CN104928271A - 一种木聚糖酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物发酵和酶工程技术领域，尤其涉及一种毕赤酵母工程菌发酵生产的饲用木聚糖酶的制作方法。本发明的目的是提供一种木聚糖酶的制备方法，包括：活化菌种；扩大培养；二次扩大培养；发酵；过滤；超滤浓缩；加入防腐剂混合均匀，精滤，除菌，灌装。通过选择合适的pH、发酵时间和培养基提高酶的产量以及使酶具有更好的耐热性，且发酵时间缩短，利于工业化生产。

Description

一种木聚糖酶的制备方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵和酶工程技术领域，尤其涉及一种毕赤酵母工程菌发酵生产的饲用木聚糖酶的制备方法。
背景技术
木聚糖酶是指可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称，它是一种存在于植物细胞壁中的异质多糖，约占细胞干重的15%-35%，主要分解由五碳糖聚合而成的半纤维素、木聚糖成为五碳糖，如木糖、木二糖、木三糖和少量的阿拉伯糖，是饲料主要用酶之一，木聚糖酶是市场上应用最广泛的单酶制剂之一，而且也是绝大多数饲用复合酶制剂的主要组成成分。
木聚糖酶在饲料、食品、纺织、造纸和日用化工等行业都有着极其广泛的用途。在饲料工业中，木聚糖酶可提高单胃动物的饲料利用率，促进动物生长；在造纸工业中应用酶前处理工艺可以使木质素提取变得更容易，同时保留纤维素成分，这样使得在随后的工艺中减少化学漂白剂的用量，达到既环保又经济的目的；木聚糖应用于小麦食品，通过改善面团的持水性和面筋结构进而改善其品质，并延长其货架期等；上述事实说明木聚糖酶的市场容量很大。目前国内生产木聚糖酶的厂家较少，酶活力单位较低，质量不稳定，木聚糖酶产品主要依靠进口。
目前大多数木聚糖酶的最适温度在40-60℃之间。由于酶在饲料、工业生产、食品加工过程中要经受高温高湿工序，如制粒等，饲用酶还要经受胃酸和胃蛋白酶的损害，这就要求相应酶种具有良好的耐热性。现有技术中制备木聚糖酶发酵时间过长，而且容易引起产量的下降。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种产率高、耐热性好的木聚糖酶的制备方法。
一种木聚糖酶的制备方法，包括如下步骤：
活化菌种：用YPD培养基对毕赤酵母工程菌进行活化，活化条件为30℃,20-24h；
扩大培养：将活化好的菌种接入摇瓶中，于30℃下，以180-220r/min的转速进行扩大培养；
二次扩大培养：22-24h后接入种子罐，30℃条件下进一步扩大培养；
发酵：经种子罐扩大培养后，接入发酵罐，30℃下， pH4.8-5.1条件下进行发酵，140h后发酵结束；
过滤：将发酵结束的料液，加入1%的硅藻土，混合均匀后，打入板框压滤机进行过滤，过滤压力<0.5MPa；
超滤浓缩：过滤澄清后，用膜分子量10000Da的有机膜进行超滤浓缩，浓缩至所需要的酶活；
加入防腐剂盐和山梨酸钾，盐的浓度为10%，山梨酸钾的浓度为2‰。加入量为本领域常规技术手段，例如，质量比为1:1-1:10加入。
加入上述的防腐剂后，与滤液混合均匀，在小于0.5Mpa的压力下，精滤、除菌，灌装。
所述扩大培养的培养基是YPD培养基。
所述YPD培养基是：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%。
所述二次扩大培养的培养基是：碳源5-7%，氮源0.5-3%，硫酸镁0.5-1.0%，硫酸钾0.5-1.0%，磷酸二氢钾0.2-0.6%；优选碳源7%，氮源2%，硫酸镁0.8%，硫酸钾0.5%，磷酸二氢钾0.3%。
所述二次扩大培养基的碳源优选甘油，氮源优选磷酸二氢铵。
所述发酵的条件是30℃下，pH4.8-5.1进行发酵，所述pH优选5.0。
所述发酵的培养基是：甲醇10-20%，氨水1-2％、磷酸二氢钾0.7％、七水合硫酸镁0.03％、硫酸钙 0.05％、硫酸钾0.05％，葡萄糖10%。
所述甲醇的浓度优选15%，氨水优选1.5%
所述的发酵时间120-140小时。
本发明研究中对发酵过程的甲醇用量进行筛选，研究发现，获得木聚糖酶较现有技术产量大幅提高；同时，通过各阶段培养基成分的研究筛选，发现所述方法制得的木聚糖酶与现有木聚糖酶相比具有更好的耐热性，同时产率获得保障，发酵时间也大幅缩短，特别适合工业化生产，能够有效提高产品效率。本发明的木聚糖酶在温度90℃，相对酶活均可保持85%以上；而现有木聚糖酶在温度30-70℃范围内，相对酶活只保持60%。
具体实施方式
下面结合结合具体实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的保护内容不仅限于这些实施例。
酶活性的测定方法为：准确移取3mL缓冲液于100mL容量瓶中，将其浸没在不同温度的水浴锅中（90℃），预热5min，再准确称取2.50g木聚糖酶倒入容量瓶，摇匀，湿热处理3min，测定其剩余酶活，并计算在不同处理条件下木聚糖酶的相对剩余酶活性。
实施例1
活化菌种：用YPD培养基对毕赤酵母工程菌（保藏号：CCTCC，No:M205033）进行活化，活化条件为30℃,22h；
扩大培养：将活化好的菌种接入摇瓶中，于30℃下，以220r/min的转速进行扩大培养，扩大培养所用的培养基是YPD培养基；
二次扩大培养：22h后接入种子罐，30℃条件下进一步扩大培养，二次扩大的培养基是：甘油7%，磷酸二氢铵2%，硫酸镁0.8%，硫酸钾0.5%，磷酸二氢钾0.3%；
发酵：经种子罐扩大培养后，接入发酵罐，30℃下， pH 5.0条件下进行发酵，120h后发酵结束，发酵培养基是：甲醇15%，氨水1.5％、磷酸二氢钾0.7％、七水合硫酸镁0.03％、硫酸钙 0.05％、硫酸钾0.05％，葡萄糖10%；
过滤：将发酵结束的料液，加入1%的硅藻土，混合均匀后，打入板框压滤机进行过滤，过滤压力发酵<0.5MPa；
超滤浓缩：过滤澄清后，用膜分子量10000Da的有机膜进行超滤浓缩，浓缩至所需要的酶活；
加入防腐剂盐和山梨酸钾，盐的浓度为10%，山梨酸钾的浓度为2‰。
加入上述的防腐剂后，与滤液混合均匀，在小于0.5Mpa的压力下，精滤、除菌，灌装，所得酶产率是85%，相对酶活约90%。
实施例2
按照实施例1的方法制备木聚糖酶，研究二次扩大培养的培养基中碳源、氮源的种类及各组分的浓度对木聚糖酶的产率和相对酶活的影响。其余培养环境不变，分别单独改变二次扩大培养基中碳源、氮源的种类、各组分的浓度，结果如下表所示：
表1
实施例3
按照实施例1的方法制备木聚糖酶，研究发酵阶段pH、发酵时间和甲醇浓度对木聚糖酶的产率和相对酶活的影响。其余培养环境不变，分别单独改变pH、发酵时间、甲醇浓度和氨水浓度，结果如下表所示：
表2

Claims (7)

1.一种木聚糖酶的制备方法，包括下述步骤：
活化菌种：用YPD培养基对毕赤酵母工程菌进行活化，活化条件为30℃,20-24h；
扩大培养：将活化好的菌种接入摇瓶中，于30℃下，以180-220r/min的转速进行扩大培养，扩大培养的培养基是YPD培养基；
二次扩大培养：22-24h后接入种子罐，30℃条件下进一步扩大培养，二次扩大培养的培养基是：碳源5-7%，氮源0.5-3%，硫酸镁0.5-1.0%，硫酸钾0.5-1.0%，磷酸二氢钾0.2-0.6%；
发酵：经种子罐扩大培养后，接入发酵罐，30℃下， pH4.8-5.1条件下进行发酵，120h-140h后发酵结束，发酵的培养基是：甲醇10-20%，氨水1-2％、磷酸二氢钾0.7％、七水合硫酸镁0.03％、硫酸钙 0.05％、硫酸钾0.05％，葡萄糖10%；
过滤：将发酵结束的料液，加入1%的硅藻土，混合均匀后，打入板框压滤机进行过滤，过滤压力<0.5MPa；
超滤浓缩：过滤澄清后，用膜分子量10000Da的有机膜进行超滤浓缩，浓缩至所需要的酶活；
加入防腐剂盐和山梨酸钾，盐的浓度为10%，山梨酸钾的浓度为2‰；
加入上述的防腐剂后，与滤液混合均匀，在小于0.5Mpa的压力下，精滤、除菌，灌装。
2.如权利要求1所述的木聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述发酵的条件是30℃下，pH5.0进行发酵。
3.如权利要求1所述的木聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述发酵过程中甲醇的浓度是15%。
4.如权利要求1所述的木聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述发酵过程中氨水的浓度为1.5%。
5.如权利要求1所述的木聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述二次培养的碳源是甘油。
6.如权利要求1所述的木聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述二次培养的氮源是磷酸二氢铵。
7.如权利要求1所述的木聚糖酶的制备方法，其特征在于，二次扩大培养的培养基是碳源7%，氮源2%，硫酸镁0.8%，硫酸钾0.5%，磷酸二氢钾0.3%。
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