CN113046340A

CN113046340A - 一种高效木葡聚糖酶及其应用

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Publication number: CN113046340A
Application number: CN202110118862.4A
Authority: CN
Inventors: 周善跃; 孙佳宁; 李保华
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2021-01-28
Filing date: 2021-01-28
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2041-01-28
Also published as: CN113046340B

Abstract

本发明公开了一种高效木葡聚糖酶及其应用，所述高效木葡聚糖酶来源于葡萄垫壳孢菌(Coniella vitis)，选自以下之一：(a)具有SEQ ID N0:3中第19‑390位氨基酸序列的蛋白质；(b)具有如SEQ ID N0:3所示的氨基酸全序列的蛋白质；(c)具有由SEQ ID N0:3所示的全序列或第19‑390位氨基酸序列经过一个或多个氨基酸保守取代、缺失或插入且具有相同功能的蛋白质。本发明还提供了高效木葡聚糖酶的编码基因、含有该基因的重组表达载体、工程菌及其应用。所述高效木葡聚糖酶具有优异的内切木葡聚糖酶活性，酶活性在强酸条件下保持稳定，这个特性完全符合同步糖化发酵工艺的条件需求，作为内切木葡聚糖酶在众多领域具有很高的应用前景。

Description

一种高效木葡聚糖酶及其应用

技术领域

本发明涉及木葡聚糖酶领域，尤其涉及一种高效木葡聚糖酶及其应用。

背景技术

植物细胞壁主要由木质纤维素(约占40％)、半纤维素(约占20-30％) 和木质素(约占20-30％)等构成。纤维素和半纤维素是重要的可再生生物质资源，在生产燃料乙醇等能源领域具有重要用途，能够极大缓解国际能源日益紧缺的紧张局面。我们国家是世界重要的农业大国，农业生产的植物固体废弃物可以提供非常丰富的纤维素和半纤维素资源。

植物细胞壁中纤维素被半纤维素所包埋，这种结构组成决定了植物细胞壁的充分降解必须首先降解外围的半纤维素，使纤维素充分暴露后才能最大限度的降解利用。木葡聚糖是一种重要的半纤维素，是组成高等植物初生细胞壁的主要成分(约占20-25％)。木葡聚糖交联结合结晶纤维素，使得植物细胞壁中的纤维素难以被纤维素酶接触和降解。高效木葡聚糖酶的利用，可以充分降解纤维素外围的木葡聚糖，使纤维素酶更容易与纤维素接触，同时木葡聚糖的降解降低了纤维素的结晶程度，可使纤维素降解的更充分、更彻底。对木葡聚糖和纤维素的降解及其降解产物葡萄糖转化的过程，目前采用同步糖化发酵工艺。而该工艺需要在pH＝5.0的酸性条件下进行，这就需要创制最适酶解反应条件为pH＝5.0并且在酸性条件下稳定的内切木葡聚糖酶，目前能够满足该反应条件的内切木葡聚糖酶极为稀少。

微生物是植物细胞壁纤维素和半纤维素降解酶的重要来源，并且我国具有非常丰富的微生物资源。目前虽然已有从微生物中获得木葡聚糖酶的报道，但是还没有从微生物中发现高效且适应酸性环境的木葡聚糖酶。

因此，现有技术有待进一步改进。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种来源于葡萄垫壳孢菌(Coniella vitis)的高效木葡聚糖酶及其编码基因及应用，该酶适应pH＝4.0-5.0的酸性条件，且具有高比活，具有极高的应用价值。

本发明的技术方案具体如下：

第一方面，本发明提供一种高效木葡聚糖酶，其被命名为CvXEG1，选自以下之一：

(a)具有SEQ ID N0:3中第19-390位氨基酸序列的蛋白质；

(b)具有如SEQ ID N0:3所示的氨基酸全序列的蛋白质；

(c)具有由SEQ ID N0:3所示的全序列或第19-390位氨基酸序列经过一个或多个氨基酸保守取代、缺失或插入且具有相同功能的蛋白质；

(d)与SEQ ID NO.3的氨基酸序列的同源性达到90％及以上的蛋白质。

上述SEQ ID N0:3序列中，第1-18位氨基酸组成木葡聚糖酶CvXEG1的信号肽，成熟的蛋白质信号肽会被切除，第42-248位氨基酸经SMART预测为保守的GH12家族木葡聚糖酶的催化结构域。

上述高效木葡聚糖酶不仅包括序列为SEQ ID N0:3的1-390位或190-390 位的酶，还包括在所述序列上进行进一步的修饰，但是依然具有基本相同酶活的其他酶。所述酶修饰包括酶的用于提高酶稳定性的分子内交联、以及侧链基团修饰、或者序列两端添加纯化标签等。

由于上述高效木葡聚糖酶基因在随着微生物基因组的复制过程中是容易发生突变，因而上述高效木葡聚糖酶的突变体也在本申请请求保护的范围内。保留相同活性的高效木葡聚糖酶突变体至少具有与Seq ID No:3所示的氨基酸序列90％以上的同源性，更优选的，突变体有92％、94％、95％、96％、97％、 98％或99％与各自对应的上述高效木葡聚糖酶的天然序列相同。上述酶突变体可为点突变、缺失突变或添加突变，相对于最初的蛋白序列，有1个、2个、 3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多氨基酸可发生变化。

优选地，所述高效木葡聚糖酶来源于垫壳孢真菌。

第二方面，本发明还公开了一种上述高效木葡聚糖酶CvXEG1的编码基因(CvXEG1)，该编码基因具有以下核苷酸序列：

(a)如SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2的核苷酸序列或其互补链；

(b)严格条件下与SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2的核苷酸序列杂交且编码权利要求1中的蛋白质具有相同功能的核苷酸序列；

或(c)与SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2的序列同源且编码权利要求1的蛋白质，且保持木葡聚糖酶活性的核苷酸序列。

优选地，上述高效木葡聚糖酶的编码基因不仅包括具有如SeqIDNo:1或 SeqIDNo:2所示的核苷酸序列，还包括与SeqIDNo:1或SeqIDNo:2序列同源性至少达到90％的突变序列。更优选的，所述突变序列有92％、94％、95％、 96％、97％、98％或99％与各自对应的上述高效木葡聚糖酶的天然序列相同。上述突变序列可为点突变、缺失突变或添加突变，相对于最初的核苷酸序列，有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多核苷酸可发生变化。

本文中“具有”的涵义为：所述编码基因可以是序列仅为如SeqIDNo:1或 SeqIDNo:2所示的核苷酸序列，还可以是在如SeqIDNo:1或SeqIDNo:2所示所示的核苷酸序列的基础上进行修饰加工得到的衍生序列，如在基因序列两端添加酶切位点、或增强子等。前述对高效木葡聚糖酶限定中采用的“具有”可进行类似解释。

第三方面，本发明还公开了含有上述编码基因的表达盒或转基因细胞系。

第四方面，本发明还提供了一种重组表达载体，其是将上述的插入到表达载体所形成的。

所述表达载体包括可转化原核细胞(如细菌中的大肠杆菌或其他)中的表达载体，也包括可转化真核细胞(如酵母，或其他)的高效表达载体。

优选地，上述表达载体为在巴氏毕赤酵母中表达的载体，如pPIC9K、 pPIC3、pPIC9、pA0804、pA0815、pHIL-D1或pPSC3K等。在本发明的实施案例中使用的表达载体为pPIC9K，具体实施为在pPIC9K的EcoR和Not酶切位点之间插入SEQ ID NO.2的第55-1170位核苷酸，得到重组表达载体 pPIC9K-CvXEG1。可根据需要采用设计其他酶切位点。

第五方面，本发明还提供了一种工程菌，所述工程菌中转化有上述的重组表达载体，能表达前述的高效木葡聚糖酶。

所述工程菌包括本领域常用的重组表达菌株，可为毕赤酵母菌株、大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、枯草杆菌和植物细胞等，优选为酵母菌。本发明中的宿主菌为酵母菌，具体为巴氏毕赤酵母GS115菌株(可购自美国 Invitrogen公司)。

第六方面，本发明提供了一株表达上述的高效木葡聚糖酶的葡萄垫壳孢菌 (拉丁文名为Coniella vitis)，其被命名为Coniella vitis QNYT13637，于2021 年1月20日，被保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC M 2021112。

第七方面，本发明还提供了一种高效木葡聚糖酶作为内切木葡聚糖酶的应用。

优选地，所述高效木葡聚糖酶应用于降解木葡聚糖。具体的，应用范围包括在降解木葡聚糖、纤维素半纤维素的生物转化、果汁生产与加工、洗涤剂生产、饲料添加、食品以及制备易于酶解的纤维素材料等中的应用。

本发明的内切木葡聚糖酶CvXEG1，酶促反应的最适pH＝5.0，最适温度为50℃，在最适条件下，酶的比活力高达229U/mg。5mM的Fe²⁺对CvXEG1的酶活力有促进作用。

本发明的内切木葡聚糖酶CvXEG1的酶活性在强酸条件下稳定，50℃条件下稳定，这个特性符合同步糖化发酵工艺的条件需求。

因此，本发明的木葡聚糖酶CvXEG1依据其高效的酶活可广泛应用于纤维素、半纤维素的生物转化、果汁的生产与加工、洗涤剂的生产、作为饲料添加、作为食品添加剂以及制备易于酶解的纤维素材料等。

第八方面，本发明还提供了前述的编码基因、表达盒或转基因细胞系、重组表达载体、工程菌、上述葡萄垫壳孢菌在制备木葡聚糖酶中的应用。可利用上述编码基因、表达盒、上述的转基因细胞系、重组表达载体、工程菌或葡萄垫壳孢菌进行葡聚糖酶的工业化生产，扩大葡聚糖酶的产量。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的高效木葡聚糖酶作为内切木葡聚糖酶，具有优异的酶活，比活力高达229U/mg；且该木葡聚糖酶的最适PH为5，且酶活性在强酸条件下保持稳定，这个特性完全符合同步糖化发酵工艺的条件需求，且其具有底物特异性，上述特性使得本发明的高效木葡聚糖酶在纤维素、半纤维素的生物转化、果汁的生产与加工、洗涤剂的生产、作为饲料添加、作为食品添加剂以及制备易于酶解的纤维素材料等领域具有很高的应用前景。

2、通过重组表达以及工程菌的构建，使高效木葡聚糖酶在工程菌中进行大量表达，不仅产量高，并且酶活性高，满足该高效木葡聚糖酶工业化生产的需要。

附图说明

图1为RT-PCR扩增获得的CvXEG1基因的cDNA片段的电泳结果；

图2为阳性酵母转化子的PCR鉴定结果；

图3为融合蛋白的纯化结果；

图4为葡萄糖含量标准曲线；

图5为蛋白质含量标准曲线；

图6为木葡聚糖酶的酶活最适温度的测定结果；

图7为木葡聚糖酶酶活最适pH的测定结果；

图8为酶活温度稳定性；

图9为酶活pH稳定性；

图10为酶促反应动力学曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。所使用的试剂如无特殊说明，均可商业购买。实施例的定量实验，均进行了3次重复。

实验材料和实验方法

1.菌株、载体、限制性内切酶、抗生素、试剂盒

(1)葡萄垫壳孢菌由实验室分离纯化并保存。该菌株命名为QNYT13637，于2012年1月20日被保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2021112。

菌株的分离和鉴定方法：该葡萄垫壳孢菌利用组织分离培养的方法从葡萄枝蔓上获得。通过PDA培养基28℃培养形成的菌落特征、产生的分生孢子器与分生孢子的形态特征以及ITS序列特征，该菌株鉴定为葡萄垫壳孢菌。

(2)巴式毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115，购自Invitrogen公司(California，USA)，产品目录号为C18100。

(3)表达载体Ppic9K购自Invitrogen公司(California，USA)，产品目录号为V17520。

(4)限制性内切酶：EcoRⅠ(产品目录号为1040B)，NotⅠ(产品目录号为1166B)和SacⅠ(产品目录号为1078A)，均购自TaKaRa公司(辽宁，中国)。

(5)抗生素：遗传霉素(G418)，(产品目录号为A600958-0006)；氨苄青霉素钠(Amp)(产品目录号为A610028-002)，购自生工生物工程(上海) 股份有限公司。

(6)其他：

Max Super-Fidelity DNA Polymerase(目录号为 P505-d1/d2/d3)、2×Taq Master Mix(Dye Plus)(产品目录号为P112-01/02/03)。

(7)试剂盒：

载体克隆试剂盒

ⅡOne Step Cloning Kit(产品目录号为C112)，购自Vazyme公司(江苏，中国)，产品目录号为P505-d1/d2/d3；

柱式真菌总RNA抽提纯化试剂盒，购自生工生物工程(上海)股份有限公司，产品目录号为B518659；

质粒小量提取试剂盒，购自庄盟生物公司，目录号为ZP101-2；

PCR纯化试剂盒，购自生工生物工程(上海)股份有限公司，产品目录号为B518141-0100。

2.多糖

木葡聚糖(产品目录号为P-XYGLN，购自Magazyme公司)；木聚糖(产品目录号为9014-63-5，购自北京博奥拓达有限公司)；羧甲基纤维素钠(产品目录号30036365，购自国药集团化学试剂有限公司)；β-葡聚糖(产品目录号为S11183，购自源叶生物有限公司)；微晶纤维素(产品目录号为S14009，购自源叶生物有限公司)。

3.培养基

(1)葡萄白腐病菌培养用培养基

马铃薯-葡萄糖琼脂培养基(PDA)(1L)：称取200g土豆，去皮洗净切块，加热煮沸30分钟，期间冲洗三角瓶，每瓶加入3g左右琼脂粉备用，煮沸后用四层纱布过滤，定容至1L，加入20g葡萄糖，加热溶化β后，分装到三角瓶中，封口，121℃灭菌20分钟。

(2)酵母用培养基

液体培养基配制方法如下，如需固体培养基，则需要加入3％的琼脂粉。

配制培养基所需母液和缓冲液配制：

10×葡糖糖：10％葡萄糖。

10×YNB：100mL水中加入13.4g酵母无氨基酸氮源(YNB)。

500×生物素：100mL水中加入20mg生物素。

1M磷酸钾缓冲液(PH6.0):132mL 1M K2HPO4溶液与868mL 1M KH2PO4 溶液混合，用磷酸或氢氧化钾调节PH至6.0。

10×YNB和500×生物素需要单独配制并过滤除菌并在4℃保存。

YPD培养基(1L)：酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，115℃高温高压灭菌20分钟。

BMGY(1L):酵母提取物10g，蛋白胨20g，甘油10mL，用蒸馏水定容至800mL后，121℃高温高压灭菌20分钟。灭菌后单独加入100mL 1M磷酸钾缓冲液、100mL 10×YNB、2mL 500×生物素，混匀后立即使用或者4℃保存。

BMMY(1L):酵母提取物10g，蛋白胨20g，用蒸馏水定容至700mL后， 121℃高温高压灭菌20分钟。灭菌后单独加入100mL 1M磷酸钾缓冲液、100mL 10×YNB、100mL甲醇、2mL 500×生物素，混匀后立即使用或者4℃保存。

MD培养基(1L)：100mL 10×YNB、100mL 10×葡萄糖、2mL 500×生物素，115℃高温高压灭菌20分钟。

4、木葡聚糖酶酶活力的测定

(1)葡萄糖标准曲线的制作

用蒸馏水配制1.0mg/mL的葡萄糖标准溶液，取9只25mL试管，按照下表1加入1.0mg/mL的葡萄糖标准溶液和蒸馏水。

表1葡萄糖标准溶液的配置

将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5分钟，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管中加入蒸馏水定容至25mL，摇匀。于λ＝540nm处测定吸光度值。

以葡萄糖浓度为横轴(X轴)，以吸光度值为纵轴(Y轴)作散点图，添加趋势线得到标准曲线为y＝0.6294x-0.0413(相关系数R²＝0.9939)。

(2)酶活力的测定

酶活力的测定设置反应组和对照组。

反应组为在25mL试管中加入1mL 0.2％木葡聚糖pH＝5的缓冲液，在50℃的水浴锅保温5分钟后，加入1mL酶液并快速混匀，保温反应一段时间后，加入3mL DNS终止反应并沸水浴5分钟显色，冷却至室温后，于λ＝540nm 处测定吸光度值。

对照组将酶液沸水浴5分钟灭活，该灭活酶液按照上述操作进行反应作为对照，同样于λ＝540nm处测定吸光度值。

将反应组的吸光度值减去对照组的吸光度值，得到差值，将差值带入葡萄糖标准曲线计算得出反应体系中含有还原糖的量，计算出酶活力。

木葡聚糖酶活力单位(U)的定义：在设定的测定条件下，每分钟水解木葡聚糖释放出1umol还原糖所需要的酶量，定义为一个酶活力单位(U)。

(3)蛋白质含量的测定

本实验采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。用蒸馏水配制1mg/mL的标准蛋白溶液，取7只试管，按照下表进行操作。

表2标准蛋白溶液的配置

摇匀，1h内以0号管为空白对照，在λ＝595nm处测定吸光度值。

标准蛋白含量为横坐标(X轴)，以λ595为纵坐标(Y轴)，作散点图，添加趋势线得到标准曲线为y＝0.0051x+0.0376(相关系数R²＝0.9669)。

酶比活力定义：在设定的测定条件下，每mg蛋白所具有的酶活力(U/mg)。实施例一CvXEG1基因cDNA的获得

1、葡萄白腐病菌RNA的提取

将葡萄垫壳孢菌接种到PDA培养基上，培养2-3天，用手术刀轻轻刮取菌丝，用液氮研磨法破碎菌丝，所用研钵、研棒，镊子都要经过高温灭菌处理。使用柱式真菌总RNA抽提纯化试剂盒提取葡萄白腐病菌RNA，按照产品使用说明书进行。

2、反转录及CvXEG1基因cDNA的扩增

对垫壳孢Coniella vitis的基因组序列分析得知，CvXEG1基因的编码区是个单外显子。设计以下引物：

5’-GCTGAAGCTTACGTACACCCCCAACCCCAC-3’

5’-GAATTAATTCGCGGCATGATGATGATGATGATGCTCGGAACGCTTGCG-3’

利用反转录试剂盒将葡萄白腐病菌RNA反转录为cDNA。

PCR扩增体系如下：

PCR反应程序如下：

将得到的PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳。图1中的第一泳道为 2000bp的DNAMarker，共有6个DNA片段，从大到小分别为2000，1000， 750，500，250，100bp；第二泳道为CvXEG1基因的cDNA片段，图1的结果表明成功得到一段大约1200bp的DNA(与SEQ ID 2的序列大小一致)。将 PCR产物利用纯化试剂盒进行回收。将该片段克隆到T-载体上进行测序，测序结果显示，该序列与从基因组序列中预测的完全一致。

实施例二CvXEG1的表达与纯化

1、pPIC9K-CvXEG1重组表达载体的构建

质粒pPIC9K用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，双酶切产物用 DNA纯化回收试剂盒进行回收。将实施例一中获得的CvXEG1 cDNA用载体克隆试剂盒连接至pPIC9K载体质粒上并转化至大肠杆菌中JM109感受态细胞中。经氨苄抗生素筛选，对阳性转化子利用通用引物5’AOX和3’AOX 进行PCR，得到条带大小正确的阳性转化子。将验证条带大小正确的转化子送至公司测序，该段DNA的序列与序列表中SEQ ID 2的序列一致。

2含有pPIC9K-CvXEG1重组质粒的酵母菌株的构建

将上述构建的pPIC9K-CvXEG1表达质粒进行SacⅠ酶切，将线性化的质粒经点击转化导入酵母GS115感受态细胞，甲醇诱导表达，酵母的发酵液经镍柱纯化。具体操作如下：

(1)酵母感受态的制备

取甘油冻存的巴氏毕赤酵母菌株GS115在YPD平板上划线，在30℃下培养2-3天后，挑单菌落接种于含有5mlYPD液体培养基中，30℃、200rpm的摇床中过夜培养。将培养的5ml酵母菌液接种到45mlYPD培养基中，继续培养至OD600为1.3-1.5。将酵母菌液冰浴20min，4℃、4000rpm下离心5min，弃上清，收集菌体。用50ml预冷的无菌水重悬菌体并按上述步骤离心。用25ml 预冷的无菌水重悬菌体并按上述步骤离心。收集菌体后用5ml预冷的1M山梨醇重悬菌体。再次离心收集菌体，加入1M山梨醇1ml，分装至1.5mlEP管中，每管50ul。

(2)酵母感受态的点击转化

将5-10ug的线性化DNA与50ul酵母感受态混匀，转至0.2cm预冷的电击转化杯中。将电击转化杯预冷5min，设置电转仪参数为：电压1500V、电容 25uF、电阻200Ω、电击时间4～10ms。电击后立即加入1ml预冷的山梨醇，吹打均匀后转入无菌的EP管中，于30℃培养箱培养1-2小时。取400ul细胞培养液涂布于含有0.5mg/ml遗传霉素的MD平板上，30℃倒置培养3-4天。

3.重组酵母的鉴定

为筛选获得高拷贝插入的重组酵母菌株，从MD平板上挑取单菌落接种于含有2mg/ml G418的YPD平板上进行筛选，2-3天后挑取生长良好的单菌落接种于4mg/ml遗传霉素的YPD平板上进行复筛。挑取平板上生长良好的单菌落进行菌落PCR，鉴定重组转化子。

PCR引物为通用引物5’AOX和3’AOX。反应体系为：2×Easy Taq Mix12.5ul，5’AOX和3’AOX均为1ul(10uM)，巴氏毕赤酵母细胞适量，加ddH2O补足体系至总体系为25ul。

反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，35个循环，最后延伸10分钟。其以转化载体pPIC9k得到的单菌落为对照。鉴定结果见图2。

4.重组蛋白的诱导表达

将验证正确的阳性重组酵母菌株接种至5ml的液体培养基中，30℃、 200rpm震荡培养12小时，吸取1ml菌液转至含有盛有50ml BMGY培养基的 250ml三角瓶中，30℃、200rpm震荡培养14-18小时。在4℃、3500rpm条件下离心5分钟，去除上清，收集菌体。将菌体重新悬浮接种于50ml BMMY 培养基中，使其OD600＝1.0，继续在30℃、200rpm条件下培养，每隔24小时补充甲醇至终浓度的1％，收集96小时的菌液，12000rpm离心10分钟，上清液即为重组巴氏毕赤酵母GS115-pPIC9K-CvXEG1的粗蛋白溶液。

采用同样的方法诱导重组巴氏毕赤酵母GS115-pPIC9K作为对照。并将得到的粗蛋白溶液用SDS-PAGE凝胶电泳方法进行检测。

5.pPIC9K-CvXEG1重组蛋白的纯化

利用镍层析柱纯化pPIC9K-CvXEG1重组蛋白，具体操作如下：

1)蛋白样品的准备

(1)将四中获得的粗酶液经45％硫酸铵沉淀。

(2)蛋白沉淀用PBS(140mM NaCI，2.7mM KCI，10mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH＝7.2)缓冲液溶解，并在PBS缓冲液中透析。

2)Ni-柱的准备

(1)用去离子水洗涤，洗去乙醇和基质间的空气；

(2)用5x柱体积的NiSO₄洗柱子；

(3)5x柱体积的去离子水洗柱子；

(4)10x柱体积的Binding Buffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCI，5mM咪唑，pH＝8.0)洗柱子。

3)蛋白纯化

(1)蛋白样品上样；

(2)20x柱体积的Washing Buffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCI，20-50mM 咪唑，pH＝8.0)洗柱子至无蛋白检出；

(3)Elution Buffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCI，500-1000mM咪唑， pH＝8.0)洗脱，紫外吸收值最高时收集洗脱液；

最后收集的洗脱液即为纯化的蛋白溶液。对纯化蛋白通过SDS-PAGE凝胶电泳方法进行检测，结果见图3。检测结果说明：纯化得到约100KD的蛋白质，比预测pPIC9K-CvXEG1重组蛋白大约50KD。经预测，CvXEG1存在两个N-糖基化位点，推测酵母表达的pPIC9K-CvXEG1被糖基化修饰。

实施例三CvXEG1酶学性质的研究

1、重组蛋白质的底物特异性检测

分别配制0.5％木葡聚糖、0.5％羧甲基纤维钠、0.5％木聚糖、0.5％滤纸、0.5％微晶纤维素，在最适作用条件下(50℃，pH5.0)，采用前述方法测定重组蛋白质对不同底物的酶活力。

结果显示，重组蛋白质对木葡聚糖具有很高的酶解活性(比活力达到 229U/mg)，同时，该酶对木聚糖也具有一定的酶解活性(比活力达到 105U/mg)。结果见下表3：

表3重组蛋白pPIC9K-CvXEG1的底物特异性检测

2、最适作用温度

在pH5.0的条件下，配制0.2％的木葡聚糖溶液，分别在30℃，40℃，50℃， 60℃，70℃，80℃温度条件下测定重组蛋白质的酶活力。设定最适温度下的酶活力为100％，其他pH值的酶活力与最高酶活力的比值折算为相对酶活力，从而确定木葡聚糖酶的最适反应温度。以温度为X轴，相对酶活力为Y轴作图。如图6的实验结果表明，重组蛋白木葡聚糖酶的最适作用温度为50℃。

3、温度稳定性研究

分别将蛋白溶液在40-80℃下保温2小时立即取出于冰上放置10min，检测其残余酶活力，以未进行温度处理的样品酶活力为100％计算相对酶活力以研究酶的热稳定性。以温度为X轴，相对酶活力为Y轴作图，结果见图8。

图8的实验结果显示，重组蛋白木葡聚糖酶在低于50℃的条件下稳定，超过60℃相对酶活力下降趋势明显，说明重组蛋白质对超过50℃的温度敏感。

4、最适作用pH值

分别配制含0.2％木葡聚糖的pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、 10.0的缓冲液，在50℃条件下测定酶活力，设测定的最高酶活力为100％，其他pH值的酶活力与最高酶活力的比值折算为相对酶活力，从而确定木葡聚糖酶的最适反应ph。以pH为X轴，相对酶活力为Y轴作图。如图7的实验结果表明，重组蛋白木葡聚糖酶的最适作用pH为5.0。

5、pH稳定性研究

取合适浓度的上述木葡聚糖蛋白溶液，用不同pH值的缓冲液稀释，于 50℃下保温2h后取出，在冰上放置10min后再按照标准木葡聚糖酶酶活测定方法，对相应样品的残余酶活力进行检测，以未进行不同pH值的缓冲液处理的样品测得的酶活力为100％计算相对酶活力以研究木葡聚糖酶的pH稳定性。以pH为X轴，相对酶活力为Y轴作图，结果见图9。

实验结果显示：酶活力在pH4-6之间稳定，pH超过6后，相对酶活力下降，但下降趋势不太明显，说明重组蛋白木葡聚糖酶在酸性pH下都具有较高酶活力，稳定性好。

6、重组蛋白木葡聚糖酶动力学参数测定实验

米氏常数Km值是一个酶的特征常数，只与酶的特性有关，与酶的浓度无关，其物理意义是当酶反应速度达到1/2Vmax时的底物浓度，Km值的大小可以反映木葡聚糖酶对底物的亲和力的大小，Km值越小，表明酶与底物亲和力越大。

分别配制pH5.0浓度为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％的木葡聚糖底物溶液，同时与适当浓度的pPIC9K-CvXEG1木葡聚糖酶酶液在标准反应体系中进行酶促反应，利用Lineweaver-Burk双倒数作图法测其Km值及Vmax值，得出Km值为0.03mg/ml，Vmax值为6.24U/ml。如图10为该酶的酶促反应动力曲线。

7、金属离子对重组蛋白木葡聚糖酶酶活性的影响研究

在标准的木葡聚糖酶反应体系中，加入不同种类金属离子，至终浓度为5 mmol/L。分别测定其酶活力并以在标准的酶反应条件(不添加任何其他金属离子)下测得的酶活力为100％计算相对酶活力以比较不同种类金属离子对重组蛋白木葡聚糖酶酶活力的影响。

结果显示：不同的金属离子对木葡聚糖酶酶的活力具有不同的作用，其中 Fe²⁺和K⁺对酶活性有增强作用，Fe²⁺对木葡聚糖酶的酶活增强作用最大。结果见下表4。

表4金属离子对重组蛋白pPIC9K-CvXEG1酶活力的影响

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种高效木葡聚糖酶及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1720

<212> DNA

<213> 带有信号肽的CvXEG1 基因(gene of CvXEG1 with signal peptide)

<400> 1

aaggaaaaga acaacaacag ccgacagtcg tcattagcac cgcccgtctc tctcttttgc 60

cctggcggct cacactcgtt cctgtacaag gcactttact gccgtacatt ctttcaccag 120

taaataaccc accggtcttt ccaaaacaga cacaaagctc gtgtgtagct acatagtaca 180

gacaacaaca aacaaacaga cactgttttc ttttttctga ttcattcact cattcatcca 240

ttgattacaa atcctcccga aagtatacgt ggacctacaa aatcgacgaa aaaaacaaca 300

accataatac caaaaccatg aactctatcc tcatcaccgc tctcctcgcc ggcgccgtcc 360

gtgcagcggc tcacccccaa ccccaccgcg tcgaggcccg cgccacctcc atctgcggcc 420

agtgggacac tatacccaca ggggtgtaca ccgtctacca ggacctgtgg aacgaggacg 480

ccggcacggg ctcgcagtgc tcgaccgtcg acaacctcag tgacgacggc gtgctctcgt 540

ggtcgaccaa gtggtcgtgg tccggcggga gcacgaaggt caagtcgtac gcaaacattg 600

tgaccaactt caccatcacc acgctcgact ccatctcgtc catcccctct ctctggtcgt 660

ggtcctactc gggtaccgac cttgtcgccg atgtcagcta cgacatgttt acgtcttcgt 720

cggcgtctgg cagcaatgag tatgaaatca tgatctggct cgaagccatt ggcggcgcgg 780

gccccatctc ctccacgggg agcagcattg caactgcgac gatcgcaggc tctacctggg 840

acctttacag cggagccaac ggcgacacca ctgtctttac cttcgttgcc acctcggctg 900

tggaggactt cagcggtgat atcaaggact ttctcaacta cctcatcgac aacgaaggcc 960

tctccagcag ccaatacctg ctgagcatcg gcgccggcac cgagcccttt accggctcca 1020

gcgctgtgct ctccgtcgcg tcctactcgt gcgccgtctc gaccggagcc gcctcgacct 1080

cagccgcagc ctcgaccgtt gccgccacca cgctcgcgaa ctcgtctgct gtggccacca 1140

cctccagcag cagcagcagc agcagcagca ccgctgccgc cgtgtctacc gctgccatct 1200

attcgagcag tgccgtggca cccgcctcga gcagttccgt cgcacccgcc tcgactgccg 1260

ctccatctag ccctgcgtcg tcagcatcgt caacgtcgtc atcgtcgtcg tcagcgatca 1320

tctctgtcgc ttcccaggtt gtttcatccg tgccaatttc ggccacgccc atttcatccg 1380

cgcccgtgac cactgcagct cctaccactg ctgctccgac cactgctgag ccggcgacca 1440

ctctggctac cagcaccaag aagagctgcc accgcaagcg ttccgagtaa aagagtccgg 1500

caaggtgtat tatgtcaagt gaagggagaa agaaggggat gtttttgaag gatattgggt 1560

tgcatatgca tgatcgcttg tcgctggtct gtttggaagt agcatgattt cttctttagg 1620

tactcgctcc acatcactta caaagttttg ctgttgtaga taatgaaaag taaacttgga 1680

tcctactctc aagcgtttct tgaaagaaaa aagaataaaa 1720

<210> 2

<211> 1170

<212> DNA

<213> CvXEG1 基因(gene of CvXEG1 )

<400> 2

atgaactcta tcctcatcac cgctctcctc gccggcgccg tccgtgcagc ggctcacccc 60

caaccccacc gcgtcgaggc ccgcgccacc tccatctgcg gccagtggga cactataccc 120

acaggggtgt acaccgtcta ccaggacctg tggaacgagg acgccggcac gggctcgcag 180

tgctcgaccg tcgacaacct cagtgacgac ggcgtgctct cgtggtcgac caagtggtcg 240

tggtccggcg ggagcacgaa ggtcaagtcg tacgcaaaca ttgtgaccaa cttcaccatc 300

accacgctcg actccatctc gtccatcccc tctctctggt cgtggtccta ctcgggtacc 360

gaccttgtcg ccgatgtcag ctacgacatg tttacgtctt cgtcggcgtc tggcagcaat 420

gagtatgaaa tcatgatctg gctcgaagcc attggcggcg cgggccccat ctcctccacg 480

gggagcagca ttgcaactgc gacgatcgca ggctctacct gggaccttta cagcggagcc 540

aacggcgaca ccactgtctt taccttcgtt gccacctcgg ctgtggagga cttcagcggt 600

gatatcaagg actttctcaa ctacctcatc gacaacgaag gcctctccag cagccaatac 660

ctgctgagca tcggcgccgg caccgagccc tttaccggct ccagcgctgt gctctccgtc 720

gcgtcctact cgtgcgccgt ctcgaccgga gccgcctcga cctcagccgc agcctcgacc 780

gttgccgcca ccacgctcgc gaactcgtct gctgtggcca ccacctccag cagcagcagc 840

agcagcagca gcaccgctgc cgccgtgtct accgctgcca tctattcgag cagtgccgtg 900

gcacccgcct cgagcagttc cgtcgcaccc gcctcgactg ccgctccatc tagccctgcg 960

tcgtcagcat cgtcaacgtc gtcatcgtcg tcgtcagcga tcatctctgt cgcttcccag 1020

gttgtttcat ccgtgccaat ttcggccacg cccatttcat ccgcgcccgt gaccactgca 1080

gctcctacca ctgctgctcc gaccactgct gagccggcga ccactctggc taccagcacc 1140

aagaagagct gccaccgcaa gcgttccgag 1170

<210> 3

<211> 390

<212> PRT

<213> CvXEG1 蛋白(protein of CvXEG1 )

<400> 3

Met Asn Ser Ile Leu Ile Thr Ala Leu Leu Ala Gly Ala Val Arg Ala

1 5 10 15

Ala Ala His Pro Gln Pro His Arg Val Glu Ala Arg Ala Thr Ser Ile

20 25 30

Cys Gly Gln Trp Asp Thr Ile Pro Thr Gly Val Tyr Thr Val Tyr Gln

35 40 45

Asp Leu Trp Asn Glu Asp Ala Gly Thr Gly Ser Gln Cys Ser Thr Val

50 55 60

Asp Asn Leu Ser Asp Asp Gly Val Leu Ser Trp Ser Thr Lys Trp Ser

65 70 75 80

Trp Ser Gly Gly Ser Thr Lys Val Lys Ser Tyr Ala Asn Ile Val Thr

85 90 95

Asn Phe Thr Ile Thr Thr Leu Asp Ser Ile Ser Ser Ile Pro Ser Leu

100 105 110

Trp Ser Trp Ser Tyr Ser Gly Thr Asp Leu Val Ala Asp Val Ser Tyr

115 120 125

Asp Met Phe Thr Ser Ser Ser Ala Ser Gly Ser Asn Glu Tyr Glu Ile

130 135 140

Met Ile Trp Leu Glu Ala Ile Gly Gly Ala Gly Pro Ile Ser Ser Thr

145 150 155 160

Gly Ser Ser Ile Ala Thr Ala Thr Ile Ala Gly Ser Thr Trp Asp Leu

165 170 175

Tyr Ser Gly Ala Asn Gly Asp Thr Thr Val Phe Thr Phe Val Ala Thr

180 185 190

Ser Ala Val Glu Asp Phe Ser Gly Asp Ile Lys Asp Phe Leu Asn Tyr

195 200 205

Leu Ile Asp Asn Glu Gly Leu Ser Ser Ser Gln Tyr Leu Leu Ser Ile

210 215 220

Gly Ala Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Ser Ser Ala Val Leu Ser Val

225 230 235 240

Ala Ser Tyr Ser Cys Ala Val Ser Thr Gly Ala Ala Ser Thr Ser Ala

245 250 255

Ala Ala Ser Thr Val Ala Ala Thr Thr Leu Ala Ser Ser Ser Ala Val

260 265 270

Ala Thr Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ala Ala Ala

275 280 285

Val Ser Thr Ala Ala Ile Tyr Ser Ser Ser Ala Val Ala Pro Ala Ser

290 295 300

Ser Ser Ser Val Ala Pro Ala Ser Thr Ala Ala Pro Ser Ser Pro Ala

305 310 315 320

Ser Ser Ala Ser Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ile Ile Ser

325 330 335

Val Ala Ser Gln Val Val Ser Ser Val Pro Ile Ser Ala Thr Pro Ile

340 345 350

Ser Ser Ala Pro Val Thr Thr Ala Ala Pro Thr Thr Ala Ala Pro Thr

355 360 365

Thr Ala Glu Pro Ala Thr Thr Leu Ala Thr Ser Thr Lys Lys Ser Cys

370 375 380

His Arg Lys Arg Ser Glu

385 390

Claims

1.一种高效木葡聚糖酶，其特征在于，选自以下之一：

(a)具有SEQ ID N0:3中第19-390位氨基酸序列的蛋白质；

(b)具有如SEQ ID N0:3所示的氨基酸全序列的蛋白质；

(c)具有由SEQ ID N0:3所示的全序列或第19-390位氨基酸序列经过一个或多个氨基酸保守取代、缺失或插入且具有相同功能的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的高效木葡聚糖酶，其特征在于，来源于垫壳孢真菌。

3.一种如权利要求1所述的高效木葡聚糖酶的编码基因，其特征在于，所述编码基因具有：

(a)如SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2的核苷酸序列或其互补链；

(b)严格条件下与SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2的核苷酸序列杂交且编码权利要求1中的木葡聚糖酶具有相同功能的核苷酸序列；

或(c)与SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2的序列同源且编码权利要求1的木葡聚糖酶，且保持木葡聚糖酶活性的核苷酸序列。

4.含有权利要求3所述的编码基因的表达盒或转基因细胞系。

5.重组表达载体，其特征在于，是将权利要求3所述的编码基因或将权利要求1所述的木葡聚糖酶的编码基因插入到表达载体所形成的。

6.工程菌，其特征在于，所述工程菌中转化有如权利要求4所述的重组表达载体，能表达权利要求1所述的木葡聚糖酶。

7.一株表达权利要求1所述的高效木葡聚糖酶的葡萄垫壳孢菌，其特征在于，被命名为QNYT13637，保藏编号为CCTCC M 2021112。

8.如权利要求1所述的高效木葡聚糖酶作为内切木葡聚糖酶的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括所述高效木葡聚糖酶在降解木葡聚糖、纤维素半纤维素的生物转化、果汁生产与加工、洗涤剂生产、饲料添加、食品以及制备易于酶解的纤维素材料中的应用。

10.如权利要求3所述的编码基因、权利要求4所述的表达盒或转基因细胞系、权利要求5所述的重组表达载体、权利要求6所述的工程菌、权利要求7所述的葡萄垫壳孢菌在制备木葡聚糖酶中的应用。