CN104293754B - 一种内切型褐藻胶裂解酶及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种内切型褐藻胶裂解酶及其编码基因与应用。一种内切型褐藻胶裂解酶AlgL‑5，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。编码所述内切型褐藻胶裂解酶AlgL‑5的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述的褐藻胶裂解酶AlgL‑5降解褐藻胶过程中寡糖主产物包括不饱和二糖、不饱和三糖、和不饱和四糖不饱和五糖。酶的最小不饱和寡糖底物是五糖，最小不饱和寡糖产物是二糖。重组酶的性质稳定，具备一定工业应用的潜质。

Description

一种内切型褐藻胶裂解酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种内切型褐藻胶裂解酶及其编码基因与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

褐藻胶是由α-L-古罗糖醛酸(Guluronic acid,G)和β-D-甘露糖醛酸(Mannuronicacid,M)两种糖单元通过糖苷键链接而成的线性多糖，分子内聚M段、聚G段和M/G混合段交替排列。通常，褐藻胶由海带、马尾藻等食用型褐藻加工制得。铜绿假单胞菌、棕色固氮菌等微生物能分泌具有乙酰基修饰的褐藻胶。

大型海藻来源的褐藻胶，与琼胶、卡拉胶并称产量最大、用途最广的三大海洋多糖，广泛应用于化工、医药和食品行业。最新研究表明：用褐藻胶制备的聚M段寡糖药物“971”能抑制β淀粉样细胞的聚集和细胞毒性，正用于抗阿尔兹海默症的二期临床研究；聚G寡糖可与抗生素协同抑制临床多耐药致病菌。因此，组成特殊、聚合度特定的褐藻胶寡糖具有重要应用价值和经济价值，实现这类寡糖的高效制备具有重要意义。

褐藻胶裂解酶通过β-消去机制催化褐藻胶分子内糖苷键的断裂，产生非还原性末端含有共轭结构且在232nm附近具有特征吸收的系列寡糖。与化学降解相比，褐藻胶的酶法降解具有条件温和、易控制，且底物选择性强等特征，因而具有推广应用的潜质。已发现的褐藻胶裂解酶主要分离自海螺消化系统、海藻降解菌或海藻病毒等。受限于天然褐藻胶裂解酶的产量低，转基因生产褐藻胶裂解酶虽易提高产量，但多数酶的水溶性、活性较差等综合因素的影响，直至今日，与β-琼胶酶、纤维素酶等同类产品相比，少见广泛应用的商品化褐藻胶裂解酶。

中国专利文献CN102994407A(申请号201110424529.2)公开了一种内切褐藻胶裂解酶Alg2A的基因序列及其制备方法与应用。该发明所涉及的褐藻胶裂解酶Alg2A来源土壤新分离菌株Flavobacterium sp.S20。该发明还提供了一种制备该新型褐藻胶裂解酶的方法，即利用基因工程的技术方法，将该新褐藻胶裂解酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达制备的褐藻胶裂解酶Alg2A，具有降解褐藻酸钠制备褐藻酸钠寡糖的功能。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种内切型褐藻胶裂解酶及其编码基因与应用。该酶能降解褐藻胶并最终产生以不饱和二糖、不饱和三糖及不饱和四糖为主产物的系列寡糖，且摩尔比约为1:2.7:2.8；该酶最小的不饱和寡糖底物是五糖，最小的不饱和寡糖产物是二糖；该酶以内切方式降解不饱和五糖，产生等量的不饱和二糖与不饱和三糖，且不饱和二糖产生自底物的非还原性末端。

一种内切型褐藻胶裂解酶AlgL-5，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述内切型褐藻胶裂解酶AlgL-5的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种重组表达载体，在表达载体中插入了上述内切型褐藻胶裂解酶AlgL-5的编码基因。

一种重组菌或转基因细胞系，在宿主细胞或细胞系中插入了上述内切型褐藻胶裂解酶AlgL-5的编码基因。

上述内切型褐藻胶裂解酶AlgL-5在分解褐藻胶、褐藻胶寡糖或制备不饱和寡糖中的应用。

有益效果

1、本发明所述的褐藻胶裂解酶AlgL-5，由火色杆菌属细菌(Flammeovirgayaeyamensis)MY04的基因组编码，是细菌中首次报道的内切型褐藻胶裂解酶，且酶的性质稳定，具备工业应用的潜质。

2、本发明制备的内切型褐藻胶裂解酶AlgL-5对褐藻胶的比活可达到940U/mg，适用于系列不饱和寡糖的生产。

附图说明

图1、褐藻胶裂解酶AlgL-5功能模块构成的BLAST分析结果；

图2、重组外切型褐藻胶裂解酶rAlgL-5表达及纯化情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)；

其中：M、蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD；泳道1、对照菌株破壁前菌体，上样量10μL，泳道2、重组菌破壁前菌体，上样量10μL，泳道3、重组菌破壁后上清，上样量10μL，泳道4、经镍柱纯化的rAlgL-5，上样量10μL；

图3、温度对重组褐藻胶裂解酶rAlgL-5的活性影响曲线；

图4、pH值对重组褐藻胶裂解酶rAlgL-5的活性影响曲线；

图5、温度对重组褐藻胶裂解酶rAlgL-5的稳定性影响曲线；

图6、pH值对重组褐藻胶裂解酶rAlgL-5的稳定性影响曲线；

图7、金属离子对重组褐藻胶裂解酶rAlgL-5活性的影响柱形图；

图8、用重组褐藻胶裂解酶rAgaL-5降解褐藻酸钠后寡糖产物的分子凝胶色谱-HPLC分析图；(1)DP2，不饱和二糖；(2)DP3，不饱和三糖；(3)DP4，不饱和四糖；(4)DP5，不饱和五糖；(5)DP6，不饱和六糖；

图9、用重组褐藻胶裂解酶rAgaL-5降解所制备系列不饱和寡糖的HPLC分析图；

图10、外切型褐藻胶裂解酶rAlgL-5不同时间降解还原性末端被荧光标记的不饱和五糖的产物的HPLC分析图。

具体实施方式

以下实施例的阐述，是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术，而不是为了限制本发明的应用范围。发明人已经尽最大努力确保实施例中个参数的准确性(例如量，温度，等等)，但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。除非另有说明，本发明中分子量是指重均分子量，温度是摄氏度。

生物材料来源

火色杆菌(Flammeovirga yaeyamensis)MY04来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.2777，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2008年11月27日。

实施例1、火色杆菌(Flammeovirga yaeyamensis)MY04菌株基因组DNA的提取

将火色杆菌(Flammeovirga yaeyamensis)MY04接种至液体培养基YT04中，在28℃、200rpm的条件下，振荡培养至600nm吸光值(OD₆₀₀)为1.2；取培养菌液10mL，在12,000×g(g，地球引力常数)条件下离心15min，收集菌体沉淀；用10mL的溶菌酶缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0)悬浮菌体，在12,000rmp条件下离心15min，收集菌体沉淀。

上述液体培养基YT04的每升组分如下：

胰蛋白胨10g、酵母提取物5.0g、氯化钠30g，水定容至1L，pH7.2。

向上述菌体沉淀中，每管加入溶菌酶缓冲液6.0mL，得到约7.0mL的菌液，分别加入浓度为20mg/mL的溶菌酶溶液各280μL，使溶菌酶终浓度为800μg/mL；置于冰水浴中1.0h，然后转移至37℃水浴中，温浴2h，至反应体系粘稠；加入浓度为100mg/mL的十六烷基磺酸钠溶液0.41mL、100mg/mL的蛋白酶K溶液30μL，在52℃温浴1.0h；加入Tris-平衡过的酚/氯仿/异戊醇(体积比25：24：1)溶液7.5mL，轻轻颠倒混匀；在10,000×g、4℃条件下离心10min，收集上清，并加入1.0mL的NaAc-HAc(pH5.2，3.0M)缓冲液，以及8.5mL的无水乙醇，充分混匀；用0.5mL的枪头挑出丝状DNA，转移至1.5mL的EP离心管中，以70％乙醇(贮于-20℃)，洗涤2次，微离心后弃掉上清；在10,000×g、4℃条件下离心2min，彻底弃掉上清；将DNA沉淀于无菌工作台中风吹干燥，然后用无菌去离子水在4℃过夜溶解DNA样品，制得基因组DNA。

实施例2、火色杆菌(Flammeovirga yaeyamensis)MY04菌株基因组的扫描及其序列分析。

将实施例1制得的基因组DNA，采用焦磷酸测序技术进行基因组的扫描测序，由上海美吉生物公司完成。用NCBI(National Center for Biotechnology Information,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站的在线软件对DNA测序结果进行分析。所用到的NCBI网站的分析软件是Open Reading Frame Finder(ORF Finder,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和Basic Local Alignment Search Tool(BLAST,http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

用上述生物学软件分析的结果显示，火色杆菌(Flammeovirga yaeyamensis)MY04菌株基因组DNA上携带一个褐藻胶裂解酶的编码因algL-5，基因algL-5的编码区长1701bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。基因algL-5所编码的褐藻胶裂解酶AlgL-5共含有566个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。用BLAST软件在线分析，结果显示，褐藻胶裂解酶AlgL-5与Zobellia galactanivorans的基因组序列所编码的由446个氨基酸组成的褐藻胶裂解酶(NCBI注册号：WP_013992548.1)有42％的同源性，其如图1所示：蛋白质的中段含有可结合碳水化合物的F5-F8-type C结构域，C-端含有褐藻胶裂解酶超级家族2中保守的催化结构域。用生物学软件BioEdit7.0.5.3进行分析，显示蛋白质AlgL-5的理论分子量约为61kD。用信号肽在线预测软件SignalP4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线分析，该蛋白质的氨基酸序列中不含有分泌型信号肽。

实施例3、基因algL-5在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中的重组表达

以实施例1制得的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。引物序列如下：

正向引物AlgL5-F：5，-CGGATCCGATGAACAACCAGTACAATG-3’(BamH I)；

反向引物AlgL5-R：5’-GCTCGAGGTGACTTACTTTTAGGTAAC-3’(Xho I)；

正向引物AlgL5-F中下划线标注的是限制性内切酶BamH I位点，反向引物AlgL5-R下划线标注的是限制性内切酶Xho I位点。所用高保真DNA聚合酶Primerstar HS购自中国大连宝生物公司，所用PCR反应试剂按照该公司提供的产品说明进行操作。

PCR反应条件：95℃预变性4min；94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸110s，30个循环；72℃延伸5min；4℃稳定15min。

将PCR产物用限制性内切酶BamH I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。将购于美国Invitrogen公司的产品pET-22b(+)质粒DNA，用Xho I和BamHI双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。限制性内切酶Xho I和BamH I均购于中国大连宝生物公司，酶切所用到的酶与底物反应的体系、温度和时间，均按照该公司提供的产品说明操作。

将经过Xho I和BamH I双酶切的PCR产物，与同样经过双酶切的pET-22b(+)质粒载体，在DNA连接酶的催化下进行接；连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基固体平板上，37℃培养16h后，挑取单克隆；将单克隆接入含有100μg/mL氨苄青霉素的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；将质粒用正向引物AlgL5-F和反向引物AlgL5-R进行PCR验证，结果得到大小为1.7kb的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确；接着将该重组质粒进行测序，结果表明，在pET-22b(+)的BamH I和Xho I酶切位点之间插入SEQ ID NO.1所示的基因algL-5，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将该重组质粒命名为pE22-AlgL5。

将重组质粒pE22-AlgL5转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)(购自美国Invitrogen公司)，然后按照该公司提供的操作步骤，使用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行重组琼胶酶rAlgL-5的诱导表达。并用Ni-琼脂糖凝胶对rAlgL-5进行纯化，纯化条件按照凝胶的产品手册操作。用聚丙烯酰胺凝变性胶电泳检测重组琼胶酶rAlgL-5的纯化情况。结果如图2所示：经IPTG诱导表达后的BL21(DE3)菌体中，rAlgL-5的产量不低于400mg/L菌体培养物；纯化后的重组琼胶酶rAlgL-5在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合；将纯化后的rAlgL-5样品装入最小分子截留量为10kDa的透析袋，在4℃环境中对缓冲液透析，所说缓冲液的成分是50mM Tris、150mM NaCl，pH7.5，制得重组酶rAlgL-5酶液。

实施例4、重组酶rAlgL-5最适温度的测定

用去离子水配制质量体积浓度为1.2％的褐藻酸钠底物溶液，加热溶解后，置于0℃、10℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃水浴环境中降温1h。向每900μL底物溶液中添加实施例3制得的重组酶rAlgL-5的稀释液100μL，重组酶rAlgL-5的稀释液浓度为10μg/mL，混匀后继续反应，隔时取样。每个温度条件下6个平行样品，以沸水浴灭活的重组酶制剂为对照组。

用DNS-还原糖法测定各反应体系中新生成还原糖的浓度(OD₅₄₀)，并计算平均值，进行偏差分析。最大吸收值对应的反应温度为重组酶的最适温度，相对酶活(RA)定义为：各吸收值与最大吸收值的百分比。结果如图3所示：rAlgL-5在40℃反应时达到最大活力，这表明重组酶rAlgL-5的最适反应温度是40℃。在0～20℃的活性高于在40℃时酶活的50％，这表明rAlgL-5具有适冷的酶学性质。

实施例5、重组酶rAlgL-5最适pH的测定

分别用浓度为50mM的NaAc-HAC缓冲液、50mM的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液、50mM的Tris-HCl缓冲液，分别与琼脂糖配制质量体积浓度(g/mL)为1.2％的琼脂糖底物溶液，所对应的pH值分别为5、6，6、7、8，7、8、9、10三个区段，各pH值均在最适温度下调定。将底物加热溶解后，置于最适温度中降温1h，然后向每900μL底物溶液中添加实施例4制得的重组酶rAlgL-5的稀释液100μL，混匀后开始反应，并隔时取样。每个pH条件下6个平行样品，以沸水浴灭活的重组酶制剂为对照组。用DNS-还原糖法测定各反应体系中新生成的还原糖浓度(OD₅₄₀)，并计算平均值和偏差。相对酶(RA)活定义为：各组平均吸收值与最大吸收值的百分比。最大吸收值对应的pH为重组酶的最适pH。结果如图4所示：重组酶rAlgL-5的最适反应pH为7.0。

实施例6、重组酶rAlgL-5的温度稳定性分析

将实施例3制得的重组酶rAlgL-5酶液在不同温度(0℃～70℃)下热处理1h后，分别与用蒸馏水配置的质量体积浓度(g/mL)为1.2％的褐藻酸钠，按1：9(体积比)的比例混合，然后在最适温度下测定剩余酶活，以不经过热处理的酶液酶活定义为100％相对活力。结果如图5所示：重组酶rAlgL-5在低于40℃的温度下预处理1h后，仍然具有>90％的残余活性，表现出一定的热稳定性。

实施例7、重组酶rAlgL-5的pH稳定性分析

将实施例3制得的重组酶rAlgL-5的酶液，在最适温度(40℃)、不同的pH(pH5～10)环境中分别预孵育1h后，与质量体积浓度(g/mL)为1.2％的褐藻酸钠底物溶液按1：9(体积比)的比例混合，然后在最适温度下测定剩余酶活，以不经过预处理的酶液酶活定义为100％相对活力。结果如图6所示，在pH5～9的范围内预处理1h，rAlgL-5酶活仍保持80％以上。这表明rAlgL-5对pH值耐受范围较广。

实施例8、金属离子对重组酶rAlgL-5活性的影响

将用去离子水配置的质量浓度为1.2％褐藻酸钠底物、实施例3制得的重组酶rAlgL-5酶液、以及水按5：1：4(体积比)的比例混合后，接着向反应体系中添加不同的金属离子，添加的离子终浓度为1mM或10mM，然后在45℃反应40min，按前述的DNS-还原糖法测酶的活力。对照组为不加任何金属离子时rAlgL-5的活性(设定为100％)。结果图7所示，在1mM或10mM浓度下：(1)Na⁺、K⁺、Li⁺等三种一价金属试剂对rAlgL-5的活性表现为微弱的作用，Ag⁺具有显著抑制作用；(2)Cu²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺等二价金属例子，Cr³⁺、Fe³⁺等三价金属离子对酶活具有抑制作用；(3)β-巯基乙醇有促进活性，在10mM浓度下使酶活提高至135.9％。

实施例9、DNS-还原糖法测定重组酶rAlgL-5的酶活

将用去离子水配置的质量浓度为1.2％的褐藻酸钠、浓度为10μg/mL的重组酶rAlgL-5酶液、150mmol/L的HAc-NaAc(pH6.0)缓冲液以及水按1：1：1(体积比)的比例混合后，40℃下反应40min。将反应产物在沸水浴中加热10min，转入冰水浴中5min,在12,000×g、4℃条件下离心15min，收集上清；将一定体积的上清与等体积的DNS(3,5-对硝基二甲苯)-反应液混匀，在沸水浴中加热10min，降至室温，在540nm测定吸收值。用分析纯葡萄糖醛酸钠内酯作标准品，同样方法操作，绘制葡萄糖醛酸内酯的摩尔浓度与OD₅₄₀之间的量效关系曲线。用购于上海生工生物工程有限公司的蛋白质定量试剂盒测定重组酶rAlgL-5酶液的蛋白含量。按照国际标准定义计算酶的活力单位，即在标准条件下，每分钟内产生1μmol产物所需的酶量为1个IU。结果表明：重组rAlgL-5能以褐藻酸钠为底物，酶解并产生还原糖产物，酶活为450U/mg。

实施例10、重组酶rAlgL-5降解褐藻酸钠的产物的高效液相(HPLC)分析

用去离子水配制质量体积浓度(g/mL)为1.2％的褐藻酸钠底物，加热溶解后，置于40℃水浴环境中降温1h。向每100μL底物中添加实施例43制得的重组酶rAlgL-5的稀释液100μL，混匀后继续反应，隔时取样。将反应产物在沸水浴中加热10min，转入冰水浴中5min。在12,000×g、4℃条件下离心5min，收集上清。

用浓度为0.20mol/L的NH₄HCO₃溶液，平衡Superdex Peptide10/300GL(GE公司)分子凝胶色谱柱，流速0.40mL/min，至少2柱床。将上述褐藻酸钠的不同酶解时间的样品，以自动进样器加载20μL/样品，其它条件不变，232nm检测。用HPLC操作软件，分析各寡糖组分的积分面积，计算相对摩尔浓度。

如图8所示，在上述条件下，褐藻酸钠底物被降解后，随着酶解反应时间的增加，具有232nm特征吸收的寡糖产物的含量逐渐增加，且相对含量趋于稳定。这表明rAlgL-5是褐藻胶裂解酶而非褐藻胶水解酶。酶解反应的寡糖主产物是HPLC分析中出峰时间为34.8'、36.0'、38.2'、40.5'和43.2'的五个主产物。其中，出峰时间为38.2'、40.5'和43.2'的三个主产物，面积比稳定为3:3:1，提示其摩尔比为3:3:1。

实施例11、重组酶rAlgL-5降解褐藻酸钠的产物的分子量鉴定

按照实施例10所述，将共50mg褐藻酸钠用rAlgL-5彻底酶解，样品分批上样、过柱，并按照出峰时间分别收集单个寡糖样品。将寡糖样品分别集中后，反复冷冻干燥以脱盐。用无菌去离子水溶解所得寡糖样品，进行一级质谱(MS)分析，确定各寡糖的相对分子量。

阴离子模式一级质谱结果表明，重组酶rAlgL-5降解褐藻酸钠后的寡糖主产物，对应实施例10中所述的出峰时间分别为38.2'、40.5'和43.2'的、且在232nm具有特征吸收的三个寡糖主产物，其ESI(-)-MS所显示的分子量分别是703，527，351。这表明，这三个寡糖主产物分别是rAlgL-5降解褐藻胶之后所产生的不饱和四糖(UDP4)、不饱和三糖(UDP3)及不饱和二糖(UDP2)。结合图9的结果，说明不饱和二糖是重组酶rAlgL-5降解褐藻胶之后聚合度最小的的寡糖主产物。

实施例12、重组酶rAlgL-5最小不饱和寡糖底物的分析

用去离子水和实施例11所制备的不饱和五糖、不饱和四糖、不饱和三糖及不饱和二糖，分别配置底物溶液，与浓度为10μg/mL的重组酶rAlgL-5酶液、150mmol/L的HAc-NaAc(pH6.0)缓冲液以及水按1：1：1(体积比)的比例混合后，40℃反应0-12h。隔时取样，按照实施例10所述色谱操作条件，进行HPLC分析。结果如图10所示，重组酶rAlgL-5降解不饱和六糖(UDP6)之后产生不饱和四糖、不饱和三糖和不饱和二糖，降解不饱和五糖(UDP5)之后产生等量的不饱和三糖和不饱和二糖，但与不饱和四糖、不饱和三糖或不饱和二糖反应前后无显著变化。这表明，不饱和五糖是重组酶rAlgL-5的最小不饱和寡糖底物，且rAlgL-5以内切酶方式降解寡糖底物。

实施例13、重组酶rAlgL-5酶切模式的荧光-高效液相色谱(HPLC)分析

取约含10μg不饱和五糖的溶液，旋转蒸干。加入含过量邻氨基苯甲酰胺(2-AB)、硼腈化钠的二甲亚砜(DMSO)溶液，混匀后置60℃水浴中温育2h。旋转蒸干，加入500μL去离子水溶解样品，将样品与200μL氯仿共振荡，离心，收集上清。继续用氯仿反复抽提，不少于7次，得到还原性末端被荧光标记了的不饱和五糖(2-AB-UDP5)。同样方法标记不饱和褐藻胶寡糖的分子量标准物。

取上述2-AB-UDP5样品、150mmol/L的HAc-NaAc(pH6.0)缓冲液、实施例43制得的重组酶rAlgL-5的稀释液，按照体积比1:1:1混匀，置于40℃水浴中反应0～12h，隔时取样。将反应体系置沸水浴中10min，转至冰水浴5min，在12,000×g、4℃条件下离心至少15min。收集上清，作为重组酶rAlgL-5的寡糖降解产物。以预先在沸水浴中加热10min的rAlgL-5酶液，做阴性对照反应。

按照实施例10所述的色谱条件，将2-AB-UDP5及其不同酶解时间的样品，以自动进样器加载20μL/样品，其它条件不变，330nm激发，420nm检测。用HPLC操作软件，分析各寡糖组分的积分面积，计算相对摩尔浓度。参照分子量标准物的信号，确定各寡糖的相对分子量。

如图10所示，重组酶rAlgL-5降解还原性末端含有荧光标记的2-AB-UDP5后，产生等摩尔的含有荧光标记的不饱和三糖(2-AB-UDP3)。这表明rAlgL-5作为内切型褐藻胶裂解酶，进行酶解反应时是从底物的非还原性末端释放出最小产物不饱和二糖的。

Claims (6)

1.一种内切型褐藻胶裂解酶AlgL-5，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述内切型褐藻胶裂解酶AlgL-5的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种重组表达载体，在表达载体中插入了权利要求2所述内切型褐藻胶裂解酶AlgL-5的编码基因。

4.一种重组菌或转基因细胞系，在宿主细胞或细胞系中插入了权利要求2所述内切型褐藻胶裂解酶AlgL-5的编码基因。

5.权利要求1所述内切型褐藻胶裂解酶AlgL-5在分解褐藻酸钠或制备系列不饱和寡糖中的应用。

6.权利要求1所述内切型褐藻胶裂解酶AlgL-5在降解不饱和褐藻胶寡糖中的应用。