CN110951716A - 一种外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D及其重组菌株和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D及其重组菌株和应用。本发明所述外切型褐藻胶裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，编码氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。所述外切型褐藻胶裂解酶的适合反应温度为20‑35℃，在0‑30℃时具有高稳定性，因此该酶可在低温下有效降解底物，属于一种冷适应的褐藻胶裂解酶；所述外切型褐藻胶裂解酶对褐藻胶、polyG和polyM具有降解能力，降解方式为外切型，最终降解产物为不饱和单糖，并具有NaCl依赖性。本发明还构建了含所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D编码基因的重组载体和重组菌体，能够为工业化应用和生产生物乙醇提供了良好的基础。

Description

一种外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D及其重组菌株和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D及其重组菌株和应用。

背景技术

随着能源需求的不断增长和化石燃料资源的枯竭，作为可再生和清洁能源的生物乙醇受到越来越多的关注。褐藻由于其优异的特性，包括广泛的分布，高的生产率，无需耕地、淡水和肥料，并且不含木质素的优点，已成为生物乙醇生产的重要来源。

褐藻胶是褐藻中细胞壁的主要多糖，可以达到褐藻干重的40%。褐藻胶是一种线性多糖，由β-D-甘露糖醛酸（M）及其C5差向异构体α-L-古洛糖醛酸（G）连接，并且排列成聚β-D-甘露糖醛酸（polyM），聚α-L-古洛糖醛酸（polyG）和杂聚物（polyMG）。褐藻胶及其寡糖具有很高的安全性，被广泛用于食品，医药和工业生产中。

褐藻胶裂解酶通过β-消除反应降解褐藻胶，在非还原端的C4和C5之间产生不饱和双键。冷适应的褐藻胶裂解酶适用于许多工业生产，因为它们可以在低温下催化并通过略微升高温度使其选择性失活，从而可以节省能源并减少生物污染。根据作用方式的差异，褐藻胶裂解酶分为内切型和外切型。外切型褐藻胶裂解酶将褐藻胶的聚合物和低聚物降解为不饱和单糖。不饱和单糖通过非酶法转化为α-酮酸（DEH）。DEH可以被还原酶DehR还原为2-酮-3-脱氧葡萄糖酸酯（KDG），并进入Entner-Doudoroff（ED）途径产生乙醇。但是目前外切型褐藻胶裂解酶的活性低，在低温下活性更低，成为生物乙醇生产的限制条件。

发明内容

本发明的目的是提供了一种外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D及其重组菌株和应用。本发明所述的外切型褐藻胶裂解酶活性高，具有广泛的底物适应性、适应寒冷环境并且具有较高的降解活性，具有良好的市场应用前景。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

进一步的，编码所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D氨基酸序列的核苷酸序列如SEQID No.5所示。

进一步的，所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的适合反应温度为20-35℃。

进一步的，所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的最适反应温度为35℃。

进一步的，所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的适合反应pH为7.4-8.2。

进一步的，所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的最适反应pH为7.6。

进一步的，所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D在pH 7.0-10.6具有很好的pH稳定性。

进一步的，所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D在0-30℃下具有很好的稳定性。

进一步的，所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的适合反应NaCl浓度为0.2-0.5M。

进一步的，所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的最适反应NaCl浓度为0.5 M。

进一步的，Ca²⁺和Li⁺促进所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的酶活；Zn²⁺，Fe³⁺，Cu^{2 +}，SDS和EDTA抑制所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的酶活。

进一步的，所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D具有广泛的底物适应性，能够明显降解褐藻胶、polyM和polyG。

进一步的，所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的降解方式为外切型，其最终降解产物为不饱和单糖。

本发明还提供了包含所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D编码基因的重组表达载体。

进一步的，所述重组表达载体为pET-24a (+)载体。

本发明还提供了包含所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D编码基因的重组菌株。

进一步的，所述重组菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

进一步的，所述的外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的制备方法为：将所述重组菌株接种到培养基中37℃培养，培养至OD₆₀₀为0.4~0.5时，加入IPTG使其终浓度为0.1 mM，18 ℃诱导24 h；菌体离心去上清，沉淀重悬后破碎，再离心收集上清液得到粗酶液；使用镍离子亲和柱将粗酶液分离纯化获得所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D。

本发明还提供了所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D在用于制备降解褐藻胶、polyM和polyG的酶制剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：

本发明所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D可以利用含有VsAly7D编码基因的重组菌体通过培养、诱导和分离纯化获得，而VsAly7D编码基因则是通过原始褐藻胶裂解酶基因进行密码子优化而来，优化后褐藻胶裂解酶具有更好的蛋白表达量。该酶的最适反应温度35℃，且在0-30℃下具有良好的稳定性，因此该酶属于一种冷适应的褐藻胶裂解酶，能够在低温下有效降解底物，并且该酶的降解方式为外切型，最终降解产物为不饱和单糖。另外，所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的最适pH为7.6，在pH 7.0-10.6具有较好的稳定性，其同时具有广泛的底物降解性，能够降解褐藻胶、polyG和polyM并且具有高的比活力，而且所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D对褐藻胶降解速率高，能够快速产生不饱和单糖，可用于DEH的生产。本发明还构建了含上述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的重组载体和重组菌体，并且确定了其酶学性质和降解速率，能够为工业化应用和生产生物乙醇提供了良好的基础。

附图说明

图1：外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D表达纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳图（SDS-PAGE）。

图2：原始褐藻胶裂解酶表达纯化的SDS-PAGE电泳图（1，细菌破碎液；2，细菌破碎离心后上清液）。

图3：优化后褐藻胶裂解酶表达纯化的SDS-PAGE电泳图（1，细菌破碎液；2，细菌破碎离心后上清液；3，细菌破碎离心后沉淀重悬液）。

图4：pH对所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的影响结果（A，不同反应pH对酶活力的影响；B，酶的pH稳定性）。

图5：温度对所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的影响结果（A，不同反应温度对酶活力的影响；B，酶的温度稳定性）。

图6：所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的底物偏好性结果。

图7：所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的降解方式结果（A，乌氏粘度计结果；B，时程实验结果）。

图8：所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的最终降解产物结果（A，薄层层析结果；B，凝胶过滤色谱结果；C，阴离子电喷雾离子化质谱结果）。

图9：所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的NaCl依赖性结果。

图10：金属离子、EDTA和SDS对所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D活性的影响结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步详细的解释说明。

实施例1：外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的制备

1、外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D编码基因的克隆

对核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的褐藻胶裂解酶基因进行密码子优化，获得核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的褐藻胶裂解酶基因。

对核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的褐藻胶裂解酶基因进行PCR扩增反应实验，使用的扩增引物如下：

F：5’-GGAGATATACATATGAGCGATCTGAATAATGGC-3’(SEQ ID No.3)；

R：5’-GTGGTGGTGCTCGAGTTTGCCATTCAGCTTCAG-3’(SEQ ID No.4)。

PCR反应按照以下条件进行：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s；50 ℃退火20 s；72 ℃延伸60 s，共进行30个循环，之后72 ℃延伸10 min。将获得PCR产物经过测序后，得到本发明所述的外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的部分核苷酸序列984 bp，核苷酸序列如SEQID No.5所示；所述核苷酸序列共编码328个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，蛋白分子量36.7 kDa。

2、外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的重组表达载体的构建

获得的PCR产物经过胶回收试剂盒（诺维赞）纯化后，用限制性内切酶Nde I和Xho I消化，与同样酶切的pET-24a (+)载体（Takara）连接，再转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆进行DNA测序。测序获得的本发明所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的核苷酸序列（编码基因）如SEQ ID No.5所示；获得的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，确定测序正确，目的片段已经连入。将测序正确的重组表达质粒，使用质粒提取试剂盒（诺维赞）提取质粒。将重组表达质粒转化入表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)。

3、外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的诱导发酵

将重组的含有pET24a-VsAly7D载体的大肠杆菌BL(DE3)划线，挑单克隆至10 ml含有卡那霉素（kana，30 μg/ml）的液体LB培养基中，37℃摇床培养过夜。

再转接到装有100 ml液体LB（30 μg/ml kana）的500 ml锥形瓶中，于37 ℃培养至OD₆₀₀为0.4~0.5时，加入IPTG（isopropyl-β-D-galactopyraNoside），使其终浓度为0.1 mM，18 ℃诱导24 h。菌体离心，12000 rpm，15 min，去掉上清，沉淀用溶液A进行重悬（10 ml，20mM PB，500 mM NaCl，pH=8.6）。将菌体使用高压破碎机破碎后的混合液12000 rpm，4 ℃离心20 min，收集上清，得到粗酶液。使用A₂₃₅法测定粗酶液酶活力：测定反应体系在235 nm处的光吸收值，以100℃灭活10 min的酶液作对照；在此条件下，每分钟光吸收值增加0.1为一个酶活力单位（U）。

4、外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的分离纯化

使用平衡液A（20 mM PB，500 mM NaCl，pH=8.6）将镍离子亲和柱（HisTrap HP，GE）平衡5~10个体积。将处理的细胞破碎上清粗酶液上样。再使用平衡液A将未结合的杂蛋白洗脱干净，使用添加25 mM咪唑的平衡液A洗脱其他杂蛋白。使用添加100 mM咪唑的平衡液A洗脱目的蛋白，检测酶活力；然后再使用添加500 mM咪唑的平衡液A将其他蛋白洗脱，用水冲洗柱子，最后将柱子保存在20%酒精中。

将目的蛋白收集后放入透析膜（截留分子量为10 kDa），进行低温过夜透析，透析溶液为20 mM PB，pH8.6，除掉样品中的咪唑和NaCl。透析后目的蛋白放入-20℃进行保存。将目的蛋白样品取10 μl加入等体积的2×变性缓冲液（loading buffer），煮沸10 min后于常温12000 rpm离心5 min，取上清，进行SDS-PAGE电泳，胶浓度为10%，浓缩胶电压为80 V，分离胶电压为120 V。电泳胶在考马斯亮蓝R-250震荡染色4 h，使用脱色液（甲醇：乙酸：水=3:1:6）脱色后，拍照，分析。如图1所示，外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的分子量约为37 kDa，与预测分子量相符。

使用蛋白浓度测定试剂盒（诺维赞）测定蛋白浓度（单位：mg/ml），并且根据纯化后的酶的酶活力（单位：U/ml）计算外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的比活力（单位：U/mg）。如图2-3所示，优化后的褐藻胶裂解酶的电泳条带颜色变深，证明优化后褐藻胶裂解酶的蛋白表达量比原始的更多。另外，以褐藻胶为底物，外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的比活力为663U/mg。

实施例2：外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的酶学性质

1、pH对外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的影响

（1）将适当浓度的褐藻胶裂解酶VsAly7D 100 μl加入900 μl 0.3%褐藻胶底物（20 mMPB 缓冲液，pH=8.6），在不同pH的缓冲液中反应10 min，用分光光度计测定A₂₃₅数值，以最高酶活力为100%；使用的缓冲液分别为20 mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄（pH 6.0~8.0），甘氨酸-NaOH（pH 8.6~10.6），Na₂HPO₄-柠檬酸（pH 3.0~8.0），Tris-HCl（pH 7.05~8.95），计算不同pH条件下外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的相对酶活力。结果如图4A所示，外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D在pH 7.6时具有最高酶活，其适合反应pH为7.4-8.2。

（2）将适当浓度的纯酶分别在上述不同pH缓冲液中4℃保存24 h，取100 μl与900μl底物混合，30℃反应10 min，用分光光度计测定A₂₃₅数值，以保存0 h的酶活力为100%，计算不同pH下，外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的剩余相对酶活力。结果如图4B所示，外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D在pH 7.0-10.6的缓冲液中放置24 h，仍然可以保持较高活性，说明该酶在pH 7.0-10.6具有较好的pH稳定性。

2、温度对外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的影响

（1）将适当浓度的褐藻胶裂解酶VsAly7D纯酶100 μl加入900 μl 0.3%褐藻胶底物（20mM PB 缓冲液，pH=8.6），在不同温度（0、10、15、20、25、30、35、40 ℃）下反应10 min，用分光光度计测定A₂₃₅数值，以最高酶活力为100%，计算不同温度下VsAly7D的相对酶活力。如图5A所示，外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D最适反应温度为35 ℃，其在20-35℃具有较高的活性，说明所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D是一个冷适应的褐藻胶裂解酶，在低温下活性高。

（2）将适当浓度的外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D纯酶分别在不同温度（0、20、30、40、50、60、70 ℃）下水浴1 h，然后立即冰浴5 min，取100 μl酶液与900 μl底物混合，30 ℃反应10 min，用分光光度计测定A₂₃₅数值；以0 h的酶活力为100%，计算不同温度孵育后，外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的剩余相对酶活力。如图5B所示，外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D在0-30℃孵育1 h仍会保留约100%酶活，在40℃孵育1 h，酶活严重降低，只会保留不到20%酶活，说明所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D在0-30℃下具有很好的稳定性。

3、外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的底物偏好性

分别以溶解于20 mM pH 8.6 PB缓冲液的0.3%褐藻胶、polyM、polyG为底物，按照酶活的反应条件，测定VsAly7D酶活力，以最高酶活力为100%，计算其他底物的相对酶活力。图6结果显示外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D对褐藻胶、polyG和polyM均具有较高的比活力，分别为663 U/mg、894.4 U/mg和913.6 U/mg，说明外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D对于褐藻胶、polyM和polyG显示了出色的降解能力，且对polyM和polyG的活力基本相同，并都高于对褐藻胶的活力。

4、外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的降解方式

1 ml纯酶液加入9 ml 0.3%高黏褐藻胶底物，30℃反应不同时间（1、2、5、10、20、30、60、120 min），煮沸10 min终止反应；使用乌氏粘度计，计算不同样品流出的时间差。测定的样品同时进行A₂₃₅的检测，测定对应的酶活力。如图7所示，根据乌氏粘度计数据，粘度下降缓慢，根据时程实验数据，随着时间的延长，该酶只产生单糖，说明所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D是以外切型的方式降解褐藻胶的。

5、外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的最终降解产物

分别以3 mg褐藻胶底物与20 U的VsAly7D混合，30℃反应过夜（12 h），使底物完全降解，煮沸3 min后冷冻干燥浓缩5倍，12000 rpm离心10 min后取上清，上清进行薄层层析，展开剂：正丁醇：甲酸：水=4:6:1，上清用0.22 μm的灭菌后的滤膜过滤，通过快速蛋白液相色谱（FPLC）进行产物成分分析。使用的凝胶过滤色谱柱型号为Superdex peptide 10/300 GL（GE），检测方式为紫外检测器在235nm下检测吸收峰，流动相为0.2 M碳酸氢铵。

根据已经确定成分的marker（不饱和褐藻二糖三糖），薄层层析的结果显示外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的最终降解产物为单糖，并且根据marker的洗脱体积，如图8A-8B所示，外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的最终降解产物主要为不饱和单糖（洗脱体积17.09 ml）；如图8C所示，对产物进行阴离子质谱检测，结果显示降解产物为不饱和单糖。

6、外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的NaCl依赖性

配制0.3%褐藻胶底物，溶解于PB缓冲液中（20 mM，pH=8.6），加入不同浓度的NaCl，测定VsAly7D的酶活力；将最高酶活设为100%，计算不同浓度NaCl对酶活力的影响。如图9所示，没有NaCl存在时，几乎测不到酶活，随着NaCl浓度的增加，酶活逐渐升高，在0.5 M NaCl浓度下酶活最高，然后在浓度大于0.5M后随着NaCl浓度的增高，酶活逐渐下降，说明外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D具有明显的NaCl依赖性，且在0.2-0.5M下酶活较好。

7、金属离子、EDTA和SDS对外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的活性影响

在反应体系中加入一定量的EDTA、SDS及其它金属离子，使终浓度达到1 mM，测定酶活力。如图10所示，Ca²⁺和Li⁺分别使VsAly7D的活性增加到122.1%和115.7%。但是Zn²⁺，Fe³⁺，Cu^{2 +}，SDS和EDTA显著降低VsAly7D的活性，相对活性低于20%，说明Ca²⁺和Li⁺可以促进外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的酶活，而Zn²⁺，Fe³⁺，Cu²⁺，SDS和EDTA抑制外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的酶活。

以上实施例均只代表本发明技术方案，而不是对实验进行限制，虽然我们对实验方案进行了改进，但是同领域的科研人员仍然可以对前面叙述的实验方案进行进一步的改善或者对实验环节进行科学等同替换，这些变动并不使相应技术解决方案的实质偏离本发明要求保护的技术解决方案的精神和范围。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D及其重组菌株和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1044

<212> DNA

<213> 门弧菌(Vibrio sp.)

<400> 1

atgaaacaca acgtactagt agccgcaatg gctttagctc tacctacatt cgcaattgct 60

tctgacttaa ataatggcat cgattaccca gttccagctg ataaattcga catgagaaac 120

tggaaaatca cgatcccttc tgacatcaac gaagatggaa aagtggatga aattgaaggt 180

gttgcgatgc tgagttactc gcacaaggat ttcttttttc ttaatgaaga agggaactta 240

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tgggcgcttt ctagccatcc acaagcgtca gagcacagcc aagttggcgg tactcttgaa 420

gcaacactga aagtcgacca tgtttccgag catgctaaat tcccggaaag aggacctgcg 480

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aaaggttacg ggcacgggaa tgaacctatt aagatctttt ataagaagtt ccctggccat 600

gagatgggtt cggtattctg gaactacgag cgtaacctag cgaaaaatga tcccaatcga 660

attgatattg cttacccagt ttggggtaat acttgggaaa accatgacga gccaggaaaa 720

gcgggcatcg ctttaggtga agagttcagc tacaagattg aagtggctgg tacaatgatg 780

aacctgacgt ttgaaactgg acgtcacgac accgtgactt actcgataga cctgagtaaa 840

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aaactgaagc taaacggaaa gtaa 1044

<210> 2

<211> 1044

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaacaca acgtactagt agccgcaatg gctttagctc tacctacatt cgcaattgct 60

agcgatctga ataatggcat cgactacccg gttccggcgg ataagttcga catgcgcaac 120

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aaaggctatg gccacggtaa cgagccgatc aaaatcttct acaagaagtt cccgggccac 600

gagatgggca gcgtgttctg gaactacgag cgtaatctgg cgaagaacga tccgaaccgc 660

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gcgggcatcg cgctgggtga ggagttcagc tacaagatcg aggttgcggg caccatgatg 780

aatctgacgt ttgagaccgg ccgtcacgat acggttacct acagcatcga tctgagcaag 840

ggcgtggacg acaaagactt tgagcacggc tacgccgagg acatgttcta cttcaaagcc 900

ggtgcctacg gccagtgcag tgtgagtgag agtcacccag tttggggcac gggttgtgcg 960

ggtaccggcg actttgccat cgataagaag aacggcgact acaacagcgt gaccttcagc 1020

aagctgaagc tgaatggcaa ataa 1044

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggagatatac atatgagcga tctgaataat ggc 33

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<210> 5

<211> 984

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cactgggcgc tgagcagcca tccacaagcc agcgaacaca gccaagttgg cggtacgctg 360

gaagccacgc tgaaagtgga tcatgtgagc gaacacgcca agtttccaga acgcggcccg 420

gcccatagtg tggttgtggg tcagattcac gcgaagaaga ttgacgcccg catcaaggaa 480

ggcaaaggct atggccacgg taacgagccg atcaaaatct tctacaagaa gttcccgggc 540

cacgagatgg gcagcgtgtt ctggaactac gagcgtaatc tggcgaagaa cgatccgaac 600

cgcatcgata tcgcctatcc ggtttggggc aacacgtggg aaaaccatga tgaaccgggt 660

aaagcgggca tcgcgctggg tgaggagttc agctacaaga tcgaggttgc gggcaccatg 720

atgaatctga cgtttgagac cggccgtcac gatacggtta cctacagcat cgatctgagc 780

aagggcgtgg acgacaaaga ctttgagcac ggctacgccg aggacatgtt ctacttcaaa 840

gccggtgcct acggccagtg cagtgtgagt gagagtcacc cagtttgggg cacgggttgt 900

gcgggtaccg gcgactttgc catcgataag aagaacggcg actacaacag cgtgaccttc 960

agcaagctga agctgaatgg caaa 984

<210> 6

<211> 328

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Ser Asp Leu Asn Asn Gly Ile Asp Tyr Pro Val Pro Ala Asp Lys

1 5 10 15

Phe Asp Met Arg Asn Trp Lys Ile Thr Ile Pro Ser Asp Ile Asn Glu

20 25 30

Asp Gly Lys Val Asp Glu Ile Glu Gly Val Ala Met Leu Ser Tyr Ser

35 40 45

His Lys Asp Phe Phe Phe Leu Asn Glu Glu Gly Asn Leu Val Phe Glu

50 55 60

Val His Asn Lys Ala Val Thr Thr Lys Asn Ser Lys Asn Ala Arg Ser

65 70 75 80

Glu Leu Arg Glu Met Pro Arg Gly Ala Asp Phe Ser Ile Asn Thr Asp

85 90 95

Asp Leu Gln Asn His Trp Ala Leu Ser Ser His Pro Gln Ala Ser Glu

100 105 110

His Ser Gln Val Gly Gly Thr Leu Glu Ala Thr Leu Lys Val Asp His

115 120 125

Val Ser Glu His Ala Lys Phe Pro Glu Arg Gly Pro Ala His Ser Val

130 135 140

Val Val Gly Gln Ile His Ala Lys Lys Ile Asp Ala Arg Ile Lys Glu

145 150 155 160

Gly Lys Gly Tyr Gly His Gly Asn Glu Pro Ile Lys Ile Phe Tyr Lys

165 170 175

Lys Phe Pro Gly His Glu Met Gly Ser Val Phe Trp Asn Tyr Glu Arg

180 185 190

Asn Leu Ala Lys Asn Asp Pro Asn Arg Ile Asp Ile Ala Tyr Pro Val

195 200 205

Trp Gly Asn Thr Trp Glu Asn His Asp Glu Pro Gly Lys Ala Gly Ile

210 215 220

Ala Leu Gly Glu Glu Phe Ser Tyr Lys Ile Glu Val Ala Gly Thr Met

225 230 235 240

Met Asn Leu Thr Phe Glu Thr Gly Arg His Asp Thr Val Thr Tyr Ser

245 250 255

Ile Asp Leu Ser Lys Gly Val Asp Asp Lys Asp Phe Glu His Gly Tyr

260 265 270

Ala Glu Asp Met Phe Tyr Phe Lys Ala Gly Ala Tyr Gly Gln Cys Ser

275 280 285

Val Ser Glu Ser His Pro Val Trp Gly Thr Gly Cys Ala Gly Thr Gly

290 295 300

Asp Phe Ala Ile Asp Lys Lys Asn Gly Asp Tyr Asn Ser Val Thr Phe

305 310 315 320

Ser Lys Leu Lys Leu Asn Gly Lys

325

Claims (10)

1.一种外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D，其特征在于，所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

2.根据权利要求1所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D，其特征在于，编码所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

3.根据权利要求1所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D，其特征在于，所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的适合反应温度为20-35℃。

4.根据权利要求1所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D，其特征在于，所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的适合反应pH为7.4-8.2。

5.根据权利要求1所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D，其特征在于，所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的适合反应NaCl浓度为0.2-0.5M。

6.根据权利要求1所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D，其特征在于，所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D具有明显降解褐藻胶、polyM和polyG的作用。

7.根据权利要求1所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D，其特征在于，所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D的降解方式为外切型，其最终降解产物为不饱和单糖。

8.包含权利要求2所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D编码基因的重组表达载体。

9.包含权利要求2所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D编码基因的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

10.权利要求1-7任一项所述外切型褐藻胶裂解酶VsAly7D在用于制备降解褐藻胶、polyM和polyG的酶制剂中的应用。

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