CN116004577B - α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A-F44Y突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及酶工程和基因工程领域，具体涉及α‑L‑鼠李糖苷酶BtRha78A‑F44Y突变体及其制备方法和应用。所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的BtRha78A酶具有一个氨基酸的突变，所述突变为第44位的苯丙氨酸突变为酪氨酸。本发明的突变体短时间内催化效率更高，为实现大量水解芦丁制备异槲皮素进行工业化提供了理论指导。

Description

α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A-F44Y突变体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及酶工程和基因工程领域，具体涉及α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A-F44Y突变体及其制备方法和应用。

背景技术

α-L-鼠李糖苷酶是一种重要的生物技术酶，可以水解大部分天然产物末端的L-鼠李糖，例如芦丁、橙皮苷、人参皂苷等。广泛分布于细菌、真菌、植物、动物组织等。应用于工业、药用预处理和食品生产等，例如，它可以使果汁脱苦，通过萜烯的去糖基化来增强葡萄汁和改善葡萄酒香味等。芦丁，来源于槐花，苦荞等植物中，归属于黄酮醇，是槲皮素的二糖糖苷，其具广泛的药理活性，包括抗氧化、降压、抗癌、抗流感和抗炎等作用，异槲皮素同样具备此药理活性，但其因为糖苷的存在，具有可以提高化合物稳定性，增加水溶性，减少毒副作用，提高药物特异性和靶向性等优势，引来了越来越多学者的关注。然而，目前在对α-L-鼠李糖苷酶进行大规模工业和食品生产时，仍然存在着大量的技术障碍，由于天然的α-L-鼠李糖苷酶活力较低，反应条件不适等因素限制其应用。

随着蛋白质工程技术的不断兴起，开始对蛋白序列进行修改与编辑，对所需酶进行分子改造，最终达到我们的目的酶。目前，分子改造包括定向进化，理性设计和半理性设计。定向进化是在一个感兴趣的基因中低频率地引入随机分布的突变，然后选择具有所需特性的突变蛋白，定向进化可以使酶实现相对快速的工程，而不需要深入了解结构功能关系，主要限制是必须开发一种高通量筛选方法；与定向进化不同的是，理性设计需要深入的了解所改造酶的序列、结构和功能关系，最终确定所需突变的靶点，进行定点突变来研究其特性；最新进展采用定向进化与理性设计相结合，即半理性设计，来弥补上述缺陷，简单地说，该方法利用蛋白质序列和结构信息，以及相关计算，构建一个更小但智能的突变库来针对特定的残基，对特定氨基酸位置的关注会导致文库大小的显著减少，进而筛选优秀突变体。

专利号为CN202010653391.2，名称为一种α-鼠李糖苷酶、其编码基因及其表达和应用，涉及耐高温，热稳定性的α-鼠李糖苷酶，在适宜条件下可以将芦丁几乎实现完全转化为异槲皮素，催化活力仍是受限，但并未涉及分子改造技术；专利号为CN202110692714.3，名称为一种鼠李糖苷酶突变体及其制备方法和应用，对α-L-鼠李糖苷酶进行半理性设计得到高活性的组合突变体，并未应用于大量制备异槲皮素。因此，对α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A进行半理性设计获得具备水解芦丁生成异槲皮素的高效率的α-L-鼠李糖苷酶优秀突变体是一个具有意义的研究方向。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A-F44Y突变体及其制备方法和应用。

第一方面，本发明提供α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A-F44Y突变体，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的BtRha78A酶具有一个氨基酸的突变,，所述突变为第44位的苯丙氨酸突变为酪氨酸。

第二方面，本发明提供编码所述α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A-F44Y突变体的DNA分子。

进一步的，所述DNA分子具有a1-a3所示核苷酸序列中任意一个：

a1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示核苷酸序列；

a2、a1中核苷酸序列的互补序列；

a3、编码所述α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A-F44Y突变体，且因遗传密码的简并性而与a1和a2不同的核苷酸序列。

第三方面，本发明提供具有所述DNA分子的重组表达载体。

第四方面，本发明提供包含所述重组表达载体的宿主细胞。

第五方面，本发明提供所述α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A-F44Y突变体的制备方法，包括以下步骤：诱导所述宿主细胞表达α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A-F44Y突变体，分离纯化表达的BtRha78A-F44Y突变体。

第六方面，本发明提供所述α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A-F44Y突变体在催化芦丁制备异槲皮素中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明利用PyMOL对α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A底物通的入口处的氨基酸进行分析，确定第44为作为突变靶点，对其进行半理性设计新酶，获得了在短时间内催化效率更高的优秀突变体，为实现大量水解芦丁制备异槲皮素进行工业化提供了理论指导。

2.利用全细胞和纯酶分别对芦丁进行催化反应，突变体在37℃和pH 6.5的体系下进行反应。全细胞条件下，反应时间为60min时，F44Y的转化率比WT高出55.7％。纯酶条件下，反应时间为20min时，WT的转化率仅为10.7％，此时F44Y转化率提高5.13倍。F44Y反应10min的转化率35.0％可以达到WT反应80min的转化率35.0％；当反应时间达到80min时，F44Y进入平台期，此时，转化率比WT高60.9％。

附图说明

图1为实施例1中底物通道及其入口处的氨基酸残基。

图2为实施例1中丙氨酸扫描突变体全细胞对芦丁催化的相对活性。

图3为实施例2中全质粒PCR产物的核酸电泳图。

图4为实施例2中催化反应的流程图。

图5为实施例2中芦丁和异槲皮素的标准曲线。

图6为实施例2中野生型及突变体全细胞对芦丁水解活性评价。

图7为实施例3中野生型及突变体纯化后目的蛋白SDS-PAGE。图中的泳道1代表Maker，泳道2-4分别代表WT、F44A、F44Y纯化后的目的蛋白。

图8为实施例3中纯酶条件下高活性突变体催化芦丁时间曲线。

图9为实施例3中纯酶条件下反应时间为20min时优秀突变体对芦丁的催化活性。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例涉及的含有α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)的质粒pET-28a-BtRha78A由申请人实验室保存，公开于文献《Characterization of aglycoside hydrolase family 78a-L-rhamnosidase from Bacteroidesthetaiotaomicron VPI-5482 and identification of functional residues》。

实施例1：α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A突变位点的确定

使用PyMOL研究来源于人体肠道细菌多形拟杆菌VPI-5482的α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A(PDB id:3CIH)的空间结构，分析底物通道及其入口处的氨基酸残基，确定17个氨基酸残基作为突变靶点，分别为E39、F44、P45、P46、F47、W48、E233、T379、I380、W435、V436、F437、V438、D439、Y610、G611、R612，蛋白结构如图1所示。

构建17个突变位点的丙氨酸扫描突变体，异源表达后全细胞催化芦丁制备异槲皮素，将17个突变体与WT的相对活性进行比较，如图2所示，发现只有F44A相对活力比WT高32.8％，其余位点相对活力均小于野生型，我们认为该位点耐受突变程度较高，具有较高的可塑性，因此我们选择F44位点进行定点饱和突变。

实施例2：α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A突变体的制备、异源表达及催化反应

1、F44定点饱和突变：

(1)引物设计如表1所示；

表1 F44定点饱和突变引物

(2)质粒pET-28a-BtRha78A_WT的小量提取(参照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒说明书)。以质粒pET-28a-BtRha78A为模板进行全质粒PCR，PCR体系和PCR程序见表2和表3；

表2全质粒PCR体系

表3全质粒PCR程序

(3)核酸电泳：用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，以DL10000DNA Marker作为标准分子量，核酸电泳图如图3所示，产物条带在7000-10000bp之间，表明全质粒PCR扩增成功。

(4)消化模板：向PCR产物中加入1μL QuickCut Dpn I，置于37℃金属浴消化模板2h；

(5)将上述PCR产物、野生型质粒和BtRha78A-F44A(作为阳性对照)质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，在37℃培养箱培养12h。

2、F44定点饱和突变体库的筛选及α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A突变体的制备

(1)初筛：

挑单克隆：向母板每孔加入200μL 2×YT含卡那霉素的液体培养基，用已灭菌的牙签挑252个克隆，每块96孔板母板(共3块)包含6个野生型、4个阳性对照以及2个空白对照，37℃，150rpm恒温震荡过夜培养(约15h)；

菌液转接及保存：向子板每孔加入160μL的2×YT含卡那霉素的液体培养基，然后从母板中取20μL菌液分别对应加入子板中，子板于37℃，150rpm恒温震荡培养大约5.5h至菌密度OD600＝1.0，母板中每孔加入50μL 70％的甘油，暂存于-40℃冰箱；

诱导表达：向子板每孔加入20μL 5mM的IPTG，16℃，150rpm低温过夜诱导表达(约15h)；

筛选反应：将诱导表达后的菌液3700rpm离心30min，弃上清，每孔加入100μL预混合液(预混合液中包含：芦丁(终浓度为1mM)、β-D葡萄糖苷酶TnBgl1A-DM纯酶液(终浓度为0.02mg/mL)和pH 6.5 50mM PB buffer缓冲液)吸打混匀，37℃，650rpm，反应2h(α-L-鼠李糖苷酶反应)，80℃烘箱反应30min(β-D葡萄糖苷酶反应)，每孔加入100μL甲醇终止反应，3700rpm，离心30min(除去菌体和碎片)，取上清60μL加入已含140μL pH 10.0 50mM的碳酸钠的检测板中(槲皮素在碱性pH 10.0条件下自氧化形成多聚体，在320nm处出现最大吸收峰，称为槲皮素的特征峰)，室温静置30min，待酶标仪检测320nm处的吸光度值。

初筛结果：252个突变体经初筛后选择75个突变体进入复筛。

(2)复筛：

初筛获得的克隆从母板中分别对应以1％接种量转接至5mL 2×YT含卡那霉素的液体培养基，37℃，180rpm培养至OD600＝1.0，加入5μL 0.5M IPTG低温过夜诱导表达12-14h，收集菌体；

筛选反应：每组反应三个平行，实验流程如图4所示。

复筛结果：75个突变体经复筛，选择催化活力高于野生型15％的突变体(36个)进入终筛。

3、终筛

(1)突变体诱导表达

将复筛所得突变体菌种以1％接种量接种于含卡那霉素(终浓度为50ng/mL)5mL 2×YT液体培养基中进行菌种活化，37℃，210rpm，培养8-9h；将活化好的种子液均以1％接种量转接至含卡那霉素的100mL 2×YT液体培养基中，37℃，180rpm，培养至OD600＝1.0；加入IPTG(终浓度为0.5mM)，16℃，180rpm过夜诱导表达12-14h；菌液于4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。

(2)突变体催化反应

突变体全细胞对芦丁的水解反应，实验过程如图4所示。

(3)利用HPLC对异槲皮素进行定量分析，色谱条件如下：

高效液相色谱仪：1525/2487型高效液相色谱系统(Waters中国有限公司)

色谱柱：Hypersil OSD2-C18色谱柱(大连依利特分析仪器有限公司)

检测物质：芦丁和异槲皮素

检测波长：260nm

运行时间：16min

流速：1mL/min

流动相：0.5％冰乙酸：乙腈＝84:16

上样量：10μL

(4)HPLC标曲的制作

用芦丁和异槲皮素标准品制作浓度与峰面积标准曲线，用来计算底物浓度，产物浓度和转化率。用甲醇溶液配置芦丁与异槲皮素配比分别为0.20mM：0.00mM、0.18mM：0.02mM、0.16mM：0.04mM、0.14mM：0.06mM、0.12mM：0.08mM、0.10mM：0.10mM、0.08mM：0.12mM、0.06mM：0.14mM、0.04mM：0.16mM、0.02mM：0.18mM、0.00mM：0.20mM的标准品，过0.22μm有机滤膜后，HPLC进行检测，如图5所示，芦丁标准曲线为y＝9.1x，异槲皮素标准曲线为y＝8.2x。

终筛结果：选择催化活力高于野生型10％的17个突变体经测序获得其序列，制备获得α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A优秀突变体F44Y(编码基因序列如SEQ ID NO.2所示)。结果：利用图5芦丁与异槲皮素的标曲计算其转化率，如图6所示，WT、F44A和F44Y的转化率分别为33.9％、54.0％和90.3％，F44Y对芦丁转化率提高达56.8％，后续进一步研究F44Y随反应时间的变化对芦丁催化活性的影响。

实施例3：优秀突变体(F44Y)对芦丁催化活性的时间曲线制作

1、BtRha78A野生型及其突变体的表达与纯化：

(1)BtRha78A野生型及其突变体的表达，同实施例2的异源表达步骤；

(2)收集到的菌泥用pH 8.0 50mM PB buffer以1:12(w/v)重悬，然后超声50min，13000rpm离心30min，收集上清进行镍柱亲和纯化；

(3)亲和纯化纯化步骤如下：

表4亲和纯化纯化步骤

在4℃层析柜中，将亲和纯化后的目的蛋白通过2L pH 8.0 50mM磷酸缓冲液透析两次，然后分装至Eppendorf管中，利用超微量紫外可见分光光度计NanoDrop 2000测定蛋白浓度，通过SDS-PAGE电泳检测目的蛋白纯度，暂存于-20℃冰箱。

(4)通过SDS-PAGE电泳检测目的蛋白纯度，电泳结果如图7所示，4个蛋白大小与理论分子量大小一致，纯度达95％以上。

2、BtRha78A野生型及其突变体在不同反应时间下对芦丁催化活性的影响

高活性突变体酶法水解芦丁反应时间曲线测定：水解反应过程参照实施例2的催化反应，将菌体悬液替换为1mg/mL的纯酶液，测定野生型及突变体在0-80min内不同时间对芦丁的催化活性，每组反应三个平行。

纯酶条件下高活性突变体水解芦丁反应时间曲线，如图8所示，在0-80min内野生型和突变体随反应时间的增加转化率都呈现上升趋势，突变体F44Y在反应时间为70min时转化率达到94.6％，此时转化率趋于缓慢增长。而WT处于逐渐增长趋势。当反应时间为10min时，F44Y的转化率为35.7％，略高于WT反应80min的转化率34.9％。

纯酶条件下，如图9所示，反应时间为20min时，WT的转化率仅为10.7％，此时F44Y转化率提高5.13倍。

综上所述：本发明对α-L鼠李糖苷酶BtRha78A进行分子改造，对底物通道入口处的氨基酸进行半理性设计，通过高通量筛选，得到反应时间短，催化效率高的优秀突变体，突变体F44Y反应10min，可达到WT催化反应80min的转化率。以生物转化来源于廉价原材料苦荞和槐花的天然黄酮二糖苷芦丁从而高效制备生理学功效高、生物利用率高的稀有黄酮葡萄糖苷异槲皮素，为异槲皮素的工业化生产和应用奠定基础。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (6)

1.α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A-F44Y突变体，其特征在于，所述突变体是将BtRha78A酶的氨基酸序列第44位的苯丙氨酸突变为酪氨酸制得，所述BtRha78A酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.编码权利要求1所述α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A-F44Y突变体的DNA分子。

3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，具有a1-a2所示核苷酸序列中任意一个：

a1、SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；

a2、编码所述α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A-F44Y突变体，且因遗传密码的简并性而与a1不同的核苷酸序列。

4.具有权利要求3所述DNA分子的重组表达载体。

5.包含权利要求4所述重组表达载体的大肠杆菌工程菌。

6.权利要求1所述α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A-F44Y突变体在催化芦丁制备异槲皮素中的应用。