1.06
판단표준: U>1.96, P<0.05; U>2.58, P<0.01
표 4의 결과에 나타나있듯이, 5-HTP를 투여한지 15min 이후에, 작은 쥐에게서 각기 정도가 다른 머리 흔들기 반응이 나타나기 시작했으며, 그 중 20mg/kg의 약제량 그룹의 머리 흔들기 증상이 가장 뚜렷했고, 또한 출현한 양성반응 동물의 수도 가장 많았다. 공백 대조그룹의 머리 흔들기 증상은 가장 가벼웠다. 2hr 이후 공백 대조 그룹은 모두 정상으로 회복하였으며, 실험약물 A를 투여받은 3개의 약제량 그룹에서는 여전히 정도가 다른 머리 흔들기 증상을 보였다. 이로써 본 발명의 대엽 구약 추출물은 5-HTP가 유도하는 작은 쥐의 머리 흔들기 행위를 더욱 증가시켰으며, 나아가 체내에서 5-HT의 섭취를 억제하는 작용이 검증되었음을 알 수 있다.
실시예 5. 작은 쥐 요힘바인 증강 모델
요힘바인은 α2 수용체 길항제이기 때문에, α2 수용체와 결합할 수 있으며, 나아가 NA와 수용체의 결합을 저지시킨다. NA의 재섭취를 억제하거나 또는 NA의 활성 상실을 억제하는 항우울제를 만약 요힘바인과 함께 사용하면 NA의 농도가 증가되기 때문에 동물이 중독되어 사망할 수가 있다. 따라서 본 실험의 목적은 체내 실험을 통하여 본 발명인 대엽구약 추출물의 NA 재섭취를 억제하는 작용을 증명하기 위한 것이다.
작은 쥐를 무작위로 그룹을 나누어, 각 그룹을 표 5에 도시된 바와 같이 상응하는 약제량을 위에 투약한다. 실험약물 A는 실시예로 얻어진 대엽구약 추출물 샘플 1-1이며, 매일 1회, 연속 7일간 투여하고, 동시에 생리식염수그룹과 대조한다. 마지막 1회 투여한지 1hr 후, 모든 4 그룹의 작은 쥐에게 모두 염산 요힘바인을 피하주사하여, 요힘바인 투여 후 1, 2, 4, 5 및 24시간 동안 각 그룹 동물의 사망률을 관찰하고 기록한다. 결과는 표 5에 도시된 바와 같다.
작은 쥐 위장 투약의 요힘바인 독성 증강 작용에 대한 실험 결과(n=10)
약물 |
약제량(mg/kg/d) |
동물사망상황 |
|
1h 2h 4h 5h 24h |
CK- |
- |
0 0 0 0 0 |
A |
20 |
2 0 0 0 0 |
A |
10 |
1 0 0 0 0 |
A |
5 |
0 0 0 0 0 |
A |
2.5 |
0 0 0 0 0 |
CK-: 생리식염수 용액
각 그룹의 동물에게 요힘바인을 투여한 지 20분 후, 모두 정도가 다른 중추신경 계통의 흥분성 증가 현상이 나타났으며, 쉽게 흥분하고 근육이 떨리는 등 증상이 나타났고, 개별적인 작은 쥐는 입과 코에서 출혈이 있었으며, 20mg/kg의 ADP 그룹에서의 동물들의 반응이 가장 강렬했다. 표 5의 결과에서 나타난 바, 1시간 이후 20mg/kg 및 10mg/kg의 실험약물 A 약제량 그룹에서 사망이 발생하였다. 이는 본 발명인 대엽구약 추출물이 요힘바인의 독성 작용을 증강시킬 수 있음을 설명하는 것으로, 나아가 체내에서 본 발명인 대엽구약 추출물이 NA 섭취를 억제하는 작용을 일으키는 것으로 검증되었다.
실시예 6. 작은 쥐 뇌내 모노아민 산화효소에 대한 억제작용
모노아민 산화효소(MAO)의 생물학적 작용은 체내의 내원성 아민류(노르아드레날린, 도파민과 5-HT) 및 외원성 아민류의 물질이 균형을 이루도록 조절하는 것이다. 그 바탕물질과 억제제의 특이성을 근거로, 모노아민 산화효소를 두 가지 유형(MAO-A, MAO-B)으로 구분할 수 있다. 도파민과 티라민은 두 가지 MAO의 바탕물질이고, 5-HT와 갑상선호르몬은 A형 바탕물질이며, β-페닐에틸아민과 벤질아민은 B형의 바탕물질이고, 이소프렌 이소니아지드와 트라닐시프로민은 MAO의 비선택성 억제제이다. clorgyline은 MAO-A의 선택성 억제제이고, deprenyl과 파르길린은 MAO-B의 선택성 억제제이다. MAO 억제제에 항우울 작용이 있기 때문에, 본 추출물에 대하여 MAO 억제 작용 여부가 있는지 연구를 진행함으로써, 그 항우울 작용 기전을 가능한 한 많이 이해할 수 있도록 할 필요가 있다.
작은 쥐를 무작위로 그룹을 나누어, 각 그룹에 표 6에 도시된 바에 따라 상응하는 약제량의 실험약물 A(실시예 1의 샘플 1-1)를 위장 투여한다. 매일 1회, 연속 14일 동안 투여하고, 동시에 생리식염수그룹과 대조한다. 양성 대조군은 파르길린이다. 마지막 회 투약 1시간 후 동물에게서 경추를 떼어내어 신속하게 뇌를 꺼내 MAO 활성을 검측한다. 鄭莉 등의 방법(관엽개나리 추출물의 모노아민 산화효소와 모노아민 전달물질에 대한 영향, 중국 약과대학학보, 2002, 33(2): 138-141)에 따라 자외선 분광 광도계로 광밀도 값을 측정하였다. 결과는 표 6과 같다.
각기 다른 농도의 실험약물A의 작은 쥐 뇌내 MAO-A, B에 대한 억제작용(n=10, x± SD)
약물 |
약제량 |
MAO-A(OD) |
MAO-B(OD) |
CK- |
- |
0.025±0.007 |
0.04±0.007 |
CK+ |
25mg/kg |
0.012±0.005** |
0.025±0.008** |
A |
20mg/kg |
0.024±0.008 |
0.041±0.008 |
A |
10mg/kg |
0.026±0.009 |
0.039±0.008 |
A |
5mg/kg |
0.026±0.007 |
0.041±0.006 |
CK-: 생리식염수 용액; CK+: 파르길린
**: P<0.01; 공백 대조군과 비교
표 6의 결과에 나타난 바와 같이, 실험약물 A의 3개의 약제량 그룹은 작은쥐 뇌내 MAO-A와 B의 활성에 대하여 모두 억제작용이 없었다. 이는 본 발명인 대엽구약 추출물의 항우울 작용이 MAO-A 및 B의 활성과 무관함을 설명해준다.
실시예 7. 작은 쥐 수영 실험
Porsolt 등은 행위 절망 시험을 항우울제 작용의 평가 모델로 삼을 수 있음을 제시하였다. 이 모델은 작은 쥐 또는 큰 쥐가 하나의 도망칠 수 없는 제한된 공간 속에서 수영하도록 하여, 동물이 부동 상태를 나타내도록 유도할 수 있다. 상기 상태는 동물의 절망 행위를 반영하며, 상기 상태는 유효한 항우울제에 의해 억제될 수 있다.
표 7에 도시된 바와 같이, 작은 쥐를 무작위로 그룹으로 나누어, 각 그룹을 도시된 약제량에 따라 시약 A(실시예 1의 샘플 1-1), B(실시예 1의 샘플 10), C(실시예 1의 샘플 7), D(실시예 1의 샘플 3), E(실시예 1의 샘플 5), F(실시예 1의 샘플 9)와 G(실시예 1의 샘플 11)를 위장에 투여한다. 매일 1회, 연속 14일 동안 투약하고, 동시에 생리식염수그룹과 대조한다. 양성 대조군은 플루오세틴이다. 14일째에 투약한지 1시간 후, 동물을 10× 20cm, 수심 8~10cm의 유리 원형통 내부에 넣는다. 수온은 22~24℃이다. 2분 째부터 시작하여 4분 이내의 부동 누계 시간을 기록한다. 결과는 표 7과 같다.
작은 쥐 위장 투약 수영시험 결과(n=10, x± s)
약물 |
약제량(mg/kg/d) |
누계 부동 시간(s) |
CK- |
- |
121.4±17.7 |
CK+ |
30 |
73.7±17.2** |
A |
10 |
84.0±15.3** |
A |
5 |
93.5±13.3** |
A |
2.5 |
107.1±24.8 |
B |
10 |
112.7±13.0 |
B |
30 |
107.7±12.5 |
B |
60 |
96.6±16.7* |
C |
30 |
79.3±16.5** |
D |
30 |
68.4±12.6** |
E |
30 |
81.8±8.3** |
F |
30 |
76.7±13.3** |
G |
30 |
73.9±18.2** |
CK-:생리식염수 용액; CK+: 플루오세틴
**: P<0.01; *:P<0.05; 공백 대조그룹과 비교
ED50치(A): 4.56mg/kg
결과에 나타난 바로는 플루오세틴과 실험약물 A의 20, 10 및 5mg/kg 3 약제량 그룹에서 모두 작은 쥐가 수영을 멈추고 움직이지 않는 시간이 현저히 단축되었으며, 공백 대조그룹과 비교해보면, P값이 모두 0.01보다 작았다. 5mg/kg의 약제량은 즉 우수한 항우울 작용을 나타내었으며, 또한 그 약효 작용은 우수한 양-효능 관계를 보여주고 있다. 실험 약물 C-G는 30mg/kg의 약제량에서 활성이 실험약물 A에 맞먹는 동시에 동등한 약제량의 실험약물 B보다 현저하게 우수하였다.
이로써 본 발명인 대엽구약 추출물(실험약물 A, C-G)은 현저한 항우울 작용을 지니고 있고, 또한 여과 정제를 거친 후 추출물의 활성은 기존의 회류 공법으로 조제한 대엽구약 추출물(실험약물 B)보다 현저하게 높음을 알 수 있다.
실시예 8. 큰 쥐 수영 시험
큰 쥐를 4hr 동안 금식시킨 후, 40× 18cm, 수심 15cm(수온 25℃)의 유리 원형통 안에 넣어 15분 동안 수영시킨 후 드라이기로 건조시킨다. 그런 다음 표 8에 도시된 바와 같이 큰 쥐를 무작위로 6그룹으로 나누어, 각 그룹에 상응하는 약제량에 따라 실험약물 A(실시예 1의 샘플 1-1), B(실시예 1의 샘플 10)를 위장 투약한다. 매일 1회, 연속 14일 동안 투약하고, 생리식염수그룹과 대조한다. 양성 대조그룹은 벤라팍신이다. 마지막 1회 투약한지 1시간 후 큰쥐의 수영 시험을 진행한다. 수영 지속 시간은 5min이며, 5min 이내에 수영을 멈추고 움직이지 않는 시간을 기록한다. 결과는 표 8과 같다.
큰 쥐 위장 투약 수영 시험 결과(n=10, x± s)
약물 |
약제량(mg/kg/d) |
누계 부동시간(s) |
CK- |
- |
243.8±20.1 |
CK+ |
30 |
211.2±24.7* |
A |
10 |
187.1±38.2** |
A |
5 |
197.4±47.9* |
A |
2.5 |
222.7±20.2* |
B |
20 |
238.6±22.4 |
CK-: 생리식염수 용액; CK+:벤라팍신
**: P<0.01; *: P<0.05; 공백 대조 그룹과 비교
ED50치: 1.85mg/kg
결과에서, 벤라팍신과 실험약물 A의 10, 5 및 2.5mg/kg 3개의 약제량 그룹에서 큰 쥐가 수영을 멈추고 움직이지 않는 시간이 현저하게 단축되었음이 나타났다. 공백 대조 그룹과 비교해보면, P값은 모두 0.05보다 낮고, 2.5mg/kg의 약제량은 즉 우수한 항우울 작용을 나타내고 있으며, 또한 그 약효 작용은 우수한 양-효능 관계를 보여주고 있다.
대조해본 결과, 본 발명인 대엽구약 추출물(실험약물 A)의 약제량이 2.5mg/kg일 때의 생물 활성이 실험약물 B(회류법 조제)의 20mg/kg보다 높다는 것을 발견하였으며, 이는 여과 정제의 조제 공정을 거쳐 얻어진 본 발명의 대엽구약 추출물의 생물 활성이 종래의 회류 공정으로 조제한 대엽구약 추출물(실험약물 B)보다 현저히 높음을 설명해준다.
실시예 9. 작은 쥐 꼬리 매달기 실험
꼬리 매달기 실험은 Stern 등이 1985년에 소개한 일종의 항우울제를 평가하는 간단한 실험 방법이다. 도망칠 수 없는 스트레스 조건 하에서, 설치류 동물이 나타내는 부동 상태는 그 행위의 절망을 반영하며, 인류의 우울 상태를 시뮬레이션할 수 있다. 임상의 유효한 항우울제는 작은 쥐의 꼬리를 매단 후 노력을 해도 성공적으로 도피할 수 없을 때의 움직이지 않는 시간을 단축시킬 수 있다.
작은 쥐를 무작위로 그룹을 나누어, 각 그룹에 상응하는 약제량에 따라 실험약물 A(실시예 1의 샘플 1-1), B(실시예 1의 샘플 10), C(실시예 1의 샘플 7), D(실시예 1의 샘플 3), E(실시예 1의 샘플5)를 위장 투약한다. 매일 1회, 연속 14일 동안 투여하고, 생리식염수그룹과 대조한다. 양성 대조그룹은 벤라팍신이다. 마지막 1회에 투약한지 1시간 후 작은 쥐의 꼬리 매달기 실험을 실시하며, 지속시간은 6min으로, 6min 이내의 정지하여 움직이지 않는 시간을 기록한다. 결과는 표 9와 같다.
작은 쥐 위장 투약 꼬리 매달기 실험 결과(n=10, x± s)
약물 |
약제량(mg/kg/d) |
누계 부동 시간(s) |
CK- |
- |
156.4±78.6 |
CK+ |
50 |
57.5±43.0** |
A |
20 |
80.1±41.1* |
A |
10 |
86.1±43.6* |
A |
5 |
87.5±59.6* |
A |
2.5 |
106.7±40.6
|
B |
20 |
148.6±33.9
|
C |
20 |
93.3±12.4* |
D |
20 |
89.4±16.3* |
E |
20 |
92.4±12.5* |
CK-: 생리식염수 용액; CK+: 벤라팍신
**: P<0.01; *: P<0.05; 공백 대조그룹과 비교
ED50치: 3.49mg/kg
실시예 10. 항초조작용 - 작은 쥐 4판 실험
작은 쥐를 랜덤으로 그룹을 나누어, 표 10에 따라 각각 실험약물 A(실시예 1의 샘플 1-1), B(실시예 1의 샘플 10), C(실시예 1의 샘플 7), F(실시예 1의 샘플 9)와 G(실시예 1의 샘플 11)를 투여하고, 생리식염수그룹과 대조한다. 양성 대조그룹은 디아제팜이다. 투약한지 30min 후 작은 쥐를 판 위에 올려놓고 이를 15s 동안 탐구한다. 그런 다음, 작은 쥐가 하나의 판으로부터 다른 판으로 건너갈 때 전류 강도가 0.35mA이고, 0.5s동안 지속되는 전기 충격을 1회 실시한다. 작은 쥐는 이로 인해 뚜렷한 도피 반응을 나타낼 때마다, 통상적으로 2개의 판 또는 3개의 판을 지나게 된다. 만약 작은 쥐가 계속 달아나면, 이후의 3분 동안은 전기충격을 주지 않는다. 10min 이내의 전기 충격수를 기록한다. 결과는 표 10과 같다.
항초조 작용의 실험 결과(n=8, x± s)
약물 |
약제량(mg/kg) |
누계 전기충격수 |
CK- |
- |
4.80±1.63 |
CK+ |
1 |
12.78±2.05** |
A |
20 |
8.64±2.14* |
A |
10 |
7.43±1.32* |
B |
20 |
5.08±1.05 |
B |
40 |
7.32±1.01* |
C |
20 |
7.65±2.09* |
F |
20 |
8.98±3.21* |
G |
20 |
9.67±1.72* |
CK-: 생리식염수 용액; CK+: 다이제팜
**: P<0.01; *: P<0.05; 공백 대조 그룹과 비교
표 10의 결과에서, 전기충격은 작은쥐의 운동 활성을 현저히 감소시킬 수 있으며, 디아제팜과 본 발명인 대엽구약 추출물(실험약물 A, C, F, G)은 모두 전기 충격수를 증가시킬 수 있음을 나타내고 있다. 이는 본 발명의 대엽구약 추출물이 비교적 강한 항초조 작용을 지니고 있으며, 또한 동일한 약제량에서 생물 활성이 종래의 회류 공정으로 얻어진 대엽구약 추출물(실험약물 B)보다 높다는 것을 설명해준다.
실시예 11. 진정작용 - 오픈 필드(open field) 실험
작은 쥐를 무작위 그룹으로 나누어, 표 11에 따라 각각 실험약물 A(실시예 1의 샘플 1-1), C(실시예 1의 샘플 7) 및 B(실시예 1의 샘플 10)를 투여하고, 동시에 생리식염수그룹과 대조한다. 양성 대조그룹은 카바락톤(Kavalactones) 추출물이다. 30분 후 작은 쥐를 높이 35cm의 원기둥형 상자에 넣는다. 상자 바닥은 변의 길이가 5cm인 정방형 격자로 고르게 나눈다. 작은 쥐가 환경에 적응한 지 3분 후, 4분 째부터 그 후 5분 이내에 작은 쥐가 지나간 격자수를 기록한다. 결과는 표 11과 같다.
진정 작용 실험 결과(n=8, x± s)
약물 |
약제량(mg/kg) |
누계 지나간 격자수 |
CK- |
- |
167.38±8.70 |
CK+ |
100 |
136.43±6.86* |
A |
40 |
133.87±9.41* |
A |
20 |
154.74±10.23 |
C |
40 |
139.78±9.61 |
B |
40 |
151.33±5.72 |
CK-: 생리식염수 용액; CK+: 카바락톤 추출물
**: P<0.01; *: P<0.05; 공백 대조그룹과 비교
표 11의 결과에서, 카바락톤 추출물과 본 발명의 대엽구약 추출물은 작은 쥐가 격자를 지나가는 횟수를 감소시킬 수 있음을 나타내고 있다. 이는 본 발명의 대엽구약 추출물(실험약물 A, C)이 비교적 강한 진정작용이 있을 뿐만 아니라, 생물활성이 종래의 회류 공정으로 조제된 추출물(실험약물 B)보다 높다는 것을 설명해준다.
실시예 12. 진통작용 - 몸부림 실험(writhing test)
일정한 용제와 농도를 지니는 화학 자극물질을 작은쥐의 복강 내에 주입하여 내장층과 벽층 복막을 자극하고, 심부의 비교적 넓은 면적에 장시간 동안 염증성 동통을 일으킴으로써 작은쥐의 복부가 안으로 함몰하고, 몸통과 뒷다리가 늘어지며, 둔부가 솟아오르는 등 행위 반응이 나타나도록 하는 것을 몸부림 반응이라고 한다. 상기 반응은 주사 후 15분 이내에 출현 빈도가 높으며, 따라서 주사 후 15분 이내에 발생하는 몸부림 횟수 또는 반응이 발생하는 쥐의 수로 동통 정량 지표를 삼는다.
작은 쥐를 무작위로 그룹을 나누어, 표 12에 따라 실험약물 A(실시예 1의 샘플 1-1), C(실시예 1의 샘플 7) 및 B(실시예 1의 샘플 10)를 투여하고, 동시에 생리식염수그룹과 대조한다. 양성 대조그룹은 아세틸살리실산이다. 30분 후, 각각 복강에 0.02%의 벤조퀴논 수용액 0.20ml를 주사한 후, 즉시 작은 쥐를 사방이 밀폐된 상자 안에 넣는다. 작은 쥐에 첫 번째 몸부림 반응이 나타난 때부터 10분 동안 시간을 재어, 이 후 10분 이내의 작은쥐 몸부림 횟수를 기록한다. 결과는 표 12와 같다.
진통작용 실험 결과(n=10, x± s)
약물 |
약제량(mg/kg) |
누계 몸부림 횟수 |
CK- |
- |
29.25±2.62 |
CK+ |
50 |
9.89±1.09** |
A |
80 |
10.34±1.44** |
A |
40 |
14.25±2.47* |
C |
80 |
16.25±0.90* |
B |
80 |
20.97±1.23 |
CK-: 생리식염수 용액; CK+: 아세틸살리실산
**: P<0.01; *: P<0.05; 공백 대조그룹과 비교
표 12의 결과에서, 아세틸살리실산과 본 발명의 대엽구약 추출물(실험약물 A, C)은 모두 작은쥐의 몸부림 횟수를 현저하게 감소시켰음을 나타낸다. 이는 본 발명의 대엽구약 추출물이 비교적 강한 진통작용이 있을 뿐만 아니라, 생물 활성이 종래의 회류 공정으로 조제된 대엽구약 추출물(실험약물 B)보다 높다는 것을 설명해준다.
출원인이 이전에 출원했던 출원번호가 각각 00119452.6과 03115911.7인 중국 특허에서 공개한 대엽구약 추출물은 회류법으로 조제된 것이기 때문에, 과정 중 채택했던 상대적으로 높은 온도의 조작은 추출물 중 활성성분을 비교적 많이 파괴하게 되므로, 추출물의 약리활성 및 안전성이 좋지 않았다. 그러나 본 발명의 방법은 침적, 여과 및 저온 농축 건조 등 방식을 이용하기 때문에, 추출물 중 활성 성분의 파괴가 비교적 적고, 생물알칼리 및 리그난(lignans) 등 성분을 상당한 정도로 보존할 수 있어, 종래의 회류방법으로 조제한 추출물과 비교하였을 때, 본 발명의 대엽 구약 추출물은 생리활성이 현저하게 향상되었다.
이상의 실시예에서, 본 발명의 방법으로 조제된 대엽구약 추출물은 5-HT, 노르아드레날린 및 도파민 등 모노아민 전달물질의 재섭취를 효과적으로 억제할 수 있음을 쉽게 알 수 있다. 따라서 모노아민 전달물질 대사와 관련된 정신질병을 치료하거나/ 또는 예방하는 약물, 건강보조식품 또는 식품첨가제로 이용될 수 있다. 이러한 모노아민 전달물질 대사와 관련된 질병은 정신분열증, 조증, 정신적 장애, 침묵증, 기질성 정신장애 증후군, 강박증, 우울증, 초조증, 수면장애, 전간, 파킨슨 증후군, 두통, 신경통, 노인성 치매를 포함하되 이에 국한되지 않는다.