KR101720581B1

KR101720581B1 - 인플루엔자의 예방 및 치료를 위한 식물 추출물 조성물

Info

Publication number: KR101720581B1
Application number: KR1020117022613A
Authority: KR
Inventors: 쉐쥐 셰; 제이슨 쟝-청 코
Original assignee: 비바 파마슈티칼 인코포레이티드
Priority date: 2009-03-03
Filing date: 2010-03-02
Publication date: 2017-03-29
Also published as: US20100226936A1; CA2754064A1; WO2010099613A1; CN102341114A; CA2754064C; US9186385B2; KR20110132407A

Abstract

판람근(Radix isatidis)으로부터 제조된 추출물 및 금은화(Flos Lonicerae)로부터 제조된 추출물을 포함하는, 인플루엔자, 염증, 및 면역계 기능 중 하나 이상에 영향을 주는 조성물. 대안의 구체예에 있어서, 조성물은 복령(Poria cocos(Schw.) Wolf)으로부터 제조된 추출물 및 어성초(Herba houttuyniae)로부터 제조된 추출물 중 하나 이상을 더 포함한다. 상기 조성물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 것에 의한 인플루엔자, 염증 중 하나 이상을 치료하는 방법.

Description

인플루엔자의 예방 및 치료를 위한 식물 추출물 조성물{Plant Extract Compositions for Prevention and Treatment of Influenza}

관련 출원의 교차 참조

본 출원은 "인플루엔자의 예방 및 치료를 위한 식물 추출물 조성물"의 명칭을 갖는, 2009년 3월 3일에 출원된 US 가특허 출원 번호 61/157,049의 35 U.S.C. 119(e) 하의 이익을 주장하고, 그 전체는 참고문헌으로써 본 발명에 포함된다.

본 발명은 일반적으로 식물 추출물 및 특히, 감기 바이러스 감염에 영향을 주고, 포유류 면역계의 기능을 조절하는 식물 추출물의 용도에 관한 것이다.

일반 감기는 급성인, 전형적으로 상부 기도 염증을 초래하는 열병성 바이러스 감염이다. 일반 감기는 인간에게 영향을 미치는 가장 일반적인 감염 질환이다. 일반 감기를 유발하는 바이러스의 몇몇의 다른 패밀리 중에서, 가장 일반적인 것은 리노바이러스이다. 추정치는 미국에서 1년에 10억만번 이상의 감기 감염이 발생하는 것을 가리킨다. 성인은 일반적으로 매년 2번 내지 4번 감기에 걸리고, 어린이는 전형적으로 매년 6번 내지 10번 사이로 감기를 앓는다. 감기의 결과로서 근무일의 손실에 기인하는 연간 경제 부담은 미국에서 약 50억 달러일 것으로 추정된다.

일반 감기 감염의 증상은 코막힘, 코감기, 두통, 눈물이 많고 타는 듯한 눈, 열 및 기침을 포함한다. 일반 감기를 치료하기 위해 사용가능한 다양한 처방 및 비처방 약물이 있다. 그러나 이들 약물은 오직 일반 감기의 증상을 경감시키는데 도움을 주고, 보통은 복통, 욕지기, 두통, 가슴통증, 설사, 변비, 졸림 및/또는 현기증과 같은 다수의 부작용을 수반한다.

발명의 개요

본 발명의 구체예는 일반 감기의 예방 및 치료를 위한 허브 추출물 조성물 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일부 구체예는, 특히 외인성 자극에 의해 장애가 생겼을 때, 면역계 기능의 향상을 위한 허브 추출물 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일부 구체예는 염증을 조절하기 위한 허브 추출물 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일부 구체예는 인플루엔자, 염증 및 면역계 기능 중 하나 이상에 영향을 주는 허브 추출물 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일부 구체예는 이런 허브 추출물 조성물의 제조를 위한 방법에 관한 것이다.

본 발명의 한 구체예는 판람근(Radix isatidis), 인동(Lonicera japonicum) 및 복령(Poria cocos(Schw.) Wolf)의 치료적 유효량을 포함하는 허브 추출물 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 판람근 및 인동의 치료적 유효량을 포함하는 허브 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 인동 및 복령의 치료적 유효량을 포함하는 허브 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 판람근 및 복령의 치료적 유효량을 포함하는 허브 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 인동, 판람근 및 어성초(Herba houttuyniae)의 치료량을 포함하는 허브 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 앞서 언급된 허브로부터 추출물을 제조하고, 상기 조성물 중 하나를 제공하기 위하여 두 개 또는 그 이상의 추출물을 배합하는 방법에 관한 것이다.

나아간 구체예는 정제, 환약, 연질 캡슐, 경질 캡슐, 과립제, 분말, 농축액, 시럽, 액체, 주조 환(molded ball) 및 이들의 조합을 포함하는 앞서 언급된 허브 조성물의 경구 투여 형태에 관한 것이다.

다른 구체예는 앞서 언급한 허브 조성물의 치료적 유효량의 투여에 의해 인플루엔자, 염증 및 면역계 기능 중 하나 이상을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 구체예는 인플루엔자, 염증의 예방 및 치료를 위해서 뿐만 아니라 면역계 기능에 영향을 주기 위해서 및/또는 조절하기 위해서 선택된 허브 추출물의 혼합물을 포함하는 조성물, 이런 조성물의 제조 방법, 및 조성물의 사용을 위한 방법에 관한 것이다.

한 구체예에서, 본 발명은 판람근 및 복령으로부터 나온 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 판람근 및 복령 추출물은 약 1.0:0.2 내지 약 1.0:3.0의 비율로 존재한다. 대안으로, 조성물은 어성초 추출물을 추가적으로 포함할 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 인동 및 복령으로부터 나온 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 인동 및 복령 추출물은 약 1.0:0.2 내지 약 1.0:3.0의 비율로 존재한다. 대안으로, 조성물은 어성초 추출물을 추가적으로 포함할 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 판람근 및 인동으로부터 나온 개별 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 판람근 및 인동 추출물은 약 1.0:0.2 내지 약 1.0:3.0의 비율로 존재한다. 대안으로, 조성물은 어성초 추출물을 추가적으로 포함할 수 있다.

나아간 구체예는 판람근으로부터 제조된 추출물, 인동으로부터 제조된 추출물, 및 복령으로부터 제조된 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 판람근, 인동 및 복령 추출물은 약 1.0:1.0:2.1의 비율로 존재한다.

본 발명의 다른 구체예는 판람근, 인동, 복령, 및 어성초로부터 개별적으로 제조된 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

판람근은 대전(Isatis tinctoria L) 및 송람(Isatis Indigotica Fort)의 뿌리에서 나온 중국 전통 한약재로, 보통 대청으로 알려져 있다. 본원에서 기술한 목적을 위하여, 판람근 추출물을 제조하기 위하여 대청 식물의 건조 뿌리, 잎, 및 줄기를 사용하는 것이 적절하다. 한 구체예에서, 추출물은 약 5 내지 2O g의 판람근 건조 뿌리로부터 유래할 수 있다. 대안으로, 추출물은 신선하거나 건조된 꽃, 잎, 줄기, 및 종자로부터 제조될 수 있다.

인동(Lonicera japonicum, Japanese Honeysuckle, White Honeysuckle, 또는 Chinese Honeysuckle)으로 또한 지칭되는 금은화(Flos Lonicerae)의 추출물은 신선하거나 건조된 꽃, 잎, 및 줄기로부터 적절히 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 추출물은 약 5 내지 2O g의 건조된 꽃으로부터 유래할 수 있다.

복령은 육지 나무 부패 균류이다. 그것의 땅밑 균핵이 한의학에서 일반적으로 사용된다. 복령 추출물은 건조 균핵으로부터 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 추출물은 약 5-2O g의 건조 균핵으로부터 유래할 수 있다. 대안으로, 추출물은 신선한 균류로부터 제조될 수 있다.

어성초는 어성초(Houttuynia cordata Thunb.)의 지상의 일부, 예를 들면, 싹, 잎 및 줄기로부터 생산되는 한약재이다. 어성초 추출물은 신선하거나 건조된 식물의 일부로부터 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 추출물은 약 10-30g의 건조 식물 일부로부터 유래할 수 있다.

당업자는 추출물이 앞서 언급한 허브의 또다른 양들로부터 유래할 수 있음을 이해할 것이다. 게다가, 당업자는 이들 허브 추출물이 다수의 화합물을 함유하는 것을 인식할 것이며, 그것들 전부가 앞서 언급한 조성물의 제조에서 사용된다.

각각의 추출물을 제조하기 위한 방법은 일반적으로:

(a) 추출 혼합물을 생산하기 위하여 약 15분 내지 약 24시간의 범위에서 선택되는 시간의 기간 동안 주변 상온에서 적절한 부피의 수성 용매로 선별된 식물의 일부 및/또는 구성 요소를 침지시키는 단계;

(b) 수성 여과액을 생산하기 위하여 추출 혼합물을 여과시키는 단계;

(c) 수성 여과액을 수득하는 단계; 및

(d) 수성 여과액을 농축된 액체 또는 시럽-유사 밀도까지 농축 즉, 탈수시키는 단계를 포함한다.

다른 구체예에서, 방법은 (e) 수성 여과액을 약 반고체 또는 풀-유사 밀도까지 탈수시키는 단계를 더 포함한다. 나아간 대안의 구체예에서, 방법은 (f) 수성 여과액을 건조 밀도, 예를 들면, 과립제 및 분말로 탈수시키는 단계를 더 포함한다.

방법에서 사용하기 위해 적절한 수성 용매는 물이다. 대안적인 수성 용매는 유기 용매 예를 들면: 에탄올, 메탄올, 이소프로필 알코올, 에틸 아세테이트, 에틸 에테르, 아세토니트릴, 메틸렌 클로라이드, 헥산, 아세트산, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 대안의 구체예에서, 수성 용매는 무기 산 또는 무기 염기를 단독으로, 또는 하나 이상의 선별된 유기 용매와의 조합으로 더 포함할 수 있다. 나아간 대안의 구체예에서, 수성 용매는 침지시키는 시간의 기간 동안 식물 및/또는 식물 구성 요소와 함께 혼합된다.

다른 구체예에서, 추출물 용매는 유기 용매의 혼합물이다.

대안의 구체예에서, 방법은 단계 (a)의 침지 기간 동안 약 주변 상온보다 높은 범위 내지 약 110℃로 가열하는 단계를 더 포함할 수 있다. 나아간 대안의 구체예에서, 단계(a)의 침지 기간 동안 가열하지 않았을 때, 방법은 추출 혼합물을 제조하기 위하여 침지 기간 이후에 약 15분 내지 약 2시간의 범위의 시간의 기간 동안 수성 용매 및 식물 혼합물을 가열하는 단계를 더 포함할 수 있다.

대안의 구체예에서, 또한, 추출은 전통적인 달임을 포함하는, 당업계에 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 대안으로, 추출물은 적절한 크로마토그래피 컬럼, 예를 들면 실리카 겔 및 Sephadex LH-20을 사용하여 더 정제될 수 있다. 나아간 대안의 구체예에서, 식물 재료는 초임계 이산화탄소 장치 및 과정, 및/또는 환류 추출 과정를 사용하여 추출될 수 있다.

한 구체예에서, 추출물은 경구 투여 형태로 제형화된다. 추출물은 연질 캡슐 또는 경질 캡슐로 캡슐화될 수 있다. 대안의 구체예에서, 추출물은 농축액, 시럽 및 액체로서 제형화될 수 있다. 다른 대안의 구체예에서, 추출물은 정제, 환약, 연질캡슐, 경질캡슐 및 이들의 조합으로 형성하기에 적합한 결과적 혼합물을 제조하기 위하여 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제와 혼합된다.

다른 대안의 구체예에서, 추출물은 건조 분말로서 제형화될 수 있다. 다른 대안의 구체예에서, 추출물은 과립제로서 제형화될 수 있다. 대안의 구체예에서, 추출물은 전통적 한방약에 따라 유연한 점토-유사 밀도를 갖는 주조 환으로서 제형화될 수 있다. 이런 주조 환은 쉽게 휘고, 용이하게 제조되며, 주조 환의 더 크거나 더 작은 양을 섭취할 수 있는 환자의 능력에 따라 다양한 크기의 환으로 만들어진다.

본 발명의 조성물 및 그들의 제조 및 사용을 위한 방법은 하기 실시예에서 더욱 상세히 기술한다.

실시예

추출물의 제조:

판람근 및 금은화에 대한 추출물을 이전에 기술한 방법 및 물에서의 70% 에탄올 추출을 사용하여 개별적으로 제조하였다. 복령 허브는 0.6M NaOH 용액에서의 용해, 아세트산의 첨가에 의한 중화, 및 이후 에탄올의 첨가를 통한 침전에 의해 추출되었다. 각각의 추출물은 분말 형태로 건조시켰다. 추출물 분말을 표 1에서 보여준 바와 같이 질량 대 질량 비율로 합하였고, 각각 "AB" 및 "ABC"로 표지하였다:

추출물 분말	AB	ABC
A(금은화)	1	1
B(판람근)	1	1
C(복령)	0	2.12

재료:

바이러스 씨드: 마우스 폐에 적응하는 타입 1 FM 1 인플루엔자 바이러스를 Detection Department of Chinese Medicine and Biological Products로부터 얻었다. FM1 바이러스의 독성은 마우스에서 강화되었고, 이후, 배아 요낭종(Embryo urinary cysts)을 통해 두 번 통과시켰다. LD50은 5.2였다.

바이러스 희석: 바이러스 씨드 배양액을 물에 녹이고, 실험을 시작하기 전에 15 LD50 당 0.05 ㎖으로 멸균 식염수로 희석하였다.

마우스 감염: 마우스를 인플루엔자 바이러스를 각 마우스 당 4 방울, 약 0.05 ㎖ 씩 비강내로 떨어뜨려 감염시켰다.

투여: 경구 투여를 바이러스 투여를 수행한지 6시간 후에 시작하였다. 각 동물에 대한 경구 투여 투여량은 20 ㎖/kg 기준으로 계산되었다.

실시예 1: FM1 인플루엔자 바이러스의 억제

FM1 인플루엔자 바이러스의 효과적인 억제를 일련의 치료 그룹에 대하여 폐 인덱스 값의 측정을 통해 결정하였다.

바이러스-감염 동물 대조군에 대하여 계산된 낮은 폐 인덱스는 그들의 폐가 정상 대조군 동물 그룹의 폐보다 더 영향을 받았음을 가리킨다. 0.05 미만의 확률은 허브 조성물 또는 약물이 바이러스를 치료하는데 효과적이었음을 가리킨다. 결과는 아래 표 2에서 보여준다.

특이적인 병원균이 없는 등급의, 13 내지 15 그램 사이의 NIH 마우스를 아래에서 기술한 실험에 사용하였다. 각각의 시험 그룹에서 시험 동물의 절반은 수컷이었다. 사육 농도는 23±2℃였다.

마우스를 각각의 그룹에 적어도 10마리의 마우스가 있는 9개의 그룹으로 무작위로 나누었다:(1) 정상 대조군, (2) 바이러스-감염 대조군, (3) AB 고 투여량(15 g/kg), (4) AB 중간 투여량(7.5 g/kg), (5) AB 저 투여량(3.75 g/kg), (6) ABC 고 투여량(13.0 g/kg), (7) ABC 중간 투여량(7.66 g/kg), (8) ABC 저 투여량(3.83 g/kg), 및 (9) 리바비린 그룹(0.07 g/kg).

위약 및 추출물 조성물의 처리는 전체 3일 동안 하루에 한 번씩 위내로 투여되다. 정상 대조군 마우스 및 바이러스-감염 대조군 마우스는 동일한 부피의 증류수를 받았다.

정상 대조군 그룹은 바이러스로 감염되지 않은 마우스를 포함한다. 정상 대조군 그룹은 위약, 증류수의 투여를 통해 처리되었다. 바이러스-감염 대조군 그룹은 FM1 바이러스로 감염된 마우스를 포함한다. 바이러스-감염 대조군 그룹은 위약, 증류수의 투여를 통해 처리되었다. 리바비린 그룹은 인플루엔자 바이러스의 타입 1 FM1의 치료의 효과적인 수준을 설명하기 위한 베이스라인을 제공한다.

폐 인덱스의 결정: 마우스를 바이러스 감염 치료 후 4일 후에 희생시켰다. 시험 동물을 희생시키기 전 적어도 4시간 동안 식수를 제거하고, 단식시켰다. 이후 마우스의 무게를 잰 다음, 경추 탈골 후에 폐를 제거하였다. 폐의 손상 수준을 기록하였다. 이후 폐는 0.9% 표준 식염수로 2회 세척하였고, 압지로 표면의 물을 제거한 후 다시 무게를 재었다. 폐 인덱스 값의 증가는 폐질환의 정도가 증가하는 것을 가리킨다.

폐 인덱스 및 폐 인덱스의 억제율을 하기 식에 의해 계산하였다:

폐 인덱스 =(마우스 폐 무게/마우스 체중)×1OO

폐 인덱스의 억제율 =((대조군 그룹의 평균 폐 인덱스- 실험 그룹의 평균 폐 인덱스)/대조군 그룹의 평균 폐 인덱스)×100

마우스 폐 인덱스 값(x±se)

그룹	투여량 (g/kg)	동물 (n)	체중 (g)	폐 인덱스 (g/g)	폐 인덱스의 억제율 (%)	P-값 (던넷 t 양측 검정)
정상 대조군 그룹	-	11	17.04±1.00^**	0.94±0.11 ^**	-	0.000^**
바이러스-감염 대조군 그룹	-	10	11.86±0.84	1.76±0.15	-	-
리바비린	0.07	11	14.94±1.64^**	1.19±0.30^**	32.38	0.000^**
AB	15.0	12	12.85±0.56	1.41±0.12^**	19.88	0.005^**
	7.5	11	12.60±1.24	1.34±0.26^**	25.56	0.001^**
	3.75	11	12.82±1.35	1.46±0.22^*	17.04	0.034^*
ABC	13.0	11	12.81±1.81	1.41±0.28^**	19.88	0.008^**
	7.66	10	12.24±0.57	1.40±0.29^**	20.45	0.007^**
	3.83	11	11.99±0.58	1.53±0.30	13.06	0.161

주: 바이러스 대조군 그룹과 비교 ^*: P<0.05; ^**: P<0.01

상기 표 2에서 보여준 결과는 정상 대조군 그룹과 비교하여 바이러스-감염 그룹의 마우스 무게가 유의하게 감소하고, 폐 인덱스가 유의하게 증가한 것을 보여주며, 이는 바이러스 감염 동물 모델이 잘 확립되었음을 가리킨다. 또한, 바이러스-감염 대조군에 대한 낮은 폐 인덱스는 그들의 폐가 정상 대조군 동물 그룹의 폐에 비하여 더 영향을 받았음을 가리킨다. 0.05 미만의 확률은 허브 조성물 또는 베이스라인 약물의 처리가 효과적이었음을 가리킨다.

고 AB, 중간 AB 및 저 AB 추출물 투여량 및 고 ABC, 및 중간 ABC 추출물 투여량을 받은 그룹에서의 마우스는 바이러스-감염 대조군 그룹과의 비교에서 폐 인덱스의 감소에 의해 가리키는 바와 같이 폐질환의 감소를 보여주었다. 나아가, 고 AB, 중간 AB, 고 ABC 및 중간 ABC 추출물 투여량을 처리한 그룹과 리바비린 처리 마우스의 그룹의 마우스를 비교했을 때, 각각의 AB 추출물 투여량 및 ABC 추출물 투여량이 리바비린으로 처리한 것과 유사하게 인플루엔자 바이러스를 억제하는 것이 분명한데, 폐 인덱스의 유사한 억제율로 분명한 바와 같다. 표 2에서의 데이터는 AB 및 ABC 추출물이 인플루엔자 바이러스의 타입 1 FM1을 유의하게 억제할 수 있음을 명백히 설명한다.

실시예 2: 추출물 조성물의 항-염증 효과의 분석

추출물 조성물 AB 및 ABC의 항-염증 효과를 일련의 치료 그룹에 대하여 복강내 모세혈관의 투과성의 측정을 통하여 결정하였다.

20±2g의 체중인 NIH 마우스를 이 실험에 사용하였다. 각각의 시험 그룹은 같은 수의 수컷 및 암컷 마우스를 가졌다. 사육 온도는 23±2℃였다. 마우스는 각각의 그룹에 10마리의 마우스가 있는 9개의 그룹으로 무작위로 나누었다: (1) 블랭크 대조군, (2) 모델 대조군, (3) AB 고 투여량(15 g/kg), (4) AB 중간 투여량(7.5 g/kg), (5) AB 저 투여량(3.75 g/kg), (6) ABC 고 투여량(13.0 g/kg), (7) ABC 중간 투여량(7.66 g/kg), (8) ABC 저 투여량(3.83 g/kg), 및 (9) 살리실산 나트륨 그룹(0.15 g/kg).

블랭크 대조군 그룹은 위약으로 처리한, 바이러스가 감염되지 않은 마우스를 포함한다. 모델 대조군 그룹은 위약으로 처리한, FM1 바이러스로 감염된 마우스를 포함한다. 살리실산 나트륨 그룹은 인플루엔자 바이러스의 타입 1 FM1의 치료의 효과적인 수준을 설명하기 위한 베이스라인을 제공한다.

아세틱 표준 식염수 용액을 50 ㎖의 표준 식염수에 0.4%의 빙초산을 용해시켜 제조하였다.

2% 에반스 블루 표준 식염수 용액을 100 ㎖의 표준 식염수에 2 g의 에반스 블루를 용해시켜 제조하였다.

위약 및 AB 및 ABC 추출물 조성물의 처리를 3일의 기간 동안 하루에 한 번 위내로 투여하였다. 블랭크 대조군 그룹은 위약, 식염수 용액의 투여를 통해 처리되었다. 모델 대조군 그룹은 위약, 식염수 용액의 투여에 의해 처리되었다.

4 번째 날의 아침에, 마지막 치료 투여를 한지 한 시간 이후 각 그룹의 각 마우스에 꼬리 정맥을 통해 2% 에반스 블루 표준 식염수를 주사하였다(O.l ㎖/lO g). 이후, 블랭크 그룹은 복강내로 0.2 ㎖의 표준 식염수를 주사하였다. 나머지 그룹은 복강내로 0.2 ㎖의 0.8% 아세트산 표준 식염수를 주사하였다.

식염수 주사를 맞은지 약 20분 후에, 각 마우스를 경추탈골에 의해 희생시켰다. 이후, 복부 피부 및 근육을 절개하였다. 이후, 복막 마크로파지를 5 ㎖의 표준 식염수로 복강을 세척하여 수집하였다. 이후, 결과적인 세척 용액을 수집하였고, 약 15분 동안 3000 rpm에서 원심분리하였다. 이후 상청액을 수집하였고, 상청액의 흡광도 또는 광학 밀도(OD)를 분광 광도계를 사용하여 570 nm에서 측정하였다. 실험 데이터를 분석하였다. 데이터는 각각의 그룹의 결과 사이의 통계적으로 유의한 차이를 결정하기 위하여 t-검정을 사용하여 평가하였다. AB 및 ABC 허브 추출물 조성물 및 살리실산 나트륨의 항-염증 효과는 P가 0.05 미만일 때 유효한 것으로 간주되었다. 결과는 표 3에서 보여준다.

광학 밀도는 복강내 모세혈관의 투과성의 수준에 대한 지시자이다. 복강 마크로파지 수준이 증가함에 따라, 광학 밀도는 증가하고, 이는 복강내 모세혈관에서 투과성이 증가되는 것을 가리킨다. 아세트산의 투여는 복강내 모세혈관의 투과성을 증가시킨다.

항-염증 효과

그룹	투여량(g/kg)	동물	혈청에서 헤모리신의 OD값
블랭크 대조군	-	10	0.299±0.086
모델 대조군	-	10	0.341±0.023^ΔΔ
살리실산 나트륨	0.15	10	0.305±0.060^**
AB	3.75	10	0.323±0.06^*
AB	7.5	10	0.316±0.067^*
AB	15	10	0.295±0.086^**
ABC	3.83	10	0.312±0.018^**
ABC	7.66	10	0.325±0.058^*
ABC	13	10	0.310±0.043^**

^ΔΔ 블랭크 그룹과 비교, P<O.01

^* 모델 그룹과 비교: P<O.05

^** 모델 그룹과 비교 : P<0.01

표 3에서 보여준 결과는 모델 그룹의 광학 밀도가 블랭크 그룹의 것 보다 유의하게 더 높음을 명백히 보여준다. 이것은 동물 모델이 잘 확립되었음을 가리킨다.

모델 대조군 그룹과의 비교에서, AB 및 ABC 허브 조성물로 처리한 그룹의 감소된 광학 밀도는 복강내 모세혈관의 투과성을 감소시키는 이들 허브 조성물의 능력을 가리키고, 따라서 AB 및 ABC 허브 조성물 그룹의 각각의 투여량 수준의 항-염증 효과가 증명되었음을 보여준다.

고 AB, 저 ABC 및 고 ABC 추출물 투여량을 처리한 그룹의 마우스와 살리실산 나트륨 처리한 마우스의 그룹의 마우스를 비교하였을 때, 앞서 언급한 각각의 ABC 추출물 투여량 및 AB 추출물 투여량의 살리실산 나트륨으로 처리한 것과 유사한 항-염증 효과가 증명되었음이 분명하다.

표 3에서의 데이터는 AB 및 ABC 추출물이 유의한 항-염증 효과를 가졌고, 그들의 효능이 살리실산 나트륨과 유사함을 명백히 보여준다.

실시예 3: 카라기닌에 의해 유도된 래트 발 부기에서 추출물 조성물의 항-염증 효과의 분석

추출물 조성물 AB 및 ABC의 항-염증 효과를 일련의 치료 그룹에 대하여 카라기닌의 투여 후 래트 발의 발 부기의 측정을 통해 결정하였다.

200±20g의 체중의 래트를 이 실험에서 사용하였다. 각각의 시험 그룹은 동일한 수의 수컷 및 암컷 동물을 포함하였다. 사육 온도는 23±2℃였다. 래트를 각각 10마리의 래트가 있는 8개의 그룹으로 나누었다: (1) 모델 대조군, (2) AB 고 투여량(15 g/kg), (3) AB 중간 투여량(7.5 g/kg), (4) AB 저 투여량(3.75 g/kg), (5) ABC 고 투여량(13.0 g/kg), (6) ABC 중간 투여량(7.66 g/kg), (7) ABC 저 투여량(3.83 g/kg), (8) 살리실산 나트륨 그룹(0.15 g/kg), 및 (9) 블랭크 대조군. 이 실험에서는 카라기닌이 투여되지 않았을 때 동물의 발의 부기가 없기 때문에 블랭크 대조군이 없었다.

이 실험을 수행하기 위한 방법은 Drug Administration Ministry of Health P.R.C에 의해 Manual on Studies of New Medicines of TCM에서 개략적으로 기술된 가이드라인에 따랐다. 매뉴얼에서 개략 기술된 방법은 하기 단계를 상술한다:

1. 볼펜으로 각각의 래트의 왼쪽 뒷발의 윗쪽 앞쪽 발목에 위치한 선명한 가로선을 그린다;

2. 각각의 래트의 발 부피를 측정한다;

3. 블랭크 대조군 그룹에 있는 것들을 제외하고, 각각의 래트에게 뒷다리의 척골에 카라기닌의 투여량(0.05 ㎖/발)을 피하로 주사한다;

4. 4일의 기간 동안 하루에 한 번 앞서 언급한 투여량에 따라서 AB 추출물, ABC 추출물, 또는 살리실산 나트륨의 처리 중 하나를 경구로 투여한다. 모델 대조군 그룹 및 블랭크에서의 래트는 동일한 부피의 식염수로 주사하였다;

5. 4번째 날의 아침에, 마지막 처치 후 1시간 후에, 각각의 래트의 뒷다리의 척골로 카라기닌(0.05 ㎖/발)을 피하로 주사한다;

6. 두 번째 카라기닌 투여 후 1시간, 2시간, 3시간, 및 4시간에 각각 발 부피를 측정한다; 및

7. 각각의 래트에 대하여 발 부기 퍼센트를 계산한다.

부기 퍼센트는 하기 식에 의해 계산되었다:

부기 퍼센트=((염증 후 래트 발의 부기 부피-염증 전 래트 발의 부기 부피)/염증 전의 래트 발의 부기 부피)×100%

실험 데이터는 각각의 그룹의 결과 사이에서의 통계학으로 유의한 차이를 결정하기 위하여 t-검정을 사용하여 분석하였다. 블랭크 대조군 그룹의 래트의 발에는 부기가 없었다. AB 및 ABC 허브 추출물 조성물 및 살리실산 나트륨의 항-염증 효과는 P가 0.05 미만일 때 효과적인 것으로 간주되었다. 결과는 아래 표 4에서 보여준다.

모델 그룹과 비교하여, 저 AB 및 중간 AB 추출물 투여량은 4시간에서 유의한 항-염증 효과를 증명하였지만, 고 ABC 추출물 투여량은 1, 2, 3 및 4시간(p<0.01) 시점 각각에서 유의한 항-염증 효과를 보여주었다. 표 4에서의 데이터는 저 AB, 중간 AB 및 고 ABC 추출물이 유의한 항-염증 효과를 갖고, 그들의 효능이 살리실산 나트륨과 유사함을 명백히 보여준다.

카라기닌에 의해 유도된 발 부기에서의 항-염증 효과

그룹	투여량 (g/kg)	동물 (n)	발 부기( ㎖)
그룹	투여량 (g/kg)	동물 (n)	1h	2h	3h	4h
모델 대조군	-	10	0.865±0.208	0.820±0.174	0.720±0.199	0.605±0.215
살리실산 나트륨	0.15	10	0.490±0.202^**	0.405±0.195^**	0.265±0.153^**	0.170±0.136^**
AB	15	10	0.752±0.168	0.745±0.182	0.702±0.146	0.612±0.113
	7.5	10	0.700±0.175	0.705±0.144	0.615±0.181	0.455±0.101^**
	3.75	10	0.710±0.133	0.690±0.149	0.655±0.185	0.420±0.178^**
ABC	13	10	0.575±0.106^**	0.555±0.119^**	0.540±0.158^*	0.375±0.130^**
	7.66	10	0.615±0.113^*	0.596±0.108^*	0.563±0.115^*	0.512±0.132^*
	3.83	10	0.685±0.106^*	0.636±0.118^*	0.589±0.162^*	0.554±0.123^*
블랭크 대조군	-	10	-	-	-	-

^* 모델 그룹과 비교 p<0.01

^** 모델 그룹과 비교 p<0.05

실시예 4. 면역 기능에서 추출물 조성물의 항-염증 효과의 분석

추출물 조성물 AB 및 ABC의 항-염증 효과를 일련의 치료 그룹에 대하여 양 적혈구에서 순환하는 항체 수준 시험을 통해 결정하였다.

20-25g의 체중인 마우스를 이 연구에서 사용하였다. 각각의 그룹은 동일한 수의 수컷 및 암컷 동물을 포함하였다. 사육 온도는 23±2℃였다. 마우스는 각각 10마리의 래트를 포함하는 9개의 그룹으로 나누었다: (1) 블랭크 대조군, (2) 모델 대조군, (3) AB 고 투여량(15 g/kg), (4) AB 중간 투여량(7.5 g/kg), (5) AB 저 투여량(3.75 g/kg), (6) ABC 고 투여량(13.0 g/kg), (7) ABC 중간 투여량(7.66 g/kg), (8) ABC 저 투여량(3.83 g/kg), 및 (9) 레바미솔(0.03 g/kg).

위약 및 추출물 조성물의 처리는 각각의 마우스에 7일의 기간 동안 위 주입에 의해 투여되었다. 2일, 4일, 및 6일 째에, 블랭크 대조군 그룹의 것들을 제외하고, 각 마우스에게 복강내로 50 mg/10 ㎖/kg의 사이클로포스파미드를 주사하였다. 블랭크 대조군 그룹의 마우스는 복강내로 동일한 부피의 식염수를 주사하였다. 마지막 처치(7일 째)의 투여 후 3일 후에, 모든 마우스는 각각 0.2 ㎖의 양 적혈구 현탁액(식염수에서 5%의 양 적혈구)의 복막내 주사에 의해 면역화되었다. 면역화 후 5째에, 마우스의 안구를 마취하에서 제거하였다. 혈액을 수집하였고, 이후 혈청을 분리한 다음, 혈청을 식염수로 약 100배 희석하였다. 이후, 1 ㎖의 희석된 혈청을 0.5 ㎖의 5% 양 적혈구 현탁액 및 0.5 ㎖의 10% 보체와 혼합하였다. 보체는 3마리의 래트로부터 유래한 혈청을 1:10의 비율로 식염수 용액과 혼합하여 만들었다. 결과적인 혈청 용액을 약 30분의 기간 동안 약 37℃의 온도에서 인큐베이터에 저장하였다. 이후, 결과적인 혈청 용액을 더 이상의 반응을 멈추게 하기 위하여 약 O℃의 온도로 냉장고에 두었다. 혈청 용액은 이후 원심분리하여 상청액을 수집하였다. 상청액의 색깔 비교를 분광 광도계 UV-721을 사용하여 540 nm에서 수행하였다. 각각의 상청액 샘플에 대한 흡광도는 혈청 용혈 수준의 인덱스로서 기록하였다. 결과는 아래 표 5에서 보여준다.

결과는 모델 그룹에서 헤모리신의 혈청 특이적 항체의 수준이 블랭크 그룹과 비교하여 사이클로포스파미드에 의해 유의하게 감소하였음을 가리키고(P<O.01), 이는 동물 모델이 잘 확립되었음을 가리킨다.

광학 밀도는 헤모리신의 항체 수준의 지시자이다. 블랭크 그룹과의 비교에서, 사이클로포스파미드를 받은 모델 그룹은 유의하게 낮은 OD 값을 가졌고, 이는 헤모리신의 항체 수준이 사이클로포스파미드에 의해 유의하게 감소되었음을 가리킨다. 앞서 상술한 바와 같이 허브 추출물 조성물 처리의 투여는 사이클로포스파미드에 의해 유도된 면역 결핍 마우스에서 헤모리신의 항체의 수준을 유의하게 증가시키는 것을 보여주었다.

모델 그룹과의 비교에서, AB 및 ABC 추출물 조성물은 사이클로포스파미드에 의해 유도된 면역결핍 마우스에서의 면역 기능을 유의하게 향상시켰고, 세망내피계의 식세포 능력을 증가시켰다. 고 AB 투여량 및 고, 중간 및 저 ABC 투여량은 마우스에서의 면역 기능의 향상에서 레바미솔과 유사한 효능을 가졌다.

양 적혈구의 순환 항체 수준 시험에서의 효과

그룹	투여량 g/kg	동물 수	헤모리신의 OD값
블랭크 대조군	-	10	0.74+0.009
모델 대조군	-	10	0.56±0.004^ΔΔ
레바미솔	0.03	10	0.75±0.006^**
AB	3.75	10	0.68±0.006^*
AB	7.5	10	0.66±0.008^*
AB	15	10	0.72±0.006^**
ABC	3.83	10	0.70±0.018^**
ABC	7.66	10	0.69±0.008^**
ABC	13	10	0.73±0.043^**

^ΔΔ블랭크와 비교, P<O.01

^** 모델과 비교, P<O.01

^*모델과 비교, P<0.05

실시예 6: 마우스에서의 복막 마크로파지 식균작용에서 추출물 조성물의 효과의 분석

추출물 조성물 AB 및 ABC의 항-염증 효과를 일련의 치료 그룹에 대하여 마우스에서의 복막 마크로파지 식균작용의 분석을 통해 결정하였다.

20-25g의 체중인 마우스를 본 연구에서 사용하였다. 각각의 그룹은 동일한 수의 수컷 및 암컷 동물을 포함하였다. 마우스를 각각 10마리의 마우스가 있는 9개의 그룹으로 무작위로 나누었다: (1) 블랭크 대조군, (2) 모델 대조군, (3) AB 고 투여량(15 g/kg), (4) AB 중간 투여량(7.5 g/kg), (5) AB 저 투여량(3.75 g/kg), (6) ABC 고 투여량(13.0 g/kg), (7) ABC 중간 투여량(7.66 g/kg), (8) ABC 저 투여량(3.83 g/kg), 및 (9) 레바미솔 염산염 그룹. 블랭크 및 모델 대조군 그룹은 동일한 부피의 식염수를 경구로 투여하였다.

처리는 7일 동안 위 주입에 의해 마우스에게 투여되었다. 2일, 4일, 및 6일째에, 블랭크 대조군 그룹의 것들을 제외하고, 각각의 마우스에 복강내로 50 mg/10 ㎖/kg의 사이클로포스파미드를 주사하였다. 블랭크 그룹은 복강내로 동일한 부피의 식염수를 주사하였다. 마우스에 0.1 ㎖/1O g의 투여량으로 꼬리 정맥을 통해 인디아 잉크를 주사하였다. 정맥혈을 주사 후 2분 및 10분에 각각 안와로부터 수집하였다. 20 μl의 정맥혈을 2 ㎖의 0.1% 탄산 나트륨 용액과 완전히 혼합하였다. 이후 각각의 샘플에 대한 광학 밀도(OD)를 분광 광도계 UV-752에 의해 600 nm에서 측정하였다.

식세포 계수 K 및 식세포 계수 인덱스 α를 하기 식을 사용하여 계산하였다:

식세포 계수 K=(logOD₁-logOD₂)/(t₂-t₁)

식세포 계수 인덱스 α=W/WLS

t: 시간, W: 마우스 체중, WLS: 간 및 비장의 무게.

아래의 표 6은 각각의 그룹에 대한 식세포 계수(K) 및 식세포 계수 인덱스(α)를 나타낸다. 모델 그룹에 대한 식세포 계수(K) 및 식세포 계수 인덱스(α)는 블랭크 대조군 그룹과 비교하여 유의하게 감소하였고, 이는 동물 모델이 잘 확립되었음을 가리킨다. 각각의 AB 및 ABC 허브 조성물은 사이클로포스파미드에 의해 유도된 세포 면역의 억제에서 유의한 길항 작용을 가졌고, 블랭크 대조군 그룹 수준에 의해 나타내는 바와 같이 정상 수준에 가깝게 식세포 계수(K) 및 식세포 계수 인덱스(α)를 회복하였다. 사이클로포스파미드에 의해 유도된 면역결핍 마우스에서 모든 AB 및 ABC 허브 조성물은 향상된 면역 기능이 증명되었고, 그들의 효능은 레바미솔 그룹의 것과 유사하였다.

블랭크 그룹과 비교:^□□ P<0.01

모델과 비교, ^** P < 0.01,

모델과 비교 ^* P < 0.05

본 발명의 바람직한 구체예를 본원에서 보여주고, 기술하였지만, 이런 구체예는 오직 예시로서만 제공되었음을 당업자는 명백히 인식할 것이다. 다수의 변형, 변경, 및 치환이 본 발명을 벗어나지 않고 당업자에 의해 일어날 것이다. 본원에서 기술한 본 발명의 구체예의 다양한 대안이 본 발명의 실시에서 사용될 수 있음이 이해되어야만 한다. 하기 청구항은 본 발명의 범위를 규정하며, 이들 청구항의 범위 내에서의 방법 및 구성, 및 그들의 등가물은 그에 의해 커버된다는 것을 의도한다.

Claims

판람근(Radix isatidis)으로부터 제조된 추출물 및 금은화(Flos Lonicerae)로부터 제조된 추출물을 포함하는, 인플루엔자, 염증, 또는 인플루엔자 및 염증 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 복령(Poria cocos(Schw.) Wolf)으로부터 제조된 추출물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제 둘 다를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 경구 투여 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 경구 투여 형태는 정제, 환약, 연질 캡슐, 경질 캡슐, 과립제, 분말, 농축액, 시럽, 액체, 주조 환, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
20℃ 내지 110℃의 범위로부터 선택되는 온도에서 수성 용매에 식물 구성 요소를 침지시키고, 그것에 의해 허브 추출 혼합물을 제조하는 단계;
허브 추출 혼합물로부터 액체 분획을 분리하고, 상기 액체 분획을 여과하여 수성 허브 여과액을 제조하는 단계;
수성 허브 여과액을 시럽-유사 밀도까지 탈수시키는 단계; 및
상기 탈수된 허브 여과액 및 이들의 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 조제하는 단계를 포함하는,
제 1항에 따른 조성물을 제조하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 조성물은 경구 투여 형태로서 제형화하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 경구 투여 형태는 정제, 환약, 연질 캡슐, 과립제, 분말, 농축액, 시럽, 액체, 주조 환 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 수성 용매는 에탄올, 메탄올, 이소프로필 알코올, 에틸 아세테이트, 에틸 에테르, 아세토니트릴, 메틸렌 클로라이드, 헥산, 아세트산, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유기 용매와 물의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 수성 용매는 무기 산, 무기 염기, 및 이들의 조합 중 적어도 하나와 물의 혼합물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 수성 허브 여과액을 탈수 및 가공하여 건조된 분말을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 판람근 추출물 및 상기 금은화 추출물은 1.0:0.2 내지 1.0:3.0의 비율로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 판람근 추출물, 상기 금은화 추출물, 및 상기 복령 추출물은 1.0:1.0:2.1의 비율로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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