KR101371416B1 - 재조합 피키아 파스토리스에 의한 자일라나아제의 대량생산을 위한 최적 배지 조성물 및 발효 조건 - Google Patents

재조합 피키아 파스토리스에 의한 자일라나아제의 대량생산을 위한 최적 배지 조성물 및 발효 조건 Download PDF

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Abstract

본 발명은 밀기울 (wheat bran), 인산이수소칼륨 (KH2PO4) 및 황산수소칼륨 (KHSO4)을 포함하는 것을 특징으로 하는 자일라나아제 (xylanase)를 생산하는 재조합 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 균주의 자일라나아제 (xylanase) 생산용 배지 조성물 및 자일라나아제를 생산하는 재조합 피키아 파스토리스 균주를 상기 자일라나아제 (xylanase) 생산용 배지 조성물이 함유된 발효조에 투입하여 배양하는 단계를 포함하는 자일라나아제 생산 방법을 제공한다.

Description

재조합 피키아 파스토리스에 의한 자일라나아제의 대량생산을 위한 최적 배지 조성물 및 발효 조건{Optimized medium and fermentation conditions for xylanase mass production by recombinant Pichia pastoris}
본 발명은 재조합 피키아 파스토리스에 의한 자일라나아제의 대량생산을 위한 최적 배지 조성물 및 발효 조건에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 밀기울 (wheat bran), 인산이수소칼륨 (KH2PO4) 및 황산수소칼륨 (KHSO4)을 포함하는 것을 특징으로 하는 자일라나아제 (xylanase)를 생산하는 재조합 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 균주의 자일라나아제 (xylanase) 생산용 배지 조성물 및 자일라나아제를 생산하는 재조합 피키아 파스토리스 균주를 상기 자일라나아제 (xylanase) 생산용 배지 조성물이 함유된 발효조에 투입하여 배양하는 단계를 포함하는 자일라나아제 생산 방법에 관한 것이다.
자일란 (xylan)은 자일로오스 (xylose)로 이루어진 헤미셀룰로오스 (hemicellulose, 복합다당류)로 식물 세포벽의 구성요소이며, 식물에 셀룰로오스 다음으로 가장 풍부하게 존재한다. 자일란은 경목과 연목뿐만 아니라 농업 폐기물에서 최대 20~35%의 건조 중량을 차지하고 있으며, 엔도-1,4-β-자일라나아제 (endo-1,4-β-xylanase; EC 3.2.1.8)에 의해 식물 세포벽의 헤미셀룰로오스 β-1,4-당유도체 (backbone)가 가수분해되어 자일로오스나 자일로올리고당이 된다. 자일라나아제는 크래프트 펄프의 전 표백과정에서 친환경적인 표백제로 이용될 수 있으며, 다른 효소와 결합하여 농촌과 산림에서 발생하는 잔여물과 폐기물 등의 유기 폐기물을 화학적으로 분해시켜 발효성 당을 생성하여 유기 폐기물을 제거하는데 중요한 역할을 한다. 또한 동물 사료와 식품 산업을 포함한 커피 및 식물성 유지 추출, 맥주와 주스의 정제, 제약과 화학 산업, 섬유 산업 등에 이용될 수 있다.
많은 연구를 통하여 박테리아, 효모균, 방선균, 사상균 등을 포함하는 여러 미생물이 엔도-1,4-β-자일라나아제를 합성할 수 있다는 것이 밝혀졌고, 대표적으로 백색 부후 담자균 (white rot basidomycete)과 목재 부후균 (Phanerochaete chrysosporium)이 자일라나아제 C를 분비한다고 알려져 있다. 자일라나아제 C는 엔도-1,4-β-자일라나아제의 한 종류로서 글리코시드 하이드로라아제 패밀리 10 (glycoside hydrolase family 10)에 속한다. 글리코시드 하이드로라아제 패밀리 10은 짧은 사슬의 자일로올리고당에 활동적으로 작용하고, 고분자량이며, 낮은 등전점 (isoelectric point) 등의 특징을 나타낸다.
메탄올자화 효모인 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)는 자일란을 분해할 수 없고 이용할 수도 없다. 하지만 세포 내 단백질 및 세포 외 단백질이 고수준으로 발현되기 때문에 뛰어난 숙주 세포로 사용될 수 있어서, 알코올 산화 효소 1 (AOX1) 프로모터를 이용하여 리그닌 퍼옥시다아제 (lignin peroxidase), 망간 퍼옥시다아제 (manganese peroxidase)와 같은 효소를 피키아 파스토리스에서 발현 가능하게 한다. 또한, 아스퍼질러스 피쿰 (Aspergillus ficuum)과 트리코데르마 리세이 (Trichoderma reesei)는 피키아 파스토리스에 엔도-1,4-β-자일라나아제 생성을 유도하였다. 이러한 연구 결과들은 피키아 파스토리스가 엔도-1,4-β-자일라나아제를 생성할 수 있는 잠재력이 있음을 뒷받침해준다. 본 연구에서는 맥주 효모균 (Saccharomyces cerevisiae)의 α-분비 인자를 갖는 벡터 (ρPICZα)와 자일라나아제를 분비하는 목재 부후균으로부터 구축된 자일라나아제를 발현할 수 있는 재조합 플라스미드를 이용하여, 피키아 파스토리스 재조합 균사체 (자일라나아제 C + ρPICZα)의 자일라나아제를 생산을 위한 최적 배지 규명에 사용되었다.
한편, 한국등록특허 제0403903호에는 '신규한 트리코데마 리제이 X18( Trichoderma reesei X18) 변이 균주배양을 이용한 자일라나제의 생산방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2003-0062884호에는 '셀룰라아제 (cellulase)와 자일라나아제 (xylanase)를 생산하는 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) KK2 균주와 이 균주에 의해 효소 및 고체 배양물을 제조하는 방법'이 개시되어 있다. 그러나, 본 발명에서와 같이, 재조합 피키아 파스토리스에 의한 자일라나아제의 대량생산을 위한 최적 배지 조성물 및 발효 조건에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 재조합 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 균주에서 자일라나아제 (xylanase)를 대량으로 생산하기 위하여, 통계적 방법을 적용하여 자일라나아제 생산 배지의 조성과 각 성분의 농도가 최적화된 배지 조성물을 찾았고, 최적화된 배지를 이용하여 자일라나아제 생산용 발효조에서 회분식 발효를 수행할 때, 자일라나아제 생산량을 최대화할 수 있는 온도, pH, 교반속도, 공기 공급 속도 등의 물리화학적 조건이 최적화된 발효 조건을 제공함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 밀기울(wheat bran), 인산이수소칼륨 (KH2PO4) 및 황산수소칼륨 (KHSO4)을 포함하는 것을 특징으로 하는 자일라나아제 (xylanase)를 생산하는 재조합 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 균주의 자일라나아제 생산용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 자일라나아제 (xylanase)를 생산하는 재조합 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 균주를 상기의 자일라나아제 생산용 배지 조성물이 함유된 발효조에 투입하여 배양하는 단계를 포함하는 자일라나아제 생산 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 재조합 피키아 파스토리스에서 생산된 자일라나아제는 크래프트 펄프의 전 표백과정에서 표백에 필요한 화학약품의 양을 상당히 줄여 주어 친환경적인 표백제로 사용될 수 있으며, 다른 효소와 결합하여 농촌과 산림에서 발생하는 잔여물과 폐기물 등의 유기 폐기물을 화학적으로 분해시켜 발효성 당을 생성하여 유기 폐기물을 제거하는데 이용될 수 있다. 또한 동물 사료와 식품 산업을 포함한 커피 및 식물성 유지 추출, 맥주와 주스의 정제, 제약과 화학 산업, 섬유 산업 등에 이용될 수 있어서, 자연 친화적이며 산업적으로도 그 효용성이 높다.
도 1은 재조합 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)의 건조 균체량 (D.C.W)과 측정된 흡광도 값의 표준곡선식을 나타낸다. (건조 균체량에 대한 표준곡선식 (linear regression): Y=2.4306X + 0.0237)
도 2는 자일라나아제 (Xylanase) 농도와 측정된 흡광도 값의 표준곡선식을 나타낸다. (효소 활성에 대한 표준곡선식 : Y=0.1894X + 0.009)
도 3은 메탄올 농도와 측정된 흡광도 값의 표준곡선식을 나타낸다. (메탄올에 대한 표준곡선식 : Y=2.217X-0.002)
도 4는 재조합 피키아 파스토리스 (Xylanase C + ρPICZα)를 첫 번째 YPD 배지에서 24시간 동안 배양한 성장 곡선을 나타낸다.
도 5는 재조합 피키아 파스토리스 (Xylanase C + ρPICZα)를 두 번째 YPD 배지에서 24시간 동안 배양한 성장 곡선을 나타낸다.
도 6은 재조합 피키아 파스토리스의 배양에 여러 가지 탄소원을 사용했을 때 균체량과 자일라나아제의 생산성을 나타낸다. 1: YP, 2: 밀기울, 3: 쌀겨, 4: 혼합물 (밀기울 : 쌀겨 = 1 : 1), 5: 보리 껍질, 6: 수크로스, 7: 전분, 8: 글루코스, 9: 말토스, 10: 글리세롤.
도 7은 재조합 피키아 파스토리스의 배양에 여러 가지 질소원을 사용했을 때 균체량과 자일라나아제의 생산성을 나타낸다. 1: YP, 2: 쇠고기 추출물, 3: 효모 추출물, 4: 펩톤, 5: 혼합물 (효모 추출물 : 펩톤 = 1 : 2), 6: 트립톤, 7: NH4Cl, 8: NH4NO3, 9: (NH4)2SO4, 10: 요소.
도 8은 재조합 피키아 파스토리스의 배양에 여러 가지 인원 (phosphate source)을 사용했을 때 균체량과 자일라나아제의 생산성을 나타낸다. 1: YP (대조구), 2: PPD (K2HPO4), 3: PDP (KH2PO4), 4: DHP (Na2HPO4), 5: SDPD (NaH2PO4·2(H2O), 6: DAHP ((NH4)2HPO4).
도 9는 재조합 피키아 파스토리스의 배양에 여러 가지 무기염 (inorganic salt)을 사용했을 때 균체량과 자일라나아제의 생산성을 나타낸다. 1: YP, 2: 무기염이 없는 기본 배지, 3: ZnSO4, 4: CaCl2·H2O, 5: EDTA, 6 : KHSO4, 7: Na2SO4, 8: MgSO4·7H2O.
도 10은 재조합 피키아 파스토리스의 배양에 여러 가지 아미노산을 사용했을 때 균체량과 자일라나아제의 생산성을 나타낸다. 1:YP, 2: L-아르기닌 염산염 (L-Arginine monohydrochloride), 3: DL-노르류신 (DL-Norleucine), 4: DL-β-페닐알라닌 (DL-β-phenylalanine), 5: L-트립톤, 6: DL-아스파르트산.
도 11은 재조합 피키아 파스토리스의 배양에 여러 가지 비타민을 사용했을 때 균체량과 자일라나아제의 생산성을 나타낸다. 1: YP, 2: 리보플라빈, 3: 니코틴산 (niacin), 4: 피리독신, 5: 엽산 (folic acid), 6: 티아민.
도 12는 재조합 피키아 파스토리스의 배양에 여러 가지 계면활성제 (surfactant)를 사용했을 때 균체량과 자일라나아제의 생산성을 나타낸다. 1: YP, 2: 계면활성제가 없는 기본 배지, 3: Tween 20, 4: Tween 40, 5: Tween 60, 6: Tween 80, 7: 베타인 (betain), 8: PEG 1450 (폴리에틸렌 글리콜), 9: PEG 8000, 10: PEG 8000-Mg(COOH)2.
도 13은 최대 상승법 (SAM) 실험의 각 조합에서의 자일라나아제 생산량 비교도를 나타낸다.
도 14는 반응 표면 분석법을 통한 3차원 반응 표면도를 나타낸다 (RSM 1).
도 15는 반응 표면 분석법을 통한 3차원 반응 표면도를 나타낸다 (RSM 2).
도 16은 재조합 피키아 파스토리스의 자일라나아제 생산 최적화 배지를 이용하여 25℃, pH 6, 170 rpm 및 1 vvm 조건의 회분식 발효시 시간에 따른 발효 결과를 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 밀기울 (wheat bran), 인산이수소칼륨 (KH2PO4) 및 황산수소칼륨 (KHSO4)을 포함하는 것을 특징으로 하는 자일라나아제 (xylanase)를 생산하는 재조합 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 균주의 자일라나아제 생산용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명에 사용된 재조합 피키아 파스토리스 균주는 전북대학교 익산캠퍼스 생명공학과에서 실험을 통하여, 목재 부후균 (Phanerochaete chrysosporium)의 자일라나아제 유전자와 맥주 효모균 (Saccharomyces cerevisiae)의 α-분비 인자를 갖는 벡터 (ρPICZα)를 재조합하여 구축한 플라스미드가 형질전환된 재조합 피키아 파스토리스이다.
본 발명의 자일라나아제 생산용 배지 조성물은 재조합 피키아 파스토리스에서 단위시간당 자일라나아제 생산량을 최대화하기 위해 액상 배지의 조성물 및 최적화된 함량을 통계학적 방법을 적용하여 제조하였다. 통계학적 방법을 이용한 배지 최적화 실험법은 수십 회의 실험을 통해 여러 가지 배지 조성이 결과물에 미치는 영향을 통계학적 처리를 통해 확인하고, 그 배지 조성의 최적농도를 최적화할 수 있는 실험법으로, 본 실험법을 사용하여 결과물 생산에 관여하지 않거나 악영향을 끼치는 배지 성분을 제거하고 효과를 극대화시켜 궁극적으로 공정의 효율성을 증가시킬 수 있다.
최적화된 배양 배지의 설계는 매우 중요한데, 기존의 '한번에 한 요인씩(one factor at a time)' 방법에 의한 배양 배지 최적화는 각 요인의 영향을 확인할 수 있지만, 많은 실험을 해야 하기 때문에 많은 시간이 소요되고, 최적화에 가장 결정적인 요인 및 일부 요인들의 상호 작용에 의한 영향 등을 구별할 수 있는 통계적인 방법이 존재하지 않는다는 단점이 있다. 따라서 이를 적용하기 위해서는 동시에 여러 독립적인 요인들을 고려할 수 있을 뿐만 아니라 각 요인들 간의 관계를 특징지을 수 있는 통계적 모델과 같은 별도의 통계적인 실험 설계 기법 및 최적 단계의 계산을 필요로 한다. 본 발명에서는 이러한 단점을 해결하고 생산 수율의 향상, 개발 시간 및 총 소요 비용의 절감을 위하여 한번에 한 요인 실험 (one factor at a time method), 플라켓 버만 설계 (Plackett-Burman design), 일부 실시법 (fractional-factorial design), 최대 상승법 (steepest ascent method) 및 반응 표면 분석 방법 (Response surface methodology, RSM)을 사용하여 재조합 피키아 파스토리스에서 자일라나아제의 대량 생산을 위한 배지 조성물이 최적화되었다.
본 발명의 자일라나아제 대량 생산을 위한 배지 조성물을 최적화하기 위해 사용한 '플라켓 버만 설계 (Plackett-Burman design)'는 독립적인 여러 요인들이 실험에 미치는 영향을 알아보는 방법으로 각 요소들의 상관관계는 무시된다. 본 발명의 실시예에서 각각의 배지 성분들 중에서 실험 결과에 영향을 미치는 주요 요인을 분석함으로써 다양한 배지 조합에서 생산성에 큰 영향을 미치는 주요 성분을 찾아내는 방법으로 플라켓 버만 설계 (Plackett-Burman design)가 이용되었다.
'일부실시법 (fractional-factorial design)'은 실험 설계가 둘 또는 그 이상의 요소를 가지고 있는 경우 각각의 요소들의 가능한 조합을 통해 상관관계를 알아보는 통계 실험법이다. 본 발명에서도 배지 성분 각자가 기여하는 정도를 알아보기 위해 플라켓 버만 설계를, 두 가지 배지 성분의 상호 영향을 조사하기 위해 일부실시법이 이용되었다.
'최대 상승법 (steepest ascent method)'은 플라켓 버만 설계, 일부실시법에 의해 선별된 배지 성분의 최적 농도가 어느 정도의 범위인지를 결정하기 위해 사용되었으며, 더 정밀하게 배지 성분의 최적 농도를 조사하기 위해 '반응 표면 분석 방법 (response surface methodology)'이 실시되었다.
본 발명의 일 구현예에서, 자일라나아제 생산용 배지 조성물은 바람직하게는 밀기울 7.56~15.22 g/L, 인산이수소칼륨 0.13~1.46 g/L 및 황산수소칼륨 0.02~0.25 g/L를 함유할 수 있으며, 가장 바람직하게는 밀기울 11.62 g/L, 인산이수소칼륨 0.66 g/L 및 황산수소칼륨 0.09 g/L를 함유할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 자일라나아제 생산용 배지 조성물은 밀기울 (wheat bran), 인산이수소칼륨 (KH2PO4), 황산수소칼륨 (KHSO4), 효모 추출물 (yeast extract), DL-β-페닐알라닌 (DL-β-phenylalanine), 티아민 (thiamine), 황화철 (FeSO4) 및 Tween 60을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 밀기울 7.56~15.22 g/L, 인산이수소칼륨 0.13~1.46 g/L, 황산수소칼륨 0.02~0.25 g/L, 효모 추출물 24~36 g/L, DL-β-페닐알라닌 0.25~0.75 g/L, 티아민 0.25~0.75 g/L, 황화철 0.005~0.015 g/L 및 Tween 60 4~6 g/L를 함유할 수 있으며, 가장 바람직하게는 밀기울 11.62 g/L, 인산이수소칼륨 0.66 g/L, 황산수소칼륨 0.09 g/L, 효모 추출물 30 g/L, DL-β-페닐알라닌 0.5 g/L, 티아민 0.5 g/L, 황화철 0.01 g/L 및 Tween 60 5 g/L를 함유할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 자일라나아제 (xylanase)를 생산하는 재조합 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 균주를 상기의 자일라나아제 (xylanase) 생산용 배지 조성물이 함유된 발효조에 투입하여 배양하는 단계를 포함하는 자일라나아제 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 배양은 회분식 배양 (batch culture)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 회분식 배양은 초기에 한 번 배지를 채운 후 더 이상의 영양물질을 공급하지도, 생성물을 제거하지도 않으면서 세포를 배양하는 방식이다. 회분식 발효의 특징은 미생물의 생존 환경이 연속적으로 변화하며, 발효조 내의 물리화학적 상태는 시간의 흐름에 따라 악화 된다. 이 배양 방식은 주로 정지기에 생산되는 2차 대사 산물의 생산에 유리하며, 목적에 맞추어 배지 조성, 수소 이온 농도, 온도, 산소 공급 등을 변화시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 배양 조건은 배양 온도 24~27℃, pH 5.5~6.5, 교반 속도 160~180rpm, 공기 유속 0.5~1.5vvm 및 메탄올 농도 0.5~1.25%(v/v)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 배양 온도 25℃, pH 6, 교반 속도 170rpm, 공기 유속 1vvm 및 메탄올 농도 1%(v/v)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 발효조는 1~3L의 배지가 포함된 2~5L 크기의 발효조일 수 있으며, 바람직하게는 1.5L의 배지가 포함된 2.5L 크기의 발효조일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험 재료 및 방법
재조합 피키아 파스토리스 균주의 배양
재조합 피키아 파스토리스 균주의 보관을 위해 고체 배지에서 배양한 균을 YPD 액체배지 (1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 덱스트로스)에 접종하여 30℃, 170 rpm으로 24시간 배양한 후 성장이 좋은 배양균을 30% 글리세롤이 함유된 증류수에 넣어 -80℃ 초저온 냉동고에서 냉동 보관하였으며, 필요시마다 해동하여 사용하였다. YPD 액체 배지 10 mL당 YPD 고체 배지에 도말된 균주 1 콜로니를 접종하여 170 rpm, 30℃의 조건으로 17시간 배양하여 종균으로 사용하였다.
성장 배양 및 생산 배양을 위해 플라스크 배양이 이용되었다. 성장 배양은 250 mL의 플라스크에 배양부피 50 mL의 YPD 배지를 넣어 종균으로 배양한 재조합 피키아 파스토리스 (xylanase C + ρPICZα) 배양액을 10% 접종하여 170 rpm, 30℃로 유지된 항온진탕배양기 (Vision scientific Co. LTD.)에서 15시간 배양하였다. 생산 배양은 250 mL의 플라스크에 배양부피 50 mL의 배지를 넣어 성장 배양 단계에서 배양한 재조합 피키아 파스토리스 배양액을 2% 접종하여 같은 조건에서 96시간 배양하였다. 자일라나아제 발현을 유도하기 위하여, 24시간 마다 50 mL 생산 배지에 100% 메탄올 0.5 mL (1% 농도)을 첨가하였다. 플라스크 배양 실험은 3회 반복하여, 그 결과를 분석하였다.
배지의 살균시 고온고압에 의해서 당 성분의 카라멜화, 배지 중 카르보닐 화합물과 아민, 아미노산, 단백질 등의 아미노 혼합물에 의한 아미노-카르보닐 반응 (Maillard reaction)등과 같은 갈변현상, 무기물 성분의 침전 및 이로 인하여 미생물의 고른 배지 성분 섭취가 방해받는 현상을 방지하기 위하여 각 배지 성분을 따로 멸균하고 방냉한 후 무균상태에서 각 배지 성분을 혼합하여 사용하였다. 자일라나아제 생산 배지의 기본 조성은 표 1에 나타내었다.
자일라나아제 생산 배지 기본 조성
배지의 조성 농도 (g/L)
밀기울 (d=0.5 mm) 10
효모 추출물 30
베타인 (Betaine) 5
K2HPO4 1
MgSO4 0.5
FeSO4 0.01
재조합 피키아 파스토리스 균주의 발효조 배양
플라스크 배양과 비교시 발효조에서의 배양은 산소전달, 전단응력, pH 등의 운전조건이 다르므로 배지의 최적 조성비도 플라스크 배양과는 다소 상이할 수 있을 것으로 예상된다. 그러나 플라스크 배양에서 얻은 결과를 토대로 발효조 운전 조건을 확립하는 실험을 수행하였다. 2.5 L의 발효조 (Kobio Tech Co. Ltd.)에서 1.5 L로 조업부피를 유지하였으며, 공기 유속 1 vvm (volume of air/volume of fluid/min), 교반속도 170 rpm, pH 5로 발효 조건을 유지하였다. 발효 중 거품을 제거하기 위해 소포제를 사용하였으며, 증발로 인한 배지의 감소를 막기 위해서 습윤기를 공기 공급 라인에 설치하여 공기 중의 수분함량을 포화상태로 유지하여 발효조로 공급하였다. 종균 배양은 플라스크 배양방법과 동일한 방법으로 배양하였으며, 발효조에 2% (v/v) 접종하여 실험을 수행하였다. 배양기간 동안 일정 시간마다 시료를 취하여 건조 균체 질량과 효소활성을 분석하고 용존산소 농도의 변화를 관찰하였다. 발효조 배양 실험시 발효조는 121℃에서 15분간 고압살균 하였고, 살균 후 무균상자에서 방냉하고, 살균한 배지를 분주하였다.
실시예 1. 분석 방법
1-1. 건조 균체량 ( Dry cell weight ; D.C.W)
건조 균체량은 원심분리기를 사용하여 균체를 분리한 후 105℃로 유지된 건조기에서 항량이 되었을 때의 질량을 측정하였으며, 측정된 건조 균체량과 660 nm에서 배양액의 흡광도를 측정한 값을 이용하여 표준곡선식을 수립하였다. 발효액의 건조균체량은 측정된 흡광도 값을 표준곡선식에 대입하여 계산하였다 (도 1).
1-2. 자일라나아제 측정
자일라나아제 활성은 Bailey 등의 방법에 의해 결정되었다 (Journal of Biotechnology, 1992, Vol.23, pp. 257-270). 재조합 피키아 파스토리스 (xylanase C + ρPICZα)의 배양액 1 mL을 샘플로 취하여 12,000 rpm으로 10분간 원심분리한 후 상층액을 효소원으로 사용하였다. 효소 상징액 200 ㎕와 200 ㎕의 1% 비치우드 자일란 (bichwood xylan) 용액 (pH 5)을 혼합하여 70℃에서 10분간 반응시켰다. 그리고 DNSA (3,5-dinitrosalicylic acid) 용액 200 ㎕를 넣고 130℃에서 100분간 반응시킨 후 5 mL로 희석하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 측정된 흡광도 값을 표준곡선식에 대입하여 계산하였다 (도 2). 이때, 효소 활성은 1분간 1 μmol 환원당을 생성할 때 필요한 효소의 양을 1 유닛 (unit)으로 정의하였다.
1-3. 메탄올 측정
메탄올을 분석하기 위하여 크로모트로핀산 분광광도법 (Chromotropic acid spectrophotography)을 사용하였다. 12,000 rpm에서 10분간 원심분리한 시료 상층액 20 ㎕에 25% 페놀 0.2 mL과 1% 과망간산칼륨 (Potassium permanganate) 0.1 mL을 넣고 잘 섞어서 반응시킨 후 상온에서 5분 정치하였다. 그 다음에 5% 아황산나트륨 (sodium sulfite)과 1 mL 진한 황산 (concentrated sulfuric acid)을 혼합한 후 골고루 흔들어 섞었다. 이 혼합액과 0.5% 크로모트로핀산 (chromotropic acid) 0.1 mL을 혼합하여 100℃에서 20분간 발색시킨 후, 상온으로 냉각하고 증류수를 넣어서 부피를 2 mL로 맞추고 574 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도 값을 표준곡선식에 대입하여 메탄올 함량을 계산하였다 (도 3).
실시예 2. 성장 배지와 생산 배지에서의 미생물 성장 곡선
생산 배지를 최적화하기에 앞서 성장 배지에서 재조합 피키아 파스토리스 (XylanaseC + ρPICZα)의 성장 곡선을 확인하였으며 (도 4, 5), 대량의 활성이 있는 균주를 생산 배지에 접종하기 위하여 성장 배양을 2번 수행하였다. 첫 번째 성장 배지에서 24시간 동안 배양한 결과 미생물의 생장이 활발한 시기인 15시간째를 성장 배지 접종을 위한 성장기간으로 선정했으며, 두 번째 성장 배지에서 24시간 동안 배양한 결과 미생물의 생장이 활발한 시기인 17시간째를 생산 배지 접종을 위한 성장기간으로 결정하였다. 첫 번째 성장 배지에서 15시간 배양한 균을 두 번째 성장 배지에 접종하여 17시간 동안 배양하였고, 처음보다 약 1.5배 많은 균체량을 생산 배지에 접종하여 실험을 진행하였다.
실시예 3. 한 번에 한 요인 실험방법 ( one factor at a time method )을 이용한 영양원의 선별
3-1. 탄소원 선별
세포가 성장하고 에너지를 이용해 다양한 대사활동을 하기 위한 가장 기본적인 영양분은 탄소원이다. 탄소원은 배양을 위한 필수 성분이라 할 수 있는데, 세포가 이러한 탄소원을 배양액으로부터 공급받아 이용할 때 다양한 탄소원 중에서도 어느 성분을 더 쉽게 이용할지는 세포마다 다르게 가지는 효소의 분해 능력에 따라 좌우된다고 볼 수 있다. 따라서 본 실험에서는 자일라나아제 생산성이 높은 생산 배지를 선정하기 위하여 기본 생산 배지 조성 (표 1)에 탄소원인 밀기울 (wheat bran) 대신 일반적으로 널리 사용되는 수크로스 (surcose), 전분 (starch), 글루코스 (gluose), 말토스 (maltose), 글리세롤 (glycerol) 및 각종 농업 잔류물을 탄소원으로 이용하여 실험을 진행하였다 (도 6). 그 결과, 농업 잔류물이 다당류보다 자일라나아제 생산성이 더 강한 것으로 나타났다. 여러 종류의 농업 잔류물 중, 밀기울은 1237.24 unit/ml로 최고로 높은 자일라나아제 생산성을 나타냈다. 자일라나아제는 유도 효소인데, 자일란은 세포 안에 들어갈 수 없기 때문에 직접 유도물질이 아니며, 자일로비오스 및 자일로트리오스 등을 포함한 초기 가수분해 산물이 자일라나아제 유도 물질이라는 연구 결과가 있다. 낮은 농도의 β-자일로스와 자일로비오스는 자일라나아제 유도 효과가 있었고, β-갈락토스 또는 β-아라비노스가 포함된 자일란 배지는 자일라나아제 생산을 증가시켰다. 농업 잔류물인 밀기울은 헤미셀룰로오스와 가용성 아라비노자일란 (arabinoxylan)을 포함하기 때문에 높은 효소 생산성이 있으며, 물리적 또는 화학적 전처리가 불필요해서 자일라나아제 생산 비용이 적게 든다. 따라서 밀기울을 모든 후속 실험에 탄소원으로 이용하였다. 자일라나아제 생산이 균체량과 관계는 있지만 비례적인 관계가 아니므로 자일라나아제 생산을 위한 배지 조성과 균체량 증가를 위한 배지 조성은 다르다고 판단되었다.
3-2. 질소원 선별
탄소원 못지 않게 중요한 배지 성분인 질소원은 배양액 내에서 세포 성장 및 에너지 대사를 위해 이용될 뿐 아니라 다양한 아미노산의 공급원이다. 다양한 질소원의 이용 정도 또한 세포가 가진 분해 능력에 따라 좌우되는데, 재조합 피키아 파스토리스의 자일라나아제 생산에 있어서 균주가 쉽게 이용하는 질소원을 조사하고자 하였다. 기존의 생산 배지를 바탕으로 하여 탄소원 조사 실험을 통해 결정한 밀기울을 탄소원으로 이용하고, 질소원인 효모 추출물 대신에 쇠고기 추출물 (beef extract), 펩톤, 트립톤, 염화암모늄 (NH4Cl), 질산암모늄 (NH4NO3) 등의 다양한 질소원을 같은 농도로 첨가하여 실험을 진행하였다 (도 7). 자일라나아제 생산에 있어서 무기 질소원보다 유기 질소원을 사용했을 때, 효소 생산에 효과적이라는 것이 확인되었다. 이것은 유기 질소원이 많은 종류의 아미노산을 포함하고, 이러한 아미노산이 균사에 직접 흡수될 수 있기 때문이다. 또한, 탄소 골격의 길이와 -CH3, -NH2 그룹의 존재가 자일라나아제 분비에 중요한 역할을 한다는 연구결과와 같이 상기 아미노산들은 -CH3 구조를 포함하기 때문에 효소 생산량을 증가시켰다. 유기 질소원과는 대조적으로, 무기 질소원을 이용할 때는 먼저 아미노산으로 분해를 시켜야 하기 때문에 재조합 피키아 파스토리스 균주의 성장이 느려졌고, 이에 따라 효소 분비량 또한 감소하였다. 펩톤처럼 복합한 질소원은 NH4 + 이온을 방출하는데, NH4 + 이온은 균체 성장을 촉진할 뿐만 아니라, 낮은 농도에서 단백질 분비를 억제하는 성질에 따라 효소 분비량을 증가시켰다. 여러 가지 유기 질소원 중 쇠고기 추출물과 효모 추출물에서 약 1,700 unit/mL의 비슷한 효소 생산성이 나타났다. 최종적으로 쇠고기 추출물보다 가격이 저렴하고, YP배지 보다 1.69배 높은 생산성을 나타내는 효모 추출물을 질소원으로 선택하였다.
3-3. 인원, 무기염 선별
인원(phosphate source)은 pH를 외부에서 조절하지 않을 때, pH 변화를 최소화하는 완충제로 사용된다. 여러 가지 인원을 비교하였을 때, 가장 높은 자일라나아제 생산성을 보인 것은 인산이수소칼륨 (potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4)으로 YP배지보다 약 1.57배 증가한 1573.39 unit/mL으로 나타났다 (도 8).
도 9에서는 금속 이온이 효소의 활성에 미치는 영향을 연구하였다. 대부분의 무기염은 0.5 mL/L의 농도 하에 자일라나아제의 활성에 거의 영향을 미치지 않았으나, 논문에 의하면 Hb2 +, Cu2 + 및 Fe2 + 이온이 효소의 활성화를 완전히 억제하는 것으로 알려져 있고, Zn2 + 이온은 가장 큰 억제 작용이 있는 것으로 나타났다. 이밖에 Ag+ 이온은 자일라나아제의 활성을 감소시키고, MnO4 2 -는 완전히 자일라나아제의 활성을 억제하였다. 이번 연구 결과에 따르면 Ca2 +, Mg2 + 및 EDTA 등은 완전한 억제작용을 나타내지 않았다. 황산수소칼륨 (KHSO4) 첨가 배지의 자일라나아제 활성 (1636.75 unit/mL)은 무기질이 첨가되지 않은 기본 배지 (1208.5 unit/mL)와 비교했을 때, 36.4% 증가하였다.
3-4. 아미노산과 비타민의 선별
대다수의 자일라나아제, 락카아제 (laccase) 및 펙티나아제 (pectinase) 등의 세포외 효소는 아미노산을 첨가하면 효소생산량이 증가하는 것으로 알려져 있다. 선형 탄소 사슬(carbon linear chain) 중에 -CH3 구조를 갖는 DL-노르류신 (DL-Norleucine)은 자일라나아제 생산량을 1601.5 unit/mL으로 증가시켰고, 많은 아미노산 중 DL-β-페닐알라닌 (DL-β-Phenylalanine)이 가장 많은 자일라나아제를 생산했다. DL-β-페닐알라닌을 사용하여, 96시간의 플라스크 배양 후 자일라나아제의 생산량은 1637.87 unit/mL로 나타났다. 이는 YP배지와 비교했을 때 45.6% 증가한 수치이다 (도 10).
종합 비타민은 자일라나아제의 생산에 필수성분이라고 알려져 있다. 비타민의 공급이 자일라나아제의 활성을 촉진시키는 원인은 세포막의 투과성의 변화, 세포외 분비 (exocytosis) 작용, 균사의 시스 탈리 (hyphal sheath desorption) 현상, 효소의 안전성 및 효소 분자 본체의 구조의 변화라고 밝혀져 있는데, 자일라나아제의 활성은 티아민 (thiamine)을 첨가할 때 1876.1 unit/mL으로 가장 높게 나타났다. 이는 YP배지를 사용했을 때의 활성인 1124.6 unit/mL보다 66.8% 증가한 수치이다 (도 11).
3-5. 계면활성제의 선별
여덟 가지의 다양한 계면활성제인 Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, 베타인 (betain), PEG 1450 (폴리에틸렌 글리콜), PEG 8000 및 PEG 8000-Mg(COOH)2 등이 자일라나아제의 활성화에 미치는 영향에 대한 연구를 수행하였다 (도 12). 많은 연구결과에 의하면 계면활성제가 다양한 셀룰로오스의 효소성 가수분해에 적극적인 역할을 한다고 알려져 있다. 계면활성제는 각각 효소의 안전성, 기질의 구조와 효소-기질의 상호 작용 등에 영향을 주고, 세포막의 투과성을 변화시킬 수 있으며, 효소의 변성을 방지할 수 있다. 다양한 계면활성제 중 Tween 60의 첨가는 1988.7 unit/ml으로 가장 높은 효소 생산성을 나타냈다. 이는 YP 기본 배지의 생산량인 1103.5 unit/mL보다 80.2% 증가한 수치이다 (도 12).
실시예 4. 플라켓 버만 설계 ( Plackett - Burman design )을 이용한 배지 성분 선별
플라켓 버만 설계 (Plackett-Burman design)에 의한 배지 조성과 각 성분의 농도 및 그에 따른 분석을 표 2, 3, 4 및 5에 나타냈으며, 농도가 높은 탄소원, 질소원 및 계면활성제의 농도는 중심 값에서 20%로 조절하였고, 농도가 낮은 나머지 변수들은 50%로 조절하였다. 이때 가장 높은 생산성을 보인 배지는 M5 배지로 자일라나아제는 2409.4 unit/mL, D.C.W는 7.27 g/L로 나타났다. 균주의 성장에 가장 크게 영향을 주는 인자는 밀기울 (A)로 평균제곱 (Mean square) 값이 0.779였으며, A의 농도가 높은 M1, M2, M4, M5, M6 및 M10 배지에서 자일라나아제가 현저하게 높게 측정되었다. 그 다음으로 KH2PO4 및 KHSO4의 평균제곱 값이 각각 0.1264 및 0.1432로 다른 인자에 비해 높은 값을 나타내었다. 플라켓 버만 실험 설계에 의해 3가지 인자 밀기울, KH2PO4 및 KHSO4를 선정하였고, 선별된 성분의 상호작용과 최적농도를 결정하기 위하여 완전 실시법 (full factorial design) 및 최대 상승법 (steepest ascent method, SAM)을 수행하였다.
플라켓 버만 설계에서 선택된 배지 조성
배지의 조성 농도 (g/L) 요인 ( factor )
밀기울 10 A
효모 추출물 30 B
KH2PO4 1 C
Tween 60 5 D
DL-β-페닐알라닌 0.5 E
티아민 0.5 F
KHSO4 0.5 G
FeSO4 0.01 H
플라켓 버만 설계에서 각 성분의 최고 및 최저 값
배지의 조성 최고 값 (g/L) 최저 값 (g/L)
밀기울 12 8
효모 추출물 36 24
KH2PO4 1.5 0.5
Tween 60 6 4
DL-β-페닐알라닌 0.75 0.25
티아민 0.75 0.25
KHSO4 0.75 0.25
FeSO4 0.015 0.005
여덟 가지 변수에 대한 플라켓 버만 설계 및 결과
실시 변수 자일라나아제
(mU/mL)		 D.C.W
(g/L)
A B C D E F G H
M1 + - + - - - + + 1.91 6.44
M2 + + - + - - - + 1.52 6.77
M3 - + + - + - - - 1.22 5.69
M4 + - + + - + - - 1.69 5.43
M5 + + - + + - + - 2.41 7.27
M6 + + + - + + - + 2.05 6.09
M7 - + + + - + + - 1.52 7.19
M8 - - + + + - + + 1.26 5.64
M9 - - - + + + - + 1.28 6.40
M10 + - - - + + + - 1.89 7.28
M11 - + - - - + + + 1.47 5.71
M12 - - - - - - - - 1.19 5.71
M13 0 0 0 0 0 0 0 0 1.69 5.91
M14 0 0 0 0 0 0 0 0 1.62 5.23
플라켓 버만 설계에서 자일라나아제 생산에 대한 각 성분들의 기여도 분석
A B C D E F G H
∑(H) 11.4731 10.1865 9.6603 9.6779 10.1162 9.8979 10.4646 9.4949
∑(L) 7.9426 9.2291 8.2383 9.7378 9.2995 9.5178 8.9511 9.9208
차이 3.5304 0.9574 1.4220 -0.0598 0.8166 0.3801 1.5136 -0.4259
효과 0.4413 0.1197 0.1778 -0.0075 0.1021 0.0475 0.1891 -0.0532
평균제곱 0.7790 0.0573 0.1264 0.0002 0.0417 0.0090 0.1432 0.0113
실시예 5. 3-요인 일부실시법 (3- factor fractional factorial design )을 이용한 자일라나아제 생산 배지 최적화
한번에 한 요인 실험 (one factor at a time method, OFAT)은 주어진 조건에서 그 요소의 영향을 파악하기 위해 하나의 요인을 변화시키고, 다른 요인들은 고정한 상태에서 실험을 수행하였고, 플라켓 버만 설계 실험은 중요한 변수만을 선별하는데 중점을 두었기 때문에 요인들 간의 상호작용은 관찰할 수 없었다. 따라서 플라켓 버만 설계 결과에 의해 자일라나아제 생산에 크게 영향을 주는 세 가지 성분을 선택하고, 각 성분들의 고, 저 수준에 따른 상호작용에 의한 생산성 변화를 관찰하고자 일부실시법 (fractional factorial design, FFD)을 수행하였다. 실험에 사용된 각 요인의 농도는 표 6에 나타내었다.
FFD 실험 결과를 분석해보면 (표 7), 밀기울이 고 수준, KH2PO4 및 KHSO4 성분이 저 수준인 2번 배지에서 자일라나아제가 2.11 mU/mL로 가장 높았고, KH2PO4가 저 수준, 밀기울 및 KHSO4 성분이 고 수준인 6번 배지에서 가장 낮은 1.54 mU/mL의 자일라나아제 생산성을 나타내었다. 이 결과를 가지고 일부실시모델 (fractional factorial model)에 적용시켜 통계처리를 하였으며, D.C.W의 이차다항식은 다음과 같다.
자일라나아제 = 1.83 + 0.054*A - 0.033*B - 0.11*C + 0.092*A* B - 0.056 * A * C + 0.076*B*C
(A : 밀기울, B : KH2PO4, C : KHSO4)
이 식에서 각 항의 계수는 Design Expert pro S/W의 다중 회귀분석에 의한 결과이며, 각 변수들의 효과 리스트는 표 8에 나타내었다. A (밀기울), B (KH2PO4) 및 C (KHSO4) 요인들의 변화에 따른 자일라나아제 생산 배지에 대한 최종 모델식을 통해, 각 성분의 효과를 살펴보면 밀기울은 +0.054로 긍정적 효과를 보였으며, KH2PO4 및 KHSO4는 각각 -0.033 및 -0.11 값을 갖는 부정적인 효과를 나타내었다. 요인들 간의 상호작용에 대한 효과는 도 12에 나타내었으며, 자일라나아제 생산 배지에 대한 최종 모델식을 통해 각 성분의 효과를 살펴보면 밀기울 및 KHSO4는 -0.056로 부정적인 효과를 보였으며, 밀기울 및 KH2PO4, KH2PO4 및 KHSO4의 관계는 각각 0.092 및 0.076으로 긍정적인 효과를 보였다. 이상의 결과를 바탕으로 반응 표면 분석 방법 (response surface methodology, RSM)을 이용한 배지 성분 농도의 최적화 실험 전에, 최대 상승법 (SAM)을 이용하여 세 가지 배지 성분의 농도를 일정하게 변화시켜 균체량 향상을 위한 최적 농도에 접근하고자 하였다.
3-요인 일부실시법에서 각 성분의 농도
밀기울 KH2PO4 KHSO4
+1 12 1.5 0.75
0 10 1 0.5
-1 8 0.5 0.25
자일라나아제 생산용 배지 조성 결정을 위한 일부실시법 실험 계획 및 결과
밀기울 KH2PO4 KHSO4 자일라나아제
(mU/mL)		 D.C.W
(g/L)
1 -1 -1 -1 2.00 4.90
2 +1 -1 -1 2.11 5.92
3 -1 +1 -1 1.67 4.18
4 +1 +1 -1 2.00 5.06
5 -1 -1 +1 1.81 5.38
6 +1 -1 +1 1.54 6.15
7 -1 +1 +1 1.63 5.41
8 +1 +1 +1 1.89 5.18
9 0 0 0 1.99 4.52
10 0 0 0 1.95 5.34
Figure 112012027170228-pat00001
실시예 6. 자일라나아제 생산 배지 성분의 농도 최적화를 위한 최대 상승법 (SAM) 실험
일부실시법 실험 결과를 근거로 하여 배지 성분의 최적 농도에 접근하기 위하여 단계별 축차 실험 (sequential experiments)인 최대 상승법 (steepest ascen method, SAM)을 수행하였다. 최대 상승법은 각 성분들이 최적점으로 진행될 수 있는 최단거리를 보여줌으로써 반응 표면 분석법 (RSM) 이전에 실시하여 좀 더 정확하고 빠르게 배지 최적화를 수행할 수 있다. 따라서 한번에 한 요인 실험과 일부실시법을 통해 선별된 세 가지 배지 성분인 밀기울, KH2PO4 및 KHSO4의 농도를 일정하게 변화시켜 균체 성장을 위한 최적 농도에 접근하고자 하였다. 일부실시법으로 얻은 1차 모형식을 근거로 하여, 각 성분들의 중점 (center point)에서 각 수준 간의 실제 차이 (origin step), 컴퓨터에서 주어지는 다항식의 계수 (주효과, main effect), 주효과 (main effect)의 1/2 (계수, coefficient)을 이용하여 최적점으로 갈 수 있는 최단거리를 구할 수 있었다 (표 9, 10). 표 10에 요인들의 수준 변화에 따른 축차 실험 계획을 나타내었고, 최대상승법의 시작점은 일부실시법의 중심점으로 하였다.
KH2PO4와 KHSO4는 중점에서 각각 0.052 g/L, 0.091 g/L씩 농도를 감소시켰고, 균체성장에 긍정적인 영향을 미치는 밀기울은 0.347 g/L 증가시켜 실험을 진행한 결과, 자일라나아제는 단계 5에서 2344.25 unit/L로 제일 높은 생산량을 나타냈다 (도 13). 최대 생산성을 보인 단계 5를 각 배지 성분의 최적농도 부근이라고 판단하여 그 농도 범위 내에서 RSM을 수행하였다.
자일라나아제 생산용 배지 농도 최적화를 위한 최대 상승법 실험 설계 값
밀기울 KH2PO4 KHSO4
중점 (center point) 10 1 0.5
실제 차이 (origin step) 2 0.5 0.25
주효과 (main effect) 0.11 -0.066 -0.23
계수 (coefficient) 0.055 -0.033 -0.115
r 값 (r value) 2.077
기울기 값 (slope value) 0.867 -0.520 -1.814
새로운 차이 (new step) 1.735 -0.260 -0.453
자일라나아제 생산용 배지 농도 최적화를 위한 최대 상승법 실험 조합표
No. 밀기울 KH2PO4 KHSO4
중점 (1) 10 1 0.5
2 10.3466 0.9480 0.4094
3 10.6931 0.8960 0.3188
4 11.0397 0.8440 0.2283
5 11.3863 0.7921 0.1377
6 11.7329 0.7401 0.0471
실시예 7. 반응 표면 분석법 ( RSM )을 통한 자일라나아제 생산 배지 최적화
이전 연구에서 선별된 배지 성분의 최적 농도 결정을 위해 반응 표면 분석법을 수행하였다. 실험계획법으로는 중심합성계획법 (Central composite design)을 이용하였다. 현재 사용하고 있는 생산 배지의 농도를 중심점으로 사용하여 밀기울, KH2PO4 및 KHSO4의 농도를 최적화하고자 세 가지 성분의 농도를 -α, -1, 0, 1 및 α 다섯 단계로 부호화하였다 (표 11). 본 발명에서는 3 개의 중점을 사용하였으며, α 값은 1.147이었다. 총 실험 횟수는 3회 반복하여 51개의 실험구가 수행되었다. 독립변수에 영향을 받는 종속변수 (Y)는 자일라나아제의 회귀분석에 사용되었으며, 회귀분석에 의한 모델식의 예측에는 Design Expert pro S/W ver. 7.0을 사용하였다.
자일라나아제 생산용 배지 조성 결정을 위한 중심합성계획 실험 성분 농도 (α : 1.682)
Xn 독립 변수 수준
-α -1 0 +1 +α
X1 밀기울 7.56 9.11 11.386 13.67 15.22
X2 KH2PO4 0.13 0.4 0.7921 1.19 1.46
X3 KHSO4 0.02 0.07 0.1377 0.21 0.25
이상의 결과를 통계처리를 하였으며, 그 결과 나타난 분산분석표 (Analysis of variance, ANOVA), 효과 리스트와 각 변수들의 통계 값을 표 12에 나타내었다. 유의확률 (probability value, P value) 값이 가지는 의미는 일반적으로 0.05보다 작으면 '통계적으로 유의하다 (significant)'라고 하며, 이 값이 0.01보다 작으면, '통계적으로 매우 유의하다 (highly significant)'라고 말한다. 여기서 유의하다란 용어는 가정한 모형이 데이터 해석에 의미가 있다는 뜻이다. 전체적인 실험 모델의 유의성을 확인해 본 결과 P 값이 0.0005로 0.05보다 낮게 분석되었다. 그리고 결정계수 (R-square)는 0.9701로 1에 가까운 값으로 반응모형이 신뢰할 수 있음을 나타냈다. 모수 추정에 의한 2차 회귀식은 다음과 같이 분석되었다.
자일라나아제 = 2.68 + 0.053*A - 0.033*B - 0.024*C + 0.042*A* B - 0.046 * A * C + 0.41*B*C
(A : 밀기울, B : KH2PO4, C : KHSO4)
Figure 112012027170228-pat00002
주어진 데이터에 대한 정확한 최적점을 찾기 위하여 모수 추정에 의한 2차 회귀식을 바탕으로 능선분석을 하였으며, 최종적으로 반응 표면 분석을 통하여 (도 14), 밀기울과 KHSO4의 농도는 11.39 g/L, 0.02 g/L 부근이 최적점과 가깝다는 것을 확인할 수 있었고, KH2PO4의 농도는 더 낮아질 때 자일라나아제 생산량이 더 높아질 것이라고 예상할 수 있었다. 1차 RSM의 분석 결과를 바탕으로 2차 RSM에서 예상되는 결과를 표 13에 나타내었다.
1차 RSM에 의한 각 성분의 농도에 따른 자일라나아제 생산량 예상 값
밀기울 KH2PO4 KHSO4 자일라나아제 (mU/mL)
1 13.52 0.42 0.2 1700.31
2 2.96 0.46 0.08 2306.71
3 9.26 0.46 0.2 1739.51
4 11.39 0.79 0.14 2657.13
5 9.11 1.19 0.21 1633.60
6 13.52 0.46 0.08 2412.37
7 13.67 1.19 0.069 2075.06
8 13.67 1.19 0.21 1731.23
9 9.11 1.19 0.069 1793.63
10 9.51 0.9 0.1 2370.28
11 13.23 0.52 0.1 2448.18
12 11.40 0.69 0.15 2596.87
13 13.28 0.68 0.11 2524.66
14 10.54 0.79 0.15 2554.86
15 13.54 0.73 0.12 2431.53
16 12.14 1.02 0.15 2460.9
17 9.5 0.48 0.15 2131.39
18 10.09 0.44 0.2 1905.71
19 13.09 0.6 0.11 2547.33
20 10.03 0.91 0.18 2298.69
21 12.66 0.77 0.086 2746.54
22 10.54 1.00 0.16 2412.08
23 9.58 1.06 0.14 2154.43
24 10.94 0.5 0.19 2179.20
25 11.54 0.86 0.091 2775.43
26 11.62 0.66 0.091 2885.6
27 9.63 0.85 0.17 2236.36
28 11.30 0.57 0.15 2493.15
29 9.23 0.76 0.11 2332.63
30 10.24 0.44 0.19 2029.10
31 11.27 0.59 0.15 2536.13
32 10.02 0.73 0.097 2609.05
33 11.96 0.58 0.19 2273.87
34 13.54 0.47 0.14 2122.91
35 9.45 0.63 0.12 2347.70
이러한 분석 결과를 적용하여 예상되는 자일라나아제 생산량이 가장 높은 26번을 중심으로 2차 RSM을 진행하였으며 (표 14), 독립 변수들의 수준과 결과를 표 15 및 16에 나타내었다. 실험에 대한 분석은 1차 실험과 동일한 프로그램을 사용하였다.
반응 표면 분석법의 회귀 분석 결과 (RSM 1)
No. 배양 조건 예상
자일라나아제 (U/mL)		 실험
자일라나아제 (U/mL)		 D.C.W (g/L)
밀기울 KH2PO4 KHSO4
1 -1(9.11) -1(0.4) -1(0.07) 2219.5 2127.5 6.72
2 +1(13.67) -1(0.4) -1(0.07) 2333.6 2296.6 7.69
3 -1(9.11) +1(1.19) -1(0.07) 1789.8 1742.34 8.26
4 +1(13.67) +1(1.19) -1(0.07) 2074.4 1979.5 7.79
5 -1(9.11) -1(0.04) +1(0.21) 1496.4 1544.4 7.94
6 +1(13.67) -1(0.04) +1(0.21) 1423.9 1430.8 9.14
7 -1(9.11) +1(1.19) +1(0.21) 1630.4 1608.6 8.64
8 +1(13.67) +1(1.19) +1(0.21) 1731.2 1760.8 8.48
9 -a(7.56) 0(0.79) 0(0.14) 1459.5 1467.1 8.75
10 +a(15.22) 0(0.79) 0(0.14) 1589.6 1633.2 8.98
11 0(11.39) -a(0.13) 0(0.14) 1734.9 1768.7 8.34
12 0(11.39) +a(1.46) 0(0.14) 1616.4 1680.4 7.39
13 0(11.39) 0(0.79) -a(0.02) 2921.3 3051.7 8.87
14 0(11.39) 0(0.79) +a(0.25) 2060.8 1987.1 8.28
15 0(11.39) 0(0.79) 0(0.14) 2649.6 2820.7 7.84
16 0(11.39) 0(0.79) 0(0.14) 2649.6 2460.4 8.07
17 0(11.39) 0(0.79) 0(0.14) 2649.6 2675.6 7.95
자일라나아제 생산용 배지 조성 결정을 위한 중심합성계획 실험 성분 농도 (2차 RSM, α : 1.682)
Xn 독립 변수 수준
-α -1 0 +1 +α
X1 밀기울 7.71 9.3 11.62 13.94 15.53
X2 KH2PO4 0.11 0.33 0.66 0.99 1.22
X3 KHSO4 0.015 0.046 0.091 0.14 0.17
Figure 112012027170228-pat00003
분산분석결과 결정계수 (R-square)가 0.9747로 1에 매우 가까운 값을 나타내어 반응모형이 신뢰할 수 있음을 나타내었으며, 전체 모델의 유의 확률은 0.0001보다 작으므로 가정된 모형반응이 자료에 적합하다고 할 수 있다. 모수 추정에 의한 2차 회귀식은 다음과 같이 분석되었다.
자일라나아제 = 2.95 + 0.053*A - 0.13*B - 0.027*C + 0.087*A*B - 0.049*A*C + 0.011*B*C - 0.4*A2 -0.39*B2 -0.076*C2
(A : 밀기울, B : KH2PO4, C : KHSO4)
주어진 데이터에 대한 정확한 최적점을 찾기 위해 모수 추정에 의한 2차 회귀식을 바탕으로 능선분석을 하였으며, 최종적으로 반응표면분석을 통하여 (표 17) 효소에 가장 영향을 주는 세 가지 인자의 최적 농도를 찾을 수 있었다 (도 14, 15). 각각의 농도는 밀기울 11.62 g/L, KH2PO4 0.66 g/L 및 KHSO4 0.091 g/L로 분석되었다. 상기 농도에 대한 확인 실험 결과, 최초로 실시한 기본 생산 배지보다 약 2.6배, YP 생산 배지보다 약 3.7배 증가된 2991.0 U/mL의 자일라나아제를 얻을 수 있다. 통계적 실험 계획법을 통해 얻은 최적 생산 배지의 농도는 표 18에 제시하였다.
반응 표면 분석법의 회귀분석 결과 (2차 RSM)
No. 배양 조건 예상 자일라나아제 활성 (U/mL) 실험 자일라나아제 활성 (U/mL) D.C.W (g/L)
밀기울 KH2PO4 KHSO4
1 -1(9.30) -1(0.33) -1(0.05) 2126.5 2212.3 3.85
2 +1(13.94) -1(0.33) -1(0.05) 2178.1 2199.9 4.14
3 -1(9.30) +1(0.99) -1(0.05) 1971.1 1629.7 4.01
4 +1(13.94) +1(0.99) -1(0.05) 2248.5 2157.7 4.21
5 -1(9.30) -1(0.33) +1(0.14) 2347.1 2252.1 4.72
6 +1(13.94) -1(0.33) +1(0.14) 2234.3 2120.1 3.80
7 -1(9.30) +1(0.99) +1(0.14) 1879.8 1878.6 6.11
8 +1(13.94) +1(0.99) +1(0.14) 1965.2 2018.9 3.92
9 -a(7.71) 0(0.66) 0(0.09) 1816.9 1825.4 4.54
10 +a(15.53) 0(0.79) 0(0.09) 1964.6 1870.8 3.93
11 0(11.62) -a(0.10) 0(0.09) 1989.3 2036.3 3.04
12 0(11.62) +a(1.22) 0(0.09) 1669.6 1675.5 3.32
13 0(11.62) 0(0.66) -a(0.01) 2722.4 2902.2 6.50
14 0(11.62) 0(0.66) +a(0.17) 2703.5 2601.2 4.91
15 0(11.62) 0(0.66) 0(0.09) 2945.2 2927.7 6.02
16 0(11.62) 0(0.66) 0(0.09) 2945.2 2991.0 5.98
17 0(11.62) 0(0.66) 0(0.09) 2945.2 2914.5 5.86
RSM 결과에 따른 최적 배지의 조성과 농도
배지의 조성 농도 (g/L)
밀기울 11.62
효모 추출물 30
Tween 60 5
DL-β-페닐알라닌 0.5
티아민 0.5
FeSO4 0.01
KH2PO4 0.66
KHSO4 0.09
실시예 8. 자일라나아제 생산용 최적 배지를 이용한 회분식 발효조건 선정
8-1. 온도 선정
효소 기질 반응에 대한 온도는 효소의 생산성에 중요한 역할을 하며, 배양 환경의 온도와 세포 내 온도는 항상 일치하게 된다. 배양 환경의 온도는 빠르게 세포 내의 온도와 동일하게 되므로 세포의 반응속도, 대사의 특성, 영양요구 및 균체 구성 등에 불가피하게 영향을 준다. 증식속도는 배양온도에 의하여 민감한 반응을 일으킨다. 따라서 최적 배지를 이용하여 자일라나아제의 생산, 자일라나아제 생산 균주의 건조 중량과 메탄올 농도에 적합한 온도 조건을 찾기 위해 다른 물리적인 조건은 동일하게 유지(170 rpm, 1 vvm, pH 5)하고 배양온도를 4가지 조건으로 다르게 하여 실험을 진행하였다. 그 결과 25℃, 28℃, 30℃, 32℃로 배양 온도가 상승할수록 자일라나아제 생산량이 감소하는 경향을 보였으며, 25℃의 조건에서 배양 96시간이 지난 후 자일라나아제 생산량이 2569.5 U/L로 가장 높았다 (표 19). 이는 28℃보다 1.033 배, 30℃에서의 활성보다 1.396 배 더 높은 수치이다. 그리고 자일라나아제 생산량은 32℃에서 1677.2 U/L로 제일 낮게 나타났다. 온도의 증가로 자일라나아제의 활성이 감소하였는데, 이는 효소의 구성 성분이 단백질이기 때문에 온도에 따른 변성, 형태 변화와 관련이 있다. 게다가, 저온 또는 고온은 곰팡이의 성장을 억제시켜 효소 생산 감소를 야기할 수 있다. 회분식 발효에서 재조합 피키아 파스토리스 (XylanaseC + ρPICZα)의 자일라나아제 생산 최적 온도는 생산량이 가장 높았던 25℃로 결정하였다.
온도에 따른 회분식 발효 결과
온도 (℃) D.C.W (g/L) 자일라나아제
생산량 (U/mL)		 최종 메탄올
농도 (mL/L)
25 7.28 2.57 2.8
28 10.74 2.49 3.1
30 6.84 1.84 3.0
32 10.71 1.68 3.1
8-2. pH 선정
pH값이 세균 성장속도에 미치는 영향은 대칭적이며 배양 pH는 증식속도 이외에 탄소원과 에너지원의 대사에도 상당한 영향을 미친다. 원형질막의 선택적 투과성에 의해 세포 내부 pH가 배지 pH에 의하여 크게 영향을 받지는 않지만, 미생물 대사는 외부 환경의 pH에 의해 영향을 받는다. 여러 연구를 참고하여 다른 물리적인 조건은 170 rpm, 1 vvm 그리고 온도는 25℃로 동일하게 하고, pH는 5~7까지의 범위로 실험을 진행한 결과 자일라나아제 생산량은 pH 6에서 가장 높게 나타나는 것을 알 수 있었다. 이때 얻은 자일라나아제 생산량 (3683.6 mU/mL)은 pH 5일 때 (2569.5 mU/mL)보다 1.4배, pH 7일 때 (1826.8 mU/mL)보다 2배 더 높았다. 자일라나아제 생산량은 pH 6에서 가장 높았고, pH 6보다 낮거나 또는 높아지면 효소 생산량이 감소되었다. 그리고 효소 활성이 중성 또는 알칼리성 배지보다 산성 배지 조건에서 더 높은 것을 확인했다. 이 결과는 대부분의 곰팡이가 생산한 자일라나아제는 산성 조건에서 더 활성이 높다는 결과와 일치하였다.
pH에 따른 회분식 발효 결과
D.C.W
(g/L)		 자일라나아제
생산량 (U/mL)		 최종 메탄올
농도 (mL/L)
pH 5 7.28 2.57 2.8
pH 6 5.45 3.68 2.6
pH 7 5.68 1.83 5.5
8-3. 교반 속도 선정
교반은 농도, 온도 및 그 외 성질의 기울기 (gradient)를 제거함으로써 배지 내의 불균일을 해소시키는 생물 공정에서 가장 중요한 물리적 조작 중 하나이다. 발효를 위한 최적의 환경을 조성하기 위해 생물 반응기는 호기적 배양에서 산소를 포함한 모든 기질에 세포가 쉽게 접근할 수 있게 해야 한다. 단지 영양물질이 풍부한 배지를 발효기에 채우는 것만으로는 불충분하며, 만일 배양액이 잘 혼합되지 못하면 세포가 그들이 필요로 하는 물질을 빠른 속도로 소모하므로 곧 영양물질이 고갈된 지역이 생길 것이다. 만일 교반에 의해 세포물질들이 균일한 상태를 유지하지 못한다면 이러한 문제가 증폭되므로, 배양액에서 세포가 침강된 지역의 기질 농도는 급하게 0으로 떨어질 것이다. 그 밖에 교반의 중요한 기능은 열전달이다. 생물반응기는 원하는 온도를 유지할 수 있도록 용액으로부터 또는 용액으로 충분히 신속하게 열을 전달할 수 있어야 한다. 이러한 교반의 효율성은 배양액의 유동학적 성질에 따라 달라진다.
세포의 효소 활성이 가장 높게 나타나는 교반 속도를 찾기 위해, 선행 실험에서 선택된 25℃, pH 6, 그리고 공기유속은 1 vvm으로 동일하게 하고, 150 rpm, 170 rpm, 200 rpm의 조건으로 실험을 진행한 결과를 표 21에 나타내었다. 교반 속도가 빠를수록 공급되는 기포의 파괴가 산소전달을 촉진하고, 배양액의 고른 혼합을 통해 균체 성장에 긍정적인 영양을 주지만, 교반 속도가 200 rpm 이상으로 높아지면 기계적 힘에 의해 민감한 미생물 세포의 경우 세포 파괴가 일어나 배양에 바람직하지 못하기 때문에 실험에서 제외시켰다. 실험 결과를 분석해보면, 150 rpm에서 200 rpm까지의 균체량은 교반 속도가 빨라질수록 증가하지만, 자일라나아제의 생산량은 1907.8 mU/mL부터 3683.6 mU/mL까지 늘어나다가 1092.9 mU/mL으로 감소했다. 이를 통해 자일라나아제 생산량이 균체량과 비례적인 관계가 아닌 것을 알 수 있었으며, 효소 생산에 가장 긍정적인 영향을 주는 교반 속도는 170 rpm인 것으로확인되었다.
교반 속도에 따른 회분식 발효 결과
교반 속도 (rpm) D.C.W
(g/L)		 자일라나아제
생산량 (U/mL)		 최종 메탄올
농도 (mL/L)
150 3.69 1.9 4.8
170 5.45 3.68 2.6
200 6.88 1.1 6.2
8-4. 발효조 내부로 공급되는 공기 유속 선정
호기성 배양에서 사용되는 일반적인 발효조에서 산소는 임펠러 (impeller)의 아래에 위치한 폭기 장치에 의해 배지로 공급된다. 그리고는 임펠러의 작동에 의해 배양액 전체에 기체가 고르게 분포하게 된다. 배지 내로 공급되는 공기는 산소의 양과 직결되고, 미생물의 생리현상에 지대한 영향을 준다. 이러한 공기 유속이 효소 활성에 미치는 영향과 공기 유속을 선정하기 위해서 0 vvm (volume of air/volume of fluid/min), 1 vvm 및 2 vvm의 조건으로 배양한 결과를 표 22에 나타냈다. 공급되는 공기의 속도가 0 vvm에서 1 vvm으로 증가함에 따라 자일라나아제의 생산이 지대하게 느려졌다. 공기를 공급하는 것은 세포에 충분한 영양을 공급 할뿐만 아니라 미생물이 생산하는 기체와 부산물을 세포 내에서 빠르게 제거할 수 있기 때문에 일반적으로 공기 유속을 올리면 산소 대량 이동 계수 (oxygen mass transfer coefficient)가 증가하여 세포의 산소 이용량도 높아진다. 하지만 공급되는 공기의 속도가 가장 빠른 2 vvm의 조건에서 효소 활성이 가장 높게 일어날 것이라는 예상과 달리 배양 96시간 후 효소 활성이 2543.1 mU/mL로 저해되는 것을 알 수 있었다. 이는 과도한 교반 속도가 높은 전단 응력과 마모를 일으켜 진균의 형태 변화를 일으키고, 자일라나아제 생산에 부정적인 영향을 미친 것으로 보인다. 또한 과도한 산소 농도는 균의 활성을 억제하거나 불활성화시키기 때문에 효소 활성에 가장 긍정적인 영향을 주는 공기 유속으로 1 vvm을 선택하였다.
공기 유속에 따른 회분식 발효 결과
공기 유속
(vvm)		 D.C.W
(g/L)		 자일라나아제
생산량 (U/mL)		 최종 메탄올
농도 (mL/L)
0 2.21 0.47 6.4
1 5.45 3.68 2.6
2 7.65 2.54 3.9
8-5. 메탄올( methanol ) 농도 선정
본 연구에 사용된 균주는 목재 부후균 (Phanerochaete chrysosporium)으로부터 얻어진 자일라나아제 유전자의 이종발현 숙주로 선정된 피키아 파스토리스 (xylanaseC + ρPICZα)를 사용하였다. 이 균주는 매우 강력한 메탄올 유도성 프로모터인 알콜 옥시다아제 유전자 (alcohol oxidase gene, AOX1) 프로모터를 이용하여 자일라나아제를 세포벽 밖으로 분비시킨다. 이 과정에서 메탄올은 효소를 생산시키는 유도물질일 뿐만 아니라 숙주세포의 에너지원으로도 이용되는 이중의 기능을 가지기 때문에 균체량과 효소 분비량을 모두 증가시킬 수 있다. 따라서 메탄올 농도는 발효과정에 매우 중요한 요인이며, 메탄올농도가 자일라나아제 생산에 미치는 영향은 표 23에 나타내었다. 메탄올의 농도가 0.25%에서 1%로 높아질수록 효소 분비에 긍정적인 영향을 주지만, 메탄올 농도가 1.25%까지 높아지면 숙주 세포의 성장을 억제시킨다. 반면에 메탄올의 양이 부족하면 에너지원으로 사용할 수 있는 탄소원이 부족하게 되기 때문에 균의 성장이 느려지게 되며, 효소 분비량도 감소하게 된다. 상기와 같은 결과를 바탕으로 자일라나아제 생산에 가장 긍정적인 영향을 주는 메탄올 농도 1%를 회분식 발효를 위한 조건으로 결정하였다.
메탄올 농도에 따른 회분식 발효 결과
NO. 메탄올 농도 (%) D.C.W
(g/L)		 자일라나아제
생산량 (U/mL)		 최종 메탄올
농도 (mL/L)
1 0.25 5.78 1.82 2.26
2 0.50 7.28 2.56 2.35
3 0.75 7.18 2.82 2.54
4 1.00 5.45 3.68 2.60
5 1.25 5.96 2.59 2.99

Claims (10)

  1. 밀기울(wheat bran), 인산이수소칼륨 (KH2PO4) 및 황산수소칼륨 (KHSO4)을 포함하는 것을 특징으로 하는 목재 부후균 (Phanerochaete chrysosporium)의 자일라나아제 유전자와 맥주 효모균 (Saccharomyces cerevisiae)의 α-분비 인자를 갖는 벡터를 재조합하여 구축한 플라스미드가 형질전환된 재조합 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 균주의 자일라나아제 (xylanase) 생산용 배지 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배지 조성물은 밀기울 7.56~15.22 g/L, 인산이수소칼륨 0.13~1.46 g/L 및 황산수소칼륨 0.02~0.25 g/L를 함유하는 것을 특징으로 하는 자일라나아제 생산용 배지 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 배지 조성물은 밀기울 11.62 g/L, 인산이수소칼륨 0.66 g/L 및 황산수소칼륨 0.09 g/L를 함유하는 것을 특징으로 하는 자일라나아제 생산용 배지 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 배지 조성물은 밀기울 (wheat bran), 인산이수소칼륨 (KH2PO4), 황산수소칼륨 (KHSO4), 효모 추출물 (yeast extract), DL-β-페닐알라닌 (DL-β-phenylalanine), 티아민 (thiamine), 황화철 (FeSO4) 및 Tween 60을 포함하는 것을 특징으로 하는 자일라나아제 생산용 배지 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 배지 조성물은 밀기울 7.56~15.22 g/L, 인산이수소칼륨 0.13~1.46 g/L, 황산수소칼륨 0.02~0.25 g/L, 효모 추출물 24~36 g/L, DL-β-페닐알라닌 0.25~0.75 g/L, 티아민 0.25~0.75 g/L, 황화철 0.005~0.015 g/L 및 Tween 60 4~6 g/L를 함유하는 것을 특징으로 하는 자일라나아제 생산용 배지 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 배지 조성물은 밀기울 11.62 g/L, 인산이수소칼륨 0.66 g/L, 황산수소칼륨 0.09 g/L, 효모 추출물 30 g/L, DL-β-페닐알라닌 0.5 g/L, 티아민 0.5 g/L, 황화철 0.01 g/L 및 Tween 60 5 g/L를 함유하는 것을 특징으로 하는 자일라나아제 생산용 배지 조성물.
  7. 목재 부후균 (Phanerochaete chrysosporium)의 자일라나아제 유전자와 맥주 효모균 (Saccharomyces cerevisiae)의 α-분비 인자를 갖는 벡터를 재조합하여 구축한 플라스미드가 형질전환된 재조합 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 균주를 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 자일라나아제 (xylanase) 생산용 배지 조성물이 함유된 발효조에 투입하여 배양하는 단계를 포함하는 자일라나아제 생산 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 배양은 회분식 배양인 것을 특징으로 하는 자일라나아제 생산 방법.
  9. 삭제
  10. 제7항에 있어서, 상기 발효조는 1~3L의 배지가 포함된 2~5L 크기의 발효조인 것을 특징으로 하는 자일라나아제 생산 방법.
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