CN109988739A - 一步法高效制备小分子硫酸软骨素和小分子透明质酸的方法 - Google Patents

一步法高效制备小分子硫酸软骨素和小分子透明质酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种一步法高效制备小分子硫酸软骨素和小分子透明质酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明将来源于普通变形杆菌Proteus vulgaris ATCC33420的硫酸软骨素ABC裂解酶进行异源表达，选取信号肽wapA，采用组成型木糖启动子Pxyl和pHY300PLK载体，通过木糖进行诱导，实现了硫酸软骨素ABC裂解酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达，并通过设计的硫酸软骨素裂解酶‑酶膜反应器实现了小分子硫酸软骨素和小分子透明质酸的高效连续生产。本发明以食品级枯草芽孢杆菌作为宿主菌株，安全可靠，为工业化绿色生产小分子硫酸软骨素和小分子透明质酸的提供了有效的参考与借鉴，同时节能减排，经济效益和社会效益显著。

Description

一步法高效制备小分子硫酸软骨素和小分子透明质酸的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种硫酸软骨素裂解酶克隆表达及其在硫酸软骨素制备中的应用。
背景技术
硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate)和透明质酸(Hyaluronic Acid)都属糖胺聚糖，硫酸软骨素是D-葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺的共聚物的硫酸酯盐，共聚物内六碳糖通过β-(1,4)和β-(1,3)糖苷键交替连接，一般约含50～70个双糖单位，分子量在10kDa～50kDa之间。透明质酸是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺通过β-(1,3)糖苷键连接而成的双糖重复结构单位组成的线性多糖；每个双糖单位通过件β-(1,4)糖苷键与另一个双糖单位连接起来；其双糖单位可达25000个之多，分子量在20000～50000kDa之间。
硫酸软骨素作为医疗药物，它们具有降血脂、抗血栓、抗肿瘤、治疗关节炎、动脉硬化、心脑血管疾病、听觉障碍、肾炎、肝炎以及神经痛等作用，还可用作滴眼剂；作为食品添加剂，硫酸软骨素可用于食品的乳化、保湿和祛除异味。透明质酸具有高度粘弹性和可塑性，超强的持水性和渗透性以及良好的生物相容性，被广泛应用于医学、药物、化妆品和食品等领域。
目前工业生产硫酸软骨素的方法通常包括碱法、酶法、中性盐法以及碱盐法等，虽然工艺不同，但硫酸软骨素分子量一般为10kDa～50kDa，此类硫酸软骨素因分子量较大，人体吸收及生物利用度较低，严重影响了硫酸软骨素的疗效。大量的研究文献证明，分子量在2000Da左右的硫酸软骨素吸收率和生物利用度最好。透明质酸具有更大的分子量(20000～50000kDa)，也存在相同的问题。因此，制备小分子硫酸软骨素和小分子透明质酸具有重要意义。
制备小分子硫酸软骨素和透明质酸的方法有物理降解法、化学降解法、酶解法。物理法主要为加热、机械剪切、超声波破碎和、γ-射线辐照等，可促使硫酸软骨素和透明质酸发生降解。虽然物理降解法处理过程简单，产品易于回收，但是存在一定的缺陷，例如加热法易使产品变色，超声效率较低，γ-射线辐照残留，且产品的稳定性差、分子量范围较大。化学降解方法有水解法和氧化降解法，水解法包括酸水解和碱水解，氧化降解常用的氧化剂为次氯酸钠和过氧化氢。但是，化学降解法引入了化学试剂，反应条件复杂，易给产品的生物活性带来影响和产品的纯化带来困难，且产生大量的工业废水。而酶法降解由于其反应条件温和、便于检测以及生物活性保持较好等特点，成为近年来小分子肝素的研究的热点。
硫酸软骨素裂解酶(Chondroitinase,ChSase)是一类能将硫酸软骨素和透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和二糖及寡糖的裂解酶。根据其作用底物的不同分为ChSase ABC,ChSase AC,ChSase B和ChSase C。硫酸软骨素裂解酶产生菌如表1所示，其中普通变形杆菌Proteus vulgaris是ChSase ABC的主要来源。
表1硫酸软骨素裂解酶产生菌
目前对于ChSase ABC的重组表达研究较少，Prabhakar等虽然构建了Escherichiacoli BL21(DE3)-pET-28a-csl ABC，但是仅仅得到少量的可溶性蛋白，大多的ChSase ABC以包涵体的形式存在。李晔等虽然将P.vulgaris KCTC2579来源的ChSase ABC基因通过融合标签甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH和麦芽糖结合蛋白MBP在E.coli中得到可溶性表达，但是融合标签的存在影响了酶的相关性质。此外，小分子量硫酸软骨素一般用于医药和食品领域，因此大肠杆菌表达的ChSase ABC并不适用于小分子量硫酸软骨素的制备。高慧玲等建立了ChSase ABC分泌型真核表达载体，结果以分泌形式表达，但是人胶质瘤细胞TJ905生产周期较长且培养条件苛刻不适合工业化应用。
对于ChSase ABC的发酵生产主要的问题是：发酵生产ChSaseABC酶活偏低，且多为胞内表达，而破碎过程必定会增加生产成本。因此，构建以分泌型生产ChSase ABC的菌株具有更重要的经济、社会和环境意义。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是，提供一种一步法高效制备小分子硫酸软骨素和小分子透明质酸的方法，该法首先构建了食品安全的ChSase ABC重组菌，实现了ChSaseABC的分泌表达，解决了ChSase ABC以包涵体存在的生产问题；通过设计的硫酸软骨素裂解酶-酶膜反应器实现了小分子硫酸软骨素和小分子透明质酸的一步法高效连续生产，并将昂贵的硫酸软骨素裂解酶循环利用，大大降低了生产成本。本法不仅降低了生产成本和生产周期，而且对节能减排和环境保护起到了积极的作用。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一步法高效制备小分子硫酸软骨素和小分子透明质酸的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)基因工程菌的构建：
根据已报道的Proteus vulgaris来源的硫酸软骨素ABC裂解酶基因序列，设计引物通过体外扩增法得到SEQID NO.1所示的基因序列。利用体外扩增技术分别扩增硫酸软骨素ABC裂解酶基因、信号肽wapA、木糖启动子Pxyl以及pHY300PLK基因，再将这4个基因通过一步克隆试剂盒连接，即得到重组质粒pHY300PLK-Pxyl-wapA-硫酸软骨素l ABC；再将重组质粒转化枯草芽孢杆菌，即得到枯草芽孢杆菌基因工程菌。
(2)硫酸软骨素ABC裂解酶的诱导表达：
将重组枯草芽孢杆菌接种于5mL含有四环素抗性的LB液体培养基中，37℃过夜培养；再以4％接种量转接200mL含四环素抗性的发酵培养基，发酵培养2～4小时至OD660达到0.6时，加入木糖诱导表达16～24h。
(3)小分子透明质酸制备：
(3a)软骨预处理：将动物软骨粉碎处理后，放入反应釜中，加入蒸馏水，控制温度为80～95℃，加热1～4h，除去上层油脂；
(3b)酶解：用NaOH调节步骤(3a)得到的软骨预处理液的pH为7.0～10.0；向其中加入木瓜蛋白酶和胶原蛋白酶，使总酶活与软骨质量的比例为1×106～6×106U：1kg，酶解1～5h；再用12mol/L的盐酸调节pH为6.0～8.0，向其中加入菠萝蛋白酶和胰蛋白酶，使总酶活与软骨质量的比例为1×105～6×105U：1kg，酶解1～5h；最后灭酶，得到混合液A；
酶解完成的确定：将0.5mol/L三氯乙酸滴加到酶解液中观察酶解液的混浊程度，酶解液不混浊或显微混浊，则证明酶解完成；
(3c)过滤：过滤步骤(3b)得到的混合液A，收集滤液；
(3d)吸附：将步骤(3c)得到的滤液加入离子交换层析柱内，经吸附处理后，得到吸附了硫酸软骨素和透明质酸的层析柱；
吸附完成的确定方法：将2体积的无水乙醇加入1体积的吸附穿透液中，或将CPC滴加到吸附液中，若无硫酸软骨素或透明质酸析出或溶液没有变浑浊，即吸附完成。
(3e)除杂：用0.5％～1％的NaCl水溶液以2～6BV/h的流速对步骤(3d)得到的吸附了硫酸软骨素和透明质酸的层析柱进行除杂处理；
除杂完成的确定方法：除杂穿透液中蛋白质浓度小于1‰时，除杂完成；
(3f)洗脱：用2％～5％的NaCl水溶液以2～4BV/h的流速对吸附了硫酸软骨素和透明质酸的层析柱进行洗脱处理，得到洗脱液A，洗脱液A中含有透明质酸；
洗脱完成的确定方法：将2体积的无水乙醇加入1体积的实时洗脱液中，若无透明质酸析出或溶液没有变浑浊，洗脱完成。
(3g)脱盐：将步骤(3f)得到的洗脱液A用超滤系统100kDa～300kDa超滤膜的进行脱盐，得到超滤截留液Ⅰ；
脱盐完成的确定方法：将2体积的无水乙醇加入1体积的超滤截留液中，若仅溶液变浑浊，但无透明质酸沉淀析出，脱盐完成；
(3h)透明质酸的连续降解：将步骤(3g)得到超滤截留液Ⅰ泵入酶膜反应器的降解反应釜10-2中，向其中加入硫酸软骨素ABC裂解酶，使硫酸软骨素ABC裂解酶的总酶活与透明质酸质量的比例为1×104～6×104U：1kg，控制转速50～200rpm，温度20～40℃。降解反应进行1h后，开启超滤膜系统2，小分子透明质酸透过超滤膜进入浓缩釜13中，大分子透明质酸被截留返回到降解反应釜中继续降解，硫酸软骨素ABC裂解酶则被截留返回到降解反应釜中循环利用。当浓缩釜中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启超滤浓缩系统，水分子透过超滤膜进入降解反应釜中被循环利用，小分子透明质酸被截留返回到浓缩釜中继续浓缩。
透明质酸降解完成的确定方法：以CPC滴定法测定降解反应釜中透明质酸的浓度小于降解前透明质酸浓度的10％，即降解完成。
(3i)除菌：对步骤(3h)浓缩釜13得到的超滤截留液Ⅱ进行灭菌处理，得到无菌滤液Ⅱ；
(3j)浓缩：将步骤(3i)得到无菌滤液Ⅱ通过三效浓缩器浓缩，得到无菌浓缩液ⅠI；
浓缩完成的确定方法：透明质酸浓度在100～150g/L时，即浓缩完成。
(3k)干燥：将步骤(3j)得到的无菌浓缩液ⅠI泵入喷雾干燥塔内，进风温度185℃，出风温度90℃，进行干燥，得到小分子透明质酸成品；
(4)小分子硫酸软骨素制备：
(4a)洗脱：用12％～15％的NaCl水溶液以2～6BV/h的流速对步骤(3f)中的层析柱进行第二次洗脱处理，得到洗脱液B，洗脱液B中含有硫酸软骨素；
洗脱完成的确定方法：将2体积的无水乙醇加入1体积的实时洗脱液中，若无硫酸软骨素析出或溶液没有变浑浊，即洗脱完成。
(4b)脱盐：将步骤(4a)得到的洗脱液B用1000Da～8000Da的超滤膜系统进行超滤脱盐，得到超滤截留液III；
脱盐完成的确定方法：将2体积的无水乙醇加入1体积的超滤截留液中，若仅溶液变浑浊，但无硫酸软骨素沉淀析出，即脱盐完成；
(4c)硫酸软骨素的连续降解：将步骤(4b)得到超滤截留液III泵入酶膜反应器的降解反应釜10-1中，向其中加入硫酸软骨素ABC裂解酶，使硫酸软骨素ABC裂解酶的总酶活与硫酸软骨素质量的比例为1×104～6×104U：1kg，控制转速50～200rpm，温度20～40℃。当降解反应进行0.5h后，开启超滤膜系统，小分子硫酸软骨素透过超滤膜进入浓缩釜中，大分子硫酸软骨素被截留返回到降解反应釜中继续降解，硫酸软骨素ABC裂解酶则被截留返回到降解反应釜中循环利用。当浓缩釜中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启纳滤系统，水分子透过纳滤膜进入降解反应釜中被循环利用，小分子硫酸软骨素被截留返回到浓缩釜中继续浓缩。
硫酸软骨素降解完成的确定方法：以CPC滴定法测定降解反应釜中硫酸软骨素的浓度小于降解前硫酸软骨素浓度的10％，即降解完成。
(4d)除菌：对步骤(4c)浓缩釜13中得到的纳滤截留液ⅡI进行除菌处理，得到无菌滤液ⅡI；
(4e)浓缩：将步骤(4d)得到无菌滤液ⅡI通过三效浓缩器浓缩，得到无菌浓缩液ⅠII；
浓缩完成的确定方法：硫酸软骨素浓度在300～350g/L时，即浓缩完成。
(4f)干燥：将步骤(4e)得到的无菌浓缩液Ⅰ加入喷雾干燥塔内，进风温度185℃，出风温度90℃，进行干燥，得到小分子硫酸软骨素成品；
其中，步骤(2)中，所述的发酵培养基优选成分为：糖蜜8g/L，硫酸软骨素5g/L，酵母粉6g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，K2HPO4·3H2O 3g/L，CaCl2 2g/L，pH6.5。
其中，步骤(2)中，所述的枯草芽孢杆菌基因工程菌表达硫酸软骨素裂解酶的时机是OD660为0.4～1.2，优选0.8；所述的木糖诱导剂浓度为0.5～20g/L，优选5～8g/L；所述优选诱导表达时间为16～20h。
其中，步骤(3a)中，所述的动物软骨为鲨鱼软骨、鲟鱼软骨、牛软骨、猪软骨、鸭软骨和鸡软骨中的一种或几种的混合物，反应釜中，水与软骨的质量比为1～5：1，鲨鱼和鲟鱼软骨优选2：1；牛软骨优选3：1；猪软骨优选5：1；鸭软骨和鸡软骨优选1：1；
其中，步骤(3b)中，所述的木瓜蛋白酶和胶原蛋白酶的添加量按照酶活比为1：2添加；所述的菠萝蛋白酶和胰蛋白酶的添加量按照酶活比为3：1添加；优选木瓜蛋白酶和胶原蛋白酶的添加量是3×106U：1kg，优选菠萝蛋白酶和胰蛋白酶的添加量是4×105U：1kg。
其中，步骤(3d)中，所述的离子交换层析柱中填充的是88-30型离子交换树脂。
其中步骤(3e)中，所述的NaCl水溶液浓度优选为0.8％，流速为5BV/h；步骤(3f)中，所述的NaCl水溶液浓度优选为3％，流速为3BV/h；
其中步骤(3g)中，所述的脱盐超滤系统中超滤膜的优选孔径为20kDa；
其中步骤(3h)中，所述的透明质酸优选浓度为3～5％；硫酸软骨素ABC裂解酶优选添加量为5×104U：1kg；酶膜反应器中超滤膜系统12的优选操作压力为0.15～0.25MPa；酶膜反应器中超滤膜系统14的优选操作压力为0.10～0.15MPa；酶膜反应器中超滤膜系统12和超滤膜系统14的优选循环流速为5～10L/min；
其中，步骤(3i)和(4d)中，所述除菌处理，是利用0.01～0.22μm除菌膜过滤除菌，优选0.1μm的金属除菌过滤器。
其中，步骤(3k)和(4e)中，所述的三效浓缩器浓缩，其浓缩条件为：一效温度85～90℃，二效温度80～85℃，三效温度65～70℃，真空度为0.03～0.05MPa。
其中步骤(4a)中，所述的NaCl水溶液浓度优选为12.5％，流速为4BV/h；
其中步骤(4b)中，所述的脱盐超滤系统中超滤膜的优选孔径为5000Da～8000Da；
其中步骤(4c)中，所述的硫酸软骨素为6～10％；硫酸软骨素ABC裂解酶优选添加量为2.5×104U：1kg；酶膜反应器中超滤膜系统12的优选操作压力为0.05～0.15MPa；酶膜反应器中超滤膜系统14的优选操作压力为0.05～0.10MPa；酶膜反应器中超滤膜系统12和超滤膜系统14的优选循环流速为5～8L/min；
有益效果：
1、本发明采用食品级枯草芽孢杆菌作为生产菌株，可满足医疗卫生和食品安全的要求，无内毒素和病原感染的风险，安全无毒，操作简单，为重组枯草芽孢杆菌工业化生产小分子透明质酸和小分子硫酸软骨素提供了借鉴。
2、设计的硫酸软骨素裂解酶-酶膜反应器，避免了酶的固定化操作，并使游离硫酸软骨素裂解酶得到了重复利用，有效降低了生产成本。
3、本发明通过生物降解法，从软骨中一步法制备了小分子透明质酸和小分子硫酸软骨素，减少了生产工序和能耗，降低了生产周期与生产成本，符合节约资源，环境友好的生产理念。
4、本发明将生物降解法替代了物理降解法和化学降解法制备小分子透明质酸和小分子硫酸软骨素的工艺，有效的保证了产品的生物活性和物理化学性质。
5、本发明利用除菌膜对小分子透明质酸和小分子硫酸软骨素溶液进行灭菌处理，使其微生物指标达到检测标准，避免了传统辐照灭菌引起的产品物理性状的改变。
6、本发明从动物软骨中一步法连续制备了小分子透明质酸和小分子硫酸软骨素，大大提高了利润空间。此外，可以根据生产要求更改膜分离系统12中膜孔径的大小，实现硫酸软骨素和透明质酸的分子量可控生产。
附图说明
图1重组pHY300-Pxyl-wapA-csl ABC构建流程图；
图2硫酸软骨素ABC裂解酶的SDS-PAGE电泳图；
图3酶膜反应器结构示意图；
图4酶膜反应器操作稳定性(批次反应收率)。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
图3中，1-1～1-3温度传感器，2-1～2-3电机，3-1～3-12调节阀，4-1～4-4恒流泵，5-1～5-2原料进口，6-1～6-3空气放空口或者压缩空气进口，7清水进口，8-1～8-3夹套，9-1～9-3搅拌器，10-1第一降解反应釜，10-2第二降解反应釜，11-1～11-3压力表，12超滤膜组件，12-1超滤进口，12-2超滤出口，13浓缩釜，14-1纳滤进口，14-2纳滤出口，15-1～15-3物料出口，16超滤回流出口，17纳滤回流出口。
本发明中使用的酶膜反应器的包括如下组件：
第一降解反应釜10-1、第二降解反应釜10-2、超滤膜组件12、浓缩釜13和膜过滤组件14；
所述第一降解反应釜10-1包括：第一夹套8-1、第一搅拌桨9-1、第一电机2-1、第一温度传感器1-1，所述第一夹套8-1包覆在第一降解反应釜10-1的外部，所述第一搅拌桨9-1与第一电机2-1连接，所述第一搅拌桨9-1、第一温度传感器1-1伸入第一降解反应釜10-1的内部，所述第一降解反应釜10-1的上部设有反应液出口管道，所述反应液出口管道与超滤膜组件12的一端连接，所述反应液出口管道上设有第一恒流泵4-3-1、第一调节阀3-9-1、第一压力表11-1、所述反应液出口管道上设有第一料液出口15-1；
所述第二降解反应釜10-2包括：第二夹套8-3、第二搅拌桨9-3、第二电机2-3、第二温度传感器1-2，所述第二夹套8-3包覆在第二降解反应釜10-2的外部，所述第二搅拌桨9-3与第二电机2-3连接，所述第二搅拌桨9-3、第二温度传感器1-2伸入第二反应釜10-2的内部，所述第二降解反应釜10-2的上部设有第二反应液出口管道，所述第二反应液出口管道与第二超滤膜组件12的一端连接，所述反应液出口管道上设有第二恒流泵4-3-2、第二调节阀3-9-3、第二压力表11-3、第二所述反应液出口管道上设有第二料液出口15-3；
所述超滤膜组件12包括：超滤液进口12-1、超滤液出口12-2，所述超滤膜组件12内设有超滤膜，所述超滤膜的孔径为1000Da、2000Da、2500Da、3000Da或者5000Da，所述超滤液进口12-1与反应液出口管道连接，所述超滤液出口12-2通过管道与浓缩釜13连接，所述超滤膜组件12上设有超滤回流出口16，所述超滤回流出口16通过管道与第一降解反应釜10-1、第二降解反应釜10-2连接；
所述浓缩釜13包括：夹套8-2、搅拌桨9-2、电机2-2、温度传感器1-2，所述夹套8-2包覆在浓缩釜13包括：夹套8-2、搅拌桨9-2、电机2-2、温度传感器1-2，所述夹套8-2包的外部，所述搅拌桨9-2与电机2-2连接，所述搅拌桨9-2、温度传感器1-2伸入浓缩釜13的内部，所述浓缩釜13上设有清水进入管道7，所述清水进入管道7上设有调节阀3-5和恒流泵4-2；
所述膜过滤组件14包括进口14-1和出口14-2，所述膜过滤组件14中设有纳滤膜或超滤膜，所述纳滤膜的孔径为100Da～1000Da，所述超滤膜的孔径为10KDa～50kDa；所述膜过滤组件14的进口14-1通过管道与浓缩釜13连接，所述管道上设有恒流泵4-4、调节阀3-10、压力表11-2。
实施例1：重组枯草芽孢杆菌的构建
硫酸软骨素ABC裂解酶基因的扩增：以Proteus vulgaris ATCC33420的基因组为模板，扩增硫酸软骨素ABC裂解酶基因片段。PCR扩增体系为基因组DNA 1μL，引物1和引物2各4μL,KOD聚合酶50μL,ddH2O 41μL，PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性2min；然后60℃退火30s，72℃延伸1.2min，循环35次；72℃延伸l min。
线性化pHY300PLK基因的扩增：以pHY300PLK为模板，扩增更改酶切位点的pHY300PLK线性化片段。PCR扩增体系为pHY300PLK 1μL，引物3和引物4各4μL,KOD聚合酶50μL,ddH2O 41μL，PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性2min；然后62℃退火30s，72℃延伸5min，循环35次；72℃延伸l min。
糖启动子Pxyl基因的扩增：以Bacillus subtilis str.168基因组为模板，扩增木糖启动子Pxyl基因片段。PCR扩增体系为基因组1μL，引物5和引物6各4μL,KOD聚合酶50μL,ddH2O 41μL，PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性2min；然后62℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环35次；72℃延伸l min。
以Bacillus subtilis str.168基因组为模板，扩增信号肽wapA基因片段。PCR扩增体系为基因组1μL，引物7和引物8各4μL,KOD聚合酶50μL,ddH2O 41μL，PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性2min；然后62℃退火30s，72℃延伸0.2min，循环35次；72℃延伸lmin。
重组质粒构建：将以上4条扩增条带经凝胶电泳后切胶，用柱式割胶回收试剂盒回收，回收产物用一步克隆多片段试剂盒MultiS进行环化，将环化产物连接加入100μL感受态细胞中，冰浴30min，42℃水浴热激90s，快速置于冰上1～3min。加入新鲜的LB液体培养基800μL，于37℃振荡培养45min，取200μL菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基表面，37℃培养12～16h。将阳性菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养并提取质粒，送测序公司测序确认，重组质粒pHY300-Pxyl-wapA-csl ABC构建成功。
重组枯草芽孢杆菌构建：吸取5μL重组质粒pHY300-Pxyl-wapA-csl ABC加入500μL枯草芽孢杆菌感受态中，在37℃恒温摇床中100rpm条件下培养1.5h，取转化菌液用涂布棒涂布于四环素抗性平板。将阳性菌落接种于含有四环素抗性的LB液体培养基中培养。经酶活测定结果可知，该阳性克隆菌落含有DNA片段插入质粒，即构建完成含硫酸软骨素ABC裂解酶基因的重组枯草芽孢杆菌。
表1重组枯草芽孢杆菌的构建所需引物
实施例2：硫酸软骨素ABC裂解酶的诱导表达
将构建的重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis str.l68-△spoOA-pHY300PLK-Pxyl-wapA-csl ABC接种于含有四环素抗性的LB液体中培养基中，37℃过夜培养；再以4％接种量转接到1L含四环素的发酵培养基中，发酵培养2～4h至OD660达到0.6时，加入8g/L的木糖进行诱导表达24h，而由于本发明中宿主为敲除了芽孢生长所需的关键基因枯草芽孢杆菌，因此有利于硫酸软骨素ABC裂解酶分泌表达，最终发酵液上清液中硫酸软骨素ABC裂解酶酶活可达24U/mL，为目前最高水平。
实施例3：发酵液的硫酸软骨素ABC裂解酶酶活测定
取1mL的发酵液离心，分别取0.1mL上清液和7.9mL 1g/L硫酸软骨素(0.02mol/LTris-HCL配制，pH7.5)，加入到15mL的比色管中，置于37℃水浴锅中反应20min，立即置于沸水浴中煮沸5min，对照管以相同的条件加入灭活的发酵液上清液，在232nm处测定光吸收值。酶的活力单位U定义为37℃条件下，每分钟催化形成1μmol不饱和双糖所需的酶量。
实施例4：以鱼类软骨为原料一步法联产小分子硫酸软骨素和小分子透明质酸。
将1000kg鲨鱼和鲟鱼软骨(包括翅骨、脊椎骨和头骨等)加入酶解反应釜中，加入2000kg蒸馏水，升温到85℃，保持1h，降温至50℃，用6mol/L的NaOH溶液调整pH至8.5，加入总酶活力为3×109U的木瓜蛋白酶和胶原蛋白酶，55℃酶解2h；调整pH至7.5，再加入总酶活力为2.0×108U的菠萝蛋白酶和胰蛋白酶，50℃酶解4h；用盐酸调节pH至6.5，升温至75℃，保持2h灭酶。酶解结束后趁热利用碟片离心机将酶解液过滤，得到滤液。将滤液用盐酸调节pH至5.5后，打入离子交换层析柱(88-30型离子交换树脂)内，保持温度55℃，5BV/h的流速回流吸附3h；然后用0.7％的NaCl水溶液以4BV/h的流速对糖胺聚糖的层析柱进行除杂处理；再用2％的NaCl水溶液以2BV/h的流速对糖胺聚糖的层析柱进行洗脱处理，得到含有透明质酸的洗脱液；将含有透明质酸的洗脱液用300kDa的超滤膜进行脱盐；再将脱盐后的透明质酸溶液泵入酶膜反应器的降解反应釜10-2中，并加入2×104U的硫酸软骨素ABC裂解酶，50rpm，30℃条件下进行反应。降解1h后，开启超滤膜系统12，实现小分子透明质酸与透明质酸的分离。当浓缩釜13中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启超滤浓缩系统，将小分子透明质酸溶液浓缩。对小分子透明质酸溶液浓缩进行灭菌处理，再将其通过三效浓缩器继续浓缩后用喷雾干燥塔进行干燥，得到无菌小分子透明质酸成品11.34kg，产品收率为1.13％，平均分子量为29kDa；
用12％的NaCl水溶液以3BV/h的流速层析柱进行第二次洗脱处理，得到含有硫酸软骨素的洗脱液；将含有硫酸软骨素的洗脱液用5000Da的超滤膜进行脱盐；再将脱盐后的硫酸软骨素溶液泵入酶膜反应器的降解反应釜10-1中，并加入1×104U的硫酸软骨素ABC裂解酶，50rpm，30℃条件下进行反应。降解0.5h后，开启超滤膜系统12，实现小分子硫酸软骨素与硫酸软骨素的分离。当浓缩釜13中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启纳滤浓缩系统，将小分子硫酸软骨素溶液浓缩。对小分子硫酸软骨素溶液浓缩进行灭菌处理，再将其通过三效浓缩器继续浓缩后用喷雾干燥塔进行干燥，得到无菌小分子硫酸软骨素成品185kg，产品收率为18.54％，平均分子量为4800Da。
如果制备其他不同分子量的硫酸软骨素或者透明质酸，只需更换酶膜反应器中，超滤系统12的超滤膜孔径大小即可实现。
实施例5：以猪、牛软骨为原料一步法联产小分子硫酸软骨素和小分子透明质酸。
将2000kg牛和猪软骨(包括气管、喉骨、月亮骨、肋骨和鼻骨等)加入酶解反应釜中，加入5000kg蒸馏水，升温到95℃，保持2h，降温至50℃，用6mol/L的NaOH溶液调整pH至8.5，加入总酶活力为1×1010U的木瓜蛋白酶和胶原蛋白酶，55℃酶解2h；调整pH至7.5，再加入总酶活力为8×108U的菠萝蛋白酶和胰蛋白酶，50℃酶解4h；用盐酸调节pH至6.5，升温至75℃，保持2h灭酶。酶解结束后趁热利用碟片离心机将酶解液过滤，得到滤液。将滤液用盐酸调节pH至5.5后，打入离子交换层析柱内(88-30型离子交换树脂)，保持温度55℃，5BV/h的流速回流吸附3h；然后用0.7％的NaCl水溶液以4BV/h的流速对糖胺聚糖的层析柱进行除杂处理；再用2％的NaCl水溶液以2BV/h的流速对糖胺聚糖的层析柱进行洗脱处理，得到含有透明质酸的洗脱液；将含有透明质酸的洗脱液用300kDa的超滤膜进行脱盐；再将脱盐后的透明质酸溶液泵入酶膜反应器的降解反应釜10-2中，并加入2×104U的硫酸软骨素ABC裂解酶，50rpm，30℃条件下进行反应。降解1h后，开启超滤膜系统12(100kDa)，实现小分子透明质酸与透明质酸的分离。当浓缩釜13中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启超滤浓缩系统(50kDa)，将小分子透明质酸溶液浓缩。对小分子透明质酸溶液浓缩进行灭菌处理，再将其通过三效浓缩器继续浓缩后用喷雾干燥塔进行干燥，得到无菌小分子透明质酸成品14.94kg，产品收率为7.47‰，平均分子量为96kDa；
用12％的NaCl水溶液以3BV/h的流速层析柱进行第二次洗脱处理，得到含有硫酸软骨素的洗脱液；将含有硫酸软骨素的洗脱液用5000Da的超滤膜进行脱盐；再将脱盐后的硫酸软骨素溶液泵入酶膜反应器的降解反应釜10-1中，并加入2×104U的硫酸软骨素ABC裂解酶，50rpm，30℃条件下进行反应。降解0.5h后，开启超滤膜系统12(2kDa)，实现小分子硫酸软骨素与硫酸软骨素的分离。当浓缩釜13中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启纳滤浓缩系统(360Da)，将小分子硫酸软骨素溶液浓缩。对小分子硫酸软骨素溶液浓缩进行灭菌处理，再将其通过三效浓缩器继续浓缩后用喷雾干燥塔进行干燥，得到无菌小分子硫酸软骨素成品471.6kg，产品收率为23.58％，平均分子量为1950Da。
如果制备其他不同分子量的硫酸软骨素或者透明质酸，只需更换酶膜反应器中，超滤系统12的超滤膜孔径大小即可实现。
实施例6：以鸡、鸭软骨为原料一步法联产小分子硫酸软骨素和小分子透明质酸。
将3000kg鸡和鸭软骨(包括气管和胸骨等)加入酶解反应釜中，加入3000kg蒸馏水，升温到90℃，保持1h，降温至50℃，用6mol/L的NaOH溶液调整pH至8.5，加入总酶活力为5×109U的木瓜蛋白酶和胶原蛋白酶，55℃酶解1h；调整pH至7.5，再加入总酶活力为8×108U的菠萝蛋白酶和胰蛋白酶，50℃酶解4h；用盐酸调节pH至6.5，升温至75℃，保持2h灭酶。酶解结束后趁热利用碟片离心机将酶解液过滤，得到滤液。将滤液用盐酸调节pH至5.5后，打入离子交换层析柱内(88-30型离子交换树脂)，保持温度55℃，5BV/h的流速回流吸附3h；然后用0.7％的NaCl水溶液以4BV/h的流速对糖胺聚糖的层析柱进行除杂处理；再用2％的NaCl水溶液以2BV/h的流速对糖胺聚糖的层析柱进行洗脱处理，得到含有透明质酸的洗脱液；将含有透明质酸的洗脱液用300kDa的超滤膜进行脱盐；再将脱盐后的透明质酸溶液泵入酶膜反应器的降解反应釜10-2中，并加入2×104U的硫酸软骨素ABC裂解酶，50rpm，30℃条件下进行反应。降解1h后，开启超滤膜系统12(50kDa)，实现小分子透明质酸与透明质酸的分离。当浓缩釜13中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启超滤浓缩系统(20kDa)，将小分子透明质酸溶液浓缩。对小分子透明质酸溶液浓缩进行灭菌处理，再将其通过三效浓缩器继续浓缩后用喷雾干燥塔进行干燥，得到无菌小分子透明质酸成品28.13kg，产品收率为9.37‰，平均分子量为19.2kDa；
用12％的NaCl水溶液以3BV/h的流速层析柱进行第二次洗脱处理，得到含有硫酸软骨素的洗脱液；将含有硫酸软骨素的洗脱液用5000Da的超滤膜进行脱盐；再将脱盐后的硫酸软骨素溶液泵入酶膜反应器的降解反应釜10-1中，并加入2×104U的硫酸软骨素ABC裂解酶，50rpm，30℃条件下进行反应。降解0.5h后，开启超滤膜系统12(2kDa)，实现小分子硫酸软骨素与硫酸软骨素的分离。当浓缩釜13中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启纳滤浓缩系统(360Da)，将小分子硫酸软骨素溶液浓缩。对小分子硫酸软骨素溶液浓缩进行灭菌处理，再将其通过三效浓缩器继续浓缩后用喷雾干燥塔进行干燥，得到无菌小分子硫酸软骨素成品50.65kg，产品收率为25.33％，平均分子量为1900Da。
如果制备其他不同分子量的硫酸软骨素或者透明质酸，只需更换酶膜反应器中，超滤系统12的超滤膜孔径大小即可实现。
实施例6：酶膜反应器的操作稳定性
其他操作步骤均与实施例4、5、6相同，所不同的是，对酶膜反应器的操作稳定性进行考察，实施例5为例具体说明。生产中酶膜反应器中的硫酸软骨素ABC裂解酶是反复使用的，在连续投料(相同重量的软骨)6批次情况下，分别考察第一降解反应釜10-1和第二降解反应釜10-2中硫酸软骨素ABC裂解酶批次稳定性(见图4)，降解反应釜10-1和10-2中的硫酸软骨素ABC均具有较好的可操作性。
序列表
<110> 常熟理工学院
<120> 一步法高效制备小分子硫酸软骨素和小分子透明质酸的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2994
<212> DNA
<213> 普通变形杆菌(Proteus vulgaris)
<400> 1
gccaccagca atcctgcatt tgatcctaaa aatctgatgc agtcagaaat ttaccatttt 60
gcacaaaata acccattagc agacttctca tcagataaaa actcaatact aacgttatct 120
gataaacgta gcattatggg aaaccaatct cttttatgga aatggaaagg tggtagtagc 180
tttactttac ataaaaaact gattgtcccc accgataaag aagcatctaa agcatgggga 240
cgctcatcta cccccgtttt ctcattttgg ctttacaatg aaaaaccgat tgatggttat 300
cttactatcg atttcggaga aaaactcatt tcaaccagtg aggctcaggc aggctttaaa 360
gtaaaattag atttcactgg ctggcgtact gtgggagtct ctttaaataa cgatcttgaa 420
aatcgagaga tgaccttaaa tgcaaccaat acctcctctg atggtactca agacagcatt 480
gggcgttctt taggtgctaa agtcgatagt attcgtttta aagcgccttc taatgtgagt 540
cagggtgaaa tctatatcga ccgtattatg ttttctgtcg atgatgctcg ctaccaatgg 600
tctgattatc aagtaaaaac tcgcttatca gaacctgaaa ttcaatttca caacgtaaag 660
ccacaactac ctgtaacacc tgaaaattta gcggccattg atcttattcg ccaacgtcta 720
attaatgaat ttgtcggagg tgaaaaagag acaaacctcg cattagaaga gaatatcagc 780
aaattaaaaa gtgatttcga tgctcttaat attcacactt tagcaaatgg tggaacgcaa 840
ggcagacatc tgatcactga taaacaaatc attatttatc aaccagagaa tcttaactct 900
caagataaac aactatttga taattatgtt attttaggta attacacgac attaatgttt 960
aatattagcc gtgcttatgt gctggaaaaa gatcccacac aaaaggcgca actaaagcag 1020
atgtacttat taatgacaaa gcatttatta gatcaaggct ttgttaaagg gagtgcttta 1080
gtgacaaccc atcactgggg atacagttct cgttggtggt atatttccac gttattaatg 1140
tctgatgcac taaaagaagc gaacctacaa actcaagttt atgattcatt actgtggtat 1200
tcacgtgagt ttaaaagtag ttttgatatg aaagtaagtg ctgatagctc tgatctagat 1260
tatttcaata ccttatctcg ccaacattta gccttattac tactagagcc tgatgatcaa 1320
aagcgtatca acttagttaa tactttcagc cattatatca ctggcgcatt aacgcaagtg 1380
ccaccgggtg gtaaagatgg tttacgccct gatggtacag catggcgaca tgaaggcaac 1440
tatccgggct actctttccc agcctttaaa aatgcctctc agcttattta tttattacgc 1500
gatacaccat tttcagtggg tgaaagtggt tggaataacc tgaaaaaagc gatggtttca 1560
gcgtggatct acagtaatcc agaagttgga ttaccgcttg caggaagaca cccttttaac 1620
tcaccttcgt taaaatcagt cgctcaaggc tattactggc ttgccatgtc tgcaaaatca 1680
tcgcctgata aaacacttgc atctatttat cttgcgatta gtgataaaac acaaaatgaa 1740
tcaactgcta tttttggaga aactattaca ccagcgtctt tacctcaagg tttctatgcc 1800
tttaatggcg gtgcttttgg tattcatcgt tggcaagata aaatggtgac actgaaagct 1860
tataacacca atgtttggtc atctgaaatt tataacaaag ataaccgtta tggccgttac 1920
caaagtcatg gtgtcgctca aatagtgagt aatggctcgc agctttcaca gggctatcag 1980
caagaaggtt gggattggaa tagaatgcca ggggcaacca ctattcacct tcctcttaaa 2040
gacttagaca gtcctaaacc tcatacctta atgcaacgtg gagagcgtgg atttagcgga 2100
acatcatccc ttgaaggtca atatggcatg atggcattcg atcttattta tcccgccaat 2160
cttgagcgtt ttgatcctaa tttcactgcg aaaaagagtg tattagccgc tgataatcac 2220
ttaattttta ttggtagcaa tataaatagt agtgataaaa ataaaaatgt tgaaacgacc 2280
ttattccaac atgccattac tccaacatta aatacccttt ggattaatgg acaaaagata 2340
gaaaacatgc cttatcaaac aacacttcaa caaggtgatt ggttaattga tagcaatggc 2400
aatggttact taattactca agcagaaaaa gtaaatgtaa gtcgccaaca tcaggtttca 2460
gcggaaaata aaaatcgcca accgacagaa ggaaacttta gctcggcatg gatcgatcac 2520
agcactcgcc ccaaagatgc cagttatgag tatatggtct ttttagatgc gacacctgaa 2580
aaaatgggag agatggcaca aaaattccgt gaaaataatg ggttatatca ggttcttcgt 2640
aaggataaag acgttcatat tattctcgat aaactcagca atgtaacggg atatgccttt 2700
tatcagccag catcaattga agacaaatgg atcaaaaagg ttaataaacc tgcaattgtg 2760
atgactcatc gacaaaaaga cactcttatt gtcagtgcag ttacacctga tttaaatatg 2820
actcgccaaa aagcagcaac tcctgtcacc atcaatgtca cgattaatgg caaatggcaa 2880
tctgctgata aaaatagtga agtgaaatat caggtttctg gtgataacac tgaactgacg 2940
tttacgagtt actttggtat tccacaagaa atcaaactct cgccactccc ttga 2994
<210> 2
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaaaaaaa gaaagaggcg aaactttaaa aggttcattg cagcattttt agtgttggct 60
ttaatgattt cattagtgcc agccgatgta ctagca 96
<210> 3
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttacattgta atcatgtcca gaaaatgatc aatcacaatg gaggacattc ctaatgccgg 60
tgcattctgt cctaaggaag atggcaataa ttcatagcta ttgcctaatt gggaataaac 120
ccttgatgat acttcacttc tcattgaatt taaaaccata ggatgcgatt caattatgct 180
atttcttaaa attacggctt gtgggttgaa agtatttaga atattggtaa ggcctattcc 240
taaatagaat ccaaaatttt gtaatgcatt taaggttccg atatcattca gatgggcgag 300
gtttatgata tcttgatagg acagtttttt ctctttggtc tgaagagatt ttaataaagc 360
cttctctgaa gcatacaatt cccagcatcc tcggtttccg caactgcatt taggaccatt 420
aaagtctatt gtcatatgtc ccatttctcc agagaagccg cttactcctc tatataaatg 480
attgttgata ataacaccga tccctattcc tgtgctgata cttacgtaaa taatgttatc 540
gtgatttttt gcagctccaa atactttttc tccatatgcg ccagcatttg cctcattttc 600
aataaaaaca ggcacattgt acttctcttg tatcgaagat tttaagtcaa tatctctcca 660
gttggagttc ggagtgaaaa caattttttg atctttatca atgagtccag gcacgcaaat 720
acctatacca ataagcccgt acggagattg gggcatttgc gtaataaagt gatgaatcat 780
atcaatcaaa atgtctttcg ttatttctgg agaattggat tccaaatggc ggtattgatc 840
aagaacgatt gttccttcaa ggtctgttaa aatgccatta atataatcca caccaacatc 900
tattccaacg gagtatcctg cctttttatt aaaaacaagc atgacaggtc ttcttccgcc 960
acttgattgt ccttgaccta tttcaaatac catactttct ttcattaacg tgtttacctg 1020
tgatgagaca gttgatttat ttaatccagt catttcagat aattttgctc ttgaaatagg 1080
tgaattttta aggatttctt ttaataataa cttttgattt acttttttga caaaggtttg 1140
atcagcgata tccacttcat ccactccatt tgtttaatct ttaaattaag tatcaacata 1200
gtacatagcg aatcttccct ttattatatc taatgtgttc ataaaaaact aaaaaaaata 1260
ttgaaaatac tgacgaggtt atataagatg aaaataagtt agtttgttta aacaacaaac 1320
taataggtga tgtacttact atatgaaata aaatgcatct gtatttgaat gaatttattt 1380
ttaaggggga aatca 1395

Claims (8)

1.一种产硫酸软骨素的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌中导入了硫酸软骨素ABC裂解酶基因，所述硫酸软骨素ABC裂解酶基因前具有扩增信号肽wapA基因和木糖启动子Pxyl基因，所述硫酸软骨素ABC裂解酶基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述扩增信号肽wapA的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述木糖启动子Pxyl基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的产硫酸软骨素的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis str.l68-△spoOA或者Bacillussubtilis WB800-△spoOA。
3.权利要求1或2所述产硫酸软骨素的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，将木糖启动子Pxyl基因、扩增信号肽wapA基因、硫酸软骨素ABC裂解酶基因依次连接，得到重组片段，将重组片段导入pHY300PLK质粒中，得到重组质粒，将重组质粒导入枯草芽孢杆菌中，既得到产硫酸软骨素的枯草芽孢杆菌基因工程菌；
所述硫酸软骨素ABC裂解酶基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；
所述扩增信号肽wapA基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；
所述木糖启动子Pxyl基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
4.权利要求1或2所述产硫酸软骨素的枯草芽孢杆菌基因工程菌在发酵产硫酸软骨素ABC裂解酶、制备硫酸软骨素及制备透明质酸中的应用。
5.一步法高效制备小分子硫酸软骨素和小分子透明质酸的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)利用权利要求1中产硫酸软骨素的枯草芽孢杆菌基因工程菌发酵得到硫酸软骨素ABC裂解酶；
(2)小分子透明质酸制备：
(2a)软骨预处理：将动物软骨粉碎处理，投入反应釜中，加水，控制温度为70～95℃，加热1～4h；
(2b)酶解：用NaOH调节步骤(2a)得到的软骨预处理液的pH为7.0～10.0；向其中加入木瓜蛋白酶和胶原蛋白酶，使总酶活与软骨质量的比例为1×106～6×106U：1kg，酶解1～5h；再用12mol/L的盐酸调节pH为6.0～8.0，向其中加入菠萝蛋白酶和胰蛋白酶，使总酶活与软骨质量的比例为1×105～6×105U：1kg，酶解1～5h；最后灭酶，得到混合液A；
(2c)过滤：过滤步骤(2b)得到的混合液A，收集滤液；
(2d)吸附：将步骤(2c)得到的滤液加入离子交换层析柱内，经吸附处理后，得到吸附了硫酸软骨素和透明质酸的层析柱；
(2e)除杂：用0.5％～1％的NaCl水溶液以2～6BV/h的流速对步骤(3d)得到的吸附了硫酸软骨素和透明质酸的层析柱进行除杂处理；
(2f)洗脱：用2％～5％的NaCl水溶液以2～6BV/h的流速对吸附了硫酸软骨素和透明质酸的层析柱进行洗脱处理，得到洗脱液A，洗脱液A中含有透明质酸；
(2g)脱盐：将步骤(2f)得到的洗脱液A用超滤系统100kDa～300kDa超滤膜的进行脱盐，得到超滤截留液Ⅰ；
(2h)透明质酸的连续降解：将步骤(2g)得到超滤截留液Ⅰ泵入酶膜反应器的第二降解反应釜(10-2)中，向其中加入硫酸软骨素ABC裂解酶，使硫酸软骨素ABC裂解酶的总酶活与透明质酸质量的比例为1×104～6×104U：1kg，控制转速50～200rpm，温度20～40℃，降解1h；
开启酶膜反应器的超滤膜系统，小分子透明质酸透过超滤膜进入浓缩釜(13)中，大分子透明质酸被截留返回到第二降解反应釜(10-2)中继续降解，硫酸软骨素ABC裂解酶则被截留返回到第二降解反应釜(10-2)中循环利用；
当浓缩釜(13)中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启超滤浓缩系统(14)，水分子透过超滤膜进入第二降解反应釜(10-2)中被循环利用，小分子透明质酸被截留返回到浓缩釜(13)中继续浓缩，得到超滤截留液Ⅱ；
(2i)除菌：对步骤(3h)浓缩釜(13)得到的超滤截留液Ⅱ进行灭菌处理，得到无菌滤液Ⅱ；
(2j)浓缩：将步骤(3i)得到无菌滤液Ⅱ通过三效浓缩器浓缩，得到无菌浓缩液ⅠI；
(2k)干燥：将步骤(3j)得到的无菌浓缩液ⅠI泵入喷雾干燥塔内，进风温度185℃，出风温度90℃，进行干燥，得到小分子透明质酸，所述小分子透明质酸的分子量为10kDa～50kDa；
(3)小分子硫酸软骨素制备：
(3a)洗脱：用12％～15％的NaCl水溶液以2～6BV/h的流速对步骤(2f)中的层析柱进行第二次洗脱处理，得到洗脱液B，洗脱液B中含有硫酸软骨素；
(3b)脱盐：将步骤(3a)得到的洗脱液B用1000～8000Da的超滤膜系统进行超滤脱盐，得到超滤截留液III；
(3c)硫酸软骨素的连续降解：将步骤(3b)得到超滤截留液III泵入酶膜反应器的第一降解反应釜(10-1)中，向其中加入硫酸软骨素ABC裂解酶，使硫酸软骨素ABC裂解酶的总酶活与硫酸软骨素质量的比例为1×104～6×104U：1kg，控制转速50～200rpm，温度20～40℃，降解0.5h；
开启超滤膜系统(12)，小分子硫酸软骨素透过超滤膜进入浓缩釜(13)中，大分子硫酸软骨素被截留返回到降解反应釜(10-1)中继续降解，硫酸软骨素ABC裂解酶则被截留返回到降解反应釜(10-2)中循环利用；
当浓缩釜(13)中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启纳滤系统(14)，水分子透过纳滤膜进入降解反应釜(10)中被循环利用，小分子硫酸软骨素被截留返回到浓缩釜(13)中继续浓缩，得到纳滤截留液ⅡI；
(3d)除菌：对步骤(3c)浓缩釜13中得到的纳滤截留液ⅡI进行除菌处理，得到无菌滤液ⅡI；
(3e)浓缩：将步骤(3d)得到无菌滤液ⅡI通过三效浓缩器浓缩，得到无菌浓缩液ⅠII；
(3f)干燥：将步骤(3e)得到的无菌浓缩液Ⅰ加入喷雾干燥塔内，进风温度185℃，出风温度90℃，进行干燥，得到小分子硫酸软骨素，所述硫酸软骨素的分子量为1000Da～5000Da。
6.根据权利要求1所述的一步法高效制备小分子硫酸软骨素和小分子透明质酸的方法，其特征在于，所述酶膜反应器的包括如下组件：
第一降解反应釜(10-1)、第二降解反应釜(10-2)、超滤膜组件(12)、浓缩釜(13)和膜过滤组件(14)；
所述第一降解反应釜(10-1)包括：第一夹套(8-1)、第一搅拌桨(9-1)、第一电机(2-1)、第一温度传感器(1-1)，所述第一夹套(8-1)包覆在第一降解反应釜(10-1)的外部，所述第一搅拌桨(9-1)与第一电机(2-1)连接，所述第一搅拌桨(9-1)、第一温度传感器(1-1)伸入第一降解反应釜(10-1)的内部，所述第一降解反应釜(10-1)的上部设有反应液出口管道，所述反应液出口管道与超滤膜组件(12)的一端连接，所述反应液出口管道上设有第一恒流泵(4-3-1)、第一调节阀(3-9-1)、第一压力表(11-1)、所述反应液出口管道上设有第一料液出口(15-1)；
所述第二降解反应釜(10-2)包括：第二夹套(8-3)、第二搅拌桨(9-3)、第二电机(2-3)、第二温度传感器(1-2)，所述第二夹套(8-3)包覆在第二降解反应釜(10-2)的外部，所述第二搅拌桨(9-3)与第二电机(2-3)连接，所述第二搅拌桨(9-3)、第二温度传感器(1-2)伸入第二反应釜(10-2)的内部，所述第二降解反应釜(10-2)的上部设有第二反应液出口管道，所述第二反应液出口管道与第二超滤膜组件(12)的一端连接，所述反应液出口管道上设有第二恒流泵(4-3-2)、第二调节阀(3-9-3)、第二压力表(11-3)、第二所述反应液出口管道上设有第二料液出口(15-3)；
所述超滤膜组件(12)包括：超滤液进口(12-1)、超滤液出口(12-2)，所述超滤膜组件(12)内设有超滤膜，所述超滤膜的孔径为1000Da、2000Da、2500Da、3000Da或者5000Da，所述超滤液进口(12-1)与反应液出口管道连接，所述超滤液出口(12-2)通过管道与浓缩釜(13)连接，所述超滤膜组件(12)上设有超滤回流出口(16)，所述超滤回流出口(16)通过管道与第一降解反应釜(10-1)、第二降解反应釜(10-2)连接；
所述浓缩釜(13)包括：夹套(8-2)、搅拌桨(9-2)、电机(2-2)、温度传感器(1-2)，所述夹套(8-2)包覆在浓缩釜(13)包括：夹套(8-2)、搅拌桨(9-2)、电机(2-2)、温度传感器(1-2)，所述夹套(8-2)包的外部，所述搅拌桨(9-2)与电机(2-2)连接，所述搅拌桨(9-2)、温度传感器(1-2)伸入浓缩釜(13)的内部，所述浓缩釜(13)上设有清水进入管道(7)，所述清水进入管道(7)上设有调节阀(3-5)和恒流泵(4-2)；
所述膜过滤组件(14)包括进口(14-1)和出口(14-2)，所述膜过滤组件(14)中设有纳滤膜或超滤膜，所述纳滤膜的孔径为100Da～1000Da，所述超滤膜的孔径为10KDa～50kDa；所述膜过滤组件(14)的进口(14-1)通过管道与浓缩釜(13)连接，所述管道上设有恒流泵(4-4)、调节阀(3-10)、压力表(11-2)。
7.根据权利要求5所述的一步法高效制备小分子硫酸软骨素和小分子透明质酸的方法，其特征在于，步骤(2i)和(3d)中，所述除菌，是利用0.01～0.10μm金属过滤器进行过滤除菌。
8.根据权利要求1所述的一步法高效制备小分子硫酸软骨素和小分子透明质酸的方法，其特征在于，步骤(2j)和(3e)中，所述的三效浓缩器浓缩，其浓缩条件为：一效温度80～90℃，二效温度75～85℃，三效温度60～70℃，真空度为0.02～0.06MPa。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110357983A (zh) * 2019-08-14 2019-10-22 中国海洋大学 一种海参岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素低聚糖的制备方法
CN111808214A (zh) * 2020-07-02 2020-10-23 舟山市齐晟水产有限公司 一种利用鲟鱼软骨提取硫酸软骨素的方法
CN113801904A (zh) * 2021-09-17 2021-12-17 山东华熙海御生物医药有限公司 一种透明质酸寡糖组合物及其制备方法和用途
CN113876623A (zh) * 2021-09-24 2022-01-04 华熙生物科技股份有限公司 一种透明质酸寡糖组合物在抗皮肤衰老、促进胶原蛋白生成中的用途
CN114277049A (zh) * 2021-12-31 2022-04-05 李宪臻 一种异源表达蔗糖异构酶的基因工程菌及应用
CN115232805A (zh) * 2022-06-02 2022-10-25 中国海洋大学 一种硫酸软骨素裂解酶及其重组菌株和应用
CN117265054A (zh) * 2023-11-21 2023-12-22 烟台融科生物科技有限公司 一种使用鸡骨联产硫酸软骨素和骨胶原蛋白活性肽的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101659973A (zh) * 2008-08-26 2010-03-03 徐峥嵘 一种低分子硫酸软骨素制备方法
CN105399863A (zh) * 2015-12-17 2016-03-16 雷春生 一种透明质酸的制备方法
CN106148265A (zh) * 2016-07-15 2016-11-23 江南大学 一种产硫酸软骨素裂解酶的重组枯草芽孢杆菌及其应用
CN108624546A (zh) * 2018-05-30 2018-10-09 南京工业大学 一种重组解淀粉芽孢杆菌及其构建方法和应用
CN108795837A (zh) * 2018-07-06 2018-11-13 江南大学 一种高效表达磷脂酶d的枯草芽孢杆菌工程菌

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101659973A (zh) * 2008-08-26 2010-03-03 徐峥嵘 一种低分子硫酸软骨素制备方法
CN105399863A (zh) * 2015-12-17 2016-03-16 雷春生 一种透明质酸的制备方法
CN106148265A (zh) * 2016-07-15 2016-11-23 江南大学 一种产硫酸软骨素裂解酶的重组枯草芽孢杆菌及其应用
CN108624546A (zh) * 2018-05-30 2018-10-09 南京工业大学 一种重组解淀粉芽孢杆菌及其构建方法和应用
CN108795837A (zh) * 2018-07-06 2018-11-13 江南大学 一种高效表达磷脂酶d的枯草芽孢杆菌工程菌

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YA，Y.Z.等: "Proteus vulgaris strain KCTC 2579 chondroitinase ABC I gene, complete cds,GenBank: KR708541.1", 《GENBANK》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110357983A (zh) * 2019-08-14 2019-10-22 中国海洋大学 一种海参岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素低聚糖的制备方法
CN110357983B (zh) * 2019-08-14 2021-08-31 中国海洋大学 一种海参岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素低聚糖的制备方法
CN111808214A (zh) * 2020-07-02 2020-10-23 舟山市齐晟水产有限公司 一种利用鲟鱼软骨提取硫酸软骨素的方法
CN113801904A (zh) * 2021-09-17 2021-12-17 山东华熙海御生物医药有限公司 一种透明质酸寡糖组合物及其制备方法和用途
CN113876623A (zh) * 2021-09-24 2022-01-04 华熙生物科技股份有限公司 一种透明质酸寡糖组合物在抗皮肤衰老、促进胶原蛋白生成中的用途
CN114277049A (zh) * 2021-12-31 2022-04-05 李宪臻 一种异源表达蔗糖异构酶的基因工程菌及应用
CN115232805A (zh) * 2022-06-02 2022-10-25 中国海洋大学 一种硫酸软骨素裂解酶及其重组菌株和应用
CN115232805B (zh) * 2022-06-02 2023-11-17 中国海洋大学 一种硫酸软骨素裂解酶及其重组菌株和应用
CN117265054A (zh) * 2023-11-21 2023-12-22 烟台融科生物科技有限公司 一种使用鸡骨联产硫酸软骨素和骨胶原蛋白活性肽的方法
CN117265054B (zh) * 2023-11-21 2024-02-13 烟台融科生物科技有限公司 一种使用鸡骨联产硫酸软骨素和骨胶原蛋白活性肽的方法

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