CN113234709B - 一种内切型褐藻胶裂解酶及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种内切型褐藻胶裂解酶及其编码基因和应用。所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的降解方式为内切型，能够显著降解褐藻胶、polyM和polyG，进而获得饱和褐藻胶单糖、不饱和褐藻胶单糖和不饱和褐藻胶二糖，除此之外，该酶属于一种冷适应的褐藻胶裂解酶，适合反应温度为20‑30℃，具有NaCl依赖性。本发明还构建了包含所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C编码基因的重组载体和重组菌株，能够为工业化应用和生产生物乙醇提供良好的工具。

Description

一种内切型褐藻胶裂解酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种内切型褐藻胶裂解酶及其编码基因和应用。

背景技术

生物乙醇作为石油衍生燃料的替代品已经引起了人们的注意。木质纤维素生物质中木质素的存在使生物转化过程中碳水化合物的提取复杂化，导致生物乙醇生产效率低下。因此，利用低木质素含量的原料是低成本生产生物乙醇的有效途径。褐藻因其木质素含量低而成为良好的生物乙醇生产来源。而且藻类种类丰富，生长速度快，无需耕地，也显著降低了生物乙醇的生产成本。

褐藻胶是褐藻细胞壁的主要多糖，占褐藻干重的40%。褐藻胶是一种由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic acid, M)及其C5差向异构体α-L-古罗糖醛酸(α-L-guluronicacid, G)组成的大分子共聚物。褐藻胶有三种不同的聚合形式：polyG、polyM和polyMG，它们由G单元、M单元或G和M随机交替聚合组成。

褐藻胶裂解酶是一种多糖裂解酶，通过β-消除反应降解褐藻胶的1→4糖苷键。根据作用方式的不同，褐藻胶裂解酶分为内切型和外切型。内切型褐藻胶裂解酶裂解褐藻胶聚合物内的糖苷键，释放不饱和低聚糖（二糖、三糖和四糖）作为主要产物，外切型褐藻胶裂解酶从末端依次切割糖链，生成单糖。

褐藻胶降解产生的不饱和单糖转化为4-deoxy-l-erythro-5-hexoseuloseuronate (DEH)是生产生物乙醇的关键步骤。在目前的研究中，大多数外切型褐藻胶裂解酶都能产生不饱和单糖产物，但低的外切酶活性成为限速步骤。因此，寻找一种能产生单糖的内切型褐藻胶裂解酶成为高效生产生物乙醇的研究方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种内切型褐藻胶裂解酶及其编码基因和应用。本发明所述的内切型褐藻胶裂解酶不仅能产单糖，还具有广泛的底物适应性、适冷性，该酶酶活强，具有较高的降解活性。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的氨基酸序列中包含如SEQ ID No.6所示的催化区的氨基酸序列。

进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的降解方式为内切型。

进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的适合反应温度为20 ℃-30 ℃。

进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的最适反应温度为30 ℃。

进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的适合反应pH为7.7-8.9。

进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的最适反应pH为8.0。

进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C在pH 6.6-9.3具有很好的稳定性。

进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C在0-30 ℃下具有很好的稳定性。

进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的适合反应NaCl浓度为0.2-0.4 M。

进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的最适反应NaCl浓度为0.3 M。

进一步的，Fe³⁺和Ca²⁺促进所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的酶活；Cu²⁺、Co²⁺、Zn^{2 +}、Ni²⁺、SDS和EDTA抑制所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的酶活。

进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C具有广泛的底物适应性，能够显著降解褐藻胶、polyM和polyG。

进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的最终降解产物为饱和褐藻胶单糖、不饱和褐藻胶单糖和不饱和褐藻胶二糖。

本发明还提供了所述的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其中包含如SEQ ID No.5所示的催化区的核苷酸序列。

本发明还提供了包含所述的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的编码基因的重组表达载体。

进一步的，所述重组表达载体为pET-24a(+)载体。

本发明还提供了包含所述的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的编码基因的重组菌株。

进一步的，所述重组菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

进一步的，所述的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的制备方法为：将所述重组菌株接种到含有卡那霉素的液体LB培养基中37 ℃摇床培养，培养至OD₆₀₀为0.4~0.6时，加入IPTG使其终浓度为0.25 mM，18 ℃诱导48 h；菌体离心去上清，沉淀重悬后破碎，再离心收集上清液得到粗酶液；使用镍离子亲和柱将粗酶液分离纯化获得所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C。

本发明还提供了所述的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C在用于制备降解海洋多糖的生物酶制剂中的应用。

进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的使用量为30 U/mg -50 U/mg。

进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C能够显著降解褐藻胶、polyM和polyG。

本发明还提供了所述的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C在用于生产褐藻胶单糖和/或褐藻胶二糖中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：

本发明所述的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C可以利用含有TsAly7C编码基因的重组菌体通过培养、诱导和分离纯化获得；该酶的最适反应温度30 ℃，且在0-30 ℃下具有良好的稳定性，因此该酶属于一种冷适应的褐藻胶裂解酶，能够在低温下有效降解底物，并且该酶的降解方式为内切型，最终降解产物为饱和褐藻胶单糖、不饱和褐藻胶单糖和不饱和褐藻胶二糖。另外，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的最适pH为8.0，在pH6.6-9.3具有较好的稳定性，其同时具有广泛的底物降解性，能够降解褐藻胶、polyG和polyM，并且具有很高的比活力，而且所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C对褐藻胶降解速率高，能够快速产生不饱和单糖，可用于DEH的生产。本发明还构建了含上述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的重组载体和重组菌株并且确定了其酶学性质和降解速率，能够为工业化应用和生产生物乙醇提供了良好的基础。

附图说明

图1：内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C表达纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳图（1，pET-24a(+)空载体；2，细菌破碎液；3，细菌破碎离心后上清液；4，TsAly7C纯酶）。

图2：pH对所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的影响结果（A，不同反应pH对酶活力的影响；B，酶的pH稳定性）。

图3：温度对所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的影响结果（A，不同反应温度对酶活力的影响；B，酶的温度稳定性）。

图4：所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的底物偏好性结果。

图5：所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的降解方式结果（A，乌氏粘度计结果；B，时程实验结果）。

图6：所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的最终降解产物结果（A，凝胶过滤色谱结果；B，阴离子电喷雾离子化质谱结果-单糖；C，阴离子电喷雾离子化质谱结果-二糖）。

图7：所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的NaCl依赖性结果。

图8：金属离子、EDTA和SDS对所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C活性的影响结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步详细的解释说明。

实施例1：内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的制备

1、内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C编码基因的克隆和获取

本发明提供的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的全长氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。以内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C编码基因全长序列（SEQ ID No.1）作为PCR反应的模板，并使用如下含有pET-24a同源臂的引物进行PCR扩增：

F：5’- TAAGAAGGAGATATACATATGGGCTCAACAGCACCAAATAACG -3’ (SEQ ID No.2)；

R：5’- GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTCTGGTTTAGTTGCGTCACTTAATA -3’ (SEQ IDNo.3)。

PCR反应按照以下条件进行：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s；58 ℃退火15 s；72 ℃延伸1 min，共进行28个循环，之后72 ℃延伸5 min。将获得PCR产物经过测序后，得到如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

上述PCR获得的如SEQ ID No.4所示的序列包含pET-24a同源臂的部分以及内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的催化区的核苷酸序列，其中内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的催化区的核苷酸序列1035 bp，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列共编码345个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，理论分子量38.7 kDa。

2、内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的重组表达载体的构建

将获得的上述PCR产物经过胶回收试剂盒（思科捷）纯化后，与用限制性内切酶NdeI和Xho I双酶切的pET-24a(+)载体（Novagen公司）连接，再转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆进行DNA测序。测序获得的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；获得的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，确定测序正确，目的片段已经连入。将测序正确的重组表达质粒，使用质粒提取试剂盒（思科捷）提取质粒。将重组表达质粒转化入表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)。

3、内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的诱导发酵

将重组的含有pET24a-TsAly7C载体的大肠杆菌BL21(DE3)划线，挑单克隆至5 mL含有卡那霉素（kana，50 μg/mL）的液体LB培养基中，37 ℃摇床培养过夜。

再转接到装有100 mL液体LB（50 μg/mL kana）的500 mL锥形瓶中，于37 ℃培养至OD₆₀₀为0.4~0.6时，加入IPTG（isopropyl-β-D-galactopyraNoside），使其终浓度为0.25mM，18 ℃诱导48 h。菌体离心，6500 rpm，30 min，去掉上清，沉淀用溶液A进行重悬（10 mL，20 mM PB，500 mM NaCl，pH=8.0）。将菌体使用高压破碎机破碎后的混合液12000 rpm，4 ℃离心30 min，收集上清，得到粗酶液。使用A₂₃₅法测定粗酶液酶活力：测定反应体系在235 nm处的光吸收值，以100 ℃灭活10 min的酶液作对照；在此条件下，每分钟光吸收值增加0.1为一个酶活力单位（U）。

4、内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的分离纯化

使用平衡液A（20 mM PB，500 mM NaCl，pH=8.0）将镍离子亲和柱（HisTrap HP，GE）平衡5~10个体积。将处理的细胞破碎上清粗酶液上样。再使用平衡液A将未结合的杂蛋白洗脱干净，使用添加25 mM咪唑和50 mM咪唑的平衡液A洗脱其他杂蛋白。使用添加200 mM咪唑的平衡液A洗脱目的蛋白，检测酶活力；然后再使用添加500 mM咪唑的平衡液A将其他蛋白洗脱，用水冲洗柱子，最后将柱子保存在20%酒精中。

将目的蛋白收集后放入透析膜（截留分子量为10 kDa），进行低温过夜透析，透析溶液为添加300 mM NaCl的20 mM PB，pH8.0，除掉样品中的咪唑。透析后目的蛋白放入-20℃进行保存。将目的蛋白样品取10 μL加入等体积的2×变性缓冲液（loading buffer），煮沸10 min后于常温12000 rpm离心2 min，取上清，进行SDS-PAGE电泳，胶浓度为10%，浓缩胶电压为80 V，分离胶电压为120 V。电泳胶在考马斯亮蓝R-250震荡染色4 h，使用脱色液（乙酸：乙醇：水=2:1:17）脱色后，拍照，分析。如图1所示，内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的分子量约为38 kDa，与预测分子量相符。

使用蛋白浓度测定试剂盒（新赛美）测定蛋白浓度（单位：mg/mL），并且根据纯化后的酶的酶活力（单位：U/mL）计算内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的比活力（单位：U/mg）。如图1中的泳道4所示，纯化后的褐藻胶裂解酶的电泳条带单一，证明蛋白纯化成功。另外，以褐藻胶为底物，检测到内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的比活力为1187 U/mg。

实施例2：内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的酶学性质

1、pH对内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的影响

（1）将适当浓度的褐藻胶裂解酶TsAly7C 100 μL加入900 μL 0.3%褐藻胶底物（20mM PB 缓冲液，pH=8.0），在不同pH的缓冲液中反应10 min，用分光光度计测定A₂₃₅数值，以最高酶活力为100%；使用的缓冲液分别为50 mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄（pH6.0~8.0），甘氨酸-NaOH （pH8.6~10.6），Na₂HPO₄-柠檬酸（pH3.0~8.0），Tris-HCl（pH7.05~8.95），计算不同pH条件下内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的相对酶活力。结果如图2A所示，内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C适合反应pH为7.7-8.9，且在pH 8.0时具有最高酶活。

（2）将适当浓度的纯酶分别在上述不同pH缓冲液中4 ℃保存12 h，取100 μL与900μL底物混合，30 ℃反应10 min，用分光光度计测定A₂₃₅数值，以未处理的酶活力为100%，计算不同pH下，内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的剩余相对酶活力。结果如图2B所示，内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C在pH6.6-9.3的缓冲液中放置12 h，仍然可以保持较高活性，说明该酶在pH6.6-9.3具有较好的pH稳定性。

2、温度对内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的影响

（1）将适当浓度的褐藻胶裂解酶TsAly7C纯酶100 μL加入900 μL 0.3%褐藻胶底物（20 mM PB 缓冲液，pH=8.0），在不同温度（10、15、20、25、30、40、50、60 ℃）下反应10 min，用分光光度计测定A₂₃₅数值，以最高酶活力为100%，计算不同温度下TsAly7C的相对酶活力。如图3A所示，内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C最适反应温度为30 ℃，其在20-30 ℃具有较高的活性，说明所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C是一个冷适应的褐藻胶裂解酶，在低温下活力高并产单糖。

（2）将适当浓度的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C纯酶分别在不同温度（0、20、30、40、50、60、70、80 ℃）下水浴1 h，然后立即冰浴5 min，取100 μL酶液与900 μL底物混合，30℃反应10 min，用分光光度计测定A₂₃₅数值；以0 h的酶活力为100%，计算不同温度孵育后，内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的剩余相对酶活力。如图3B所示，内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C在0-30 ℃孵育1 h仍会保留约100%酶活，在60 ℃孵育1 h，酶活严重降低，只会保留60%左右酶活，说明所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C在0-30 ℃下具有很好的稳定性。

3、内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的底物偏好性

分别以溶解于20 mM pH8.0 PB缓冲液的0.3%褐藻胶、polyM、polyG为底物，按照酶活的反应条件，测定TsAly7C酶活力，以最高酶活力为100%，计算其他底物的相对酶活力。图4结果显示内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C对褐藻胶、polyG和polyM均具有较高的比活力，分别为1187 U/mg、1790 U/mg和2110 U/mg，说明内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C对于褐藻胶、polyM和polyG显示了出色的降解能力，且对polyM和polyG的活力基本相同，并都高于对褐藻胶的活力。

4、内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的降解方式

1 mL纯酶液加入9 mL 0.3%高黏褐藻胶底物，30 ℃反应不同时间（0、1、5、10、20、30、60 min），煮沸10 min终止反应；使用乌氏粘度计，计算不同样品流出的时间差。测定的样品同时进行A₂₃₅的检测，测定对应的酶活力。如图5所示，根据乌氏粘度计数据，粘度下降迅速，根据时程实验数据，该酶刚开始产生大糖，随着时间的延长，大糖降解产生小糖，说明所述褐藻胶裂解酶TsAly7C是以内切型的方式降解褐藻胶的。

5、内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的最终降解产物

分别以3 mg褐藻胶底物与100 U的TsAly7C混合，30 ℃反应过夜（12 h），使底物完全降解，煮沸3 min后冷冻干燥浓缩2倍，12000 rpm离心10 min后取上清，上清用0.22 μm的灭菌后的滤膜过滤，通过快速蛋白液相色谱（FPLC）进行产物成分分析。使用的凝胶过滤色谱柱型号为Superdex peptide 10/300 GL（GE），检测方式为紫外检测器在235 nm下检测吸收峰，流动相为0.2 M碳酸氢铵。

根据已经确定成分的marker（不饱和褐藻胶二糖和三糖）的洗脱体积，如图6A所示，内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的最终降解产物主要为不饱和褐藻胶二糖和不饱和褐藻胶单糖（洗脱体积15.6 mL和16.7 mL）；如图6B和6C所示，对产物进行阴离子质谱检测，结果显示降解产物为饱和褐藻胶单糖、不饱和褐藻胶单糖和不饱和褐藻胶二糖。

6、内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的NaCl依赖性

配制0.3%褐藻胶底物，溶解于PB缓冲液中（20 mM，pH=8.0），加入不同浓度的NaCl，测定TsAly7C的酶活力；将最高酶活设为100%，计算不同浓度NaCl对酶活力的影响。如图7所示，没有NaCl存在时，几乎测不到酶活，随着NaCl浓度的增加，酶活逐渐升高，在0.3 M NaCl浓度下酶活最高，然后在浓度大于0.3 M后随着NaCl浓度的增高，酶活逐渐下降，说明内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C具有明显的NaCl依赖性，且在0.2-0.4 M下酶活较好。

7、金属离子、EDTA和SDS对内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的活性影响

在反应体系中加入一定量的EDTA、SDS及其它金属离子，使终浓度达到1 mM，测定酶活力。如图8所示，Fe³⁺和Ca²⁺分别使TsAly7C的活性增加到128.9%和126.2%。但是Cu²⁺、Co^{2 +}、Zn²⁺、Ni²⁺、SDS和EDTA显著降低TsAly7C的活性，其中Zn²⁺和SDS的存在下几乎检测不到酶活，说明Fe³⁺和Ca²⁺可以促进内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的酶活，而Cu²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、SDS和EDTA抑制内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的酶活，且Zn²⁺和SDS具有非常强的抑制作用。

以上实施例均只代表本发明技术方案，而不是对实验进行限制，虽然我们对实验方案进行了改进，但是同领域的科研人员仍然可以对前面叙述的实验方案进行进一步的改善或者对实验环节进行科学等同替换，这些变动并不使相应技术解决方案的实质偏离本发明要求保护的技术解决方案的精神和范围。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种内切型褐藻胶裂解酶及其编码基因和应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1107

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcaacgat tcacgttcaa cgtaccggta acattaagct tgttagcatc aataatttta 60

gtcggttgtg gctcaacagc accaaataac gacgatgctg caaataaaac ggcccaaaca 120

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ttaagtgacg caactaaacc agaataa 1107

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taagaaggag atatacatat gggctcaaca gcaccaaata acg 43

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtggtggtgg tggtgctcga gttctggttt agttgcgtca cttaata 47

<210> 4

<211> 1077

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taagaaggag atatacatat gggctcaaca gcaccaaata acgacgatgc tgcaaataaa 60

acggcccaaa caaaaacacc cgttattcct gccgatgctt ttgatctcag tcattggaaa 120

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tcaaagttag tattaagtga cgcaactaaa ccagaactcg agcaccacca ccaccac 1077

<210> 5

<211> 1035

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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ttagaaaaag aaaatccaga tcgtacagat attgcttacc ctgtttgggg taatacttgg 660

gaaaatccag ccgatcctgg tgataaaggt attgagttag gcgaaagctt tagctacgaa 720

atcaatgttt ataacaacat tatgtactta acctttgaaa atgaaaaaca aggtactgtt 780

aaataccaaa ttgatttatc aaacaatgtc gacgcgtacg gcaaagtaga tgaaaaagat 840

catccgcaag gttacaaagg cgacttttta tactttaaag ccggtgctta taaccaatgt 900

agtacaaaag acgatgaact tttctggtac accgcatgtc ctggtactgg cgtttgggca 960

acagataaag ccaatggcga ttacactagt gtcgcttttt caaagttagt attaagtgac 1020

gcaactaaac cagaa 1035

<210> 6

<211> 345

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gly Ser Thr Ala Pro Asn Asn Asp Asp Ala Ala Asn Lys Thr Ala Gln

1 5 10 15

Thr Lys Thr Pro Val Ile Pro Ala Asp Ala Phe Asp Leu Ser His Trp

20 25 30

Lys Ile Thr Leu Pro Leu Asp Asp Asn Asn Asp Gly Lys Ile Asp Glu

35 40 45

Ile Ser Val Arg Lys Ile Gln Arg Tyr Ser His Pro Asp Phe Phe Tyr

50 55 60

Leu Asn Glu Asn Gln Glu Met Val Phe Thr Val Pro Asn Lys Ala Lys

65 70 75 80

Thr Thr Ser Gly Ser Ser Asn Thr Arg Ser Glu Leu Arg Gln Met Pro

85 90 95

Arg Gly Lys Asn Lys Lys Ile Lys Thr His Ala Pro Gly Asn Asn Phe

100 105 110

Ala Leu Ala Val Asn Asp Lys Ala Glu Ile Ile Gly Gly Lys Met Asn

115 120 125

Ala Thr Leu Lys Val Asn His Val Ala Lys Arg Ala Gly Tyr Lys Asn

130 135 140

Lys Lys Pro Ala Tyr Ser Val Val Val Gly Gln Ile His Ala Thr Lys

145 150 155 160

Asp Lys Asn Ile Val Ala Glu Gly Asn Gly Phe Gly Trp Gly Asn Glu

165 170 175

Pro Ile Lys Ile Tyr Tyr Lys Lys Trp Pro Glu His Lys Thr Gly Ser

180 185 190

Val Phe Trp Asn Tyr Glu Arg Asn Leu Glu Lys Glu Asn Pro Asp Arg

195 200 205

Thr Asp Ile Ala Tyr Pro Val Trp Gly Asn Thr Trp Glu Asn Pro Ala

210 215 220

Asp Pro Gly Asp Lys Gly Ile Glu Leu Gly Glu Ser Phe Ser Tyr Glu

225 230 235 240

Ile Asn Val Tyr Asn Asn Ile Met Tyr Leu Thr Phe Glu Asn Glu Lys

245 250 255

Gln Gly Thr Val Lys Tyr Gln Ile Asp Leu Ser Asn Asn Val Asp Ala

260 265 270

Tyr Gly Lys Val Asp Glu Lys Asp His Pro Gln Gly Tyr Lys Gly Asp

275 280 285

Phe Leu Tyr Phe Lys Ala Gly Ala Tyr Asn Gln Cys Ser Thr Lys Asp

290 295 300

Asp Glu Leu Phe Trp Tyr Thr Ala Cys Pro Gly Thr Gly Val Trp Ala

305 310 315 320

Thr Asp Lys Ala Asn Gly Asp Tyr Thr Ser Val Ala Phe Ser Lys Leu

325 330 335

Val Leu Ser Asp Ala Thr Lys Pro Glu

340 345

<210> 7

<211> 368

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Gln Arg Phe Thr Phe Asn Val Pro Val Thr Leu Ser Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ser Ile Ile Leu Val Gly Cys Gly Ser Thr Ala Pro Asn Asn Asp Asp

20 25 30

Ala Ala Asn Lys Thr Ala Gln Thr Lys Thr Pro Val Ile Pro Ala Asp

35 40 45

Ala Phe Asp Leu Ser His Trp Lys Ile Thr Leu Pro Leu Asp Asp Asn

50 55 60

Asn Asp Gly Lys Ile Asp Glu Ile Ser Val Arg Lys Ile Gln Arg Tyr

65 70 75 80

Ser His Pro Asp Phe Phe Tyr Leu Asn Glu Asn Gln Glu Met Val Phe

85 90 95

Thr Val Pro Asn Lys Ala Lys Thr Thr Ser Gly Ser Ser Asn Thr Arg

100 105 110

Ser Glu Leu Arg Gln Met Pro Arg Gly Lys Asn Lys Lys Ile Lys Thr

115 120 125

His Ala Pro Gly Asn Asn Phe Ala Leu Ala Val Asn Asp Lys Ala Glu

130 135 140

Ile Ile Gly Gly Lys Met Asn Ala Thr Leu Lys Val Asn His Val Ala

145 150 155 160

Lys Arg Ala Gly Tyr Lys Asn Lys Lys Pro Ala Tyr Ser Val Val Val

165 170 175

Gly Gln Ile His Ala Thr Lys Asp Lys Asn Ile Val Ala Glu Gly Asn

180 185 190

Gly Phe Gly Trp Gly Asn Glu Pro Ile Lys Ile Tyr Tyr Lys Lys Trp

195 200 205

Pro Glu His Lys Thr Gly Ser Val Phe Trp Asn Tyr Glu Arg Asn Leu

210 215 220

Glu Lys Glu Asn Pro Asp Arg Thr Asp Ile Ala Tyr Pro Val Trp Gly

225 230 235 240

Asn Thr Trp Glu Asn Pro Ala Asp Pro Gly Asp Lys Gly Ile Glu Leu

245 250 255

Gly Glu Ser Phe Ser Tyr Glu Ile Asn Val Tyr Asn Asn Ile Met Tyr

260 265 270

Leu Thr Phe Glu Asn Glu Lys Gln Gly Thr Val Lys Tyr Gln Ile Asp

275 280 285

Leu Ser Asn Asn Val Asp Ala Tyr Gly Lys Val Asp Glu Lys Asp His

290 295 300

Pro Gln Gly Tyr Lys Gly Asp Phe Leu Tyr Phe Lys Ala Gly Ala Tyr

305 310 315 320

Asn Gln Cys Ser Thr Lys Asp Asp Glu Leu Phe Trp Tyr Thr Ala Cys

325 330 335

Pro Gly Thr Gly Val Trp Ala Thr Asp Lys Ala Asn Gly Asp Tyr Thr

340 345 350

Ser Val Ala Phe Ser Lys Leu Val Leu Ser Asp Ala Thr Lys Pro Glu

355 360 365

Claims (6)

1.一种内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C，其特征在于，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

2.权利要求1所述的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其中包含如SEQ ID No.5所示的催化区的核苷酸序列。

3.包含权利要求2所述的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的编码基因的重组表达载体。

4.包含权利要求2所述的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的编码基因的重组菌株。

5.权利要求1所述的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C在用于制备降解海洋多糖的生物酶制剂中的应用。

6.权利要求1所述的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C在用于生产褐藻胶单糖和/或褐藻胶二糖中的应用。

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