CN1693448A - 一种酵母基因工程菌及耐热耐碱木聚糖酶制剂和应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明是通过基因工程的手段构建能高效表达耐热耐碱木聚糖酶的酵母基因工程菌，并从其中培养分离纯化制取耐热耐碱木聚糖酶，从而能高效、经济的转化制备木寡糖。利用本发明的酵母基因工程菌GS115/HB705制备的耐热耐碱木聚糖酶酶活性可达426IU/ml，耐热性可达80℃，耐碱性可达pH10.6。利用该耐热耐碱木聚糖酶生产木寡糖纯度高，效益好。

Description

一种酵母基因工程菌及耐热耐碱木聚糖酶制剂和应用方法

                        技术领域

本发明涉及的是酵母基因工程菌，特别是一种高效表达耐热耐碱木聚糖酶的酵母基因工程菌及耐热耐碱木聚糖酶制剂和耐热耐碱木聚糖酶水解制备木寡糖的方法。

                        背景技术

植物是自然界中主要的可再生有机资源，其主要成分是纤维素，半纤维素和木质素。其中半纤维素约占植物干重的35％，是除纤维素外，自然界中最为丰富的多糖，而半纤维素主要由木聚糖等多糖组成。作为木聚糖降解的主要作用酶，β-1，4-内切木聚糖酶使木聚糖降解为木聚寡糖或者木糖。

现在，木聚糖酶已被用于纸浆制造、生物漂白、禽畜饲料品质改进等生产实践上。在造纸工业，利用木聚糖酶作为纸浆漂白助剂不仅可以提高纸张的白度和强度，还可以减少氯的用量，从而减轻对环境的污染(Wong K K Y，CRC Crit，Rev et al.Biotechnol.1992，12：413~435)。在食品工业，用木聚糖酶水解木聚糖的方法来生产功能性低聚木糖已成为现实(尤新.食品工业科技.2001，6：1~4)。在饲料行业，利用木聚糖酶可以改善饲料的营养价值，从而提高饲料的利用率。我国农业部制定的《允许使用的饲料和饲料添加剂品种目录》上，将木聚糖酶列入饲料级酶制剂。然而木聚糖酶在饲料行业的应用面临产量低、成本高、耐热性酶难以获得等问题。

由于木聚糖在碱性条件下的可溶性最高，故碱性木聚糖酶尤其倍受关注。同时，木聚糖酶在应用中所进行的预处理过程通常需高温条件，因此，热稳定度高的耐高温木聚糖酶尤显重要。而且，现有木聚糖酶发酵产量较低、分离、纯化工艺较复杂已成为目前木聚糖酶规模化应用的关键限制因子。因此，寻找或产生高温、耐碱木聚糖酶，并显著提高木聚糖酶的酶活性及其在宿主中的分泌表达水平则成为当前木聚糖酶研究中的一个非常重要的方向。

目前，国内有关科研单位广泛进行了木聚糖酶及其相关内容的研究。如中科院微生物研究所刘伟丰、毛爱军、祝令香、赵云、董志扬等人对耐碱性木聚糖酶基因在短小芽孢杆菌中高效分泌表达的研究(见微生物学报，Vol.44.August.No.4.2004，487-490)，其酶活性968.108IU/mL，最适反应温度为55℃，在60℃条件下保温2h酶活力下降90％，该木聚糖酶不耐高温。

中国农业大学王海，李里特，石波等人用玉米芯酶法制备低聚木糖的研究，(见食品科学：2002，Vol，23，No.5，81-83)其木聚糖酶酶活性3.6IU/ml，发酵酶活低，耐热或耐碱性不够好。

国外Guptan N等(Cloning，Expression，and Sequence Analysis of theGene Encoding the Alkali-Stable，Thermostable Endoxylanase fromAlkalophilic，Mesophilic Bacillus sp.Strain NG-27.Appl.Environ.Microbiol，2000，66(6)：2631-2635)克隆了一个耐热耐碱的木聚糖酶基因，但他们只在大肠杆菌中对该基因实现了表达，在1000ml摇瓶中测得的酶活仅为7IU/ml。

                            发明内容

本发明是通过基因工程的手段构建能高效表达耐热耐碱木聚糖酶的酵母基因工程菌，并从其中培养分离纯化制取耐热耐碱木聚糖酶，从而能高效、经济的转化制备木寡糖。

使用的微生物：本发明涉及的酵母基因工程菌(毕赤酵母菌Pichia pastorisGS115/HB705)，它具有高效表达耐热耐碱木聚糖酶的特性，该菌株于2005年4月15日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC No：M205033(以下简称GS115/HB705)

GS115/HB705菌株的菌学特性：

a、形态特征：毕赤酵母的无性生殖为芽殖，有时有假菌丝。有性生殖产生子囊内含有1---4枚光滑圆形、礼帽形或土星子囊孢子。

b、生理生化特征：毕赤酵母能利用特殊的物质为原料生长，如石油、甲醇、氨态氮、有机酸等。GS115/HB705菌株具有毕赤酵母的生理生化特征，同时因插入了耐热耐碱木聚糖酶基因，具有高效表达耐热耐碱木聚糖酶基因的特性。

本发明是这样实现的。酵母基因工程菌GS115/HB705(Pichia pastoris)是通过构建环境基因组文库，并从中筛选出一耐热耐碱木聚糖酶基因，Blast的结果发现，该基因与来源于Bacillus sp.NG-27的木聚糖酶基因AF015445在核苷酸水平具98％同源性，在氨基酸水平具100％同源性。根据其序列设计引物，通过PCR扩增出上述耐热耐碱木聚糖酶酶基因，并将此基因插入到毕赤酵母整合表达载体pHBM905中，然后将得到的含耐热耐碱木聚糖酶酶基因的表达载体导入到毕赤酵母中，再从中筛选出一种高效表达耐热耐碱木聚糖酶酶的酵母基因工程菌GS115/HB705菌株。我们所得到的酶的最适反应pH为8.5，最适反应温度为70℃，在30℃-85℃范围内仍具60％以上酶活性，尤其在50℃-80℃范围内，仍具80％以上酶活性：其在70℃、pH8.5时的半衰期为30min；而且其pH稳定性很高，在pH 4.0-10.6范围内仍具80％以上酶活性。利用该基因工程菌产酶纯度达90％以上，易分离纯化。

具体做法是，根据筛选到的耐热耐碱木聚糖酶酶基因序列，应用PCR方法用从环境基因组文库中筛选到的阳性克隆的质粒DNA为模板，扩增出1.2Kb的DNA片段，将其插入到毕赤酵母(Pichia pastoris)整合表达载体中，再通过化学转化导入到毕赤酵母宿主GS115中，再从中筛选出高效表达耐热耐碱木聚糖酶的酵母基因工程菌。

将高效表达的耐热耐碱木聚糖酶的酵母基因工程菌GS115/HB705，在以甲醇为碳源的培养基中，温度24℃---28℃，经24---360小时诱导培养(每隔一定时间测酶活，酶活性达426IU/ml时停止诱导培养)，将完成诱导培养的酵母基因工程菌经高速离心除去菌体，收集上清液，即粗酶液，经过滤浓缩即得耐热耐碱木聚糖酶产品。

应用上述的耐热耐碱木聚糖酶粗酶液水解制备木寡糖的方法，其步骤为：

1)、将抽提于玉米芯的木聚糖制成浓度为10％--20％的玉米芯木聚糖溶液；

2)、按每50---100g玉米芯木聚糖对应1ml的粗酶液的比例加酶；

3)、上述混合液在60℃---80℃、时间4--12小时进行水解反应；

4)、将水解物进行离心去残渣，取上清液，再经微滤、超滤、真空干燥即为木寡糖成品。

将水解物进行离心去残渣，取上清液，再经微滤、超滤、真空干燥后称重，计算收率为20％---40％，进行薄层层析或质谱鉴定表明2---7糖的木寡糖含量占80％以上。

利用本发明的酵母基因工程菌GS115/HB705制备的耐热耐碱木聚糖酶酶活性高，耐热性可达80℃，耐碱性可达pH10.6。利用该耐热耐碱木聚糖酶生产木寡糖纯度高，效益好。

                        具体实施方式

通过构建环境基因组文库，筛选出内切β-木聚糖酶基因，经过DNA测序分析证实筛选出的基因与来源于Bacillus sp.NG-27的木聚糖酶基因AF015445在核苷酸水平具98％同源性，在氨基酸水平具100％同源性。通过PCR方法将上述基因插入到毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体上，再通过化学转化导入到毕赤酵母宿主GS115中，并对得到的若干转化子进行PCR鉴定。

实施例1：鉴定确证导入了耐热耐碱木聚糖酶基因的GS115转化子若干(如8-10个)，经摇瓶培养，使细胞密度对应的OD600达到2.0---6.0；转接到以甲醇作为唯一碳源的诱导培养基中于24℃---28℃诱导培养。

诱导培养48小时后，每隔24小时取样，对所取样进行SDS-PAGE进行电泳分析。

选择、诱导、培养高效表达耐热耐碱木聚糖酶效果的菌株GS115/HB705(GS115+耐热耐碱木聚糖酶基因)，重复上述过程进行较大规模(100----1000ml的装瓶量)的诱导培养，其间取样进行SDS-PAGE分析，当产酶水平达36IU/ml以上时，停止诱导，离心分离菌体，收集含耐热耐碱木聚糖酶的上清液，即为粗酶液，粗酶液进行酶活测定，酶活性为36IU/ml。

实施例2：鉴定确证导入了耐热耐碱木聚糖酶基因的GS115转化子若干(如8-10个)，经摇瓶培养，使细胞密度对应的OD600达到2.0---6.0；转接到以甲醇作为唯一碳源的诱导培养基中于24℃---28℃诱导培养。

诱导培养192小时，其间前48小时，每隔12小时取样，48小时后，每隔24小时取样，对所取样进行SDS-PAGE进行电泳分析。

选择、诱导、培养高效表达耐热耐碱木聚糖酶效果的菌株GS115/HB705(GS115+耐热耐碱木聚糖酶基因)，重复上述过程进行较大规模(100----1000ml的装瓶量)的诱导培养，其间取样进行SDS-PAGE分析，当产酶水平达179IU/ml以上时，停止诱导，离心分离菌体，收集含耐热耐碱木聚糖酶的上清液，即为粗酶液，粗酶液进行酶活测定，酶活性为179IU/ml。

实施例3：鉴定确证导入了耐热耐碱木聚糖酶基因的GS115转化子若干(如8-10个)，经摇瓶培养，使细胞密度对应的OD600达到2.0---6.0；转接到以甲醇作为唯一碳源的诱导培养基中于24℃---28℃诱导培养。

诱导培养360小时，其间前48小时，每隔12小时取样，48小时后，每隔24小时取样，对所取样进行SDS-PAGE进行电泳分析。

选择、诱导、培养高效表达耐热耐碱木聚糖酶效果的菌株GS115/HB705(GS115+耐热耐碱木聚糖酶基因)，重复上述过程进行较大规模(100----1000ml的装瓶量)的诱导培养，其间取样进行SDS-PAGE分析，当产酶水平达426IU/ml以上时，停止诱导，离心分离菌体，收集含耐热耐碱木聚糖酶的上清液，即为粗酶液，粗酶液进行酶活测定，酶活性为426IU/ml。

粗酶液水解时间：将100---1000g抽提于玉米芯的木聚糖配制成10％--20％的玉米芯木聚糖溶液，再按50---100g玉米芯木聚糖对应1ml粗液的比例加酶，于60℃---80℃进行4---12小时的水解反应。

将上述水解物进行离心去残渣，将上清液依次微滤、超滤、真空干燥后称重，计算收率为20---40％，取部分干燥物重新按一定比例溶于蒸馏水中，进行薄层层析或质谱鉴定表明2---7糖的低聚糖含量大于80％。

Claims (4)

1、一种酵母工程菌(毕赤酵母Pichia pastoris GS115/HB705)，保藏号为CCTCC No：M205033，是通过建立环境基因组文库的方法及PCR技术，从中筛选出一耐热耐碱木聚糖酶基因，其特征在于根据筛选到的耐热耐碱木聚糖酶酶基因序列设计引物，应用常规PCR方法用从环境基因组文库中筛选到的阳性克隆的质粒DNA为模板，扩增出1.2Kb的DNA片段，将其插入到毕赤酵母(Pichiapastoris)整合表达载体pHBM905中，再通过化学转化导入到毕赤酵母宿主GS115中，再从中筛选出高效表达耐热耐碱木聚糖酶酵母基因工程菌。

2、按权利要求1所述的酵母基因工程菌制备的耐热耐碱木聚糖酶，其特征在于将高效表达耐热耐碱木聚糖酶的酵母基因工程菌，在以甲醇为碳源的培养基中，温度24℃---28℃ ，经24---360小时诱导培养，每隔一定时间测酶活，酶活性达36-426IU/ml时停止诱导培养)，将完成诱导培养的酵母基因工程菌经高速离心除去菌体，收集上清液，即粗酶液，经过滤浓缩即得耐热耐碱木聚糖酶产品。

3、按权利要求2所述的酵母基因工程菌制备的耐热耐碱木聚糖酶，其特征在于酶的最适反应pH为8.5，最适反应温度为70℃，在30℃-85℃范围内仍具60％以上酶活性，尤其在50℃-80℃范围内，仍具80％以上酶活性；其在70℃、pH8.5时的半衰期为30min，在pH4.0-10.6范围内仍具80％以上酶活性，利用该基因工程菌产酶纯度达90％以上。

4、按权利要求2或3所述的耐热耐碱木聚糖酶水解制备木寡糖的方法，其特征在于：

1)、将抽提于玉米芯的木聚糖配制成浓度为10---20％木聚糖的溶液；

2)、按每50---100g木聚糖对应1ml的粗酶液比例加酶；

3)、上述混合液在60℃---80℃、时间4--12小时进行水解反应；

4)、将水解物进行离心去残渣，取上清液，再经微滤、超滤、真空干燥即为木寡糖成品。