KR100527912B1 - 항알레르기 추출물 제조방법 - Google Patents

항알레르기 추출물 제조방법 Download PDF

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Abstract

본발명은 알레르기성비염, 천식, 아토피성 피부염등의 알레르기 관련 질병등에 치유효과가 있는 생약 추출물의 제조방법에 관한 것으로서, 마황추출물, 신이추출물, 지실추출물, 토천궁추출물, 박하추출물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로하는 생약추출물임을 특징으로하는 항알레르기추출물의 제조방법.

Description

항알레르기 추출물 제조방법{anti-allergic an extract manucture method}
본발명은 알레르기반응 개선을 위한 생약 항랄레르기 추출물의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 자세하게는 마황, 신이, 지실, 토천궁 박하등의 생약 추출물을 주성분으로하여 알레르기성 비염, 피부염,천식등의 즉시형 알레르기 반응을 억제할 수 있는 항알레르기 추출물의 제조방법에 관한 것이다.
알레르기 관련질병은 최근에 급격히 증가하고 있는 데 이 경향은 앞으로 더 심화될 것이라는 것이 대부분의 전문가들의 생각이다. 이러한 알레르기를 억제하거나 줄여줄 수 있는 약제의 개발은 그동안 많은 나라의 제약회사등에서 아주 중요한 프로젝트로 수행해오고 있으며 그러한 노력으로 사이클로스포린 A혹은 FK 506등의 약물이 개발되게 되었다.
사이클로스포린 A(CsA)또는 FK506은 곰팡이로부터 유래되는 면역억제성 천연물질로서, T세포속에서 두물질은 다수의 유전자들의 전사를 억제한다. 사이클로스포린은 사이클로필린(Cyp)과 FK506은 특이 결합단백질(FKBP)과 결합하여 콤플렉스를 이루고 다시 이착물은 칼시노이린(Calcineurin;CN)과 결합되어 칼시노이린의 탈인산화 효소(phosphatase)활성을 억제한다.
억제된 CN활성으로 IL2생성이 억제된다. 알레르기성, 천식성질환은 T세포와 이의 매개체에 의해 제어되는 염증반응에 기초한다.
코르코스테로이드(corticosteroid)은 여전히 가장 많이 선택되는 치료제이고 싸이클로스포린, FK506은 동물실험과 임상연구에 모두 기관지 천식등의 내재하는 염증치료에 유용한 치료제임이 입증되었다.
그러나 이들은 높은 면역억제능과 한께 다양한 부작용, 특히 신장독성과 신경독성이 보고된다. 따라서 이러한 면역억제제의 공지된 의약적 치료효과는 상당히 제한적일 수 밖에 없고 특히 장기요법에서 문제가 될 수 있다.
본 발명은 우리나라에서 사용하고 있는 생약등에서도 알레르기를 억제하는 성분이 있음을 한방임상적 혹은 경험등으로 확인한 바 있고, 이들 중 효과가 더욱 뛰어난 몇가지 천연생약성분을 이용하여 이를 실험하여 그 효능을 확인한 항알레르기 추출물의 제조방법을 제공하고자 한다.
본발명은 알레르기반응 개선용 생약 항알레르기 추출물의 제조방법에 관한 것으로서 보다 자세하게는,
마황, 신이, 지실, 토천궁 박하등의 생약 추출물을 주성분으로하여 알레르기성 비염, 피부염,천식등의 즉시형 알레르기 반응을 억제할 수 있는 항알레르기 생약 추출물을 제공하기 위한 것이다.
과민반응(Hypersensitivity) 또는 알레르기(Allergy)라는 것은 외부로부터 들어온 항원을 체내에서 면역반응에 의해 제거되는 과정에서 정상적인 반응과는 달리 오히려 해로운 영향을 미치게 될 때를 일컫는 말이다.
과민반응은 항상 정상적인 반응보다 증가됐을 때를 말하는 것은 아니고 포괄적으로 항원에 대한 부적절한 면역반응도 모두 포함한다. 과민반응은 그 과정에서 생성되고 관여하는 effector molecules에 따라 여러가지의 형태로 나뉜다.
즉시형과민반응(Immediate hypersensitive reaction)의 경우 antibody isotypes에 따라 다른 면역반응작동분자(immune effector molecule)를 유도한다. 즉, IgE는 비만세포(mast cell)의 탈과립을 유도하여 히스타민을 비롯한 생물학적 활성을 갖는 effector molecules을 생성시키며, IgG 와 IgM은 보체 (complement)를 활성화 시킴으로써 과민반응을 유발한다. 후자의 경우 주된 effector molecules은 membrane-attack complex 나 보체 활성화 과정의 산물들인 C3a, C4a 그리고 C5등이다. 지연형과민반응(Delayed-type hypersensitivity reaction)의 경우 관련 T cell에서 분비되는 여러가지 cytokine들이 effector molecules에 해당된다
allergy는 반응하는 항원과 항체, 또는 감작 임파구의 종류, 보체 관여의 유무, 반응에 의해서 생기는 생물학적 생성물질의 종류와 그 물질에 의해서 일어나는 반응의 장에 관여하는 세포의 종류 등 그 발생기전에 의해서 1형 - 5형으로 분류참고 한다.
〔1형 allergy〕
-전신성 anaphylaxis
항원인 allergen에 이미 감작되어 있는 생체 내에는 특이적인 추세포성 항체가 생성되어 있어서 비만세포, 호염기구 및 혈소판의 IgE 수용체에 결합된다. 사람의 경우 IgE항체의 Fc단편이 비만세포 표면상의 수용체에 결합된 상태에 재주입된 동일한 allergen이 결합하는 데 따라 활성을 띠면 이 신호로 세포막의 adenylcyclease계가 작용하고, 세포질 내의 cyclic AMP가 감소됨으로써 가용성 중재자들, 즉 histamine, serotonin, bradykinin, SRS-A, ECF-A 등이 불안정하여 과립이 파괴되면서 세포로부터 방출되어 과민증이 일어난다.
-국소 anaphylaxis
Prausnitz-Kustner 반응, Schultz-Dale 시험, 아토피 과민증 (atopy)
〔2형 allergy〕
이 형의 과민성은 세포들의 표면 또는 기타 조직구성성분에 존재하는 항원들에 대항하는 항체들에 의해 매개된다. 항원성 결정인자들은 세포막에 내재성이거나 세포 표면에 흡수된 외인성 항원일 수도 있다. 이 중 어떤 경우이든 과민성 반응은 항체들의 정상 또는 변화된 세포 표면항원들과의 결합의 결과로 일어난다. 2형의 반응에는 둘 또는 세종의 상이한 항체의존성 기전이 관여한다.
〔3형 allergy〕
이 형의 과민성 반응은 여러 혈청매개체 중 원칙적으로 보체계를 활성화함으로써 조직손상을 일으키는 항원-항체 복합체들에 의해서 발생한다. 독성반응은 항원이 순환혈내 또는 혈관의 부위에 축적되어 있는 항체와 결합할 때 시작된다. 전자는 순환 면역복합체, 후자는 부위소재성 면역복합체에 의해 유발된다. 복합체들이 순환혈액내에서 형성되며, 특히 혈관벽내에 축적되어 국소화 되거나 또는 신사구체와 같은 여과구조체에 함입될 때 조직손상을 일으킨다.
〔4형 allergy〕
이 형의 과민성 반응은 특이적으로 감작된 T림프구들에 의해서 시작된다. 여기에는 전통적인 지연형 과민성 반응들과, 세포매개성 세포독성 반응들이 있다. 이것은 여러 가지의 특히 결핵균과 같은 세포내 미생물학적 인자뿐만 아니라 여러 바이러스, 진균, 원충류 및 기생충들에 대한 면역성 반응의 주요형이다. 소위 말하는 화학물질 등에 대한 접촉성 피부민감성과 이식거부는 세포매개성 반응들의 다른 예들이다.
〔5형 allergy〕
세포자극형 반응이다. 갑상선기능항진증에서는 갑상선세포막상의 갑상선자극 호르몬인 TSH의 수용체에 대한 자가항체가 생성된다. 이 자가항체는 수용체와 결합하고 갑상선세포를 자극하여 그 기능을 항진시키며, 갑상선호르몬의 과잉 분비가 초래되고 이런 양상으로 세포 표면에 있는 allergen과 추세포성 항체가 반응한 결과, 그 세포가 자극하는 현상을 5형 과민증이라 한다
본 발명에서는 지난 30년간 생활수준의 급격한 향상과 더불어 날로 증가하여 현재 약30%의 소아와 약10%의 성인이 겪고있는 기관지천식, 아토피성피부염, 알러지성 비염, 알러지성 결막염등과 관계된 즉시형과민반응인 제 1형 국소성 알러지 반응의 정도를 줄여줄 수 있는 생약 추출물의 제조방법을 제공하고자 함이다.
먼저 본 발명을 구성하고 있는 생약들을 간단히 소개하면 다음과 같다.
마황(麻黃)은 학명 Ephedra sinica으로 마황과의 떨기나무 초마황, 목적마황의 줄기부위이다. 나무의 높이 30~70cm이다. 줄기는 곧게 서며 속새 같은 가지가 많이 갈라진다. 마디가 많고 마디에 비늘같은 막질잎이 1쌍씩 달리며 밑은 합쳐져서 원줄기를 둘러싼다. 뿌리는 나무처럼 단단하며 붉은 빛을 띤 갈색이다. 암 수 딴 그루이다.
마황의 성분은 따뜻하고 맛이 쓰며 독이 없고 중풍과 상한두통 및 온학을 낫게하고 겉으로 땀을 내고 사열기와 한열을 치료하고 오장의 사기를 치료하고 주리를 통하고 온역과 산풍장기를 치료한다. 성분으로 알려진 것은 알칼로이드계의 ephedrine과 ephedrine유도체등이 많이 있다.
신이(辛夷)는 낙엽성 관목인 목련과(Magnoleacease)의 목련(Magnolia kobus)혹은 백목련(Magnolia denudata)의 꽃봉우리로 라틴명은 Flos Magnoleae이며 봄철 꽃봉오리가 벌어지기 전에 따서 햇빛에 말려 이용한다. 신이는 전통적으로 풍으로 속골이 아픈 것을 낫게하며 얼굴의 주근깨를 없애고 코가 메는 것 콧물이 흐르는 것등을 낫게하며 눈을 밝게 하며 수염과 머리털을 나게 한다고 알려져 있고(본초강목) 기존 신이의 성분 동정연구에 의하면, 마그놀롤(Magnolol), 시리긴(Syringin), 호노키올(Honokiol), 유게놀(Eugenol), 티라민(Thyramine)등의 물질이 보고되어 있다.
지실(枳實)은 산초나무과의 탱자나무(학명;Poncirus trifoliata)의 덜익은 열매를 말하며,밝혀진 성분으로는 linonene, linalool, citral등의 정유성분과 hesperidin, neohesperidine등의 플라보노이드성분등이 있다. 주로 소화 불량, 복부 창만, 잦은 트림, 복통 등에 기의 순행을 강력하게 이 끌면서 치료 하고 소화 장애로 명치끝이 그들먹하고 답답하며 식욕이 떨어 지고 정신과 몸이 피곤한 증상에 쓰인다. 관상 동맥 장애로 가슴이 아픈 증상에는 해백, 과루를 배합하여 사용 한다.
토천궁(土川芎)은 미나리과(Umbelliferae)의 다년생초본인 천궁(토천궁: Ligusticom chuanxiong Hort)의 뿌리줄기를 그대로 또는 열탕에 데쳐 말린 것으로 senkyunolide, ligustilide, butylidenpthalide, butylpthalide, cnidilide 등의 주요성분을 함유. 약리작용은 진경, 진정, 혈압강화, 항균, 항진균 작용 및 비타민 E 결핍증치료에 쓰인다.
박하는 Mentha arvensis var. piperascens Malinv.의 학명을 갖는 꿀풀과 식물로서 풀전체가 약용재료로 사용되며 주요성분은 menthol, menthone, camphene, limonene 등이다
이하에서는, 본발명의 생약 추출물이 항알레르기 작용이 있음을 입증하기 위한 실험예,실시예를 들어 상세히 설명하도록 하겠다.
실시예 1:시료의 제조방법
시판되는 생약재를 분쇄하여 분쇄물 300g에 용매로 에탄올,또는 물 3L을 첨가하고, 냉각콘덴서가 달린 환류추출기에서 3시간 동안 끓여 추출한 다음, 300mesh여과포로 여과한후 잔사를 같은방법으로 1회 더 추출하였다. 각각의 단계에서 얻어진 추출액을 혼합하고 상온에서 화트만(Whatman) 2번 여과지로 여과하여 불용성 물질을 제거한 후 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 60℃로 감압 농축하고 동결건조하여 건조추출물을 얻었다. 각각의 경우에 사용한 생약재, 용매 및 건조추출물의 건조중량은 표1에 나타내었다.
표. 1 생약제, 용매 및 건조추출물의 건조중량
실시예 생약재 용매 건조중량(g)
1 마황 70% 에탄올 21.5
2 20% 에탄올 22.6
3 정제수 20.3
4 신이 70% 에탄올 20.7
5 20% 에탄올 24.3
6 정제수 23.1
7 지실 70%에탄올 25.8
8 20%에탄올 26.9
9 정제수 28.5
10 토천궁 70%에탄올 20.4
11 20%에탄올 21.3
12 정제수 22.6
13 박하 70%에탄올 14.6
14 20%에탄올 16.1
15 정제수 16.9
실험예1: 이개부종(耳介浮腫)반응실험
마우스귀에 비만세포 스티뮬레이터인 compound 48/80(N-methyl-p-methoxy phenylethylamine) 혹은 대조군인 생리식염수를 피내주사하여 이개부종반응을 일으켰다. 실시예에서 얻어진 추출물등의 효과는 피내주사 1시간전에 투여한 다음 digimatic micrometer를 이용하여 귀의 두께를 측정함으로써 결정하였다.
비면역학적 자극제인 compound 48/ 80을 마우스귀에 피내주사하였을 때 일어나는 이개부종 반응에서 실시예 1~15의 추출물들과 이들의 혼합액의 효과를 분석하였다. 정상마우스에서는 compound 48/80(50~ 200ug/site)은 농도의존적으로 이개부종반응을 증가시켰고 compound 48/80(100ug/site,20ul)처리시 이개부종반응이 가장 잘 일어나서 이농도와 양을 국소에 도포한 다음30분후에 시료들의 효과를 분석하였다.
시료들은 냉동건조하여 4℃에 보관하고 있다가 생리식염수에 용해하여 compound 48/80을 주사하기 1시간전에 약물을 처리하였다. 시료들의 농도는 0.1mg/ml로 균일하게 조정하였다.
표.2에 그결과들을 정리하였다.
표. 2 추출물들의 귀부종에 대한 억제효과 시험결과
시료 귀의 두께(um)
실시예.1 (마황70% 에탄올추출물) 85
실시예.2 (마황20% 에탄올추출물) 75
실시예.3(마황 정제수추출물) 80
실시예.4(신이70% 에탄올추출물) 86
실시예.5(신이20% 에탄올추출물) 73
실시예.6(신이 정제수추출물) 81
실시예.7(지실 70%에탄올 추출물) 77
실시예.8(지실 20%에탄올추출물) 80
실시예.9(지실 정제수추출물) 88
실시예.10(토천궁70%에탄올추출물) 83
실시예.11(토천궁20%에탄올추출물) 76
실시예.12(토천궁 정제수추출물) 71
실시예.13(박하 70%에탄올추출물) 60
실시예.14(박하 20%에탄올추출물) 70
실시예.15(박하 정제수추출물) 74
대조군 90
실시예.2 + 실시예.5 65
실시예.2 + 실시예.5 + 실시예.7 60
실시예.2 + 실시예.5 +실시예.7 +실시예.153 53
실시예.2 + 실시예.5 +실시예.7 +실시예.12+실시예.13 48
실험예.2 히스타민의 분석
Kanemoto등의 방법에 준하여 마우스 복강비만세포를 분리하였다. 즉 마우스를 에테르로 마취시킨후 0.1%gelatin을 함유한 Tyrode buffer B(Nacl, NaHCO3,KCl, NaH2PO4,Glucose)약 20ml을 복강내에 주입하고 30초간 복강을 가볍게 맛사지한 후 복강 중앙벽을 조심스럽게 절개하여 복강세포를 함유한 세척액을 파스퇴를 피펫으로 채취하였다. 복강세포를 150×g로 10분간씩 3회 반복하여 원심분리 침전시킨후 상층 부유액을 버리고 동일한 Tyrode bufferB로 재부유시켰다.
이 세포 부유액 중 비만세포는 22.5% w/v metrizamide를 이용하여 Yurt등의 방법으로 분리 정제하였다.
세포배양상층액중에 있는 히스타민의 양의 정량은 shore등의 방법으로 하였다.
즉 에펜도르프 튜브에 시료 500ul를 넣고 0.1 N-HCl 450ul, 60%과염소산용액 50ul를 넣고 혼합후 원심분리(1,500rpm, 20min)하여 그 상층액 800ul를 5N-NaOH용액 500ul,증류수 3ml, n-butanol 10ml 및 NaCl 1.2g을 혼합한 시험관에 넣고 진탕후 원심분리(2,000rpm, 10min)하였다. Butanol층 8ml를 50ml시험관에 넣고 0.1N HCl용액 3ml, n-Heptane 10ml 가하여 진탕후 원심분리(2,000rpm,10min)하였다. 여기서 얻어진 수층 2ml에 1N-NaOH용액 400ul와 1% o-phthaldialdehyde 용액 100ul를 넣고 37도씨 워터배스에서 3분동안 방치하여 spectrofluorometer(λex=360nm, λem=440nm)로 형광도을 측정하였다. 히스타민 유리억제율(%)은 다음과 같이 계산하였다.
〔히스타민유리억제율 산출공식(%)〕
억제율(%) = [(약물을 부가하지 않았을 때 히스타민 양- 약물을 부가하였을 때 히스타민 양)/ 약물을 부가하지 않았을 때의 히스타민 양 ] * 100
compound 48/80으로 자극하기 20분전에 실시예의 시료들을 0.1mg/ml의 농도로 비만세포에 처리하고 히스타민 방출하는 정도를 측정한 결과 표. 3의 결과처럼 히스타민 방출을 억제하는 것을 확인하였다.
표.3 생약들의 compound 48/80에 의해 야기된 히스타민 방출에 대한 효과
시료 억제율(%)
실시예.1 (마황70% 에탄올추출물) 69
실시예.2 (마황20% 에탄올추출물) 71
실시예.3(마황 정제수추출물) 65
실시예.4(신이70% 에탄올추출물) 78
실시예.5(신이20% 에탄올추출물) 80
실시예.6(신이 정제수추출물) 83
실시예.7(지실 70%에탄올 추출물) 60
실시예.8(지실 20%에탄올추출물) 66
실시예.9(지실 정제수추출물) 65
실시예.10(토천궁70%에탄올추출물) 51
실시예.11(토천궁20%에탄올추출물) 45
실시예.12(토천궁 정제수추출물) 38
실시예.13(박하 70%에탄올추출물) 55
실시예.14(박하 20%에탄올추출물) 59
실시예.15(박하 정제수추출물) 61
실시예.2 + 실시예.5 78
실시예.2 + 실시예.5 + 실시예.7 70
실시예.2 + 실시예.5 +실시예.7 +실시예.12 82
실시예.2 + 실시예.5 +실시예.7 +실시예.12+실시예.13 89
실험예. 3 수동 피부알레르기 반응
생약들의 수동피부알레르기 반응에 대한 효과를 분석하기위하여 Ig E 의존성 피부반응은 anti-DNP(dinitrophenyl) IgE를 스프래규산(sprqgue-dawley)랫트의 피부내에 주사한 다음 48시간후에 DNP-HSA(dinitrophenyl-human serum albumin)와 4%Evan blue를 꼬리 정맥에 주사하여 국소성 아나필락시 쇼크를 일으켰다. 에반스 블루를 주사하기 1시간 전에 생약을 여러농도(0.1~ 100mg/kg)를 경구 투여하여 알레르기 억제효과를 확인하였다.(표.4), 실험예.3에서는 실험예.1와 실험예.2에서 가장효과가 잘나타나는 것으로 확인된 동일비율로 혼합된 생약혼합물(실시예.2 + 실시예.5 +실시예.7 +실시예.12+실시예.13)만을 농도별로 실험을 행하였다.
표.4 생약의 피부알레르기 억제 반응에 대한 효과
시료명 투여량(mg/kg) 염료량(ug/site)
대조군 8.41
실시예.2+ 실시예.5 +실시예.7 +실시예.12+실시예.13 0.1 8.05
실시예.2+ 실시예.5 +실시예.7 +실시예.12+실시예.13 1 7.52
실시예.2+ 실시예.5 +실시예.7 +실시예.12+실시예.13 10 7.13
실시예.2+ 실시예.5 +실시예.7 +실시예.12+실시예.13 100 6.54
본 발명에 따른 항 알레르기 추출물은 compound 48/80에 의해 유도되는 이개부종반응(耳介浮腫反應) 및 anti-DNP IgE에 의해 유도되는 피부(皮膚)알레르기 반응실험동물모델을 이용하여 생쥐의 귓볼에 주사하여 일으킨 이개부종반응을 현저히 억제(抑制)시켰다.
또한,anti-DNP IgE를 주사하여 조직내에 있는 비만세포 표면의 IgE수용체와 결합시킨 다음 항원자극에 의한 비만세포의 활성화를 유도하여 피부알레르기반응을 일으킨 수동 피부알레르기반응도 억제됨을 관찰하였다.
이러한 생체내 실험결과를 복강비만세포를 분리하여 생체외 실험으로 확인한바 상관성 있는 결과를 나타내었다. 더욱이 본 발명에 따른 compound 48/80에 의한 이개부종반응 억제효과는 비만세포 특이적 염색방법으로 세포수준에서 확인한 것이다.
본 발명에 따른 compound 48/80은 비만세포 표면의 FcεRI 특이적 항원에 의한 급성피부질환에도 매우 효과적인 것을 알수 있었다.
이상과 같이 즉시형알레르기 반응의 원인세포인 비만세포를 비면역학적 자극제인 본 발명 항알레르기조성물 compound 48/80로 활성화시켰을때 일어나는 이개부종반응을 농도의존적으로 억제시킴을 알수 있었다.
또 본 발명에 따른 이개부종 반응 억제효과는 국소비만세포의 탈과립반응의 억제에 기인하였고, compound 48/80자극에 의한 복강비만세포로부터 히스타민 방출을 농도의존적으로 억제시켰다.
그리고, IgE 항체투여에 의한 전형적인 면역학적 반응인 알레르기반응을 억제시켰다.
이상과 같이 본 발명에 따른 항알레르기 추출물의 제조방법에 의한 compound 48/80은 실험동물모델에서 비면역학적및 면역학적 자극에 의한 즉시형알레르기 반응을 모두 억제시켰다.더욱이 비면역학적 자극의 경우 신이산(辛荑散)보다 그 효과가 월등하기 때문에 임상적으로 유용하게 활용할수 있을것으로 사료되는 유용한 발명인 것이다.

Claims (2)

  1. 시판되는 생약재 마황, 신이, 지실, 토천궁, 박하를 분쇄하여 분쇄물 300g에 용매로 에탄올,또는 물 3L을 첨가하고, 냉각콘덴서가 달린 환류추출기에서 3시간 동안 끓여 추출한 다음, 300mesh여과포로 여과한후 잔사를 같은방법으로 1회 더 추출한후, 각각의 단계에서 얻어진 추출액을 혼합하고 상온에서 화트만(Whatman) 2번 여과지로 여과하여 불용성 물질을 제거한 후 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 60℃로 감압 농축하고 동결건조하여 건조추출물을 얻음을 특징으로하는 항알레르기 추출물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,생약재추출 용매로는 물, 탄소수 1~4의 저급알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 혼합용매를 이용함을 특징으로 하는 항알레르기추출물의 제조방법.
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