CN109988723B

CN109988723B - 一株产硫酸软骨素abc裂解酶的重组酵母菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN109988723B
Application number: CN201811425963.0A
Authority: CN
Inventors: 吴凌天; 郗栋南; 赖淑涵; 朱益波; 刘欣雨; 霍薪宇; 刘学润
Original assignee: Changshu Institute of Technology
Current assignee: Changshu Institute of Technology
Priority date: 2018-11-27
Filing date: 2018-11-27
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2038-11-27
Also published as: CN109988723A

Abstract

本发明公开了一株产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明将来源于普通变形杆菌Proteus vulgaris ATCC33420的硫酸软骨素ABC裂解酶进行异源表达，选取pPIC9K载体，通过甲醇进行诱导，实现了硫酸软骨素ABC裂解酶在毕赤酵母GS115中的分泌表达，并通过设计的硫酸软骨素ABC裂解酶‑酶膜反应器实现了小分子硫酸软骨素的高效连续生产，并使硫酸软骨素ABC裂解酶得到了循环利用，大大降低了生产成本。本发明以食品级酵母菌作为宿主菌株，安全可靠，为工业化绿色生产小分子硫酸软骨素A、B和C提供了有效的参考与借鉴，同时节能减排，经济效益和社会效益显著。

Description

一株产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌及其构建方法与应用。

背景技术

硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate)D-葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺的共聚物的硫酸酯盐，共聚物内六碳糖通过β-(1,4)和β-(1,3)糖苷键交替连接，一般约含50～70个双糖单位，分子量在10kDa～50kDa之间。硫酸软骨素作为医疗药物，它们具有降血脂、抗血栓、抗肿瘤、治疗关节炎、动脉硬化、心脑血管疾病、听觉障碍、肾炎、肝炎以及神经痛等作用，还可用作滴眼剂；作为食品添加剂，硫酸软骨素可用于食品的乳化、保湿和祛除异味。

表1硫酸软骨素分类

目前工业生产硫酸软骨素的方法通常包括碱法、酶法、中性盐法以及碱盐法等，虽然工艺不同，但硫酸软骨素分子量一般为10kDa～50kDa，此类硫酸软骨素因分子量较大，人体吸收及生物利用度较低，严重影响了硫酸软骨素的疗效。大量的研究文献证明，分子量在2000Da左右的硫酸软骨素吸收率和生物利用度最好。因此，制备小分子硫酸软骨素具有重要意义。

制备小分子硫酸软骨素的方法有物理降解法、化学降解法、酶解法。物理法主要为加热、机械剪切、超声波破碎和、γ-射线辐照等，可促使硫酸软骨素发生降解。虽然物理降解法处理过程简单，产品易于回收，但是存在一定的缺陷，例如加热法易使产品变色，超声效率较低，γ-射线辐照残留，且产品的稳定性差、分子量范围较大。化学降解方法有水解法和氧化降解法，水解法包括酸水解和碱水解，氧化降解常用的氧化剂为次氯酸钠和过氧化氢。但是，化学降解法引入了化学试剂，反应条件复杂，易给产品的生物活性带来影响和产品的纯化带来困难，且产生大量的工业废水。而酶法降解由于其反应条件温和、便于检测以及生物活性保持较好等特点，成为近年来小分子硫酸软骨素的研究的热点。

硫酸软骨素ABC裂解酶(Chondroitinase,ChSase)是一类能将硫酸软骨素等糖胺聚糖降解为不饱和二糖及寡糖的裂解酶。根据其作用底物的不同分为ChSase ABC,ChSaseAC,ChSase B和ChSase C。硫酸软骨素ABC裂解酶产生菌如表1所示，其中普通变形杆菌Proteus vulgaris是ChSase ABC的主要来源。

表1硫酸软骨素ABC裂解酶产生菌

目前对于ChSase ABC的重组表达研究较少，Prabhakar等虽然构建了Escherichiacoli BL21(DE3)-pET-28a-csl ABC，但是仅仅得到少量的可溶性蛋白，大多的ChSase ABC以包涵体的形式存在。李晔等虽然将P.vulgaris KCTC2579来源的ChSase ABC基因通过融合标签甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH和麦芽糖结合蛋白MBP在E.coli中得到可溶性表达，但是融合标签的存在影响了酶的相关性质。此外，小分子量硫酸软骨素一般用于医药和食品领域，因此大肠杆菌表达的ChSase ABC并不适用于小分子量硫酸软骨素的制备。高慧玲等虽然建立了ChSase ABC分泌型真核表达载体，结果以分泌形式表达，但是人胶质瘤细胞TJ905生产周期较长且培养条件苛刻不适合工业化应用。

综上所述，国内对于ChSase ABC的发酵生产主要的问题是：发酵生产ChSaseABC酶活偏低，且多为胞内表达，而破碎过程必定会增加生产成本。因此，构建以分泌型生产ChSase ABC的菌株具有更重要的经济、社会和环境意义。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是，提供一株产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌，实现了ChSase ABC的分泌表达，解决了ChSase ABC以包涵体存在的生产问题。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌在制备小分子硫酸软骨素A、小分子硫酸软骨素B、小分子硫酸软骨素C中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一株产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌，该重组酵母菌中导入了硫酸软骨素ABC裂解酶基因，所述硫酸软骨素ABC裂解酶基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

上述产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌的构建方法，包括如下步骤：将SEQIDNO.1所示的硫酸软骨素ABC裂解酶基因导入pPIC9K质粒，所述得到重组质粒，将重组质粒转化酵母菌，既得到产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌。

其中，所述的酵母菌为毕赤酵母Pichia pastoris GS115。

上述产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌在制备硫酸软骨素ABC裂解酶、小分子硫酸软骨素中的应用在本发明的保护范围之内。

.一种小分子硫酸软骨素的生产方法，该方法包括如下步骤：

(1)基因工程菌的构建(见附图1)

根据已报道的Proteus vulgaris ATCC33420来源的硫酸软骨素ABC裂解酶基因序列，设计引物通过体外扩增法得到SEQID NO.1所示的基因序列。用限制性内切酶EcoRI和NotI将上述PCR产将和质粒pPIC9K分别进行双酶切，在将酶切后的2个基因片段用T₄DNA连接酶连接，即得到重组质粒pPIC9K-csl ABC；再将重组质粒转化酵母菌，即得到重组酵母菌。

(2)硫酸软骨素ABC裂解酶的诱导表达(见附图2)

将构建的重组酵母接种于YPD液体中培养基中，28℃过夜培养；再以4％接种量转接到发酵培养基中，发酵培养至OD₆₆₀达到3～8时，将发酵液离心，弃发酵上清液，重组酵母细胞用产酶培养基重悬，加入5～30g/L甲醇诱导硫酸软骨素ABC裂解酶表达，诱导4～6天。

(3)小分子硫酸软骨素制备

(3a-1)小分子硫酸软骨素A的连续降解

将粗品硫酸软骨素A粉末配置成水溶液，泵入酶膜反应器的降解反应釜10中，向其中加入硫酸软骨素ABC裂解酶，使硫酸软骨素ABC裂解酶的总酶活与硫酸软骨素质量的比例为1×10⁴～6×10⁴U：1kg，控制转速50～200rpm，温度20～40℃。当降解反应进行0.5h后，开启超滤膜系统，小分子硫酸软骨素透过超滤膜进入浓缩釜13中，大分子硫酸软骨素被截留返回到降解反应釜中继续降解，硫酸软骨素ABC裂解酶则被截留返回到降解反应釜中循环利用。当浓缩釜中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启纳滤系统，水分子透过纳滤膜进入降解反应釜中被循环利用，小分子硫酸软骨素被截留返回到浓缩釜中继续浓缩。

硫酸软骨素降解完成的确定方法：以CPC滴定法测定降解反应釜中硫酸软骨素的浓度小于降解前硫酸软骨素浓度的10％，即降解完成。

(3a-2)小分子硫酸软骨素B的连续降解

将粗品硫酸软骨素B粉末配置成水溶液，泵入酶膜反应器的降解反应釜10中，向其中加入硫酸软骨素ABC裂解酶，使硫酸软骨素ABC裂解酶的总酶活与硫酸软骨素质量的比例为1×10⁴～6×10⁴U：1kg，控制转速50～200rpm，温度20～40℃。当降解反应进行0.5h后，开启超滤膜系统，小分子硫酸软骨素透过超滤膜进入浓缩釜中，大分子硫酸软骨素被截留返回到降解反应釜中继续降解，硫酸软骨素ABC裂解酶则被截留返回到降解反应釜中循环利用。当浓缩釜中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启纳滤系统，水分子透过纳滤膜进入降解反应釜中被循环利用，小分子硫酸软骨素被截留返回到浓缩釜中继续浓缩。

(3a-3)小分子硫酸软骨素C的连续降解

将粗品硫酸软骨素C粉末配置成水溶液，泵入酶膜反应器的降解反应釜10中，向其中加入硫酸软骨素ABC裂解酶，使硫酸软骨素ABC裂解酶的总酶活与硫酸软骨素质量的比例为1×10⁴～6×10⁴U：1kg，控制转速50～200rpm，温度20～40℃。当降解反应进行0.5h后，开启超滤膜系统，小分子硫酸软骨素透过超滤膜进入浓缩釜中，大分子硫酸软骨素被截留返回到降解反应釜中继续降解，硫酸软骨素ABC裂解酶则被截留返回到降解反应釜中循环利用。当浓缩釜中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启纳滤系统，水分子透过纳滤膜进入降解反应釜中被循环利用，小分子硫酸软骨素被截留返回到浓缩釜中继续浓缩。

(3b)除菌：对步骤(3a-1)、(3a-2)以及(3a-3)浓缩釜13中得到的纳滤截留液I、Ⅱ和ⅠII分别进行除菌处理，得到无菌滤液I、Ⅱ和ⅠII；

(3c)浓缩：将步骤(3b)得到无菌滤液I、Ⅱ和ⅠII分别通过三效浓缩器浓缩，得到无菌浓缩液I、Ⅱ和ⅠII；

浓缩完成的确定方法：小分子硫酸软骨素A、B、C的浓度在300～350g/L时，即浓缩完成。

(3d)干燥：将步骤(3c)得到的无菌浓缩液I、Ⅱ和ⅠII分别加入喷雾干燥塔内，进风温度185℃，出风温度90℃，进行干燥，得到小分子硫酸软骨素A、B和C成品；

其中，步骤(2)中，所述的产酶培养基优选成分为：无氨基酸酵母氮源13.4g/L，生物素0.0004g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，磷酸氢二钾2.3g/L，磷酸二氢钾11.8g/L，pH6.0。

其中，步骤(2)中，所述的重组酵母菌表达硫酸软骨素ABC裂解酶的时机是OD₆₆₀为3～8，优选5～6；诱导剂甲醇浓度为5～30g/L，优选10～15g/L；所述优选诱导表达时间为4～5天。

其中步骤(3a-1)、(3a-2)以及(3a-3)中，所述的硫酸软骨素A、B、C的优选浓度为60

～100g/L；硫酸软骨素ABC裂解酶优选添加量为2.5×10⁴U：1kg；酶膜反应器中超滤膜系统12的优选操作压力为0.05～0.15MPa；酶膜反应器中超滤膜系统14的优选操作压力为0.05～0.10MPa；酶膜反应器中超滤膜系统12和超滤膜系统14的优选循环流速为5～8L/min；

其中，步骤(3b)中，所述除菌处理，是利用0.01～0.22μm除菌膜过滤除菌，优选0.1μm的金属除菌过滤器。

其中，步骤(3c)中，所述的三效浓缩器浓缩，其浓缩条件为：一效温度85～90℃，二效温度80～85℃，三效温度65～70℃，真空度为0.03～0.05MPa。

有益效果：

1、本发明采用食品级毕赤酵母GS115作为生产菌株，可满足医疗卫生和食品安全的要求，无内毒素和病原感染的风险，安全无毒，操作简单，为重组毕赤酵母GS115工业化生产小分子硫酸软骨素A、B、C提供了借鉴。

2、本发明设计的硫酸软骨素ABC裂解酶-酶膜反应器，避免了酶的固定化操作，并使游离硫酸软骨素ABC裂解酶得到了重复利用，有效降低了生产成本。

3、本发明通过生物降解法，制备了小分子硫酸软骨素A、B、C，减少了高温高压、强酸强碱的极端生产过程，符合节约资源，环境友好的生产理念。

4、本发明将生物降解法替代了物理降解法和化学降解法制备硫酸软骨素A、B、C的工艺，有效的保证了产品的生物活性和物理化学性质。

5、本发明利用除菌膜对小分子硫酸软骨素A、B、C溶液进行灭菌处理，使其微生物指标达到检测标准，避免了传统辐照灭菌引起的产品物理性状的改变。

6、本发明设计的酶膜反应器可以根据生产要求更改中膜分离系统12中超滤膜的膜孔径大小，实现硫酸软骨素A、B、C分子量的可控连续生产。

附图说明

图1重组pPIC9K-csl ABC构建流程图；

图2硫酸软骨素ABC裂解酶SDS-PAGE电泳图；

图3酶膜反应器结构示意图；

图4酶膜反应器操作稳定性(批次反应收率)。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

图3中，1-1、1-2为温度传感器，2-1、2-2为电机，3-1～3-11为调节阀，4-1～44-4恒流泵，5原料/物料进口，6-1、6-2为空气阀，7为清水进口，8-1、8-2为夹套，9-1、9-2为搅拌器，13为浓缩福，14为纳滤膜组件，14-1/14-2为纳滤进/出口，15-1、15-2为物料出口，16为超滤回流出口，17为纳滤回流出口。

本发明中所述的酶膜反应器包括如下部件：

降解反应釜(10)、超滤膜组件(12)、浓缩釜(13)和膜过滤组件(14)；

所述降解反应釜(10)包括：夹套(8-1)、搅拌桨(9-1)、电机(2-1)、温度传感器(1-1)，所述夹套(8-1)包覆在降解反应釜(10-1)的外部，所述搅拌桨(9-1)与电机(2-1)连接，所述搅拌桨(9-1)、温度传感器(1-1)伸入反应釜(10-1)的内部，所述降解反应釜(10-1)的上部设有反应液出口管道，所述反应液出口管道与超滤膜组件(12)的一端连接，所述反应液出口管道上设有料液出口(15-1)；

所述超滤膜组件(12)包括：超滤液进口(12-1)、超滤液出口(12-2)，所述超滤膜组件(12)内设有超滤膜，所述超滤膜的孔径为1000Da、2000Da、2500Da、3000Da或者5000Da，所述超滤液进口(12-1)与反应液出口管道连接，所述超滤液出口(12-2)通过管道与浓缩釜(13)连接，所述超滤膜组件(12)上设有超滤回流出口(16)，所述超滤回流出口(16)通过管道与降解反应釜(10-)连接；

所述浓缩釜(13)包括：夹套(8-2)、搅拌桨(9-2)、电机(2-2)、温度传感器(1-2)，所述夹套(8-2)包覆在浓缩釜(13)的外部，所述搅拌桨(9-2)与电机(2-2)连接，所述搅拌桨(9-2)、温度传感器(1-2)伸入浓缩釜(13)的内部，所述浓缩釜(13)上设有清水进入管道(7)；

所述膜过滤组件(14)包括进口(14-1)和出口(14-2)，所述膜过滤组件(14)中设有纳滤膜或超滤膜，所述纳滤膜的孔径为300Da～1000Da，所述超滤膜的孔径为10KDa～50kDa；所述膜过滤组件(14)的进口(14-1)通过管道与浓缩釜(13)连接。

实施例1：重组毕赤酵母GS115的构建

硫酸软骨素ABC裂解酶基因的扩增：以Proteus vulgaris ATCC33420的基因组为模板，扩增硫酸软骨素ABC裂解酶基因片段。PCR扩增体系为基因组DNA 1μL，引物1和引物2各4μL，KOD聚合酶50μL,ddH₂O 41μL，PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性2min；然后60℃退火30s，72℃延伸3min，循环35次；72℃延伸l min。将PCR产物经凝胶电泳后切胶，用柱式割胶回收试剂盒回收，得到纯化的硫酸软骨素ABC裂解酶基因片段。

表1重组毕赤酵母GS115的构建所需引物

硫酸软骨素ABC裂解酶基因的双酶切：双酶切体系为10×QuickCut Green Buffer10μL，已纯化的硫酸软骨素ABC裂解酶基因片段86μL，QuickCut EcoRI和QuickCut NotI各2μL，将上述加入离心管中，轻轻混匀后瞬时离心，37℃保温20min。将酶切产物经凝胶电泳后切胶，用柱式割胶回收试剂盒回收，得到酶切的硫酸软骨素ABC裂解酶基因片段。

线性化pPIC9K载体的制备：双酶切体系为10×QuickCut Green Buffer 10μL，pPIC9K环状质粒86μL，QuickCut EcoRI和QuickCut NotI各2μL，将上述加入离心管中，轻轻混匀后瞬时离心，37℃保温20min。将酶切产物经凝胶电泳后切胶，用柱式割胶回收试剂盒回收，得到线性化pPIC9K载体。

重组质粒pPIC9K-csl ABC的构建(见附图1)：将线性化pPIC9K载体和酶切的硫酸软骨素ABC裂解酶基因片段通过T₄DNA连接酶过夜环化连接，将环化产物连接加入100μL感受态DH 5α细胞中，冰浴30min，42℃水浴热激90s，快速置于冰上1～3min。加入新鲜的LB液体培养基800μL，于37℃振荡培养45min，取200μL菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基表面，37℃培养12～16h。将阳性菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养并提取质粒，送测序公司测序确认，重组质粒pPIC9K-csl ABC构建成功。

重组毕赤酵母GS115构建：吸取5μL线性化的pPIC9K-csl ABC质粒加入100μL毕赤酵母GS115感受态中，冰上放置15min，迅速加入0.2cm的电击杯中进行电击，迅速加入山梨醇，涂布与含有遗传霉素抗性的MD固体平板，28℃培养2～3天。将阳性菌落接种于含有遗传霉素抗性的MD液体培养基中培养。经酶活测定结果可知，该阳性克隆菌落含有DNA片段插入质粒，即构建完成含硫酸软骨素ABC裂解酶基因的重组毕赤酵母GS115。

实施例2：硫酸软骨素ABC裂解酶的诱导表达(见附图2)

将构建的重组毕赤酵母GS115-pPIC9K-csl ABC接种于YPD液体中培养基中，28℃过夜培养；再以4％接种量转接到1L发酵培养基中，发酵培养至OD₆₆₀达到5时，无菌条件下将发酵液离心，弃发酵上清液，重组毕赤酵母GS115-pPIC9K-csl ABC细胞产酶培养基重悬，加入10g/L甲醇(每天补加)诱导硫酸软骨素ABC裂解酶的分泌表达，培养5天后，发酵液中酶活力可达8U/mL。

实施例3：发酵液的硫酸软骨素ABC裂解酶酶活测定

取1mL的发酵液离心，分别取0.1mL上清液和7.9mL 1g/L硫酸软骨素A(0.02mol/LTris-HCL配制，pH7.5)，加入到15mL的比色管中，置于28℃水浴锅中反应20min，立即置于沸水浴中煮沸5min，对照管以相同的条件加入灭活的发酵液上清液，在232nm处测定光吸收值。酶的活力单位U定义为28℃条件下，每分钟催化形成1μmol不饱和双糖所需的酶量。

实施例4：小分子硫酸软骨素A制备。

将1000L100g/L的硫酸软骨素A溶液泵入酶膜反应器的降解反应釜10中，并加入1×10⁴U的硫酸软骨素ABC裂解酶，50rpm，30℃条件下进行反应。降解0.5h后，开启超滤膜系统12(膜孔径为2000Da)，实现小分子硫酸软骨素与硫酸软骨素的分离。当浓缩釜13中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启纳滤浓缩系统，将小分子硫酸软骨素溶液浓缩。对小分子硫酸软骨素溶液浓缩进行灭菌处理，再将其通过三效浓缩器继续浓缩后用喷雾干燥塔进行干燥，得到无菌小分子硫酸软骨素A成品89.25kg，产品收率为89.25％，平均分子量为1800Da。

如需制备其他分子量的硫酸软骨素A，只需更换酶膜反应器中超滤系统12的超滤膜即可实现。

实施例5：小分子硫酸软骨素B制备。

将1000L 60g/L的硫酸软骨素B溶液泵入酶膜反应器的降解反应釜10中，并加入3×10⁴U的硫酸软骨素ABC裂解酶，50rpm，30℃条件下进行反应。降解0.5h后，开启超滤膜系统12(膜孔径为3000Da)，实现小分子硫酸软骨素与硫酸软骨素的分离。当浓缩釜13中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启纳滤浓缩系统，将小分子硫酸软骨素溶液浓缩。对小分子硫酸软骨素溶液浓缩进行灭菌处理，再将其通过三效浓缩器继续浓缩后用喷雾干燥塔进行干燥，得到无菌小分子硫酸软骨素B成品53.13kg，产品收率为88.55％，平均分子量为2900Da。

如需制备其他分子量的硫酸软骨素B，只需更换酶膜反应器中超滤系统12的超滤膜即可实现。

实施例6：小分子硫酸软骨素C制备。

将1000L 80g/L的硫酸软骨素C溶液泵入酶膜反应器的降解反应釜10中，并加入2×10⁴U的硫酸软骨素ABC裂解酶，50rpm，30℃条件下进行反应。降解0.5h后，开启超滤膜系统12(膜孔径为2000Da)，实现小分子硫酸软骨素与硫酸软骨素的分离。当浓缩釜13中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启纳滤浓缩系统，将小分子硫酸软骨素溶液浓缩。对小分子硫酸软骨素溶液浓缩进行灭菌处理，再将其通过三效浓缩器继续浓缩后用喷雾干燥塔进行干燥，得到无菌小分子硫酸软骨素C成品73.49kg，产品收率为91.86％，平均分子量为1960Da。

如需制备其他分子量的硫酸软骨素C，只需更换酶膜反应器中超滤系统12的超滤膜即可实现。

实施例7：小分子硫酸软骨素的连续生产

其他操作步骤均与实施例4、5、6相同，所不同的是，在第一批次降解反应完成之后，继续向降解反应釜10中投料，且投料量不变，但硫酸软骨素ABC裂解酶不再添加，后续降解反应所需硫酸软骨素ABC裂解酶实质是将第一批次降解反应的酶进行循环利用，即小分子硫酸软骨素的连续批次生产。但随着酶的逐渐失活，后续批次降解反应所需时间逐渐增长，当降解反应时间延长为原来1倍时，向降解反应釜10中加入与第一批次等酶活的硫酸软骨素ABC裂解酶。

实施例8：酶膜反应器的操作稳定性

其他操作步骤均与实施例4、5、6相同，所不同的是，对酶膜反应器的操作稳定性进行考察。生产中酶膜反应器中的硫酸软骨素ABC裂解酶是反复使用的，在连续投料(投料量不变，降解时间不变)6批次情况下，分别考察小分子硫酸软骨素的收率(见附图4)，酶膜反应器在制备小分子硫酸软骨素A、B、C时均具有较好的操作稳定性。

序列表

<110> 常熟理工学院

<120> 一株产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌及其构建方法与应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2994

<212> DNA

<213> 变形普通杆菌ATCC33420(Proteus vulgaris ATCC33420)

<400> 1

gccaccagca atcctgcatt tgatcctaaa aatctgatgc agtcagaaat ttaccatttt 60

gcacaaaata acccattagc agacttctca tcagataaaa actcaatact aacgttatct 120

gataaacgta gcattatggg aaaccaatct cttttatgga aatggaaagg tggtagtagc 180

tttactttac ataaaaaact gattgtcccc accgataaag aagcatctaa agcatgggga 240

cgctcatcta cccccgtttt ctcattttgg ctttacaatg aaaaaccgat tgatggttat 300

cttactatcg atttcggaga aaaactcatt tcaaccagtg aggctcaggc aggctttaaa 360

gtaaaattag atttcactgg ctggcgtact gtgggagtct ctttaaataa cgatcttgaa 420

aatcgagaga tgaccttaaa tgcaaccaat acctcctctg atggtactca agacagcatt 480

gggcgttctt taggtgctaa agtcgatagt attcgtttta aagcgccttc taatgtgagt 540

cagggtgaaa tctatatcga ccgtattatg ttttctgtcg atgatgctcg ctaccaatgg 600

tctgattatc aagtaaaaac tcgcttatca gaacctgaaa ttcaatttca caacgtaaag 660

ccacaactac ctgtaacacc tgaaaattta gcggccattg atcttattcg ccaacgtcta 720

attaatgaat ttgtcggagg tgaaaaagag acaaacctcg cattagaaga gaatatcagc 780

aaattaaaaa gtgatttcga tgctcttaat attcacactt tagcaaatgg tggaacgcaa 840

ggcagacatc tgatcactga taaacaaatc attatttatc aaccagagaa tcttaactct 900

caagataaac aactatttga taattatgtt attttaggta attacacgac attaatgttt 960

aatattagcc gtgcttatgt gctggaaaaa gatcccacac aaaaggcgca actaaagcag 1020

atgtacttat taatgacaaa gcatttatta gatcaaggct ttgttaaagg gagtgcttta 1080

gtgacaaccc atcactgggg atacagttct cgttggtggt atatttccac gttattaatg 1140

tctgatgcac taaaagaagc gaacctacaa actcaagttt atgattcatt actgtggtat 1200

tcacgtgagt ttaaaagtag ttttgatatg aaagtaagtg ctgatagctc tgatctagat 1260

tatttcaata ccttatctcg ccaacattta gccttattac tactagagcc tgatgatcaa 1320

aagcgtatca acttagttaa tactttcagc cattatatca ctggcgcatt aacgcaagtg 1380

ccaccgggtg gtaaagatgg tttacgccct gatggtacag catggcgaca tgaaggcaac 1440

tatccgggct actctttccc agcctttaaa aatgcctctc agcttattta tttattacgc 1500

gatacaccat tttcagtggg tgaaagtggt tggaataacc tgaaaaaagc gatggtttca 1560

gcgtggatct acagtaatcc agaagttgga ttaccgcttg caggaagaca cccttttaac 1620

tcaccttcgt taaaatcagt cgctcaaggc tattactggc ttgccatgtc tgcaaaatca 1680

tcgcctgata aaacacttgc atctatttat cttgcgatta gtgataaaac acaaaatgaa 1740

tcaactgcta tttttggaga aactattaca ccagcgtctt tacctcaagg tttctatgcc 1800

tttaatggcg gtgcttttgg tattcatcgt tggcaagata aaatggtgac actgaaagct 1860

tataacacca atgtttggtc atctgaaatt tataacaaag ataaccgtta tggccgttac 1920

caaagtcatg gtgtcgctca aatagtgagt aatggctcgc agctttcaca gggctatcag 1980

caagaaggtt gggattggaa tagaatgcca ggggcaacca ctattcacct tcctcttaaa 2040

gacttagaca gtcctaaacc tcatacctta atgcaacgtg gagagcgtgg atttagcgga 2100

acatcatccc ttgaaggtca atatggcatg atggcattcg atcttattta tcccgccaat 2160

cttgagcgtt ttgatcctaa tttcactgcg aaaaagagtg tattagccgc tgataatcac 2220

ttaattttta ttggtagcaa tataaatagt agtgataaaa ataaaaatgt tgaaacgacc 2280

ttattccaac atgccattac tccaacatta aatacccttt ggattaatgg acaaaagata 2340

gaaaacatgc cttatcaaac aacacttcaa caaggtgatt ggttaattga tagcaatggc 2400

aatggttact taattactca agcagaaaaa gtaaatgtaa gtcgccaaca tcaggtttca 2460

gcggaaaata aaaatcgcca accgacagaa ggaaacttta gctcggcatg gatcgatcac 2520

agcactcgcc ccaaagatgc cagttatgag tatatggtct ttttagatgc gacacctgaa 2580

aaaatgggag agatggcaca aaaattccgt gaaaataatg ggttatatca ggttcttcgt 2640

aaggataaag acgttcatat tattctcgat aaactcagca atgtaacggg atatgccttt 2700

tatcagccag catcaattga agacaaatgg atcaaaaagg ttaataaacc tgcaattgtg 2760

atgactcatc gacaaaaaga cactcttatt gtcagtgcag ttacacctga tttaaatatg 2820

actcgccaaa aagcagcaac tcctgtcacc atcaatgtca cgattaatgg caaatggcaa 2880

tctgctgata aaaatagtga agtgaaatat caggtttctg gtgataacac tgaactgacg 2940

tttacgagtt actttggtat tccacaagaa atcaaactct cgccactccc ttga 2994

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggaattcatg gccaccagca atcctgca 28

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ataagaatgc ggccgctcaa gggagtggcg agag 34

Claims

1.一株产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌，其特征在于，该重组酵母菌中导入了硫酸软骨素ABC裂解酶基因，所述硫酸软骨素ABC裂解酶基因的核苷酸序列如SEQID NO. 1所示；

包括如下步骤：将SEQID NO. 1所示的硫酸软骨素ABC裂解酶基因导入pPIC9K质粒，得到重组质粒，将重组质粒转化酵母菌，既得到产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌；

所述的酵母菌为毕赤酵母Pichia pastoris GS115。

2.权利要求1所述产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌在制备硫酸软骨素ABC裂解酶、小分子硫酸软骨素中的应用。

3.一种小分子硫酸软骨素的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1) 小分子硫酸软骨素制备：

将大分子硫酸软骨素A粉末配置成水溶液，泵入酶膜反应器的降解反应釜（10）中，向其中加入硫酸软骨素ABC裂解酶，使硫酸软骨素ABC裂解酶的总酶活与硫酸软骨素质量的比例为1 × 10⁴ ~ 6 × 10⁴ U：1 kg，控制转速50 ~ 200 rpm，温度20 ~ 40 °C；当降解反应进行0.5 ~ 1.5 h后，开启酶膜反应器的超滤膜系统（12），小分子硫酸软骨素透过超滤膜进入浓缩釜（13）中，大分子硫酸软骨素被截留返回到降解反应釜（10）中继续降解，硫酸软骨素ABC裂解酶则被截留返回到降解反应釜（10）中循环利用；当浓缩釜（13）中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启纳滤系统（14），水分子透过纳滤膜进入降解反应釜（10）中被循环利用，小分子硫酸软骨素被截留返回到浓缩釜（13）中继续浓缩；

(2) 除菌：对步骤(1)浓缩釜（13）中得到的纳滤截留液进行除菌处理，得到无菌滤液；

(3) 浓缩：将步骤(2)得到无菌滤液通过三效浓缩器浓缩，得到无菌浓缩液；

(4) 干燥：将步骤(3)得到的无菌浓缩液加入喷雾干燥塔内，进风温度185 °C，出风温度90 °C，进行干燥，得到小分子硫酸软骨素成品。

4.根据权利要求3所述小分子硫酸软骨素的生产方法，其特征在于，所述硫酸软骨素ABC裂解酶按照如下方法制备：

将权利要求1所述的产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌YPD液体培养基中，28 °C过夜培养至OD₆₆₀值在3 ~ 8，离心，收集菌泥；用产酶培养基重悬重组酵母细胞，每天补加0.5~ 3%的甲醇，28 °C，220 rpm条件下培养3 ~ 7天；

所述产酶培养基的配方如下：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，3 g/L K₂HPO₄，12 g/LKH₂PO₄，13.4 g/L无氨基酸酵母氮源， 4 × 10^-4 g/L生物素，甲醇5 mL/L。

5.根据权利要求3所述小分子硫酸软骨素的生产方法，其特征在于，所述的酶膜反应器包括如下部件：

降解反应釜（10）、超滤膜组件（12）、浓缩釜（13）和膜过滤组件（14）；

所述降解反应釜（10）包括：夹套（8-1）、第一搅拌桨（9-1）、第一电机（2-1）、第一温度传感器（1-1），所述夹套（8-1）包覆在降解反应釜（10）的外部，所述第一搅拌桨（9-1）与第一电机（2-1）连接，所述第一搅拌桨（9-1）、第一温度传感器（1-1）伸入降解反应釜（10）的内部，所述降解反应釜（10）的上部设有反应液出口管道，所述反应液出口管道与超滤膜组件（12）的一端连接，所述反应液出口管道上设有料液出口（15-1）；

所述超滤膜组件（12）包括：超滤液进口（12-1）、超滤液出口（12-2），所述超滤膜组件（12）内设有超滤膜，所述超滤膜的孔径为1000 Da、2000 Da、2500 Da、3000 Da或者5000Da，所述超滤液进口（12-1）与反应液出口管道连接，所述超滤液出口（12-2）通过管道与浓缩釜（13）连接，所述超滤膜组件（12）上设有超滤回流出口（16），所述超滤回流出口（16）通过管道与降解反应釜（10）连接；

所述浓缩釜（13）包括：夹套（8-2）、第二搅拌桨（9-2）、第二电机（2-2）、第二温度传感器（1-2），所述夹套（8-2）包覆在浓缩釜（13）的外部，所述第二搅拌桨（9-2）与第二电机（2-2）连接，所述第二搅拌桨（9-2）、第二温度传感器（1-2）伸入浓缩釜（13）的内部，所述浓缩釜（13）上设有清水进入管道（7）；

所述膜过滤组件（14）包括进口（14-1）和出口（14-2），所述膜过滤组件（14）中设有纳滤膜或超滤膜，所述纳滤膜的孔径为300 Da ~ 1000 Da，所述超滤膜的孔径为10 KDa ~ 50kDa；所述膜过滤组件（14）的进口（14-1）通过管道与浓缩釜（13）连接。

6.根据权利要求3所述小分子硫酸软骨素的生产方法，其特征在于，步骤(2)中，所述除菌处理，是利用0.01 ~ 0.10 μm金属过滤器进行过滤除菌。

7.根据权利要求3所述小分子硫酸软骨素的生产方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的三效浓缩器浓缩，其浓缩条件为：一效温度80 ~ 90℃，二效温度75 ~ 85℃，三效温度60 ~70℃，真空度为0.03 ~ 0.06 MPa。