CN105316301A - 属于gh10家族的耐热性木聚糖酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种耐热性木聚糖酶，其具有由下列(A)、(B)或(C)构成的木聚糖酶催化区域：(A)由序列号1所示氨基酸序列构成的多肽；(B)由序列号1所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的、且至少在90℃、pH6.0的条件下具有木聚糖酶活性的多肽；(C)由与序列号1所示氨基酸序列具有75％以上序列一致性的氨基酸序列构成的、并且至少在90℃且pH6.0的条件下具有木聚糖酶活性的多肽。

Description

属于GH10家族的耐热性木聚糖酶
技术领域
本发明涉及一种耐热性木聚糖酶、编码上述耐热性木聚糖酶的多核苷酸、用于表达上述耐热性木聚糖酶的表达载体、整合了上述表达载体的转化体以及使用上述耐热性木聚糖酶的木质纤维素分解产物的制造方法。
本申请要求基于2014年7月28日在日本申请的特愿2014-153337号的优先权，并在本文中引用其内容。
背景技术
除了对运输用能源供应的担忧之外，由于全球变暖和大气污染等环境上的问题，近年来，石油替代能源的开发成为非常重要的课题。植物生物质是地球上最丰富的可再生能源，作为石油替代资源而备受期待。植物生物质的主要成分(木质纤维素)为纤维素、半纤维素(包含木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖)等多糖类、木质素、以及其他果胶等。这些多糖类被各种糖苷水解酶水解为葡萄糖或木糖等单糖后，用作生物燃料或化学品原料。
具有复杂结构的木质纤维素是难分解性的，难以用单一的酶分解或糖化。因此，对于多糖类中的纤维素的水解，通常需要糖苷水解酶中的内切葡聚糖酶(内切-1,4-β-D-葡聚糖酶，EC3.2.1.4)、外切型纤维二糖水解酶(1,4-β-纤维二糖糖苷酶(cellobiosidase)或纤维二糖水解酶，EC3.2.1.91、EC3.2.1.176)、β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)这三种酶。另一方面，半纤维素包含木聚糖、阿拉伯聚糖及甘露聚糖等，其构成因植物的种类而异。例如，在阔叶树和草本植物中，木聚糖构成了主要成分。对于木聚糖的水解，需要木聚糖酶(内切-1,4-β-木聚糖酶，EC3.2.1.8)、β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)。
在以往的以木质纤维素为资源的生物乙醇的制造中，以乙醇的高能效转化为目的，尝试了基于高固液比(30～60％的固液比)的糖化处理。这种基于高固液比的木质纤维素的酶糖化，生物质糖化液的粘性高，难以进行木质纤维素的水解反应。因此，通过使用耐热性酶在例如80℃以上的高温下进行酶解糖化处理，除了加快水解反应速度之外，降低了生物质糖化液的粘性，从而有望实现缩短糖化反应时间并降低酶量。因此，对于各种糖苷水解酶，期望开发耐热性更优异的酶。
大多数耐热性糖苷水解酶可以通过如下方式获得：对生存于高温环境下的嗜热性微生物进行分离鉴定，从这些分离培养的微生物中克隆基因，确定DNA序列后，利用大肠杆菌或丝状真菌等表达而获得。特别是对于作为半纤维素的木聚糖的水解所需要的木聚糖酶，出于木质纤维素的分解和纸浆加工等目的，迄今为止，从嗜热性细菌、丝状真菌、古细菌等中进行了大量分离。例如，分别在专利文献1中公开了在60～80℃表现出酶活性的、来源于解纤维热酸菌(Acidothermuscellulolyticus)的木聚糖酶，在专利文献2中公开了在60～80℃表现出酶活性的、来源于从新西兰的温泉中分离出的厌氧耐热菌的木聚糖酶，在专利文献3中公开了最适温度为80℃的、来源于从土壤中分离出的芽孢杆菌属细菌的木聚糖酶。非专利文献4报道了最适温度为60～80℃左右的、来源于解纤维顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)的木聚糖酶。此外，进行了进一步提高耐热性的尝试，例如，在专利文献4～7中记载了通过取代天然酶的氨基酸而进一步提高耐热性的木聚糖酶。在专利文献8中记载了，利用从酶活性结构域和糖基结合域之间通过连接肽连接的天然木聚糖酶中缺失糖基结合域、或者糖基结合域和连接肽，使宿主中的酶生成量增加。这些酶的最适温度几乎全部为60～80℃，期望其耐热性的进一步提高。
另一方面，作为超高耐热性木聚糖酶，在专利文献9、10、非专利文献1～3中报道了最适温度超过85℃的、分离自特定的细菌或丝状真菌的木聚糖酶。根据专利文献9，报道了来源于海洋红嗜热盐菌(Rhodothermusmarinus)的、最适温度为90℃的木聚糖酶，但其比活性在90℃约为26nkat/mg蛋白质(＝约1.6U/mg蛋白质)，相当低。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利第5902581号说明书
专利文献2：美国专利第6083733号说明书
专利文献3：特开2004-121257号公报
专利文献4：美国专利第5759840号说明书
专利文献5：美国专利第5866408号说明书
专利文献6：美国专利第7060482号说明书
专利文献7：美国专利申请公开第2010/0062511号说明书
专利文献8：美国专利申请公开第2006/0014247号说明书
专利文献9：美国专利第5395765号说明书
专利文献10：美国专利第5688668号说明书
非专利文献
非专利文献1：ZhengQiang等，《生物科学和生物工程杂志(JournalofBioscienceAndBioengineering)》，2001年，第92卷，第423-428页。
非专利文献2：Winterhalter和Liebl，《应用与环境微生物学(AppliedandEnvironmentalMicrobiology)》，1995年，第61卷，第1810-1815页。
非专利文献3：Yoon等，《农业化学和生物技术(AgriculturalChemistryandBiotechnology)》，2004年，第47卷，第157-160页。
非专利文献4：Kishishita等，《蛋白质表达和纯化(ProteinExpressionandPurification)》，2014年，第94卷，第40-45页。
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种至少在90℃且pH6.0的条件下表现出木聚糖酶活性的新的耐热性木聚糖酶、编码上述耐热性木聚糖酶的多核苷酸、用于表达上述耐热性木聚糖酶的表达载体、整合了上述表达载体的转化体、以及使用上述耐热性木聚糖酶制造木质纤维素分解产物的方法。
解决技术问题的技术手段
本发明的发明人为了解决上述问题，通过从温泉高温土壤中直接提取DNA来进行难培养微生物群的大规模宏基因组测序，成功获取了具有新的氨基酸序列的耐热性木聚糖酶，从而完成了本发明。
即，作为本发明的耐热性木聚糖酶、多核苷酸、表达载体、转化体、耐热性木聚糖酶的制造方法、糖苷水解酶混合物、以及木质纤维素分解产物的制造方法，可以列举下列[1]～[10]。
[1]一种耐热性木聚糖酶，其特征在于具有由下列(A)、(B)或(C)构成的木聚糖酶催化区域：
(A)由序列号1所示氨基酸序列构成的多肽；
(B)由序列号1所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的、并且至少在90℃且pH6.0的条件下具有木聚糖酶活性的多肽；
(C)由与序列号1所示氨基酸序列具有75％以上序列一致性的氨基酸序列构成的、并且至少在90℃且pH6.0的条件下具有木聚糖酶活性的多肽。
[2]上述[1]的耐热性木聚糖酶，其在pH6.0且60～99℃下表现出木聚糖酶活性。
[3]一种多核苷酸，其具有由下列(a)～(e)中任一碱基序列构成的编码木聚糖酶催化区域的区域：
(a)编码由序列号1所示氨基酸序列构成的多肽的碱基序列；
(b)编码由序列号1所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的、并且至少在90℃且pH6.0的条件下具有木聚糖酶活性的多肽的碱基序列；
(c)编码由与序列号1所示氨基酸序列具有75％以上序列一致性的氨基酸序列构成的、并且至少在90℃且pH6.0的条件下具有木聚糖酶活性的多肽的碱基序列；
(d)编码与序列号2所示碱基序列具有75％以上序列一致性、并且至少在90℃且pH6.0的条件下具有木聚糖酶活性的多肽的碱基序列；
(e)编码与由序列号2所示碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下进行杂交的多核苷酸的碱基序列、且至少在90℃且pH6.0的条件下具有木聚糖酶活性的多肽的碱基序列。
[4]上述[3]的多核苷酸，上述多肽在pH6.0且60～99℃下表现出木聚糖酶活性。
[5]一种表达载体，其整合了上述[3]或[4]的多核苷酸，在宿主细胞中可表达具有木聚糖酶活性的多肽。
[6]一种转化体，其导入有上述[5]的表达载体。
[7]上述[6]的转化体，其为真核微生物。
[8]上述耐热性木聚糖酶的制造方法，包括在上述[6]或[7]的转化体中生产耐热性木聚糖酶。
[9]一种糖苷水解酶混合物，其包含上述[1]或[2]的耐热性木聚糖酶、上述[3]或[4]的多核苷酸编码的耐热性木聚糖酶、或者利用上述[8]的耐热性木聚糖酶的制造方法制得的耐热性木聚糖酶及至少一种以上的其他糖苷水解酶。
[10]一种木质纤维素分解产物的制造方法，包括使由含有包含木聚糖的半纤维素的木质纤维素所形成的材料与上述[1]或[2]的耐热性木聚糖酶、上述[3]或[4]的多核苷酸编码的耐热性木聚糖酶、上述[6]或上述[7]中记载的转化体、利用上述[8]的耐热性木聚糖酶的制造方法制得的耐热性木聚糖酶、或者上述[9]的糖苷水解酶混合物接触，由此生产木质纤维素分解产物。
发明效果
本发明的耐热性木聚糖酶至少在90℃且pH6.0的条件下具有木聚糖酶活性。因此，上述耐热性木聚糖酶适合于高温条件下的、由含有包含木聚糖的半纤维素的木质纤维素构成的材料的糖化处理(水解处理)。
此外，本发明的多核苷酸、整合了上述多核苷酸的表达载体、导入有上述表达载体的转化体适合用于制造本发明的耐热性木聚糖酶。
附图说明
图1为基因克隆AR19G-10-6所编码的多肽(AR19G-10-6)的氨基酸序列(序列号1)与放线菌门吸水链霉菌井冈变种5008(Streptomyceshygroscopicussubsp.Jinggangensis5008)的GH10木聚糖酶(序列号6)的氨基酸序列的比对图。
图2为表示实施例1中的AR19G-10-6基因在大肠杆菌中表达得到的AR19G-10-6蛋白的SDS-PAGE分析结果的图。
图3为表示实施例1中的大肠杆菌所表达的AR19G-10-6蛋白对各底物的木聚糖酶活性的测定结果的图。
图4为表示实施例1中的大肠杆菌所表达的AR19G-10-6蛋白在各温度下的木聚糖酶活性(pH6.0)的测算结果的图。
图5为表示实施例1中的大肠杆菌所表达的AR19G-10-6蛋白在各pH的木聚糖酶活性(90℃)的测算结果的图。
图6为表示实施例1中的大肠杆菌所表达的AR19G-10-6蛋白示出的、伴随热变性而引发的SYPROOrange(宝石橙蛋白染色试剂)的荧光强度变化的图。
具体实施方式
[耐热性木聚糖酶]
众所周知，包含丝状真菌、细菌和古细菌的大多微生物是具有难培养性的，在土壤等微生物环境中生存的菌约99％为未知的菌。特别公认在高温环境中生存的微生物的培养是极其困难的，目前的微生物培养技术只不过是分离培养出0.1％以下土壤中生存的微生物。该高温土壤微生物的难培养性成为耐热性酶的开发无进展的一个原因。
近年来，通过开发可大量序列解码千兆碱基对的新一代千兆测序仪(giga-sequencer)，可完整解码土壤等中所含有的微生物群的基因组。提出了利用该分析技术的宏基因组分析法，从而使难培养性微生物的基因组解码得到了飞速发展，上述宏基因组分析法即制备来自于土壤等环境样本的微生物菌落的基因组DNA，对基因组结构不均匀且多杂的菌群直接进行基因组的全面解码，通过并行计算机进行解码数据的拼接，再度构成微生物群基因组序列。
本发明的发明人如下述实施例1所示，从所采集的高温温泉土壤(例如可列举58～78℃的含有土壤、泥、生物垫(biomat)、生物膜等的温泉水)提取微生物菌落的基因组DNA(宏基因组DNA)，进行宏基因组DNA的鸟枪法测序和注释，获得编码与已知木聚糖酶类似的氨基酸序列(例如具有20％以上序列一致性、且期望值(E-Value)不足1e-20的氨基酸序列)的开放阅读框(ORF)。在这些ORF中，对于33个确定了木聚糖酶催化区域的ORF，根据ORF的碱基序列信息设计引物，通过PCR法，从高温温泉土壤宏基因组DNA克隆得到候选基因。将PCR克隆得到的DNA整合到大肠杆菌中，表达上述碱基序列编码的蛋白质，通过木聚糖酶分解活性检测来进行功能筛选。最终，从这些ORF中得到具有木聚糖酶活性的耐热性木聚糖酶(下面有时称为“AR19G-10-6”)。分别将AR19G-10-6的氨基酸序列示于序列号1，将编码AR19G-10-6的氨基酸序列的碱基序列示于序列号2。
如下述实施例1<9>所示，AR19G-10-6对木聚糖表现出高水解活性，另一方面，对于磷酸溶胀Avicel(PSA)、作为微晶纤维素的Avicel、羧甲基纤维素(CMC)、由β-1,3键和β-1,4键葡聚糖形成的地衣多糖(Lichenan)、由β-1,3键和β-1,6键葡聚糖形成的海带多糖(Laminarin)、PNPX(对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷)及PNPG(对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷)几乎没有表现出分解活性。
另外，在本说明书中，“木聚糖酶活性”是指以木聚糖为底物的水解活性。此外，在本说明书中，“具有活性”是指至少对1种底物起作用，与阴性对照(Negativecontrol)相比，被水解的底物的还原末端的数量或者在显色反应中存在显著差异。因此，“具有木聚糖酶活性”是指至少对木聚糖起作用，与阴性对照(Negativecontrol)相比，被水解的底物的还原性末端的数量或者在显色反应中存在显著差异。
此外，作为另一方面，“具有木聚糖酶活性”是指在pH6.0的条件下、且温度40～99℃的范围内，至少对木聚糖具有6.0U/mg以上的水解活性。
此外，作为另一方面，“具有木聚糖酶活性”是指在90℃的条件下、且pH4.0～8.0的范围内，至少对木聚糖具有2.3U/mg以上的水解活性。
在公知的氨基酸序列数据库中对AR19G-10-6的氨基酸序列进行检索时，序列一致性最高的氨基酸序列为属于放线菌门吸水链霉菌井冈变种5008(Streptomyceshygroscopicussubsp.Jinggangensis5008)的属于GH10家族的木聚糖酶(Genbank：AEY92972.1)的氨基酸序列(序列号6)，其序列一致性(相似性)，全长为51％，木聚糖酶催化区域为56％。由底物特异性和与已知的蛋白质的氨基酸序列的序列一致性得知，AR19G-10-6为属于GH10家族的新木聚糖酶。
AR19G-10-6至少在90℃、pH6.0的条件下具有木聚糖酶活性。实际上，如下述实施例1<10>所示，AR19G-10-6在40～99℃的温度范围内表现出木聚糖酶活性
更具体而言，AR19G-10-6的木聚糖酶活性在pH6.0的条件下、40～90℃的范围内随着温度的升高而升高，即使超过90℃也没有活性的大幅降低，即使在99℃也维持了最适温度下的活性的80％以上。
通常，任何具有生理活性的蛋白质都能在不损害其生理活性的前提下，进行1个或2个以上氨基酸的缺失、取代或添加。即，对于AR19G-10-6，也可以在不丧失以木聚糖酶活性为首的糖苷水解酶活性的前提下，进行1个或2个以上氨基酸的缺失、取代或添加。
即，本发明的耐热性木聚糖酶为具有由下列(A)～(C)中任一多肽构成的木聚糖酶催化区域的耐热性糖苷水解酶。
(A)由序列号1所示氨基酸序列构成的多肽(即AR19G-10-6)；
(B)由序列号1所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的、并且至少在90℃且pH6.0的条件下具有木聚糖酶活性的多肽；或者
(C)由与序列号1所示氨基酸序列具有75％以上序列一致性的氨基酸序列构成的、并且至少在90℃且pH6.0的条件下具有木聚糖酶活性的多肽。
在本说明书中，“多肽中的氨基酸的缺失”是指失去(即去除)构成多肽的一部分氨基酸。
在本说明书中，“多肽中的氨基酸的取代”是指将构成多肽的氨基酸被替换为其他氨基酸。
在本说明书中，“多肽中的氨基酸的添加”是指在多肽中插入新的氨基酸。
在上述(B)的多肽中，对于序列号1所示氨基酸序列，缺失、取代或添加氨基酸的个数优选为1～20个，更加优选为1～10个，进一步优选为1～5个。
在上述(C)的多肽中，与序列号1所示氨基酸序列的序列一致性只要是75％以上且不足100％即可，没有特别的限制，但优选为80％以上且不足100％，更加优选为85％以上且不足100％，进一步优选为90％以上且不足100％，更进一步优选为95％以上且不足100％，特别优选为98％以上且不足100％。
另外，氨基酸序列之间的序列一致性(相似性)是以使对应氨基酸有最多一致的方式，在相当于插入及缺失的部分加入空位(gap)同时使两个氨基酸序列并列得到比对，求得一致的氨基酸相对于除去所得比对中的空位的氨基酸序列整体的比例。氨基酸序列之间的序列一致性可以使用该技术领域中公知的各种相似性检索软件来求得。本发明的氨基酸序列的序列一致性的值是以利用公知的相似性检索软件BLASTP得到的比对为基础算得的。
作为上述(B)及(C)的多肽，可以是人工设计的，也可以是AR19G-10-6等的同源物或其部分蛋白质。
上述(A)～(C)的多肽分别可以根据氨基酸序列进行化学合成，也可以由使用了下述本发明的多核苷酸的蛋白质表达系统来生产。此外，上述(B)及(C)的多肽分别也可以根据由序列号1所示氨基酸序列构成的多肽，利用导入氨基酸突变的基因重组技术来进行人工合成。
上述(A)～(C)的多肽至少在90℃、pH6.0的条件下具有木聚糖酶活性。因此，通过具有上述(A)～(C)中任一多肽作为木聚糖酶催化区域，能够得到耐热性木聚糖酶。
本发明的耐热性木聚糖酶以木聚糖为底物。上述耐热性木聚糖酶还可以以木聚糖之外的其他β-葡聚糖或低聚糖为底物。作为可充当本发明的耐热性木聚糖酶的底物的物质，例如可列举：PNPX、PNPG、对硝基苯基-α-L-呋喃阿拉伯糖苷、对硝基苯基-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、对硝基苯基-β-L-吡喃阿拉伯糖苷、对硝基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷、对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷、对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷；地衣多糖(Lichenan)等由β-1,3键和β-1,4键形成的葡聚糖；微晶粉末纤维素(Avicel)、微晶性细菌纤维素(Bacterialmicrocrystallinecellulose，BMCC)、滤纸等结晶纤维素、非结晶纤维素的磷酸溶胀微晶粉末纤维素(phosphoricacidswollenAvicel,PSA)、CMC、由β-1,4键形成的葡聚糖、纤维二糖等由β-1,4键形成的低聚糖；海带多糖等由β-1,3键和β-1,6键形成的葡聚糖；由β-1,3键形成的葡聚糖、由β-1,6键形成的葡聚糖、龙胆二糖等由β-1,6键形成的低聚糖等。
本发明的耐热性木聚糖酶至少在pH6.0的条件下，优选在80～95℃的温度范围内表现出木聚糖酶活性，更加优选在70～99℃的温度范围内表现出木聚糖酶活性，进一步优选在60～99℃的温度范围内表现出木聚糖酶活性，更进一步优选在50～100℃的温度范围内表现出木聚糖酶活性。本发明的耐热性木聚糖酶的最适温度优选在80～99℃的范围内，更加优选在85～95℃的范围内。
本发明的耐热性木聚糖酶的最适pH虽然依赖于反应温度而变化，但是在pH5.0～7.0的范围内。作为本发明的耐热性木聚糖酶，优选至少在pH5.0～8.0的范围内表现出木聚糖酶活性，更加优选在pH4～8.0的范围内表现出木聚糖酶活性。
本发明的耐热性木聚糖酶还可以进一步具有木聚糖酶活性之外的糖苷水解活性。作为其他糖苷水解活性，可列举内切葡聚糖酶活性、β-木糖苷酶活性、β-葡糖苷酶活性和纤维二糖水解酶活性等。
本发明的耐热性木聚糖酶可以是仅由上述(A)～(C)的多肽中的任一多肽构成的木聚糖酶催化区域所构成的酶，也可以进一步含有其他区域。作为其他区域，可列举公知的木聚糖酶所具有的酶催化区域之外的区域。例如，在本发明的耐热性木聚糖酶中，相对于公知的木聚糖酶，还包含通过酶催化区域被上述(A)～(C)的多肽取代而得到的酶。
本发明的耐热性木聚糖酶另外还可以在N末端或C末端具有可转移并定位于细胞内特定区域的信号肽、或者向细胞外分泌的信号肽。作为这种信号肽，例如有质外体转移信号肽、内质网驻留信号肽、核转运信号肽、或者分泌信号肽等。作为内质网驻留信号肽，例如有由HDEL的氨基酸序列构成的信号肽等。本发明的耐热性木聚糖酶在其N末端或C末端具有信号肽时，可使在转化体中表达的耐热性木聚糖酶分泌到细胞外，或定位于细胞中的内质网等中。
此外，本发明的耐热性木聚糖酶，除此之外，由于在利用表达系统生产时可简单纯化，例如也可以在上述耐热性木聚糖酶的N末端或C末端添加各种标记。作为上述标记，例如可使用His标记、HA(血凝素)标记、Myc标记及Flag标记等在重组蛋白的表达纯化中广泛使用的标记。
[编码耐热性木聚糖酶的多核苷酸]
本发明的多核苷酸编码本发明的耐热性木聚糖酶。上述耐热性木聚糖酶可以通过将整合了上述多核苷酸的表达载体导入宿主中，利用上述宿主的表达系统来生产。
具体而言，本发明的多核苷酸为具有由下列(a)～(e)中任一碱基序列构成的编码木聚糖酶催化区域的区域的多核苷酸。
(a)编码由序列号1所示氨基酸序列构成的多肽的碱基序列；
(b)编码由序列号1所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的、并且至少在90℃且pH6.0的条件下具有木聚糖酶活性的多肽的碱基序列；
(c)编码由与序列号1所示氨基酸序列具有75％以上序列一致性的氨基酸序列构成的、并且至少在90℃且pH6.0的条件下具有木聚糖酶活性的多肽的碱基序列；
(d)编码与序列号2所示氨基酸序列具有75％以上序列一致性、并且至少在90℃且pH6.0的条件下具有木聚糖酶活性的多肽的碱基序列；
(e)编码与由序列号2所示碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下进行杂交的多核苷酸的碱基序列、且至少在90℃且pH6.0的条件下具有木聚糖酶活性的多肽的碱基序列。
另外，在本说明书中，“多核苷酸中的碱基的缺失”是指失去(即去除)构成多核苷酸的一部分核苷酸。
在本说明书中，“多核苷酸中的碱基的取代”是指将构成多核苷酸的碱基替换为其他碱基。
在本说明书中，“多核苷酸中的碱基的添加”是指在多核苷酸中插入新的碱基。
本说明书中，“严格条件”例如可列举《分子克隆-实验室手册第三版》(Sambrook等，冷泉港实验室出版社)中记载的方法。例如可列举，通过在由6×SSC(20×SSC的组成：3M氯化钠、0.3M柠檬酸溶液，pH7.0)、5×邓哈特溶液(Denhardt'ssolution)(100×邓哈特溶液的组成：2质量％的牛血清白蛋白、2质量％的Ficoll、2质量％的聚乙烯吡咯烷酮)、0.5质量％的SDS、0.1mg/mL的鲑鱼精子DNA及50％的甲酰胺组成的杂交缓冲液中，在42～70℃进行数小时到一晚的温育而使杂交进行的条件。另外，作为用于温育后的清洗时的清洗缓冲液，优选为含有0.1质量％SDS的1×SSC溶液，更加优选为含有0.1质量％SDS的0.1×SSC溶液。
在上述(a)～(e)的碱基序列中，简并密码子优选宿主中使用频率高的密码子。例如，作为上述(a)的碱基序列，可以是序列号2所示碱基序列，也可以是在不改变所编码的氨基酸序列的前提下，将序列号2所示碱基序列变更为宿主中使用频率高的密码子的碱基序列。密码子的变更可以通过公知的基因序列突变技术或人工基因合成来进行。
由序列号2所示碱基序列构成的多核苷酸可以根据碱基序列信息进行化学合成，也可以是利用基因重组技术从自然界取得的编码AR19G-10-6的基因(有时被称为“AR19G-10-6基因”、“基因克隆AR19G-10-6”)的全长或含有木聚糖酶催化区域的部分区域(即编码由序列号1中的第35位亮氨酸(L)至第346位蛋氨酸(M)的312个氨基酸残基所构成的部分区域的区域)。AR19G-10-6基因的全长或其部分区域可以通过从自然界获取含有微生物的样本，以从该样本回收的基因组DNA为模板，使用基于序列号2所示碱基序列用常规方法设计的正向引物和反向引物进行PCR而获得。也可以将以从上述样本回收的mRNA为模板通过反转录反应合成的cDNA作为模板。另外，回收作为模板的核酸的样本优选为在温泉土壤等高温环境下采集的样本。
在上述(d)的碱基序列中，与序列号2所示碱基序列的序列一致性只要是75％以上且不足100％即可，没有特别的限制，但优选为80％以上且不足100％，更加优选为85％以上且不足100％，进一步优选为90％以上且不足100％，更进一步优选为95％以上且不足100％，特别优选为98％以上且不足100％。
另外，氨基酸序列之间的序列一致性(相似性)是以使对应碱基最多一致的方式，在相当于插入和缺失的部分加入空位(gap)同时使两个碱基序列并列得到比对，求得一致的碱基相对于除去所得比对中的空位的碱基序列整体的比例。氨基酸序列之间的序列一致性可以使用上述技术领域中公知的各种相似性检索软件来进行求得。本发明的碱基序列的序列一致性的值是以利用公知的相似性检索软件BLASTN得到的比对为基础算得的。
例如，上述(b)、(c)或(d)的碱基序列构成的多核苷酸分别可以通过对序列号2所示碱基序列构成的多核苷酸进行1个或2个以上碱基的缺失、取代或添加而人工合成。此外，作为上述(b)、(c)或(d)的碱基序列，可以是AR19G-10-6基因的同源基因的全长序列或其部分序列。AR19G-10-6基因的同源基因可以通过在获取碱基序列已知的基因的同源基因时所使用的基因重组技术来获得。
本发明的多核苷酸，可以为仅具有编码木聚糖酶催化区域的区域的多核苷酸，也可以除上述区域之外，还具有编码纤维素结合域、连接序列、各种信号肽、各种标记等的区域。
[表达载体]
本发明的表达载体为整合了上述本发明的多核苷酸、可在宿主细胞中表达至少在90℃、pH6.0的条件下具有木聚糖酶活性的多肽的表达载体。即，以可表达上述本发明的耐热性木聚糖酶的状态整合上述本发明的多核苷酸的表达载体。具体而言，需要在表达载体中整合由从上游开始的具有启动子序列的DNA、上述本发明的多核苷酸、以及具有终止子序列的DNA所构成的表达盒。另外，可以利用众所周知的基因重组技术来进行多核苷酸向表达载体中的整合。多核苷酸向表达载体中的整合也可以使用市售的表达载体制作试剂盒。
在本说明书中，“表达载体”是指从上游开始包含具有启动子序列的DNA、具有用于整合外源DNA的序列的DNA、以及具有终止子序列的DNA的载体。
作为上述表达载体，可以是导入大肠杆菌等原核细胞的表达载体，也可以是导入酵母、丝状真菌、昆虫培养细胞、哺乳动物培养细胞或植物细胞等真核细胞的表达载体。作为这些表达载体，可以分别对应宿主使用通常所使用的任意表达载体。
本发明的表达载体优选为不仅整合了上述本发明的多核苷酸，还整合了耐药基因等的表达载体。这是由于可以利用表达载体容易地进行转化宿主细胞和非转化宿主细胞的筛选。
作为上述耐药基因，例如可列举卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和双丙氨磷抗性基因等。
[转化体]
本发明的转化体导入有本发明的表达载体。在上述转化体中，可表达本发明的耐热性木聚糖酶。作为导入表达载体的宿主，可以是大肠杆菌等原核细胞，也可以是酵母、丝状真菌、昆虫培养细胞、哺乳动物培养细胞或植物细胞等真菌细胞。即，本发明的转化体为导入有本发明的表达载体的大肠杆菌、酵母、丝状真菌、昆虫培养细胞、哺乳动物培养细胞、植物细胞等。
通过培养大肠杆菌的转化体，可以简便且大量的生产本发明的耐热性木聚糖酶。另一方面，由于在真核细胞内，蛋白质被实施了糖链修饰，通过使用真核细胞的转化体，能够比使用原核细胞的转化体时生产耐热性更加优异的耐热性木聚糖酶。
使用表达载体制作转化体的方法没有特别的限制，可以利用在制作转化体时通常使用的方法来进行。作为上述方法，例如有热休克法、农杆菌介导法、粒子枪法、电穿孔法及PEG(聚乙二醇)法等。其中，宿主为植物细胞的情况下，优选以粒子枪法或农杆菌介导法来进行。
在将原核细胞、酵母、丝状真菌、昆虫培养细胞、哺乳培养细胞等用作宿主的情况下，所得到的转化体通常可以与转化前的宿主一样利用常规方法进行培养。
[耐热性木聚糖酶的制造方法]
本发明的耐热性木聚糖酶的制造方法，是在上述本发明的转化体中生产耐热性木聚糖酶的方法。若使用将上述本发明的多核苷酸整合到不具有控制表达时期等的能力的启动子下游的表达载体制备转化体，并对该转化体进行培养，则在上述转化体内稳定表达本发明的耐热性木聚糖酶。另一方面，对于使用通过特定化合物或温度等诱导表达的所有表达诱导型启动子制备的转化体，通过对所述转化体进行培养，进行适应于各种表达诱导条件的诱导处理，在上述转化体中表达耐热性木聚糖酶。
由转化体生产的耐热性木聚糖酶能够以留存于上述转化体中的状态使用，也可以从上述转化体中提取纯化。
从转化体中提取纯化耐热性木聚糖酶的方法只要是不损害耐热性木聚糖酶活性的方法即可，没有特别的限制，可以利用从细胞或活体组织中提取多肽时通常使用的方法来进行提取。作为上述方法，例如可列举将转化体浸入适当的提取缓冲液中，提取耐热性木聚糖酶后，将提取液与固体残渣分离的方法。作为上述提取缓冲液，优选为含有表面活性剂等增溶剂的提取缓冲液。转化体为植物的情况下，在浸入提取缓冲液前，可以预先将上述转化体切碎或粉碎。
此外，作为分离提取液和固体残渣的方法，例如可使用过滤法、压缩过滤法、离心分离处理法等公知的固液分离处理，也可以对浸入提取缓冲液状态的转化体进行挤压。提取液中的耐热性木聚糖酶可以利用盐析法、超滤法或层析法等公知的纯化方法进行纯化。
本发明的耐热性木聚糖酶在转化体中以具有分泌信号肽的状态表达时，在对上述转化体进行培养后，从所得到的培养物回收除去转化体的培养液上清液，由此能够简便的获得含有耐热性木聚糖酶的溶液。此外，本发明的耐热性木聚糖酶具有His标记等标记时，通过利用上述标记的亲和层析法，能够简便的纯化提取液或培养液上清液中的耐热性木聚糖酶。
即，本发明的耐热性木聚糖酶的制造方法包括在上述本发明的转化体中生产耐热性木聚糖酶，以及根据需要从上述转化体中提取纯化上述耐热性木聚糖酶。
[糖苷水解酶混合物]
本发明的糖苷水解酶混合物可以作为含有上述本发明的耐热性木聚糖酶、或者由上述本发明的耐热性木聚糖酶的制造方法制造的耐热性木聚糖酶及至少一种其他糖苷水解酶的糖苷水解酶混合物而使用。由上述本发明的耐热性木聚糖酶的制造方法制造的耐热性木聚糖酶可以是包含在转化体中的状态的耐热性木聚糖酶，也可以是从转化体中提取纯化的耐热性木聚糖酶。通过将本发明的耐热性木聚糖酶以与其他糖苷水解酶的混合物的形式用于多糖的水解反应，能够更高效地使难分解的木质纤维素进行分解。
作为上述糖苷水解酶混合物中含有的上述耐热性木聚糖酶之外的其他糖苷水解酶，只要是具有木质纤维素水解活性的酶即可，没有特别的限制。作为上述糖苷水解酶混合物中含有的上述耐热性木聚糖酶之外的其他糖苷水解酶，例如可列举β-木糖苷酶等半纤维素酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、或内切葡聚糖酶等。作为本发明的糖苷水解酶混合物，除了上述耐热性木聚糖酶之外，还优选含有半纤维素酶和内切葡聚糖酶中的至少一种的糖苷水解酶的混合物，更优选含有半纤维素酶和内切葡聚糖酶这两种糖苷水解酶的混合物。其中，优选含有选自由木聚糖酶、β-木糖苷酶、纤维二糖水解酶及内切葡聚糖酶构成的组中的至少一种糖苷水解酶的混合物，更加优选含有木聚糖酶、β-木糖苷酶、纤维二糖水解酶及内切葡聚糖酶全部这些糖苷水解酶的混合物。
上述糖苷水解酶混合物中含有的其他糖苷水解酶优选为至少在85℃具有糖苷水解酶活性的耐热性糖苷水解酶，更加优选为在70～90℃具有糖苷水解酶活性的耐热性糖苷水解酶。通过使上述糖苷水解酶混合物含有的全部酶为耐热性的(例如酶活性的最适温度或酶蛋白的热变性温度为70℃以上)，能够在高温条件下高效进行基于上述糖苷水解酶混合物的木质纤维素分解反应。即，上述糖苷水解酶混合物仅含有耐热性糖苷水解酶时，通过将上述糖苷水解酶混合物用于木质纤维素糖化处理，使得可以在糖化温度为70～90℃的高温环境下进行木质纤维素水解反应(高温糖化：高温水解)。通过此高温糖化，可以显著减少酶量和糖化时间，大幅降低糖化成本(水解成本)。
[木质纤维素分解物的制造方法]
本发明的木质纤维素分解产物的制造方法为通过本发明的耐热性木聚糖酶水解半纤维素生产低聚糖，从而得到木质纤维素分解产物的方法。具体而言，使含有半纤维素、更具体为包含木聚糖的半纤维素的木质纤维素所构成的材料与本发明的耐热性木聚糖酶、本发明的转化体、利用本发明的耐热性木聚糖酶的制造方法制得的耐热性木聚糖酶、或者本发明的糖苷水解酶混合物接触，由此生产半纤维素分解产物。
作为半纤维素分解产物，例如可列举出木糖、低聚木糖等。
作为含有半纤维素、更具体为包含木聚糖的半纤维素的木质纤维素所构成的材料，只要含有半纤维素、更具体为含有木聚糖即可，没有特别的限制。作为上述材料，例如可列举杂草或农业废弃物等生物质、废纸等。优选使上述材料与本发明的耐热性木聚糖酶接触前，先进行破碎或切碎等物理处理、利用酸或碱等的化学处理、或者浸渍或溶解于适当的缓冲液中的溶解处理等。
利用本发明的耐热性木聚糖酶进行半纤维素、更具体为木聚糖的水解反应的反应条件只要是使上述耐热性木聚糖酶表现出木聚糖酶活性的条件即可。例如优选在60～99℃、pH4.0～8.0的条件下进行反应，更加优选在70～99℃、pH5.0～7.0的条件下进行反应，进一步优选在80～99℃、pH5.0～7.0的条件下进行反应。上述水解反应的反应时间可考虑供水解的含有半纤维素、更具体为包含木聚糖的半纤维素的木质纤维素所构成的材料的种类、预处理方法、或者用量等进行适当的调整。例如可进行10分钟～100小时，在分解纤维素类生物质的情况下，能够以1～100小时的反应时间进行上述水解反应。
在木质纤维素的水解反应中，除了本发明的耐热性木聚糖酶之外，优选还同时或者分别使用至少一种其他糖苷水解酶。作为上述其他糖苷水解酶，可以使用与上述糖苷水解酶混合物中含有的糖苷水解酶一样的糖苷水解酶，优选的是，至少在85℃、优选至少在70～90℃具有糖苷水解酶活性的耐热性糖苷水解酶。此外，上述木质纤维素分解产物的制造方法的一个方面为使用本发明的耐热性木聚糖酶、本发明的转化体、或者利用本发明的耐热性木聚糖酶的制造方法制得的耐热性木聚糖酶，另一方面为使用上述糖苷水解酶混合物。
实施例
下面示出实施例对本发明进行进一步的详细说明，但本发明并不局限于以下实施例。
[实施例1]来自于温泉土壤的新耐热性木聚糖酶的克隆
<1>来自于温泉土壤的DNA提取与全基因组序列(WholeGenomeSequence,WGS)
以在70～99℃表现出活性的新耐热性木聚糖酶的基因探索为目的，从中性～弱碱性温泉采集土壤DNA，进行构成这些土壤的微生物群的基因组DNA的碱基序列解码。
作为中性～弱碱性温泉土壤样本，从在野外有喷出高温温泉的日本国内的3处的5个地点(宏基因组DNA样本N2、AR19、AR15、OJ1和H1)采集含有土壤、泥、生物垫(biomat)的温泉水。这些温泉土壤样本采集时的温度为58～78℃、pH为7.2～8的范围内。
使用DNA提取试剂盒(ISOILLargeforBeadsver.2,NIPPONGENE社制)，从所采集的温泉土壤样本各10g中提取DNA。对于所提取的DNA中的5μg，使用罗氏诊断(RocheDiagnostics)社制GSFLXTitanium454进行宏基因组DNA的鸟枪法测序。
对温泉土壤样本AR19进行宏基因组DNA的序列解码，得到平均解码长度(readlength)为396bp、总解码数(totalreadnumber)为2,766,332个、总基因组解码量为1,106,243,280bp的全基因组序列(WGS)数据集。
<2>温泉宏基因组数据的拼接与统计量
将Roche454的输出(sff文件)通过PyroBayes(Quinlan等，《自然方法》，2008年，第5卷，第179-181页)再次进行碱基识别(base-calling)，得到FASTA形式的序列文件和质量值文件。切掉所得序列解码的端部，提高其品质，使用454生命技术公司的拼接软件Newbler2.3版进行拼接。拼接是设定为“最低的可接受重叠匹配(mi)＝0.9”、“选项：-大(对于大型或复杂的基因组，加快拼接，但降低精度。)”来进行的。
拼接为100bp以上的总解码长度共计为104,096,316bp，此数据集用于纤维素酶基因分析。解码总数为2,766,332个解码中的2,040,651个解码拼接为平均1,027bp以上的重叠群(共计101,372个重叠群)，其中最大重叠群的长度为187,970bp。
<3>木聚糖酶的开放阅读框(OPF)预测
从Uniprot数据库(http://www.uniprot.org/)下载EC号为3.2.1.4(纤维素)、3.2.1.21(β-葡糖苷酶)、3.2.1.37(β-木糖苷酶)、3.2.1.91(纤维素1,4-β-纤维二糖糖苷酶)、3.2.1.8(内切-1,4-β-木聚糖酶)的序列(访问日期：2011/12/9)，构建这些糖苷水解酶基因的蛋白质组本地数据库。使用注释软件Orphelia(Hoff等，《核酸研究》，2009年，第37卷，Web服务器问题：W101-W105)，由上述<2>所得重叠群序列推断基因区域(＝开放阅读框)(Orphelia选项：默认(模型＝Net700，最大重叠(maxoverlap)＝60))。为了从推断的ORF提取糖苷水解酶基因，使用了BLASTP(blastallver.2.2.18)，参照了上述本地数据库。BLASTP的选项条件设为“过滤查询序列＝假”，“期望值(E)<1e-20”[以下为默认值：空位开放罚分＝-1，空位扩展罚分＝-1，空位比对的X下降值＝0，阈值拓展命中＝0，字段长度＝默认(Costtoopenagap＝-1，Costtoextendedgap＝-1，Xdropoffvalueforgappedalignment＝0，Thresholdforextendinghits＝0，Wordsize＝default)]，以命中ORF序列为糖苷水解酶基因进行收集。收集的碱基序列包含纤维素酶、内切半纤维素酶、脱支酶等糖苷水解酶基因的碱基序列。
<4>基因的糖苷水解酶(GH)家族分类
对于在上述<3>中收集的碱基序列，以蛋白质功能区域序列数据库pfamHMMs(Pfam23.0版和HMMERv2.3；Finn等，《核酸研究数据库》，2010年，第38卷，第D211-222页)为标准进行功能分类。具体而言，使用了蛋白质基序检索程序HMMER(Durbin等，“概形HMM理论。生物序列分析理论：蛋白质和核酸的概率模型(ThetheorybehindprofileHMMs.Biologicalsequenceanalysis：probabilisticmodelsofproteinsandnucleicacids)”，1998年，剑桥大学出版社；hmmpfam(2.3.2版)中，E值截止值<1e-5；数据库＝Pfam_fs(可用于查找所表示的结构域在序列中的片段的模型。))，对于在上述<3>中收集的各碱基序列，由与Pfam结构域数据库的相似性，确定糖苷水解酶(GH)家族。另外，将覆盖GH催化结构域的70％以上的碱基序列计入属于各家族的酶基因。
通过使用了宏基因组AR19的序列数据的BLASTP进行相似性检索，并通过HMMER进行结构域检索，预测33个ORF(全长ORF为20个，非全长ORF为13个)为木聚糖酶基因。这些ORF的GH家族分类示于表1中。如表1所示，从宏基因组AR19得到7个属于GH10家族的木聚糖酶基因的全长ORF，1个属于GH11家族的木聚糖酶基因的全长ORF。对于推断为木聚糖酶基因的全部ORF，设计引物，通过PCR从温泉土壤宏基因组DNA克隆基因。结果从属于GH10家族的、具有木聚糖酶基因序列的开放阅读框AR19G-10分离出木聚糖酶基因。
[表1]
<5>开放阅读框AR19G-10
开放阅读框AR19G-10编码由357个氨基酸构成的多肽(序列号1)，上述多肽为从第1位氨基酸残基蛋氨酸开始、在编码上述多肽的碱基序列的3’末端以终止密码子终止的全长序列(序列号2)。根据利用了信号序列预测软件SignalP4.1的分析，在开放阅读框AR19G-10所编码的多肽中，第1位的蛋氨酸(M)至第28位的丝氨酸(S)的28个氨基酸残基为分泌信号。此外，从基序的序列相似性推测，在开放阅读框AR19G-10编码的多肽中，第35位的亮氨酸(L)至第346位的蛋氨酸(M)的312个氨基酸残基编码糖苷水解酶第10家族的催化结构域。与上述ORF编码的氨基酸序列的序列一致性最高的已知氨基酸序列为放线菌门吸水链霉菌井冈变种5008(Streptomyceshygroscopicussubsp.Jinggangensis5008)的GH10木聚糖酶(Genbank：AEY92972.1)。对于利用ClustalW算法算得的两者的氨基酸序列的相似性，全长为51％，在GH10催化区域为56％，由此确认了上述ORF为新的序列。
<6>基因克隆
使用由序列号5所示碱基序列构成的正向引物(5’-CACCATGAAGCTCTATCGGTACGGCTTG-3’：在序列号3所示碱基序列的5’末端添加4个碱基(CACC)而成。5’一侧所添加的CACC为用于插入载体的序列。)与由序列号4所示碱基序列构成的反向引物(5’-CTACCTCCCTTTGGCGGCTACATA-3’)，以通过基因组DNA扩增试剂盒(GenomiPhiV2DNA扩增试剂盒，GE医疗社制)扩增的温泉土壤DNA为模板，进行PCR。序列号3所示碱基序列与由序列号2所示碱基序列的第1～24位碱基所构成的部分序列为相同的(同一)碱基序列。此外，序列号4所示碱基序列与由序列号2所示碱基序列的第1,051～1,074位碱基所构成的部分序列为互补的碱基序列。
所扩增的PCR产物插入ChampionpETDirectionalTOPO表达试剂盒(生命技术(LifeTechnologies)社制)的pET101/D-TOPO载体中，转化为OneShotTOP10菌株。通过菌落PCR选择阳性克隆，使用含有100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基，以37℃、200rpm培养17～20小时后，使用小提试剂盒(MiniprepKit，Wizard加SV小提(Minipreps)DNA纯化系统，Promega社制)进行质粒的制备。所制备的质粒用生命技术(LifeTechnologies)社的3730DNA分析测序仪进行序列确认。
通过PCR克隆，从开放阅读框AR19G-10得到AR19G-10-5、AR19G-10-6、AR19G-10-7、AR19G-10-11和AR19G-10-21这5个基因克隆。作为木聚糖酶候选基因的基因克隆AR19G-10-6的碱基序列与开放阅读框AR19G-10(序列号2)完全相同，编码了由357个氨基酸残基构成的多肽(AR19G-10-6)(序列号1)。
图1中示出了基因克隆AR19G-10-6的氨基酸序列与放线菌门吸水链霉菌井冈变种5008(Streptomyceshygroscopicussubsp.Jinggangensis5008)的GH10木聚糖酶的氨基酸序列(序列号6)的比对。在图1中，黑白对比的氨基酸表示这些全部氨基酸序列中的相同氨基酸残基(一致序列)，“-”表示缺失(空位)。
<9>基因表达及木聚糖酶蛋白的纯化
序列确认后，具有目标基因的质粒通过热休克法导入蛋白质表达用大肠杆菌。转化用感受态细胞使用了ChampionpETDirectionalTOPO表达试剂盒(生命技术(LifeTechnologies)社制)中附带的BL21Star(DE3)菌株。将具有目标基因的大肠杆菌接种到含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，培养至OD600＝0.2～0.8左右之后，添加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，进一步培养5～20小时，由此进行目标蛋白质的诱导表达。培养后，进行离心分离回收大肠杆菌，添加培养液的1/10体积的50mMTris-HCl缓冲液(pH8)进行悬浊。然后，使用超声波破碎装置astrason3000(MISONIX社制)，重复7～8次破碎5分钟-暂停5分钟的步骤，得到含有目标蛋白质的基因重组大肠杆菌的粗提物。上述基因重组大肠杆菌粗提物用过滤器(孔径Millipore社制)过滤，将所得滤液作为基因重组大肠杆菌破碎上清液。
将上述基因重组大肠杆菌破碎上清液填充到用50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡的离子交换柱HiTrapQHP(GE医疗社制)中，用中压液相色谱系统AKTAdesign(GE医疗社制)，在含有1MNaCl的50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)中以0～50％的浓度梯度对蛋白质进行分级。将具有木聚糖酶活性的分级收集混合后，通过离心式超滤膜VIVASPIN20(Sartoriusstedim社制)与含有750mM硫酸铵的50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)进行溶液交换。将溶液交换后的木聚糖酶活性分级填充到以相同溶液平衡的疏水相互作用分离柱HiTrapPhennylHP(GE医疗社制)中，通过50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)以0～100％的浓度梯度对蛋白质进行分级。将具有木聚糖酶活性的分级收集混合后，用VIVASPIN20浓缩到液量为8mL左右。将所浓缩的样本添加到由含有150mMNaCl的50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡的凝胶过滤柱Hiload26/60superdex200pg(GE医疗社制)中，通过以2～3mL/分钟的流速流过柱体积的1～1.5倍体积的相同缓冲液来进行分级。将具有木聚糖酶活性的分级收集混合后，进行与50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)的溶液交换和浓缩，得到终浓度约1mg/mL的纯化酶。
通过SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析对基因重组大肠杆菌破碎上清液和纯化酶进行了确认。基因重组大肠杆菌破碎上清液和纯化酶的SDS-PAGE用Mini-PROTEANTGX免染预制胶(伯乐(Bio-Rad)社制)进行。将上述上清液或纯化酶分别与Tris-SDSβME处理液(CosmoBio社制)以1:1混合而成的电泳试样在100℃下处理10分钟后，分别以每个试样10μL基因重组大肠杆菌破碎上清液及每个试样1μL纯化酶进行电泳。电泳终止后，通过CBB染色使蛋白质的条带可视化。
图2中示出了由导入有AR19G-10-6基因的转化大肠杆菌制备的基因重组大肠杆菌破碎上清液和由上述基因重组大肠杆菌破碎上清液纯化而成的纯化酶的SDS-PAGE分析结果。泳道1为蛋白质质量标准，泳道2为基因重组大肠杆菌破碎上清液，泳道3为纯化酶的电泳图案。结果，在上述基因重组大肠杆菌破碎上清液(泳道2)中，确认到由氨基酸序列(序列号1)预测的在质量40.7kDa附近的强条带，在纯化酶(泳道3)中，确认到对应于上述条带的单一条带(图中的箭头)。
<8>木聚糖酶活性测定(木聚糖水解活性)
在木聚糖酶活性测定中，使用木聚糖(Xylan，来源于榉木，Sigma社制)作为底物。将木聚糖溶于水，以其相对于总质量为1质量％的方式配制溶液，所得溶液(下面有时称为“1质量％的木聚糖水溶液”)用作底物溶液。另外，以下实验中使用的木聚糖水溶液全都使用了通过上述方法制备的1质量％的木聚糖水溶液。
对AR19G-10-6基因编码的酶蛋白(AR19G-10-6)的木聚糖酶活性进行了研究。具体而言，将100μL1质量％的木聚糖水溶液、50μL200mM磷酸缓冲液(pH6.0)、50μL在上述<7>中得到的基因重组大肠杆菌破碎上清液或2μL由50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释的纯化酶(0.1mg/mL)、以及48μL纯化水构成的混合液在40～99℃反应10分钟。反应中，为了防止木聚糖的沉淀，使用Eppendorf社的恒温混匀器(ThermoMixer，1400rpm)进行搅拌。在整个测算过程中，添加50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)替代基因重组大肠杆菌破碎上清液或纯化酶，将以相同条件反应的混合液作为对照区。另外，底物溶液和酶(基因重组大肠杆菌破碎上清液或纯化酶)在反应温度下分别各自保温5分钟后进行混合，开始反应。反应结束后，向各混合液添加等量的3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS溶液)，在100℃进行5分钟加热处理，冰冷却5分钟后，以17,400g进行5分钟离心，得到上清液。上清液中的还原糖含量是用分光光度计测算540nm的吸光度，使用由木聚糖制作的校准曲线进行计算，由与对照区的差求得通过酶的水解生成的还原糖含量。以1分钟生成1μmol还原糖(ReducedSugar)的酶活性为1U，除以蛋白质量得到的值为比活性(U/mg)。
其结果，在使用基因重组大肠杆菌破碎上清液和使用纯化酶的两种情况下均确认到具有木聚糖酶活性。
<9>AR19G-10-6的底物特异性
对于AR19G-10-6基因编码的酶蛋白(AR19G-10-6)，研究其相对于各种纤维素底物及半纤维素底物的水解活性。测算使用了在上述<7>中得到的纯化酶(约1mg/mL)被50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释而成的纯化酶溶液(0.1mg/mL)。此外，作为底物，使用了PSA、Avicel粉末(微晶纤维素粉末，Merck社制)、CMC(Sigma社制)、木聚糖(来源于榉木，Sigma社制)、地衣多糖(MPBiomedicals社制)、海带多糖(来源于掌状海带，Sigma社制)、PNPX(Sigma社制)、PNPG(Sigma社制)。
PSA是通过Avicel粉末(微晶纤维素粉末，Merck社制)一溶解到磷酸溶液后即添加灭菌蒸馏水(purifiedwater)而析出，然后对其进行清洗直至pH达到5以上而制备的。另外，以下实验中使用的PSA全都是通过上述方法制备的。
具体而言，首先，作为反应液，将由50μL200mM的磷酸缓冲液(pH6.0)、5μL纯化酶溶液(0.1mg/mL)和45μL纯化水构成的混合液在90℃预温育5分钟后，进一步添加100μL保温于90℃的各底物溶液(PSA、Avicel粉末、CMC、木聚糖、地衣多糖和海带多糖为1质量％水溶液，PNPX和PNPG为20mM水溶液)，所得混合液在90℃温育10分钟，由此进行酶反应。反应中，为了防止不溶性底物的沉淀，利用恒温混匀器(ThermoMixer，Eppendorf社制)对混合液进行1400rpm的振荡来对其进行搅拌。
反应结束后，在以PSA、Avicel粉末、CMC、木聚糖、地衣多糖或海带多糖为底物的反应中，以与上述<8>的研究AR19G-10-6的木聚糖酶活性时相同的方式，测定反应后的混合液的上清液的540nm的吸光度，计算通过酶的水解生成的还原糖含量，求得比活性(U/mg)。然而，对于通过木聚糖之外的底物的水解生成的还原糖含量，使用由葡萄糖制作的校准曲线进行计算。在PNPG或PNPX为底物的反应中，反应结束后，通过向各混合液添加等量的0.2MNa2CO3溶液进行搅拌，使反应停止，然后对其进行离心，得到上清液。上清液中的对硝基苯含量是用分光光度计测算420nm的吸光度，使用由预先制作的对硝基苯含量与420nm的吸光度的校准曲线进行计算，由与对照区的差求得通过酶的水解生成的对硝基苯含量。以1分钟生成1μmol对硝基苯的酶活性为1U，除以蛋白质量得到的值为比活性(U/mg)。
各个测算通过3次独立的试验进行，求取平均值和标准误差(standarderrors)。测定结果示于图3中。其结果，AR19G-10-6表现出对于木聚糖的高水解活性(215.9U/mg蛋白质)。另一方面，对于其他底物，几乎没有表现出分解活性。
<10>以木聚糖为底物的木聚糖酶活性的温度及pH依赖性
对AR19G-10-6基因编码的酶蛋白(AR19G-10-6)的木聚糖酶活性的温度依赖性及pH依赖性进行了研究。测算中使用了在上述<7>中得到的纯化酶(约1mg/mL)被50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释为0.1mg/mL的纯化酶溶液。
纯化的AR19G-10-6的木聚糖酶活性的温度依赖性的测定除了使反应温度为40、50、60、70、75、80、85、90、95或99℃来进行之外，以与上述<8>相同的方式进行，求得因水解生成的还原糖含量，算出木聚糖酶活性(U/mg)。
纯化的AR19G-10-6的木聚糖酶活性的pH依赖性的测定除了将由100μL1质量％的木聚糖水溶液、50μLMcIlvaine缓冲液(pH3～8)、45μL纯化水和5μL纯化酶溶液(0.1mg/mL)构成的混合液在90℃反应10分钟之外，以与上述<8>相同的方式进行，求得因水解生成的还原糖含量，算出木聚糖酶活性(U/mg)。
测算结果示于图4和图5中。图4为以温度为横轴表示各温度的纯化酶AR19G-10-6的木聚糖酶活性(pH6.0)的测算结果的图，图5为以pH为横轴表示各pH的纯化酶AR19G-10-6的木聚糖酶活性(90℃)的测算结果的图。pH标绘出底物、缓冲液和酶的混合液的测量值。
纯化酶AR19G-10-6在40～99℃的温度范围为表现出木聚糖酶活性(图4)。表现出最高活性的最适温度(Topt)是在pH6.0时为90℃。AR19G-10-6的木聚糖酶活性即使在将酶反应温度设为95℃以上，也没有观察到活性的大幅降低，在99℃仍保持了最适温度的活性的80％以上。
此外，纯化酶AR19G-10-6在反应温度90℃下、pH4.0～8.0的范围内表现出木聚糖酶活性。纯化酶AR19G-10-6的最适pH在90℃为pH5.7(底物、缓冲液和酶的混合液的测量值)
<11>利用差示扫描荧光测定法(Differentialscanningfluorimetry)进行的木聚糖酶的热稳定性测定
差示扫描荧光测定法(DSF)是使用了荧光色素和实时PCR装置的、测算蛋白质的热变性的方法之一，可以应用于各种蛋白质。SYPROOrange等用于DSF的荧光色素在与疏水性部位结合的非极性条件下发出荧光，另一方面，在溶于水的极性条件下抑制发光。通常，蛋白质在其热变性温度下折叠结构发生解聚，内部的疏水性部位暴露于蛋白质表面。若此暴露的疏水性部分与SYPROOrange结合，则通过波长470～480nm的激发光，发出在波长595nm附近具有峰的强荧光。使蛋白质溶液的温度以一定的间隔逐步升高，测算荧光强度，由此算出热解温度(＝荧光强度的变化点)。
测量中使用了在<7>中得到的纯化酶(1mg/mL)。
具体而言，在96孔PCR板(Multiplate96孔板MLL-9651，伯乐社制)的孔中，加入2μL经过10倍稀释的SYPROOrange(生命技术社制)、1μL浓度为1mg/mL的纯化酶、5μL200mM磷酸缓冲液(pH6.0)、以及12μL纯化水，使各孔的容积为20μL。PCR板用平顶8联管盖(OpticalFlat8-CapStrips，伯乐社制)密封，使用实时PCR装置(CFX96Touch实时PCR系统，伯乐社制)，每次0.2℃，使孔的温度从30℃升高至100℃，达到目标温度后再经过10秒后，同时测算各孔的荧光强度。用波长带450～490nm的光的发光二极管(LED)激发SYPROOrange，SYPROOrange发射光通过560～580nm范围的带通滤波器，用CCD摄像机进行荧光强度的测算，荧光强度变化以温度的函数的形式标绘。使用实时PCR所附带的分析软件CFXManager(伯乐社制)进行数据解析。各个测算通过3次独立的试验进行。
图6中示出了由DSF法测得的AR19G-10-6酶蛋白显示的、伴随热变性而引发的SYPROOrange的荧光强度变化。图6的上图为测量数据，图6的下图中示出了图6的上图的荧光强度变化曲线的一级微分“-d(荧光)/dt”。热变性温度(meltingtemperature；Tm值)定义为作为温度函数的荧光强度曲线的一级微分(图6的下图的Y轴所示“-d(荧光)/dt”)的极大值。AR19G-10-6酶蛋白的荧光强度的一级微分在91℃附近和94℃附近显示出峰，表示在这些温度下发生了热变性。AR19G-10-6酶蛋白的热变性温度的平均值Tm分别为91.1℃±0.1、94.3℃±0.1(n＝3)，表现为与由木聚糖酶活性求得的上述酶的最适温度Topt＝90℃相近的值。

Claims (10)

1.一种耐热性木聚糖酶，其特征在于具有由下述(A)、(B)或(C)构成的木聚糖酶催化区域：
(A)由序列号1所示氨基酸序列构成的多肽；
(B)由序列号1所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的、且至少在90℃、pH6.0的条件下具有木聚糖酶活性的多肽；
(C)由与序列号1所示氨基酸序列具有75％以上序列一致性的氨基酸序列构成的、并且至少在90℃且pH6.0的条件下具有木聚糖酶活性的多肽。
2.根据权利要求1所述的耐热性木聚糖酶，其在pH6.0且60～99℃下表现出木聚糖酶活性。
3.一种多核苷酸，其具有由下述(a)～(e)中碱基序列构成的编码木聚糖酶催化区域的区域：
(a)编码由序列号1所示氨基酸序列构成的多肽的碱基序列；
(b)编码由序列号1所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的、并且至少在90℃且pH6.0的条件下具有木聚糖酶活性的多肽的碱基序列；
(c)编码由与序列号1所示氨基酸序列具有75％以上序列一致性的氨基酸序列构成的、并且至少在90℃且pH6.0的条件下具有木聚糖酶活性的多肽的碱基序列；
(d)编码与序列号2所示氨基酸序列具有75％以上序列一致性、并且至少在90℃且pH6.0的条件下具有木聚糖酶活性的多肽的碱基序列；
(e)编码与由序列号2所示碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下进行杂交的多核苷酸的碱基序列、且至少在90℃且pH6.0的条件下具有木聚糖酶活性的多肽的碱基序列。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中，所述多肽在pH6.0且60～99℃下表现出木聚糖酶活性。
5.一种表达载体，其整合了根据权利要求3或4所述的多核苷酸，在宿主细胞中可表达具有木聚糖酶活性的多肽。
6.一种转化体，其导入有根据权利要求5所述的表达载体。
7.根据权利要求6所述的转化体，其为真核微生物。
8.一种耐热性木聚糖酶的制造方法，其包括在根据权利要求6或7所述的转化体中生产耐热性木聚糖酶。
9.一种糖苷水解酶混合物，其包含根据权利要求1或2所述的耐热性木聚糖酶、根据权利要求3或4所述的多核苷酸编码的耐热性木聚糖酶、或者利用根据权利要求8所述的耐热性木聚糖酶的制造方法制得的耐热性木聚糖酶及至少一种其他糖苷水解酶。
10.一种木质纤维素分解产物的制造方法，其包括使含有包含木聚糖的半纤维素的木质纤维素所形成的材料与根据权利要求1或2所述的耐热性木聚糖酶、根据权利要求3或4所述的多核苷酸编码的耐热性木聚糖酶、根据权利要求6或7所述的转化体、利用根据权利要求8所述的耐热性木聚糖酶的制造方法制得的耐热性木聚糖酶、或者根据权利要求9所述的糖苷水解酶混合物接触，由此生产木质纤维素分解产物。
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