CN110408566A

CN110408566A - 一种外切型硫酸软骨素降解酶及其编码基因与应用

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Publication number: CN110408566A
Application number: CN201910691385.3A
Authority: CN
Inventors: 李福川; 关靖雯; 王淑敏
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2019-07-29
Filing date: 2019-07-29
Publication date: 2019-11-05
Anticipated expiration: 2039-07-29
Also published as: CN110408566B

Abstract

本发明涉及一种外切型硫酸软骨素降解酶及其编码基因与应用。本发明从肠道微生物中筛选出一株奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)FC220，已于2019年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.17426。本发明在该菌株基因组中发现和鉴定了一种新型的外切型硫酸软骨素降解酶，具有广泛的底物降解活性，仅作用于糖胺聚糖多糖链的还原端，释放不饱和二糖，并首次发现该外切型硫酸软骨素降解酶对糖胺聚糖中β‑1,4糖苷键切割的底物极为严格，可应用于医药及化妆品等领域，具有重要的应用价值。

Description

一种外切型硫酸软骨素降解酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种外切型硫酸软骨素降解酶及其编码基因与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)作为蛋白聚糖的多糖链，广泛分布在细胞外基质和细胞表面，参与很多生物过程，如细胞增殖、信号传输和炎症介导等。硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，CS)属于糖胺聚糖家族，是β-1,4-糖苷键连接的重复二糖单元的线性多糖，二糖单位是由D-葡萄糖醛酸与N-乙酰半乳糖胺经α-1,3-糖苷键组成的。在糖链合成过程中，硫酸软骨素的D-葡萄糖醛酸通常会在C5-差向异构酶的作用下转变为L-艾杜糖醛酸，从而形成了硫酸皮肤素(Dermatan Sulfate，DS)，在糖链中硫酸软骨素和硫酸皮肤素常交替存在，从而形成了复杂的杂合结构CS/DS。每个二糖单位可以在糖醛酸的2-O或3-O位置和N-乙酰半乳糖胺的4-O和6-O位置处发生硫酸化，自然界中生物体内合成的CS通常有六种不同硫酸化模式的二糖单位，分别是：非硫酸化二糖O unit，N-乙酰半乳糖胺四位羟基硫酸化二糖A unit，N-乙酰半乳糖胺六位羟基硫酸化二糖C unit，D-葡萄糖醛酸二位羟基和N-乙酰半乳糖胺六位羟基双硫酸化二糖D unit，N-乙酰半乳糖胺四、六位羟基双硫酸化二糖E unit，D-葡萄糖醛酸二位羟基和N-乙酰半乳糖胺四、六位羟基三硫酸化二糖T unit。CS/DS糖链这种高度复杂的结构不是随机发生的，而是具有高度的时空特异性，是各种糖链合成相关酶在不同细胞组织和器官的不同发育阶段表达调控水平所致，不同的结构使其具有不同的功能，结构的复杂性赋予其功能的多样性。

硫酸软骨素降解酶(Chondroitinase，CSase)作为微生物来源的CS/DS专一性降解酶，根据底物特异性通常被分为三类：CSaseAC，选择性降解CS，且对HA表现出一定活性；CSaseB，专一性解DS；CSaseABC，具有广泛的底物特异性，可以降解CS、DS及HA，是用于医学和研究中十分重要的酶。目前，可以利用的商品化CSase十分有限，其中来源于普通变形杆菌(Proteus vulgaris)的CSase ABC，既可以降解CS和DS，又可以以较弱的活性降解HA。CSase ABC包含两种酶，内切型CSase ABC I和外切型CSase ABC II。从催化机制来看，CSases对底物CS/DS的切割是β-消除机制，通过将N-乙酰半乳糖胺与D-葡萄糖醛酸或L-艾杜糖醛酸之间的β-1,4-糖苷键切割，在寡糖产物非还原端的糖醛酸残基的C4-C5间形成一个在232nm具有特异吸收的不饱和双键，这一不饱和双键的引入对于寡糖产物的分析检测非常有意义。普通变形杆菌(Proteus vulgaris)来源的CSaseABC可以将绝大多数CS/DS彻底降解为不饱和二糖终产物，通常被用于CS/DS的二糖组成分析。各种研究表明，CS/DS的二糖组成在不同的发育阶段和不同的组织器官中具有显著的差异，这种结构组成上的复杂性是具有时空特异性的，CS/DS糖链的结构复杂性反应了其功能上的多样性，可以借助CSase的帮助进一步研究CS/DS结构与功能的关系。近年来的研究表明CSase ABC作为底物特异性广泛的一类CSase，可用于糖胺聚糖结构和功能的研究、生产低分子量的CS/DS提高其生物利用率、相关疾病治疗如可使脑梗死后的神经再生，抑制脑梗死的发生；在治疗脊柱损伤过程中，可以显著提高轴突再生等。然而，由于缺乏高纯度、无污染的CSase ABC，以及其本身热稳定性差和自发性蛋白水解的缺陷，严重限制了其作为治疗剂的使用，因此亟需寻找和鉴定新型CS/DS降解酶作为商品化CSase ABC的替代。

目前，CSaseABC的主要来源是普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)和肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)，商品化的CSase ABC(来自生日本化学工业株式会社P.vulgaris的“CSase ABC”)是由微生物发酵分离制备的含有内切型CSase ABC I和外切型CSase ABC II的混合物，在CS/DS的定量、蛋白聚糖糖链部分的结构分析、蛋白聚糖核心蛋白的制备、缓解视网膜退化、改善瘢痕疙瘩病和减轻腰椎间盘突出症等方面有着较高的潜在应用价值。然而在对CSase ABC的纯化过程中，由于它属于胞内酶，杂蛋白的含量较高，组成较复杂，纯化过程难度较大，纯化效果较差，这些问题也导致了CSase ABC在疾病治疗应用中的局限性。在过去的研究中发现，商品化的高纯度CSase ABC不能够降解不饱和四糖，一些研究者猜测这一现象表明在纯化制备不含蛋白酶的CSase ABC时，可能将原始CSase ABC的四糖降解酶去除掉了，后续的研究表明这是由于在纯化的过程中丢失了外切型酶的活性，同时传统纯化过程的步骤繁琐费时从而导致了产率较低。在通过基因工程菌对内切型酶CSase ABC I进行异源表达的研究中，只有Vikas Prabhakar通过表达载体pET-28a将CSase ABC基因csl ABC在E.coli中成功进行了表达，但得到的酶水溶性差是包涵体；且对外切型CSase ABCII的降解方向及底物作用模式仍不够明确。因此，对于CSase ABC的重组表达研究和寻找新型高活性的CSase ABC就显得尤为重要。由于酶的用量大、潜在用途广，其纯度、特异性以及作用模式等方面为重点关注方向。

综上所述，CSase ABC不仅在糖胺聚糖结构与功能研究中发挥了重要的作用，同时在寡糖制备和医疗领域也具有十分重要的意义。但目前具有应用价值的高活力高纯度的CSase ABC较少，因此寻找和鉴定新型高效稳定的CSase ABC，研究CSase ABC对糖链切割的作用模式具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种外切型硫酸软骨素降解酶及其编码基因与应用。

本发明的技术方案如下：

一株奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)FC220，2019年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.17426。

一种外切型硫酸软骨素降解酶，氨基酸序列为(a)或(b)之一种：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有外切型硫酸软骨素降解酶活性的由(a)衍生的蛋白质氨基酸序列。

根据本发明优选的，(b)中所述氨基酸序列为：如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。

根据本发明优选的，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的外切型硫酸软骨素降解酶分离自上述奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)FC220，2019年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.17426。

本发明中的外切型硫酸软骨素降解酶对糖胺聚糖的降解具有严格的底物作用模式，仅作用于糖胺聚糖多糖链的还原端，释放不饱和二糖。

上述外切型硫酸软骨素降解酶的编码基因，核苷酸序列为(i)或(ii)之一种：

(i)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(ii)在严格条件下与(i)限定的核苷酸序列杂交且编码具有外切型硫酸软骨素降解酶活性的蛋白质的DNA分子核苷酸序列。

根据本发明优选的，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的外切型硫酸软骨素降解酶的编码基因来源于上述奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)FC220，2019年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.17426。

根据本发明优选的，(ii)中所述严格条件，是指：

在含0.5wt％十二烷基磺酸钠的6×柠檬酸钠缓冲液中，在65℃下杂交，然后用含0.1wt％十二烷基磺酸钠的2×柠檬酸钠缓冲液和含0.1wt％十二烷基磺酸钠的1×柠檬酸钠缓冲液各洗膜一次。

根据本发明优选的，(ii)中所述核苷酸序列为：如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

一种重组表达载体，在表达载体中插入了上述外切型硫酸软骨素降解酶的编码基因。

根据本发明优选的，所述表达载体选自大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体。

一种重组菌或转基因细胞系，在宿主细胞或细胞系中插入了上述外切型硫酸软骨素降解酶的编码基因。

根据本发明优选的，所述宿主细胞或细胞系选自大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

进一步优选的，所述大肠杆菌宿主细胞为Escherichia coli BL21、Escherichiacoli JM109或Escherichia coli DH5α，所述酵母菌宿主细胞为Saccharomycescerevisiae、Pichia pastoris或Kluyveromyces Iactis，所述枯草杆菌宿主细胞为Bacillus subtilis R25或Bacillus subtilis9920，所述乳酸菌宿主细胞为Lactic acidbacteria C0CC101，所述放线菌宿主细胞为Streptomyces spp.，所述丝状真菌宿主细胞为Trichoderma viride,Trichoderma reesei,Aspergillus niger或Aspergillusnidulans，所述昆虫细胞为Bombyxmori或Antharaea eucalypti，所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞CHO、幼小仓鼠肾脏细胞BHK或中国仓鼠肺细胞CHL。

上述外切型硫酸软骨素降解酶作为增强药物的吸收或递送成分在制备药物中的应用。

本发明中未详细说明的实验步骤均按照本领域常规操作进行。

有益效果

本发明从肠道微生物基因组中发现和鉴定了一种新型的CSase，具有广泛的底物降解活性，属于CSase ABC，表现为外切酶活性，仅作用于糖胺聚糖多糖链的还原端，释放不饱和二糖，可以彻底降解HA和各类CS/DS产生不饱和二糖终产物，并首次发现该外切型硫酸软骨素降解酶对糖胺聚糖中β-1,4糖苷键切割的底物极为严格，只能切割掉葡萄糖醛酸(GlcUA)/L-艾杜糖醛酸(IdoUA)和N-乙酰氨基半乳糖胺(GalNAc)组成的二糖单位上的β-1,4糖苷键产生不饱和二糖，具有重要的应用价值。

本发明制备的外切型硫酸软骨素降解酶对透明质酸的比活为0.98U/mg、对硫酸软骨素A的比活为17U/mg，可应用于脑神经修复和轴突再生等医药及化妆品等领域，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1、外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC的蛋白质三维结构模型；

图2、重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC表达情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)；其中：泳道1、蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD；泳道2、对照菌株破壁前菌体，上样量10μL；泳道3、重组菌株破壁前菌体，上样量10μL；泳道4、重组菌株破壁后上清，上样量10μL；泳道5、重组菌株破壁后沉淀，上样量10μL；

图3、温度对重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC的活性影响曲线；

图4、pΗ值对重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC的活性影响曲线；

图5、金属离子对重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC活性的影响柱形图；

图6、温度对重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC的稳定性影响曲线；

图7、重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC降解产物的HPLC分析图；其中，A：CSA降解产物；B：CSC降解产物；C：CSE降解产物；D：DS降解产物；E：HA降解产物；各数字编号代表的是：1：二硫酸化二糖；2：单硫酸化二糖；3：非硫酸化二糖；

图8、重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC不同时间降解CSA所得产物的HPLC分析图；其中数字编号代表的是：1：CSA不饱和二糖；

图9、重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC不同时间降解经糖醛酸水解酶预处理的HA六糖所得产物的HPLC分析图；其中数字编号代表的是：1：HA不饱和二糖；

图10、重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC不同时间降解HA奇数寡糖所得产物的HPLC分析图；其中，A：透明质酸三糖降解分析；B：透明质酸五糖降解分析；C：透明质酸七糖降解分析；exoCSase ABC(-)为加酶反应前；exoCSase ABC(+)为加酶反应后；各数字编号代表的是：1：透明质酸三糖；2：透明质酸五糖；3：透明质酸七糖。

具体实施方式

以下实施例的阐述，是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术，而不是为了限制本发明的应用范围。发明人已经尽最大努力确保实施例中个参数的准确性(例如量，温度，等等)，但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。除非另有说明，本发明中分子量是指重均分子量，温度是摄氏度。

生物材料：

实施例中的酶活力单位定义：每分钟催化透明质酸或硫酸软骨素或硫酸皮肤素产生1μmoL不饱和双键所需要的酶量。

实施例中硫酸软骨素(CSA、CSC、CSE)以及硫酸皮肤素(DS)购自日本东京Seikagaku公司；透明质酸(HA)购自Sigma公司，分子量M_W为15～30kDa。

硫酸软骨素A六糖是由硫酸软骨素A经酶解分离得到的；透明质酸七糖、透明质酸六糖、透明质酸五糖、透明质酸三糖、透明质酸不饱和六糖是由透明质酸经酶解分离得到的。

本发明实施例中的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品。

实施例1奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)FC220的获得和培养

分别取志愿者粪便样品重悬液l mL加入到9mL无菌水中，依次按照10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6浓度梯度稀释，通过稀释法涂布于唯一碳源固体培养基上，于37℃恒温培养36h，然后挑选菌落形态差异比较明显的菌落，重复划线接种于相应的全营养琼脂平板上，直至纯化得到单菌落，然后转接于相应的琼脂斜面上，以备后用。将培养得到的菌株，分别接种到唯一碳源液体培养基中培养，200rpm、37℃培养72h。对菌液浑浊情况进行观察同时测定菌液OD₆₀₀值的变化，并取培养液上清进行咔唑反应检测碳源的消耗情况。根据碳源消耗情况选择降解能力强的菌株，将其中降解能力表现最强的一株菌株挑取到全营养培养基上培养，并保种记为FC220。经测序鉴定，菌株FC220为奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)。

上述唯一碳源液体培养基每升组分如下：

(NH₄)₂SO₄ 10g，NaCl 5g，KH₂PO₄ 0.3g，唯一碳源为硫酸软骨素A 5g，加入水定容至1000mL，pH值为7.0。另添加琼脂20g即为唯一碳源固体培养基。

按照上述方法将奇异变形杆菌FC220转接至以不同多糖(CS、DS、HA)为唯一碳源的培养基中，通过咔唑反应检测多糖利用情况，发现该菌株在CS、DS、HA的培养基中长势良好，说明该菌种利用多糖能力强、范围广，可用于下一步实验的研究。

上述奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)FC220，2019年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.17426。

奇异变形杆菌FC220菌液的培养方法如下：

取奇异变形杆菌FC220菌株接种至液体培养基中，在37℃、200rpm的条件下，培养10小时，制得种子液。将制得的种子液，按7％的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为37℃，溶氧(即溶解氧饱和度)为30％的条件下，扩大培养2小时，制得奇异变形杆菌FC220菌液。

上述液体培养基每升组分如下：

胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、水1000mL，pH值为7.2。

实施例2、奇异变形杆菌FC220菌株基因组DNA的提取

将奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)FC220菌株接种至液体培养基(同实施例2)中，在37℃、200rpm的条件下，振荡培养至OD₆₀₀＝0.8；取培养菌液40mL，在12,000rmp条件下离心25min，收集菌体沉淀，用20mL的溶菌酶缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.0)洗涤，在12,000rmp条件下离心25min，收集菌体沉淀。

上述菌体沉淀中，每管加入溶菌酶缓冲液12.0mL(10mM Tris-HCl，pH 8.0)，得到约14.0mL的菌液，分别加入浓度为20mg/mL的溶菌酶各560μL，其终浓度约800μg/mL；冰浴1.0h后，37℃温浴2h，至溶液粘稠；加入10wt％SDS(十二烷基磺酸钠)0.82mL，100mg/mL的蛋白酶K(购自TIANGEN)溶液60μL，52℃水浴1.0h；加入Tris-平衡过的酚/氯仿/异戊醇(体积比25：24：1)15mL，轻轻颠倒混匀，至充分乳化；10,000g、4℃条件下离心10min，取上清，加入2.0mL的NaAc-HAc(pH 5.2，3.0M)缓冲液，以及17.0mL的无水乙醇，混匀；用1.0mL的枪头挑出丝状DNA，转移至1.5mL的EP离心管中，以体积分数为70％的乙醇(贮于-20℃)洗涤2次，微离心后弃上清；10,000g、4℃条件下离心3min，彻底弃掉上清；样品于无菌工作台中，酒精灯下风吹干燥；用无菌去离子水重悬溶解DNA样品，4℃过夜，得到大分子量基因组DNA。

实施例3、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)FC220菌株基因组扫描及其序列分析

将实施例3制得的大分子量基因组DNA进行测序(美吉生物公司)。用NCBI(National Center for Biotechnology Information,http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)上的软件对测序结果进行分析。所用到的NCBI分析软件是Open Reading Frame Finder(ORF Finder,http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和Basic LocalAlignment Search Tool(BLAST,http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

NCBI分析结果显示奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)FC220菌株基因组上携带有外切型硫酸软骨素降解酶基因exocsase abc，exocsase abc基因编码区长3042bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

exocsase abc基因编码的外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC由1013个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，蛋白质的理论分子量约为110kD。用SimpleModular Architecture Research Tool(SMART,http://smart.embl_heidelberg.de/)分析外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC的结构信息，结果显示外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC的N端第1至第23个氨基酸是信号肽序列，第23-778位氨基酸序列属于硫酸软骨素降解酶超家族。用SWISS-MODEL同源建模服务器(http://swissmodel.expasy.org)对外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC的蛋白质三维结构进行同源建模，最终得到其蛋白质三维结构模型如图1所示。

在含0.5wt％SDS(十二烷基磺酸钠)的6×SSC缓冲液(柠檬酸钠缓冲液)中，65℃条件下与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列杂交，然后用含0.1wt％SDS的2×SSC缓冲液和含0.1wt％SDS的1×SSC缓冲液，各洗膜一次，得到如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，核苷酸序列SEQ ID NO.3编码的蛋白质氨基酸酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列SEQ ID NO.4编码的蛋白质氨基酸酸序列如SEQ ID NO.6所示，两种蛋白质均具有外切型硫酸软骨素降解酶活性。

其中氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的蛋白质分子与氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质分子相比，具有1％的区别(氨基酸的替代)，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的蛋白质分子与SEQ ID NO.2所示的蛋白质分子相比，具有1％区别(氨基酸的替代、缺失、插入)。

实施例4、外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC编码基因在大肠杆菌中的重组表达

以实施例3制得的大分子量基因组DNA为模板，进行PCR扩增。引物如下：

正向引物exoCSase ABC-F：CCATGGTTATGCGATTACACTAAGTTTCTGCTT；

反向引物exoCSase ABC-R：CTCGAGTTACTTAATTAAATAAACTGTTATTGGT；

正向引物下划线标注的是限制性内切酶Nco I位点，反向引物下划线标注的是限制性内切酶Xho I位点。Primerstar HS DNA聚合酶购自宝生物公司，PCR反应体系按照公司提供的产品说明操作。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性40s，60℃退火30s，35个循环；72℃延伸10min。

将PCR产物与Blunt simple质粒连接后用Nco I和Xho I进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切PCR产物。将购于美国Novagen公司的pET-30a、pCold-TF载体用Nco I和Xho I双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切载体大片段。Nco I和Xho I均购于宝生物公司，酶与底物反应的体系、温度和时间均按照公司提供的产品说明操作。

将回收的酶切PCR产物分别与回收的pET-30a、pCold-TF酶切载体大片段连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株后分别涂布于含有50μg/mL卡那青霉素(pET-30a)/氨苄青霉素(pCold-TF)的Luria-Bertani培养基固体平板上，37℃培养14h，挑取单克隆；将单克隆分别接入含有50μg/mL卡那青霉素(pET-30a)/氨苄青霉素(pCold-TF)的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；将质粒分别用正向引物exoCSase ABC-F和反向引物exoCSaseABC-R进行PCR验证，结果得到大小正确的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确；接着将该重组质粒送去生工生物工程(上海)股份有限公司测序，结果表明，在pET-30a,pCold-TF的Nco I和Xho I酶切位点之间分别插入SEQ ID NO.1所示的外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC基因，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将重组质粒分别命名为pET30a-exoCSase ABC和pColdTF-exoCSase ABC。

将上述构建的pET30a-exoCSase ABC和pColdTF-exoCSase ABC分别转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)(购自美国Novagen公司)，然后按照该公司提供的操作步骤进行重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC诱导表达，其中pET30a-exoCSase ABC未表达，而pColdTF-exoCSase ABC水溶性较好。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC的表达情况，结果如图2所示，重组菌成功表达重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC，条带位置比预测的分子量略高，但测序结果正确。

实施例5、重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC的酶学性质分析

1、温度对酶活性的影响

将质量浓度为1％硫酸软骨素A底物、重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC酶液、150mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液(pH7.0)以及水，按2：1：3：4(体积比)的比例混合，分别在不同温度(0℃～90℃)反应40min，紫外法测定酶活力。结果如图3所示，重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC在40℃时达到最大活力，表明重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC的最适反应温度为40℃。

紫外法测定酶活力的方法参考现有技术(Yamagata,T.,et al.,Purificationand properties of bacterial chondroitinases and chondrosulfatases.The Journalof biological chemistry,1968.243(7):p.1523-35)，是以灭活酶为阴性对照，利用分光光度计测定反应产物232nm光吸收判断产物生产量从而判定酶活力的大小。

2、pH对酶活性的影响

在最适温度下，将质量浓度为1％硫酸软骨素A底物、重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC酶液、不同pH值的150mM HAc-NaAc或NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(PBS)或Tris-HCl缓冲液以及水(pH范围为5.0～10.0)，按2：1：3：4(体积比)的比例混合后，分别在40℃反应40min，按前述的紫外法测定酶活力。结果如图4所示，重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC在NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH 8.0)时达到最大活力，表明重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC的最适反应pH为8.0。

3、金属离子对酶活性的影响

将质量浓度为1％硫酸软骨素A底物、重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC酶液、150mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液(pH 8.0)以及水，按2：1：3：4(体积比)的比例混合后，接着向反应体系中添加不同的金属离子，添加的离子终浓度为5mM，然后在40℃反应40min，按前述的紫外法测定酶活力。对照组为不加任何金属离子时重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC的活性(设定为100％)，结果图5所示。实验结果显示，甘油、K⁺、Li⁺、Co²⁺、Na⁺能增加重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC活性，Pb²⁺、咪唑对重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC活性基本无影响，Zn²⁺、SDS、DTT、Ni⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、β-巯基乙醇、Ag⁺、Cr³⁺、Fe³⁺、Hg²⁺、EDTA、Fe²⁺对酶活呈现抑制作用。

4、温度对酶稳定性的影响

将在不同温度(0℃～70℃)下热处理1、2、4、8、12、24h后的重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC酶液与质量浓度为1％硫酸软骨素A底物溶液，在最适温度(40℃)和最适pH(pH 8.0)下测定剩余酶活，以不经过热处理的酶液酶活定义为100％相对活力(relativie activity)，结果如图6所示，表明重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC在低于50℃的温度下具有较好的热稳定性。

实施例6、重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC酶活测定

将质量浓度为1％透明质酸或硫酸软骨素(CSA/CSC/CSE)或硫酸皮肤素底物、重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC酶液、150mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液以及水，按2：1：3：4(体积比)的比例混合后，在最适温度(40℃)和最适pH(pH 8.0)下反应0.5-10min，紫外法测定酶活力。

同时用购于康为世纪公司的蛋白质定量试剂盒测定重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC酶液的蛋白含量，结果表明重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC对CSA的比活为17U/mg，CSC为4.16U/mg，CSE为1.97U/mg，DS为7.12U/mg，HA为0.98U/mg。

实施例7、重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC降解终产物的高效液相色谱(HPLC)分析

将质量浓度为1％硫酸软骨素(CSA/CSC/CSE)或透明质酸或硫酸皮肤素底物、重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC酶液、150mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液以及水，按2：1：3：4(体积比)的比例混合后，在pH8.0，40℃条件下过夜反应，对产物进行HPLC分析。HPLC条件为凝胶柱：superdex peptide 10/300GL(GE)；流动相：0.2M碳酸氢铵；流速：0.4mL/min；检测条件：UV232nm。

结果如图7所示，不同底物的终产物均为二糖，其中CSA和CSC的最终降解产物主要为单硫酸化的二糖和少量非硫酸化的二糖；CSE的主要终产物为二硫酸化、单硫酸化和非硫酸化二糖；DS的最终降解产物为二硫酸化和单硫酸化二糖；HA的终产物只有非硫酸化的二糖。

实施例8、重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC的降解模式

将质量浓度为1％硫酸软骨素A底物、重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC酶液、150mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液以及水，按2：1：3：4(体积比)的比例混合后，在pH8.0，40℃条件下反应，选取不同酶解时间(0min、10min、1h、4h、12h)的产物进行HPLC分析。HPLC条件为凝胶柱：superdex peptide 10/300GL(GE)；流动相：0.2M碳酸氢铵；流速：0.4mL/min；检测条件：UV232nm。

结果如图8所示，从图8可以看出随着降解时间的增加，产物聚合度随降解时间的延长并未发生变化，始终为二糖。该结果验证了重组硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC属于外切型硫酸软骨素降解酶，可被用于糖胺聚糖寡糖的制备以及糖胺聚糖构效关系研究。

实施例9、荧光标记对重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC降解的影响

将经过2-AB荧光标记后的透明质酸六糖或硫酸软骨素A六糖、重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC酶液、150mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液以及水，按2：3：10：15(体积比)的比例混合后，在pH8.0，40℃条件下反应36h，对产物进行HPLC分析。HPLC条件为色谱柱：YMC-Pack PA-G column，流动相：NaH₂PO₄线性洗脱，NaH₂PO₄浓度在60min内从16mM升到700mM。流速：1mL/min，检测条件：Ex 330nm，Em 420nm。

结果显示，2-AB荧光标记之后的寡糖无法再被降解，标记在还原端的2-AB荧光标记阻碍了降解活性，因此猜测重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC很有可能是从还原端降解糖链的。

实施例10、重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC的降解方向

将透明质酸不饱和六糖底物(～10mg/ml)、糖醛酸水解酶液(来自Flavobacteriumheparinum，制备方法参考现有技术：Myette,J.R.,et al.,Molecular cloning of theheparin/heparan sulfateΔ4,5unsaturated glycuronidase from Flavobacteriumheparinum,its recombinant expression in Escherichia coli,and biochemicaldetermination of its unique substrate specificity.Biochemistry,2002.41(23):p.7424-7434.)、150mM HAc-NaAc缓冲液以及水，按1：2：5：7(体积比)的比例混合后,在pH6.0，30℃条件下过夜反应，得到水解掉非还原端△4,5不饱和糖醛酸的寡糖，将其作为反应底物。将反应底物(～20μg)、重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC酶液、150mMNaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液以及水，按6：3：10：11(体积比)的比例混合后,在pH 8.0，40℃条件下反应，选取不同的酶解时间(0min、30s、1min、5min、1h)的产物进行HPLC分析。HPLC条件为凝胶柱：superdex peptide 10/300GL(GE)；流动相：0.2M碳酸氢铵；流速：0.4mL/min；检测条件：UV232nm。

结果如图9所示，从图9可以看出随着降解时间的增加，产物始终为二糖，并没有其他聚合度的寡糖产生。但在相同条件下，对相同量透明质酸不饱和六糖反应相同酶解时间均有四糖和二糖产生并有六糖剩余。该结果表明重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSaseABC是从糖链的还原端释放不饱和二糖的，可被用于糖胺聚糖寡糖的制备以及糖胺聚糖构效关系研究。

实施例11、重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC对奇数糖的降解分析

将透明质酸七糖、五糖、三糖分别作为底物，同重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC酶液、150mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液以及水，按2：1：3：4(体积比)的比例混合后，在pH8.0，40℃条件下过夜反应，对产物进行HPLC分析。HPLC条件为凝胶柱：superdexpeptide 10/300GL(GE)；流动相：0.2M碳酸氢铵；流速：0.4mL/min；检测条件：UV232nm。

结果如图10所示，还原端缺少一个N-乙酰氨基半乳糖胺(GalNAc)的奇数糖七糖、五糖、三糖不能被降解。该结果说明，重组外切型硫酸软骨素降解酶exoCSase ABC对于糖胺聚糖中β-1,4糖苷键切割的底物是严格的，只能切割掉葡萄糖醛酸(GlcUA)/L-艾杜糖醛酸(IdoUA)和N-乙酰氨基半乳糖胺(GalNAc)组成的二糖单位(GlcUAβ1-3GalNAc或IdoUAβ1-3GalNAc)上的β-1,4糖苷键产生不饱和二糖，无法切割缺失GalNAc的单糖GlcUA/IdoUA上的β-1,4糖苷键或单糖GlcUA/IdoUA前一个二糖单位上的β-1,4糖苷键产生奇数寡糖。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种外切型硫酸软骨素降解酶及其编码基因与应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3042

<212> DNA

<213> Proteus mirabilis

<400> 1

atgctaataa aaaattcttt agcttatgcg attacactaa gtttctgctt atccttaccc 60

gcacaagcat taccttctct ttctcatgaa ccttttggcg atctttatct ttttgaagat 120

gaaatgccaa ataccttgag cacctcaaat gaccatcagc tatcactaag taaagagcat 180

gctaaagatg gcgtacagtc actcaaatgg cagtatcaac cccaatcaac attaacactt 240

aataatgaag ttaattatca agatgataaa aatacagcaa caccactcac ttttatgatg 300

tggatttaca atgaaaaacc acagtcaacg ccccttacat tacaatttaa acaaaataat 360

caagtagcat taagttttaa aacggaactg aatttcacgg gttggcgagg tattgcagtt 420

ccttttcgtg atatgaaagg ctcagcaaca ggcaaattag ataaattagt cattactgca 480

ccagatcaag caggtacgct tttttttgat caaataatta tgagcgtacc tttagataat 540

cgttggccta ttcctgacta tcaaattcca tatgttaata atgcagtaaa tacaatggtg 600

agtaaaaatt ggagtgcatt attgatgtac gatcaaatgt tcacagcgca ttatcctaca 660

ttaaattttg cgactgagtt tcgtgatgat cagcctgaag tggcatctat ttatcaacgt 720

tttgaatact atcaaggtgt cagtcgtgat aaaaaaatca ccgctgaaat gatcgacaaa 780

aatttagcat tatggaaaaa attagcctta gaacaacatg ctgatggctc aataaccgca 840

aaagcccttg atcatcctaa tcgccagaat tttatcaaag tcgagggggt ctttagtgaa 900

gaaacccaaa aagcattact tgatgccaac atgctaagag atgtaggcaa aacgcttctt 960

caaacagcga tttacttgcg tagtcactcc ttatcagcaa tcgatagaaa aaaattagaa 1020

acgctctatt tattaggcac tcgttacgtt cttgaacaag gtttcacacg ggggagtggt 1080

taccaaatta ttactcacgt aggttatcaa acaagagagc tttttgatgc atggtttatt 1140

ggtcgccata ttctagcaaa acataatctg ttagcaccga cacaacaagc catgatgtgg 1200

tataacgcaa cagggcgcat atttgaaaaa gataatgaaa tcgttgatgc aaatgtcgat 1260

attctcaata cccaattaca gtggatgata aaaagtttat tgatgttgcc agattatcaa 1320

cagcgccaac aagccttagc acaattgcaa agttggctaa acaaaaccat tcttagttct 1380

aaaggtgtcg ctggtggctt taaatctgat ggctctattt ttcaccattc acaacattat 1440

ccagcttatg ccaaagatgc atttggtggc ttagcgccta gtgtttatgc cttaagtcat 1500

tccccttttc gtctttcatc accagcacat gcacgcttaa aagatgtatt attaaaaatg 1560

cgtatctata ccaaagaaac acaaattcct ctggtattaa gtggcagaca tcctacgggg 1620

ttacataaaa taagtattga tcccttcaaa tggatggctc ttgcaggtac gcccgatggt 1680

aaacaagagc tagatactac attagcagcc gcttatgcaa aattagcaaa caaagatagc 1740

tttgaaggta ttaaagcaga aaatgaaccg gtaggtgcat gggcaatgaa ttatgcttca 1800

atggcaatcc agcgtagaac atcaataaca gcgccacagc aaagctggct tgctatcgct 1860

cgtggtttta gtcgttattt agtgggtaat gaaagttatg agaataacaa ccgttatggt 1920

cgttacttgc aatatgggca acttgaaatt attcctgcgg atttaactaa atctggtttt 1980

agtcatgcag gttgggattg gaatcgatat ccaggaacga ctacgatcca ccttccttat 2040

gatgaactag aagcaaaact aagccaattg ccaagtgcag gcatagaaga aatgttgctt 2100

tcaacacaac gttattctgg tgccaataca ctaaataata acagtatgtt tgccatgaaa 2160

ttacatggtc acagtaaata tcaacaacaa agtctaagag cgaataaatc ctatttctta 2220

tttgataata gagttatcgc attaggctct ggtattgaaa ataacgataa acaacataca 2280

acagaaacga cactgttcca gtttgctgtt cctaagttac aatcaattat aattaatggt 2340

aaaaaagtga accaactcgg tactcaatta accttaaata atgccgatac attaattgat 2400

ccggcgggta acttgtataa attagctaaa gggcaaacgg tagaatttag ttatcaaaaa 2460

caatactctg ttgatgacag aaattcacag caaacagaac aattgtttgc aacagccgtt 2520

atctctcacg gtaaagcccc taaaaatgca aattatgaat atgcaatagc catagaagca 2580

caagataata aagcgcctga atacaccgta ttgcagcata ataatcaact tcatgcagta 2640

aaagataaaa tcacgcaaga agagggatat gcttttttta atgccaccga agtcaattca 2700

tctcaagctt tattattatc aagtgattcc cccactatgg taatggtaaa aaaacaaaaa 2760

caacaattaa cgctaagtat tgttaatcct gatttaaatt tatatcaggg tattgaagct 2820

gaccaagttg ataataaggg taaccaggtt gaagtgagtg tttattctcg ccaatggctt 2880

acagccgatc ctcaaccaat aagtagtaca gttactgtaa aagggatttg gaaattagcc 2940

acaccacaat taggtgttaa tattagatat caaaataata atacgctaat tacaacaacg 3000

actatacaag caataccaat aacagtttat ttaattaagt aa 3042

<210> 2

<211> 1013

<212> PRT

<213> Proteus mirabilis

<400> 2

Met Leu Ile Lys Asn Ser Leu Ala Tyr Ala Ile Thr Leu Ser Phe Cys

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Ala Gln Ala Leu Pro Ser Leu Ser His Glu Pro Phe

20 25 30

Gly Asp Leu Tyr Leu Phe Glu Asp Glu Met Pro Asn Thr Leu Ser Thr

35 40 45

Ser Asn Asp His Gln Leu Ser Leu Ser Lys Glu His Ala Lys Asp Gly

50 55 60

Val Gln Ser Leu Lys Trp Gln Tyr Gln Pro Gln Ser Thr Leu Thr Leu

65 70 75 80

Asn Asn Glu Val Asn Tyr Gln Asp Asp Lys Asn Thr Ala Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Met Met Trp Ile Tyr Asn Glu Lys Pro Gln Ser Thr Pro Leu

100 105 110

Thr Leu Gln Phe Lys Gln Asn Asn Gln Val Ala Leu Ser Phe Lys Thr

115 120 125

Glu Leu Asn Phe Thr Gly Trp Arg Gly Ile Ala Val Pro Phe Arg Asp

130 135 140

Met Lys Gly Ser Ala Thr Gly Lys Leu Asp Lys Leu Val Ile Thr Ala

145 150 155 160

Pro Asp Gln Ala Gly Thr Leu Phe Phe Asp Gln Ile Ile Met Ser Val

165 170 175

Pro Leu Asp Asn Arg Trp Pro Ile Pro Asp Tyr Gln Ile Pro Tyr Val

180 185 190

Asn Asn Ala Val Asn Thr Met Val Ser Lys Asn Trp Ser Ala Leu Leu

195 200 205

Met Tyr Asp Gln Met Phe Thr Ala His Tyr Pro Thr Leu Asn Phe Ala

210 215 220

Thr Glu Phe Arg Asp Asp Gln Pro Glu Val Ala Ser Ile Tyr Gln Arg

225 230 235 240

Phe Glu Tyr Tyr Gln Gly Val Ser Arg Asp Lys Lys Ile Thr Ala Glu

245 250 255

Met Ile Asp Lys Asn Leu Ala Leu Trp Lys Lys Leu Ala Leu Glu Gln

260 265 270

His Ala Asp Gly Ser Ile Thr Ala Lys Ala Leu Asp His Pro Asn Arg

275 280 285

Gln Asn Phe Ile Lys Val Glu Gly Val Phe Ser Glu Glu Thr Gln Lys

290 295 300

Ala Leu Leu Asp Ala Asn Met Leu Arg Asp Val Gly Lys Thr Leu Leu

305 310 315 320

Gln Thr Ala Ile Tyr Leu Arg Ser His Ser Leu Ser Ala Ile Asp Arg

325 330 335

Lys Lys Leu Glu Thr Leu Tyr Leu Leu Gly Thr Arg Tyr Val Leu Glu

340 345 350

Gln Gly Phe Thr Arg Gly Ser Gly Tyr Gln Ile Ile Thr His Val Gly

355 360 365

Tyr Gln Thr Arg Glu Leu Phe Asp Ala Trp Phe Ile Gly Arg His Ile

370 375 380

Leu Ala Lys His Asn Leu Leu Ala Pro Thr Gln Gln Ala Met Met Trp

385 390 395 400

Tyr Asn Ala Thr Gly Arg Ile Phe Glu Lys Asp Asn Glu Ile Val Asp

405 410 415

Ala Asn Val Asp Ile Leu Asn Thr Gln Leu Gln Trp Met Ile Lys Ser

420 425 430

Leu Leu Met Leu Pro Asp Tyr Gln Gln Arg Gln Gln Ala Leu Ala Gln

435 440 445

Leu Gln Ser Trp Leu Asn Lys Thr Ile Leu Ser Ser Lys Gly Val Ala

450 455 460

Gly Gly Phe Lys Ser Asp Gly Ser Ile Phe His His Ser Gln His Tyr

465 470 475 480

Pro Ala Tyr Ala Lys Asp Ala Phe Gly Gly Leu Ala Pro Ser Val Tyr

485 490 495

Ala Leu Ser His Ser Pro Phe Arg Leu Ser Ser Pro Ala His Ala Arg

500 505 510

Leu Lys Asp Val Leu Leu Lys Met Arg Ile Tyr Thr Lys Glu Thr Gln

515 520 525

Ile Pro Leu Val Leu Ser Gly Arg His Pro Thr Gly Leu His Lys Ile

530 535 540

Ser Ile Asp Pro Phe Lys Trp Met Ala Leu Ala Gly Thr Pro Asp Gly

545 550 555 560

Lys Gln Glu Leu Asp Thr Thr Leu Ala Ala Ala Tyr Ala Lys Leu Ala

565 570 575

Asn Lys Asp Ser Phe Glu Gly Ile Lys Ala Glu Asn Glu Pro Val Gly

580 585 590

Ala Trp Ala Met Asn Tyr Ala Ser Met Ala Ile Gln Arg Arg Thr Ser

595 600 605

Ile Thr Ala Pro Gln Gln Ser Trp Leu Ala Ile Ala Arg Gly Phe Ser

610 615 620

Arg Tyr Leu Val Gly Asn Glu Ser Tyr Glu Asn Asn Asn Arg Tyr Gly

625 630 635 640

Arg Tyr Leu Gln Tyr Gly Gln Leu Glu Ile Ile Pro Ala Asp Leu Thr

645 650 655

Lys Ser Gly Phe Ser His Ala Gly Trp Asp Trp Asn Arg Tyr Pro Gly

660 665 670

Thr Thr Thr Ile His Leu Pro Tyr Asp Glu Leu Glu Ala Lys Leu Ser

675 680 685

Gln Leu Pro Ser Ala Gly Ile Glu Glu Met Leu Leu Ser Thr Gln Arg

690 695 700

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705 710 715 720

Leu His Gly His Ser Lys Tyr Gln Gln Gln Ser Leu Arg Ala Asn Lys

725 730 735

Ser Tyr Phe Leu Phe Asp Asn Arg Val Ile Ala Leu Gly Ser Gly Ile

740 745 750

Glu Asn Asn Asp Lys Gln His Thr Thr Glu Thr Thr Leu Phe Gln Phe

755 760 765

Ala Val Pro Lys Leu Gln Ser Ile Ile Ile Asn Gly Lys Lys Val Asn

770 775 780

Gln Leu Gly Thr Gln Leu Thr Leu Asn Asn Ala Asp Thr Leu Ile Asp

785 790 795 800

Pro Ala Gly Asn Leu Tyr Lys Leu Ala Lys Gly Gln Thr Val Glu Phe

805 810 815

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820 825 830

Glu Gln Leu Phe Ala Thr Ala Val Ile Ser His Gly Lys Ala Pro Lys

835 840 845

Asn Ala Asn Tyr Glu Tyr Ala Ile Ala Ile Glu Ala Gln Asp Asn Lys

850 855 860

Ala Pro Glu Tyr Thr Val Leu Gln His Asn Asn Gln Leu His Ala Val

865 870 875 880

Lys Asp Lys Ile Thr Gln Glu Glu Gly Tyr Ala Phe Phe Asn Ala Thr

885 890 895

Glu Val Asn Ser Ser Gln Ala Leu Leu Leu Ser Ser Asp Ser Pro Thr

900 905 910

Met Val Met Val Lys Lys Gln Lys Gln Gln Leu Thr Leu Ser Ile Val

915 920 925

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Asn Asn Thr Leu Ile Thr Thr Thr Thr Ile Gln Ala Ile Pro Ile Thr

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Val Tyr Leu Ile Lys

1010

<210> 3

<211> 3042

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgctaataa aaaattcttt agcttatgcg attacactaa gtttctgctt atccttaccc 60

gcacaagcat taccttctct ttctcatgaa ccttttggcg atctttatct ttttgaagat 120

gaaatgccaa ataccttgag cacctcaaat gaccatcagc tatcactaag taaagagcat 180

gctaaagatg gcgtacagtc actcaaatgg cagtatcaac cccaatcaac attaacactt 240

aataatgaag ttaattatca agatgataaa aatacagcaa caccactcac ttttatgatg 300

tggatttaca atgaaaaacc acagtcaacg ccccttacat tacaatttaa acaaaataat 360

caagtagcat taagttttaa aacggaactg aatttcacgg gttggcgagg tattgcagtt 420

ccttttcgtg atatgaaagg ctcagcaaca ggcaaattag ataaattagt cattactgca 480

ccagatcaag caggtacgct tttttttgat caaataatta tgagcgtacc tttagataat 540

cgttggccta ttcctgacta tcaaattcca tatgttaata atgcagtaaa tacaatggtg 600

agtaaaaatt ggagtgcatt attgatgtac gatcaaatgt tcaaagcgca ttatcctaca 660

ttaaattttg cgactgagtt tcgtgatgat cagcctgaag tggcatctat ttatcaacgt 720

tttgaatact atcaaggtgt caatcgtgat aaaaaaatca ccgctgaaat gatcgacaaa 780

aatttagcat tatggaaaaa attagcctta gaacaacatg ctgatggctc aataaccgca 840

aaagcccttg atcatcctaa tcgccagaat tttatcaaag tcgagggggt ctttagtgaa 900

gaaacccaaa aagcattact tgatgccaac atgctaagag atgtaggcaa aacgcttctt 960

caaacagcga tttacttgcg tagtcactcc ttatcagcaa tcgatagaaa aaaattagaa 1020

acgctctatt tattaggcac tcgttacgtt cttgaacaag gtttcacacg ggggagtggt 1080

taccaaatta ttactcacgt aggttatcaa acaagagagc tttttgatgc atggtttatt 1140

ggtcgccata ttctagcaaa acataatctg ttagcaccga cacaacaagc catgatgtgg 1200

tataacgcaa cagggcgcat atttgaaaaa gataatgaaa tcgttgatgc aaatgtcgat 1260

attctcaata cccaattaca gtggatgata aaaagtttat tgatgttgcc agattatcaa 1320

cagcgcgacc aagccttagc acaattgcaa agttggctaa acaaaaccat tcttagttct 1380

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agtcatgcag gttgggattg gaatcgatat ccaggaacga ctacgatcca ccttccttat 2040

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tcaacacaac gttattctgg tgccaataca ctaaataata acagtatgtt tgccatgaaa 2160

ttacatggtc acagtaaata tcaacaacaa agtctaagag cgaataaatc ctatttctta 2220

tttgataata gagttatcgc attaggctct ggtattgaaa ataacgataa acaacataca 2280

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caatactctg ttgatgacag aaattcacag caaacagaac aattgtttgc aacagccgtt 2520

atctctcacg gtaaagcccc taaaaatgca aattatgaat atgcaatagc catagaagca 2580

caagataata aagcgcctga atacaccgta ttgcagcata ataatcaact tcatgcagta 2640

aaagataaaa tcacgcaaga agagggatat gcttttttta atgccaccga agtcaattca 2700

tctcaagctt tattattatc aagtgattcc cccactatgg taatggtaaa aaaacaaaaa 2760

caacaattaa cgctaagtat tgttaatcct gatttaaatt tatatcaggg tattgaagct 2820

gaccaagttg ataataaggg taaccaggtt gaagtgagtg tttattctcg ccaatggctt 2880

acagccgatc ctcaaccaat aagtagtaca gttactgtaa aagggatttg gaaattagcc 2940

acaccacaat taggtgttaa tattagatat caaaataata atacgctaat tacaacaacg 3000

actatacaag caataccaat aacagtttat ttaattaagt aa 3042

<210> 4

<211> 3042

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgctaataa aaaattcttt agcttatgcg attacactaa gtttctgctt atccttaccc 60

gcacaagcat taccttctct ttctcatgaa ccttttggcg atctttatct ttttgaagat 120

gaaatgccaa ataccttgag cacctcaaat gaccatcagc tatcactaag taaagagcat 180

gctaaagatg gcgtacagtc actcaaatgg cagtatcaac cccaatcaac attaacactt 240

aataatgaag ttaattatca agatgataaa aatacagcaa caccactcac ttttatgatg 300

tggatttaca atgaaaaacc acagtcaacg ccccttacat tacaatttaa acaaaataat 360

caagtagcat taagttttaa aacggaactg aatttcacgg gttggcgagg tattgcagtt 420

ccttttcgtg atatgaaagg ctcagcaaca ggcaaattag ataaattagt cattactgca 480

ccagatcaag caggtacgct tttttttgat caaataatta tgagcgtacc tttagataat 540

cgttggccta ttcctgacta tcaaattcca tatgttaata atgcagtaaa tacaatggtg 600

agtaaaaatt ggagtgcatt attgatgtac gatcaaatgt tcacagcgca ttatcctaca 660

ttaaattttg cgactgagtt tcgtgatgat cagggtgaag tggcatctat ttatcaacgt 720

tttgaatact atcaaggtgt cagtcgtgat aaaaaaatca ccgctgaaat gatcgacaaa 780

aatttagcat tatggaaaaa attagcctta gaacaacatg ctgatggctc aataaccgca 840

aaagcccttg atcatcctaa tcgccagaat tttatcaaag tcgagggggt ctttagtgaa 900

gaaaccctaa aagcattact tgatgccaac atgctaagag atgtaggcaa aacgcttctt 960

caaacagcga tttacttgcg tagtcactcc ttatcagcaa tcgatagaaa aaaattagaa 1020

acgctctatt tattaggcac tcgttacgtt cttgaacaag gtttcacacg ggggagtggt 1080

taccaaatta ttactcacgt aggttatcaa acaagagagc tttttgatgc atggtttatt 1140

ggtcgccata ttctagcaaa acataatctg ttagcaccga cacaacaagc catgatgtgg 1200

tataacgcaa cagggcgcat atttgaaaaa gataatgaaa tcgttgatgc aaatgtcgat 1260

attctcaata cccaattaca gtggatgata aaaagtttat tgatgttgcc agattatcaa 1320

cagcgccaac aagccttagc acaattgcaa agttggctaa acaaaaccat tcttagttct 1380

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tccccttttc gtctttcatc accagcacat gcacgcttaa aagatgtatt attaaaaatg 1560

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ttacataaaa taagtattgc tcccttcaaa tggatggctc ttgcaggtac gcccgatggt 1680

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tttgaaggta ttaaagcaga aaatgaaccg gtaggtgcat gggcaatgaa ttatgcttca 1800

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cgtggtttta gtcgttattt agtgggtaat gaaagttatg agaataacaa ccgttatggt 1920

cgttacttgc aatatgggca acttgaaatt attcctgcgg atttaactaa atctggtttt 1980

agtcatgcag gttgggattg gaatcgatat ccaggaacga ctacgatcca ccttccttat 2040

aatgaactag aagcaaaact aagccaattg ccaagtgcag gcatagaaga aatgttgctt 2100

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ttacatggtc acagtaaata tcaacaacaa agtctaagag cgaataaatc ctatttctta 2220

tttgataata gagttatcgc attaggctct ggtattgaaa ataacgataa acaacataca 2280

acagaaacga cactgttcca gtttgctgtt cctaagttac aatcaattat aattaatggt 2340

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ccggcgggta acttgtataa attagctaaa gggcaaacgg tagaatttag ttatcaaaaa 2460

caatactctg ttgatgacag aaattcacag caaacagaac aattgtttgc aacagccgtt 2520

atctctcacg gtaaagcccc taaaaatgca aattatgaat atgcaatagc catagaagca 2580

caagataata aagcgcctga atacaccgta ttgcagcata ataatcaact tcatgcagta 2640

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tctcaagctt tattattatc aagtgattcc cccactatgg taatggtaaa aaaacaaaaa 2760

caacaattaa cgctaagtat tgttaatcct gatttaaatt tatatcaggg tattgaagct 2820

gaccaagttg ataataaggg taaccaggtt gaagtgagtg tttattctcg ccaatggctt 2880

acagccgatc ctcaaccaat aagtagtaca gttactgtaa aagggatttg gaaattagcc 2940

acaccacaat taggtgttaa tattagatat caaaataata atacgctaat tacaacaacg 3000

actatacaag caataccaat aacagtttat ttaattaagt aa 3042

<210> 5

<211> 1013

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Leu Ile Lys Asn Ser Leu Ala Tyr Ala Ile Thr Leu Ser Phe Cys

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Ala Gln Ala Leu Pro Ser Leu Ser His Glu Pro Phe

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Gly Asp Leu Tyr Leu Phe Glu Asp Glu Met Pro Asn Thr Leu Ser Thr

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Asn Asn Glu Val Asn Tyr Gln Asp Asp Lys Asn Thr Ala Thr Pro Leu

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Met Lys Gly Ser Ala Thr Gly Lys Leu Asp Lys Leu Val Ile Thr Ala

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Pro Asp Gln Ala Gly Thr Leu Phe Phe Asp Gln Ile Ile Met Ser Val

165 170 175

Pro Leu Asp Asn Arg Trp Pro Ile Pro Asp Tyr Gln Ile Pro Tyr Val

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Asn Asn Ala Val Asn Thr Met Val Ser Lys Asn Trp Ser Ala Leu Leu

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210 215 220

Thr Glu Phe Arg Asp Asp Gln Pro Glu Val Ala Ser Ile Tyr Gln Arg

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Phe Glu Tyr Tyr Gln Gly Val Asn Arg Asp Lys Lys Ile Thr Ala Glu

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Met Ile Asp Lys Asn Leu Ala Leu Trp Lys Lys Leu Ala Leu Glu Gln

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His Ala Asp Gly Ser Ile Thr Ala Lys Ala Leu Asp His Pro Asn Arg

275 280 285

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Gln Thr Ala Ile Tyr Leu Arg Ser His Ser Leu Ser Ala Ile Asp Arg

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Lys Lys Leu Glu Thr Leu Tyr Leu Leu Gly Thr Arg Tyr Val Leu Glu

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Leu Ala Lys His Asn Leu Leu Ala Pro Thr Gln Gln Ala Met Met Trp

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Tyr Asn Ala Thr Gly Arg Ile Phe Glu Lys Asp Asn Glu Ile Val Asp

405 410 415

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Leu Gln Ser Trp Leu Asn Lys Thr Ile Leu Ser Ser Lys Gly Val Ala

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Gly Gly Phe Lys Ser Asp Gly Ser Ile Phe His His Ser Gln His Tyr

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Pro Ala Tyr Ala Lys Asp Ala Phe Gly Gly Leu Ala Pro Ser Val Tyr

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675 680 685

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Glu Asn Asn Asp Lys Gln His Thr Thr Glu Thr Thr Leu Phe Gln Phe

755 760 765

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Lys Asp Lys Ile Thr Gln Glu Glu Gly Tyr Ala Phe Phe Asn Ala Thr

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Asn Lys Gly Asn Gln Val Glu Val Ser Val Tyr Ser Arg Gln Trp Leu

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Asn Asn Thr Leu Ile Thr Thr Thr Thr Ile Gln Ala Ile Pro Ile Thr

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Val Tyr Leu Ile Lys

1010

<210> 6

<211> 1013

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Leu Ile Lys Asn Ser Leu Ala Tyr Ala Ile Thr Leu Ser Phe Cys

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Ala Gln Ala Leu Pro Ser Leu Ser His Glu Pro Phe

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Gly Asp Leu Tyr Leu Phe Glu Asp Glu Met Pro Asn Thr Leu Ser Thr

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Ser Asn Asp His Gln Leu Ser Leu Ser Lys Glu His Ala Lys Asp Gly

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Val Gln Ser Leu Lys Trp Gln Tyr Gln Pro Gln Ser Thr Leu Thr Leu

65 70 75 80

Asn Asn Glu Val Asn Tyr Gln Asp Asp Lys Asn Thr Ala Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Met Met Trp Ile Tyr Asn Glu Lys Pro Gln Ser Thr Pro Leu

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Thr Leu Gln Phe Lys Gln Asn Asn Gln Val Ala Leu Ser Phe Lys Thr

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Pro Leu Asp Asn Arg Trp Pro Ile Pro Asp Tyr Gln Ile Pro Tyr Val

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Asn Asn Ala Val Asn Thr Met Val Ser Lys Asn Trp Ser Ala Leu Leu

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Met Tyr Asp Gln Met Phe Thr Ala His Tyr Pro Thr Leu Asn Phe Ala

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Thr Glu Phe Arg Asp Asp Gln Gly Glu Val Ala Ser Ile Tyr Gln Arg

225 230 235 240

Phe Glu Tyr Tyr Gln Gly Val Ser Arg Asp Lys Lys Ile Thr Ala Glu

245 250 255

Met Ile Asp Lys Asn Leu Ala Leu Trp Lys Lys Leu Ala Leu Glu Gln

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His Ala Asp Gly Ser Ile Thr Ala Lys Ala Leu Asp His Pro Asn Arg

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Lys Lys Leu Glu Thr Leu Tyr Leu Leu Gly Thr Arg Tyr Val Leu Glu

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Leu Ala Lys His Asn Leu Leu Ala Pro Thr Gln Gln Ala Met Met Trp

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Tyr Asn Ala Thr Gly Arg Ile Phe Glu Lys Asp Asn Glu Ile Val Asp

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Leu Leu Met Leu Pro Asp Tyr Gln Gln Arg Gln Gln Ala Leu Ala Gln

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Leu Gln Ser Trp Leu Asn Lys Thr Ile Leu Ser Ser Lys Gly Val Ala

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Gly Gly Phe Lys Pro Asp Gly Ser Ile Phe His His Ser Gln His Tyr

465 470 475 480

Pro Ala Tyr Ala Lys Asp Ala Phe Gly Gly Leu Ala Pro Ser Val Tyr

485 490 495

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500 505 510

Leu Lys Asp Val Leu Leu Lys Met Arg Ile Tyr Thr Lys Glu Thr Gln

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530 535 540

Ser Ile Ala Pro Phe Lys Trp Met Ala Leu Ala Gly Thr Pro Asp Gly

545 550 555 560

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565 570 575

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580 585 590

Ala Trp Ala Met Asn Tyr Ala Ser Met Ala Ile Gln Arg Arg Thr Ser

595 600 605

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675 680 685

Gln Leu Pro Ser Ala Gly Ile Glu Glu Met Leu Leu Ser Thr Gln Arg

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805 810 815

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835 840 845

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Lys Asp Lys Ile Thr Gln Glu Glu Gly Tyr Ala Phe Phe Asn Ala Thr

885 890 895

Glu Val Asn Ser Ser Gln Ala Leu Leu Leu Ser Ser Asp Ser Pro Thr

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995 1000 1005

Val Tyr Leu Ile Lys

1010

Claims

1.一株奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)FC220，2019年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.17426。

2.一种外切型硫酸软骨素降解酶，其特征在于，氨基酸序列为(a)或(b)之一种：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有外切型硫酸软骨素降解酶活性的由(a)衍生的蛋白质氨基酸序列；

所述氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的外切型硫酸软骨素降解酶分离自权利要求1所述的奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)FC220。

3.如权利要求2所述的外切型硫酸软骨素降解酶，其特征在于，(b)中所述氨基酸序列为：如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。

4.权利要求2所述的外切型硫酸软骨素降解酶的编码基因，其特征在于，核苷酸序列为(i)或(ii)之一种：

(i)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(ii)在严格条件下与(i)限定的核苷酸序列杂交且编码具有外切型硫酸软骨素降解酶活性的蛋白质的DNA分子核苷酸序列；

所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的外切型硫酸软骨素降解酶的编码基因来源于权利要求1所述的奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)FC220。

5.如权利要求4所述的外切型硫酸软骨素降解酶的编码基因，其特征在于，(ii)中所述严格条件，是指：

6.如权利要求4所述的外切型硫酸软骨素降解酶的编码基因，其特征在于，(ii)中所述核苷酸序列为：如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

7.一种重组表达载体，其特征在于，在表达载体中插入了权利要求4所述的外切型硫酸软骨素降解酶的编码基因；

优选的，所述表达载体选自大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体。

8.一种重组菌或转基因细胞系，其特征在于，在宿主细胞或细胞系中插入了权利要求4所述的外切型硫酸软骨素降解酶的编码基因。

9.如权利要求8所述的重组菌或转基因细胞系，其特征在于，所述宿主细胞或细胞系选自大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；优选的，所述大肠杆菌宿主细胞为Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109或Escherichia coli DH5α，所述酵母菌宿主细胞为Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris或Kluyveromyces Iactis，所述枯草杆菌宿主细胞为Bacillus subtilis R25或Bacillus subtilis 9920，所述乳酸菌宿主细胞为Lactic acid bacteria C0CC101，所述放线菌宿主细胞为Streptomyces spp.，所述丝状真菌宿主细胞为Trichoderma viride,Trichoderma reesei,Aspergillus niger或Aspergillus nidulans，所述昆虫细胞为Bombyxmori或Antharaea eucalypti，所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞CHO、幼小仓鼠肾脏细胞BHK或中国仓鼠肺细胞CHL。

10.权利要求2所述的外切型硫酸软骨素降解酶作为增强药物的吸收或递送成分在制备药物中的应用。