CN104004732B - 一种壳聚糖酶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种壳聚糖酶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种壳聚糖酶及其制备方法和应用。本发明提供的蛋白质，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；b)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有壳聚糖酶活性的蛋白质；d)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有壳聚糖酶活性的蛋白质。实验证明，本发明所提供的壳聚糖酶具有较强的实用性，可用来生产壳寡糖，且本发明所提供的壳聚糖酶的生产方法工艺简单，发酵周期短，适于工业化生产壳聚糖酶。

Description

一种壳聚糖酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一种壳聚糖酶及其制备方法和应用。
背景技术
壳聚糖是葡萄糖胺以β-1，4糖苷键连接形成的直链聚合物，是几丁质脱乙酰基的衍生物。高聚合度的壳聚糖溶于酸性溶剂，被广泛地应用于食品、制药、纺织、污水处理等行业。低聚合度的壳聚糖称为壳寡糖，水溶性大于99％，比壳聚糖具有更优越的生物活性。壳寡糖可以抑制细菌和真菌的生长，提高机体的免疫活性和抗癌能力，还可作为植物调节剂，增强植物对病虫害的防御能力等。近年来针对壳寡糖生产和利用的研究越来越受到重视。
壳聚糖酶(EC.3.2.1.132)是一类可以将壳聚糖降解的酶，作用于壳聚糖的β-1，4糖苷键。相比于传统的化学水解壳聚糖法，酶解法的反应条件温和、壳寡糖得率高、对环境的污染小，具有较好的发展前景。
不同来源的壳聚糖酶的酶解产物也千差万别。而最近的研究表明：壳聚五糖、壳聚六糖和壳聚七糖具有很好的抗肿瘤活性。目前报道的壳聚糖酶的酶解产物多为壳聚二糖和壳聚三糖。
壳聚糖酶广泛地存在于多种生物中，在细菌、真菌、病毒以及植物中均发现了壳聚糖酶。目前国内对于壳聚糖酶的研究大多集中在野生产酶菌株的筛选以及发酵条件的优化等方面，但野生菌的产酶能力远远不能达到工业应用的需求。因此构建生产工艺简单、产量高的工程菌是提高壳聚糖酶工业化水平的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种蛋白质及其编码基因与相关生物材料。该蛋白质具有较高的壳聚糖酶活性，能将壳聚糖降解为下述五种壳寡糖中的全部或部分：壳聚三糖、壳聚四糖、壳聚五糖、壳聚六糖和壳聚七糖。
本发明所提供的蛋白质，名称为ChiTS，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：
a)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
b)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有壳聚糖酶活性的蛋白质；
d)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有壳聚糖酶活性的蛋白质。
其中，SEQ ID No.2由408个氨基酸残基组成，是天然壳聚糖酶ChiTS(名称为NChiTS)的氨基酸序列；SEQ ID No.4由416个氨基酸残基组成，是重组壳聚糖酶ChiTS(名称为RChiTS)的氨基酸序列；SEQ ID No.4第1-408位氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
上述c)或d)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。上述d)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.5所示的第3-1253位核苷酸序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
与ChiTS相关的生物材料也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的与ChiTS相关的生物材料，为下述B1)至B16)中的任一种：
B1)编码ChiTS的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子具体可为如下1)或2)或3)或4)所示的核酸分子：
1)编码序列是序列表中SEQ ID No.1的第1-1227位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
2)编码序列是序列表中SEQ ID No.5的第3-1253位核苷酸(pET22b-ChiTS中从NcoI位点第1位到6个组氨酸标签后面的TGA的序列)的cDNA分子或DNA分子；
3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码ChiTS的cDNA分子或基因组DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码ChiTS的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，SEQ ID No.1由1227个核苷酸组成，编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质。SEQ ID No.5由1253个核苷酸组成，第3-1253位核苷酸编码氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质，第3-1226位核苷酸编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码氨基酸序列是SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的氨基酸序列是SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的蛋白质的核苷酸序列70％或者更高同一性的核苷酸，只要氨基酸序列是SEQ ID No.2或SEQID No.4的蛋白质且具有壳聚糖酶活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述启动子中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，B2)所述的含有编码所述蛋白质的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达ChiTS的DNA，该DNA不但可包括启动ChiTS基因转录的启动子，还可包括终止ChiTS基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有编码ChiTS基因的表达盒的重组载体。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，B5)-B8)所述的微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如大肠杆菌。
上述生物材料中，B9)-B12)所述的转基因植物细胞系和转基因动物细胞系不包括繁殖材料。
在本发明的一个实施方式中，ChiTS基因通过含有ChiTS基因的表达盒的重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中。所述含有ChiTS基因的表达盒的重组载体为将载体pET22b(+)的NcoI和XhoI位点之间的序列替换为SEQ ID No.3第8-1231位所示的DNA片段(保持pET22b(+)的其他序列不变)，得到的重组载体，将该重组载体命名为pET22b-ChiTS。
本发明的再一个目的是提供一种制备表达ChiTS的重组微生物的方法。
本发明所提供的制备表达ChiTS的重组微生物的方法，包括将所述蛋白质的编码基因导入宿主微生物细胞，得到表达ChiTS的重组微生物的步骤。
其中，所述的微生物具体可为细菌、酵母、藻或真菌。其中，细菌可为大肠杆菌。
本发明的另一个目的是提供一种表达ChiTS的重组微生物。
所述重组微生物可为重组大肠杆菌，具体可为BL21(DE3)ChiTS。
本发明的又一个目的是提供一种制备ChiTS的方法。
本发明所提供的制备ChiTS的方法，包括将ChiTS的编码基因在生物细胞中进行表达得到ChiTS的步骤；所述生物细胞为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。
上述制备ChiTS的方法中，所述微生物可为酵母或细菌或藻或真菌，如大肠杆菌。所述微生物细胞具体可为上述BL21(DE3)ChiTS。
上述制备ChiTS的方法中，将ChiTS的编码基因在生物细胞中进行表达得到ChiTS的步骤，包括将所述BL21(DE3)ChiTS在发酵培养基B中培养进行诱导表达的步骤，所述发酵培养基B由水和溶质组成，所述溶质及其在所述发酵培养基B中的终浓度为：甘油8-12g/L，KH2PO48-12g/L，(NH4)2HPO45-7g/L，柠檬酸0.5-3g/L，MgSO41.55-2.59g/L，FeSO450-100mg/L，ZnSO429.5-60mg/L，CuSO420-40mg/L，MnSO44-6mg/L，Na2B4O71-3mg/L，CaCl215-30mg/L，(NH4)6HMo7O241-2mg/L。
上述方法中，将所述BL21(DE3)ChiTS在发酵培养基B中培养进行诱导表达的步骤包括：将所述BL21(DE3)ChiTS接种到所述发酵培养基B中，获得初始发酵体系，将所述初始发酵体系在条件1下培养，得到发酵液，将该发酵液命名为发酵液B1，向发酵液B1中加入所述异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG，得到诱导液，将该诱导液命名为诱导液B1，将所述诱导液B1在条件2下培养12-30小时诱导ChiTS表达，得到发酵液，将该发酵液命名为发酵液B2，将所述发酵液B2进行离心，使ChiTS进入上清液中，收集上清液，得到ChiTS。
上述方法中，所述条件1为：温度为30-42℃、pH为6.5-7.5、通气量为1-6m3(m3·min)、搅拌速度为200-2000转/分钟、溶氧量为15-55％，具体可为：温度为35-37℃，pH为7.0，通气量为2-4m3(m3·min)，搅拌速度为400-1200转/分钟，溶氧量为25-35％或温度为37℃、pH为7.0、通气量为4m3(m3·min)、搅拌速度为800转/分钟、溶氧量为30％。
上述方法中，所述条件2为：温度为28-42℃、pH为6.5-7.5、通气量为1-6m3(m3·min)、搅拌速度为200-2000转/分钟、溶氧量为15-55％，具体可为：温度为30℃，pH为7.0，通气量为2-4m3(m3·min)，搅拌速度为400-1200转/分钟，溶氧量为25-35％或温度为30℃、pH为7.0、通气量为3m3(m3·min)、搅拌速度为800转/分钟、溶氧量为30％。
上述方法中，所述12-30小时可为18小时。
上述方法所述发酵培养基B中，所述溶质及其在所述发酵培养基B中的终浓度具体可为：甘油10g/L，KH2PO410g/L，(NH4)2HPO46g/L，柠檬酸1.8g/L，MgSO42g/L，FeSO475mg/L，ZnSO445mg/L，CuSO430mg/L，MnSO45mg/L，Na2B4O72mg/L，CaCl222mg/L，(NH4)6HMo7O241.5mg/L。
上述方法中，所述异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的终浓度为10-500μM，具体可为100μM。
ChiTS在作为壳聚糖酶中的应用、所述生物材料在制备壳聚糖酶中的应用、ChiTS或所述生物材料在降解壳聚糖中的应用、ChiTS或所述生物材料在生产壳寡糖中的应用均属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述壳寡糖可为为下述五种壳寡糖中的全部或部分：壳聚三糖、壳聚四糖、壳聚五糖、壳聚六糖和壳聚七糖。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种生产壳寡糖的方法，所述方法包括以壳聚糖为底物用ChiTS进行催化反应得到壳寡糖的步骤，所述壳寡糖包括下述五种中的全部或部分：壳聚三糖、壳聚四糖、壳聚五糖、壳聚六糖和壳聚七糖。
实验证明，本发明所提供的壳聚糖酶ChiTS以可溶的形式分泌到胞外，且具有较高的酶活，胞外酶活可达186.5U/ml。本发明所提供的壳聚糖酶ChiTS酶解壳聚糖得到的壳寡糖的主要组分为壳聚三糖、壳聚四糖、壳聚五糖、壳聚六糖和壳聚七糖，表明壳聚糖酶ChiTS酶解壳聚糖产生的壳寡糖的聚合度为3-7，该壳寡糖具有广泛的应用价值。ChiTS降解50g壳聚糖得到7.5g壳聚三糖、10.8g壳聚四糖、12g壳聚五糖、9.8g壳聚六糖和4.35g壳聚七糖，ChiTS降解壳聚糖得到的产物中各组分的比例为壳聚三糖：壳聚四糖：壳聚五糖：壳聚六糖：壳聚七糖＝7.5：10.8：12：9.8：4.35。另外，本发明所提供的壳聚糖酶的生产方法工艺简单，发酵周期短，适于工业化生产壳聚糖酶。
附图说明
图1为重组壳聚糖酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。泳道M为蛋白Marker，泳道1为重组菌pET22b-BL21(DE3)胞外酶液，泳道2为重组菌BL21(DE3)ChiTS胞外壳聚糖酶液，泳道3为纯化的壳聚糖酶。
图2为壳聚糖酶降解壳聚糖的产物的高压液相色谱图。图A为标准样品，图B为壳聚糖酶ChiTS酶解壳聚糖产生的壳寡糖溶液。DP1为葡萄糖胺，DP2为壳聚二糖，DP3为壳聚三糖，DP4为壳聚四糖，DP5为壳聚五糖，DP6为壳聚六糖，DP7为壳聚七糖。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的壳聚糖购自威海迪沙海洋生物制品有限公司，发酵罐(Labfors5，Infros Co.，瑞士)。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、制备重组菌
发现一种可利用壳聚糖为单一碳源的芽孢杆菌(Bacillus sp)，提取实施例1中的芽孢杆菌基因组DNA后，根据壳聚糖酶的相关基因序列，设计简并引物。以基因组DNA为模板，用设计的简并引物进行PCR扩增，对获得的片段进行测序，测序结果表明获得的片段含有SEQ ID No.1所示的DNA分子，SEQ ID No.1所示的DNA分子是天然壳聚糖酶ChiTS的编码序列，编码SEQ ID No.2所示的壳聚糖酶，将该天然壳聚糖酶ChiTS命名为NChiTS。
制备SEQ ID No.3的DNA分子(含有SEQ ID No.1的第1-1224位)，用NcoI和XhoI分别双酶切SEQ ID No.3的DNA分子和载体pET22b(+)(Invitrogen)，将酶切产物进行连接，得到将载体pET22b(+)(Invitrogen)的NcoI和XhoI位点之间的序列替换为SEQ ID No.3第8-1231位所示的DNA片段(保持pET22b(+)的其他序列不变)，得到含有SEQ ID No.3第8-1231位所示的DNA片段的重组载体，将该重组载体命名为pET22b-ChiTS。pET22b-ChiTS表达SEQID No.4所示的重组壳聚糖酶ChiTS，将该重组壳聚糖酶ChiTS命名为RChiTS。SEQ ID No.4的第1-408位氨基酸残基与SEQ ID No.2相同。pET22b-ChiTS中含有SEQ ID No.5第3-1253位核苷酸所示的重组壳聚糖酶ChiTS的编码基因。
将pET22b-ChiTS导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌，将其命名为BL21(DE3)ChiTS。
将空载体—pET22b(+)载体导入大肠杆菌BL21(DE3)得到含有大肠杆菌pET22b(+)的重组菌pET22b-BL21(DE3)，作为空载体对照菌。
实施例2、应用工程菌小量生产壳聚糖酶
将实施例1制备的重组菌BL21(DE3)ChiTS接种至种子培养基(1L种子培养基的制备方法为：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠用水溶解，并定容至1L，121℃灭菌30min)中，在37℃下振荡培养(200r/min)至OD600nm为3，得到的培养液即为种子液。
将所述种子液接到100ml发酵培养基A(采用500ml摇瓶)(1L发酵培养基A的制备方法为：取10g胰蛋白胨、15g酵母提取物、5g氯化钠、10g甘油、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，用水溶解，调pH为7.0并定容至1L，使磷酸二氢钾的浓度为10mM，使磷酸氢二钾的浓度为65mM，121℃灭菌30min)中，在37℃下振荡培养至OD600nm在0.4-0.9之间，得到发酵液，将该发酵液命名为发酵液A1。
向发酵液A1中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至IPTG的终浓度为100μM，得到诱导液，将该诱导液命名为诱导液A1，将诱导液A1在30℃下震荡培养(200r/min)40小时诱导蛋白表达，得到发酵液，将该发酵液命名为发酵液A2，将发酵液A2在12000r/min下离心5min，使壳聚糖酶进入上清液中，收集上清液，该上清液即为小量生产壳聚糖酶液。
实施例3、应用工程菌大量生产壳聚糖酶
1、制备胞外壳聚糖酶液
1.1将实施例1制备的重组菌BL21(DE3)ChiTS接种至实施例2的种子培养基中，在37℃下振荡培养(200r/min)至OD600nm在5-7之间，得到的培养液即为种子液。
1.2分批培养阶段：将种子液以1:10的比例接种至装有3L发酵培养基B(发酵培养基B为无菌培养基，由水与溶质组成，pH为6.9-7.1，发酵培养基B的溶质及其浓度分别为：甘油10g/L，KH2PO410g/L，(NH4)2HPO46g/L，柠檬酸1.8g/L，MgSO42g/L，FeSO475mg/L，ZnSO445mg/L，CuSO430mg/L，MnSO45mg/L，，Na2B4O72mg/L，CaCl222mg/L，(NH4)6HMo7O241.5mg/L)的全自动7L发酵罐中，获得OD600nm＝0.4的发酵初始体系，将初始发酵体系在温度为37℃、pH为7.0、通气量为4m3(m3·min)、搅拌速度为800转/分钟、溶氧量为30％的条件下发酵，发酵过程中采用25％的氨水调整发酵液的pH在6.9-7.1之间，并通过搅拌转速400-1200r/min和空气通气量2-4m3/(m3·min)级联控制，使发酵液的溶解氧维持在30％。
1.3补料流加阶段：待发酵液中的甘油耗尽，向发酵液中连续流加甘油培养基(甘油培养基为无菌培养基，溶剂为水，甘油培养基中的溶质及其终浓度为：甘油500g/L，MgSO415.5g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L)。待每升发酵液中菌体细胞干重为15克时，得到发酵液，将该发酵液液命名为发酵液B1。
1.4诱导阶段：向发酵液B1中一次性添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至IPTG的终浓度为100μM，得到诱导液，将该诱导液命名为诱导液B1，将诱导液B1在温度为30℃、pH为7.0、通气量为3m3(m3·min)、搅拌速度为800转/分钟、溶氧量为30％的条件下培养15小时诱导蛋白表达，并以恒定速率10ml/(L·h)流加所述甘油培养基。发酵结束后得到发酵液，将该发酵液命名为发酵液B2，将发酵液B2进行离心，使蛋白质进入上清液中，收集该上清液，该上清液即为胞外壳聚糖酶液。
1.5纯化壳聚糖酶：按照如下方法从该胞外壳聚糖酶液中纯化ChiTS，得到纯化ChiTS：将胞外壳聚糖酶液上到用缓冲液A(缓冲液A由水和溶质组成，缓冲液A的溶质及其浓度为50mM Tris-HCl，100mM NaCl)平衡的金属螯合(Ni2+)层析柱(购自GE公司)上，流速为1ml每分钟。然后用缓冲液B(缓冲液B由水和溶质组成，缓冲液B的溶质及其浓度为50mMTris-HCl，100mM NaCl，400mM咪唑)梯度洗脱壳聚糖酶，收集洗脱峰。
2、制备总壳聚糖酶液
2.1同本实施例步骤1中1.1。
2.2同本实施例步骤1中1.2。
2.3同本实施例步骤1中1.3。
2.4诱导阶段：向发酵液B1中一次性添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至IPTG的终浓度为100μM，得到诱导液，将该诱导液命名为诱导液B1，将诱导液B1在温度为30℃、pH为7.0、通气量为3m3(m3·min)、搅拌速度为800转/分钟、溶氧量为30％的条件下培养15小时诱导蛋白表达，并以恒定速率10ml/(L·h)流加所述甘油培养基。发酵结束后得到发酵液，将该发酵液命名为发酵液B2，对发酵液B2进行超声处理破碎发酵液B2中的细胞，得到含有胞外和胞内壳聚糖酶的发酵液B3，将发酵液B3进行离心，使蛋白质进入上清液中，收集该上清液，该上清液即为总壳聚糖酶液。
3、按照本实施例步骤1中的步骤1.1、1.2、1.3和1.4将重组菌pET22b-BL21(DE3)，作为空载体对照菌，诱导蛋白表达，得到空载体胞外酶液。
4、按照本实施例步骤2中的步骤1.1、1.2、1.3和1.4将重组菌pET22b-BL21(DE3)，作为空载体对照菌，诱导蛋白表达，得到空载体总酶液。
5、将重组菌BL21(DE3)ChiTS的胞外壳聚糖酶液、重组菌pET22b-BL21(DE3)的空载体胞外酶液和纯化的壳聚糖酶分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，如图1，结果表明只有重组菌BL21(DE3)ChiTS的胞外壳聚糖酶液和纯化的壳聚糖酶中有约45kDa的蛋白(即ChiTS)条带，重组菌pET22b-BL21(DE3)的空载体胞外酶液没有该ChiTS条带。
实施例4、壳聚糖酶的酶活测定
1)氨基葡萄糖标准曲线的绘制：
配制1g/L的D-氨基葡萄糖盐酸盐溶液，分别取D-氨基葡萄糖盐酸盐溶液0μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl于试管中，然后向每个试管中补加水使每管的总体积为500μl。向上述的每个试管加入1.5ml DNS试剂(100ml DNS试剂制备方法为：取酒石酸钾钠18.2g溶于50ml蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸0.63g、NaOH2.1g、苯酚0.5g，搅拌至各组分溶解，冷却后用蒸馏水定容至100ml)，混匀并于沸水中保温5min。冷却后用分光光度计测定每个试管中的液体在540nm的光吸收值。上述每个试管中的液体的光吸收值均减去未加入D-氨基葡萄糖管的光吸收值，得出每个试管中的液体的实际光吸收值。以每个试管中糖残基的量为横坐标，每个试管中的液体的实际光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
2)壳聚糖酶的酶活测定：
将壳聚糖(威海迪沙海洋生物制品有限公司，脱乙酰度大于90％)溶于0.1mol/L、pH5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液中得到1％(质量百分比浓度)壳聚糖溶液(pH5.0)，取2ml该壳聚糖溶液，于50℃预热10min，向该壳聚糖溶液中加入20μl实施例3得到的下述五种物质(必要时可用醋酸钠缓冲液(0.1mol/L，pH5.0)进行适当的稀释)中的任一种：胞外壳聚糖酶液、纯化ChiTS、总壳聚糖酶液、空载体胞外酶液和空载体总酶液，得到反应液1，将反应液1于50℃下保温15min，然后加入1.5ml所述DNS试剂，于沸水保温5min。将上述煮沸后的溶液离心(8000rpm，5min)除去絮状沉淀，得到上清液，然后用分光光度计测定上清液在540nm的光吸收值。通过与氨基葡萄糖标准曲线对照，计算酶解反应产生的还原糖的量。壳聚糖酶一个标准酶活单位(1U)定义为：在上述测定条件下，1min反应时间内释放1μmol还原糖所需的酶量。
实验结果表明，空载体胞外酶液和空载体总酶液均没有壳聚糖酶酶活，胞外壳聚糖酶液和总壳聚糖酶液的壳聚糖酶酶活分别为186.5U/ml和245.9U/ml，胞外壳聚糖酶分泌量高达总酶量的75.9％，纯化ChiTS的壳聚糖酶比活力为555U/mg。
实施例5、壳聚糖酶水解壳聚糖生产壳寡糖
1)壳聚糖酶水解壳聚糖
称取50g壳聚糖(威海迪沙海洋生物制品有限公司，脱乙酰度大于90％)粉末，加入500ml水，边搅拌边加入冰醋酸调pH到5.0，得到1g/10ml壳聚糖溶液，向壳聚糖溶液中加入10ml实施例3的重组菌BL21(DE3)ChiTS的胞外壳聚糖酶液(壳聚糖酶的比活力为186.5U/ml)，得到反应液2，将反应液2在50℃下保温2小时至毛细管粘度计测定粘度小于5cP时，将反应液沸水浴保温5min终止酶解反应。8000r/min离心酶解液，收集上清，得到壳寡糖溶液。
2)壳寡糖溶液进行液相色谱(HPCL)分析
HPLC分析中，以葡萄糖胺及壳聚二糖至壳聚七糖的等比例混合物为标准品(葡萄糖胺及壳聚二糖至壳聚七糖均购自上海甄准生物科技有限公司，单品纯度均在95％以上)，根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)进行定量分析壳寡糖溶液。
取20μl壳寡糖溶液注入液相色谱仪，进行高效液相色谱分析，根据色谱峰的保留时间确定各组分的聚合度。使用的色谱柱为结果如下：click maltose色谱柱，250×4.6mm。分析条件为：乙腈梯度洗脱，具体为：将20μl壳寡糖溶液注入液相色谱仪后，用流动相1(流动相1由乙腈和甲酸-甲酸铵缓冲液(甲酸-甲酸铵缓冲液的pH＝3.1，浓度为100mmol/L)组成，流动相1中乙腈和甲酸-甲酸铵缓冲液的体积比为4:1)洗脱30分钟，然后用流动相2(流动相2由乙腈和甲酸-甲酸铵缓冲液(甲酸-甲酸铵缓冲液的pH＝3.1，浓度为100mmol/L)组成，流动相2中乙腈和缓冲液A的体积比为2:3)洗脱10分钟。洗脱时，流动相1和流动相2的流速均为1ml/min，在温度为30℃的条件下进行。
步骤1)的壳寡糖溶液经上述HPLC分析，如图2，结果表明，该壳寡糖溶液主要组分为壳聚三糖、壳聚四糖、壳聚五糖、壳聚六糖和壳聚七糖，表明壳聚糖酶ChiTS酶解壳聚糖产生的壳寡糖的聚合度为3-7。ChiTS降解50g壳聚糖得到7.5g壳聚三糖、10.8g壳聚四糖、12g壳聚五糖、9.8g壳聚六糖和4.35g壳聚七糖，ChiTS降解壳聚糖得到的产物中各组分的比例为壳聚三糖：壳聚四糖：壳聚五糖：壳聚六糖：壳聚七糖＝7.5：10.8：12：9.8：4.35。

Claims (14)

1.蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：
a)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
b)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质。
2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B16)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：所述核酸分子为如下1)或2)所示的核酸分子：
1)编码序列是序列表中SEQ ID No.1的第1-1227位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
2)编码序列是序列表中SEQ ID No.5的第3-1253位核苷酸的cDNA分子或DNA分子。
4.根据权利要求2或3所述的生物材料，其特征在于：所述重组微生物为将pET22b-ChiTS导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质的重组微生物，所述重组微生物命名为BL21(DE3)ChiTS，所述pET22b-ChiTS为将载体pET22b(+)的NcoI和XhoI位点之间的序列替换为SEQ ID No.3第8-1231位所示的DNA片段得到的重组载体。
5.制备权利要求1所述蛋白质的方法，包括将权利要求1所述的蛋白质的编码基因在生物细胞中进行表达得到权利要求1所述蛋白质的步骤；所述生物细胞为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述微生物为权利要求4所述的生物材料中的BL21(DE3)ChiTS。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：将权利要求1所述的蛋白质的编码基因在生物细胞中进行表达得到权利要求1所述蛋白质，包括将所述BL21(DE3)ChiTS在发酵培养基B中培养进行诱导表达的步骤，所述发酵培养基B由水和溶质组成，所述溶质及在所述发酵培养基B中的终浓度分别为：甘油 8-12g/L，KH2PO4 8-12g/L，(NH4)2HPO4 5-7g/L，柠檬酸0.5-3g/L，MgSO4 1.55-2.59g/L，FeSO4 50-100mg/L，ZnSO4 29.5-60mg/L，CuSO4 20-40mg/L，MnSO4 4-6mg/L，Na2B4O7 1-3mg/L，CaCl2 15-30mg/L，(NH4)6HMo7O24 1-2mg/L。
8.权利要求1所述的蛋白质在作为壳聚糖酶中的应用；所述应用为非疾病诊断和/或疾病治疗目的的应用。
9.权利要求2所述的生物材料在制备壳聚糖酶中的应用。
10.权利要求1所述的蛋白质在生产壳寡糖中的应用。
11.权利要求2所述的生物材料在生产壳寡糖中的应用。
12.权利要求1所述的蛋白质在降解壳聚糖中的应用。
13.权利要求2所述的生物材料在降解壳聚糖中的应用。
14.生产壳寡糖的方法，其特征在于：所述方法包括以壳聚糖为底物用权利要求1所述的蛋白质进行催化反应得到壳寡糖的步骤，所述壳寡糖包括下述五种中的全部或部分：壳聚三糖、壳聚四糖、壳聚五糖、壳聚六糖和壳聚七糖。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN106811451B (zh) * 2017-03-23 2020-07-03 华东理工大学 一种低温壳聚糖酶及其编码基因与应用
CN108330119B (zh) * 2018-04-23 2021-05-25 中国海洋大学 一种壳聚糖酶及其在壳寡糖制备中的应用
CN113817758A (zh) * 2021-10-11 2021-12-21 湖南省植物保护研究所 编码贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶基因、壳聚糖酶及其制备方法和应用
CN114438150B (zh) * 2022-04-11 2022-06-28 中国海洋大学 一种抑制壳寡糖褐变的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101397552A (zh) * 2008-04-28 2009-04-01 浙江丰安生物制药有限公司 高效重组表达的一种壳聚糖酶
CN102753023A (zh) * 2009-12-09 2012-10-24 诺维信公司 产生gh8木聚糖酶变体的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101397552A (zh) * 2008-04-28 2009-04-01 浙江丰安生物制药有限公司 高效重组表达的一种壳聚糖酶
CN102753023A (zh) * 2009-12-09 2012-10-24 诺维信公司 产生gh8木聚糖酶变体的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Genomic characterization of the Bacillus cereus sensu lato species:backdrop to the evolution of Bacillus anthracis.;Zwick ME.等;《Genome Res.》;20120831;第22卷(第8期);1512-24 *
WP_001013620.1;Zwick ME.等;《GENBANK》;20090616 *

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