CN111500565A

CN111500565A - 褐藻胶裂解酶alb00773及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用

Info

Publication number: CN111500565A
Application number: CN202010372543.1A
Authority: CN
Inventors: 鲍时翔; 黄惠琴; 郑志国; 朱军; 邹潇潇; 孟天; 胡永华
Original assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2020-05-06
Filing date: 2020-05-06
Publication date: 2020-08-07

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及褐藻胶裂解酶ALB00773及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用。该褐藻胶裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明公开了一种新型褐藻胶裂解酶ALB00773及编码该酶的基因序列和氨基酸序列，不但为市场提供了新的褐藻胶裂解酶资源，而且通过公开的基因序列和氨基酸序列，可实现褐藻胶裂解酶的异源表达应用和异源表达生产。本发明开发了利用大肠杆菌重组表达生产褐藻胶裂解酶ALB00773的方法与工艺，利用本方法，不但实现褐藻胶裂解酶ALB00773的重组生产，而且利用Ni‑NTA柱特异性吸附表达的蛋白，纯化效率大大提高。

Description

褐藻胶裂解酶ALB00773及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及褐藻胶裂解酶ALB00773及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用。

背景技术

褐藻胶是褐藻中含量最丰富的线性多糖，由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸两种糖醛酸单体通过α/β-1,4糖苷键以不同的组合模式共同构成多聚古罗糖醛酸(poly-G)、多聚甘露糖醛酸(poly-M)和古罗糖醛酸与甘露糖醛酸随机聚合的杂合片段(poly-GM)。褐藻寡糖是褐藻胶的寡聚物，相对分子质量低、水溶性好、稳定性高及安全无毒，可以用作植物生长促进剂、抗氧化剂和肿瘤抑制剂等，在农业、食品和制药工业中有很好的应用前景。目前，褐藻寡糖主要通过酸法、氧化降解法、酶法等方法制备，酶法制备具有条件温和、容易控制、产物专一等优点，成为当前国内外研究热点之一。

褐藻胶裂解酶是一类多糖裂解酶，能够通过β消除反应生成寡糖产物。褐藻胶裂解酶可以基于底物特异性分为三种，一是聚古罗糖醛酸裂解酶，二是聚甘露糖醛酸裂解酶，三是对聚古罗糖醛酸和聚甘露糖醛酸同时具有活性。就作用方式而言，褐藻胶裂解酶可分为内切酶和外切酶，内切酶切割褐藻胶内糖苷键并释放不饱和低聚糖(二糖、三糖和四糖)，而外切酶可以进一步将寡糖降解为单体。褐藻胶裂解酶分布于7个多糖裂解酶家族中，分别是PL-5、PL-6、PL-7、PL-14、PL-15、PL-17和PL-18家族。褐藻胶裂解酶来源广泛，海洋藻类、海洋软体动物和微生物(包括细菌、真菌和一些病毒)等都有产生褐藻胶裂解酶的报道，其中关于微生物来源的报道最多。细菌主要包括假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)、弧菌(Vibrio)、黄杆菌(Flavobacterium)、芽孢杆菌(Bacillus)、链霉菌(Streptomyces)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、固氮菌(Azotobacter)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、棒杆菌(Corynebacterium)、类单胞菌(Alteromonas)、肠杆菌(Enterobacter)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)等。真菌报道较少，在国外报道有Asteromyces cruciatus、Corouospora intermedia、Dendryphiella arenaria、Dendryphiella salina等。2018年高杨报道从南大洋沉积物中分离出红酵母属(Rhodotorula)、青霉菌属(Penicillium)和曲霉属(Aspergillus)共10株产褐藻胶裂解酶真菌。1999年Suda首次在小球藻病毒基因中发现了有关褐藻胶裂解酶的基因片段，并对该基因表达的蛋白进行了表征。

褐藻胶裂解酶不仅在褐藻寡糖制备领域具有广泛应用，在医药领域同样备受人们关注。自1928年发现青霉素至今，以青霉素为代表的抗生素从病魔手中挽救了无数的生命，给感染性疾病的治疗带来了巨大的变化。抗生素是通过抑制细胞壁、细胞膜、核酸或蛋白质等生命物质的合成，对细菌产生毒性的。然而，抗生素的长期使用，导致抗生素耐药菌株的出现，如对β-内酰胺类、氨基糖苷类、氯霉素和四环素等抗生素耐药并呈上升趋势。近年来，由金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌等引起的细菌感染导致的死亡率和治疗费用也在持续增加。英国政府2016年抗生素耐药性评估报告显示，全球每年约有70万人死于耐药菌感染，到2050年死亡人数可能达到1000万。世界卫生组织等监管机构宣布，抗生素的耐药性正在对全球健康构成威胁，发现新的治疗细菌感染的方法已迫在眉睫。国内外研究发现，细菌合成并附着在其表面的生物膜是细菌在生长过程中为适应生存环境而形成的一种天然屏障，起到保护功能。病原细菌生物膜一方面使细菌逃避机体免疫系统的作用，阻碍细胞吞噬作用，另外，可以阻止抗生素的渗透，降低了病原细菌对抗生素的敏感性。多糖是细菌生物膜的重要组分，降解细菌生物膜多糖，是提高抗生素疗效的新途径。

本发明的褐藻胶裂解酶来源于申请人分离获得的类芽胞杆菌HB172198(Paenibacillus sp.)，该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为：CGMCC No.15412，保藏日期为：2018年03月05日。申请人已就该菌株及其应用申请了专利(一种类芽胞杆菌菌株HB172198及其应用，申请号201810891281.2)。在该专利中，申请人就菌株HB172198、菌株HB172198发酵产酶工艺、菌株HB172198产生的酶在降解褐藻上的应用申请保护。虽然通过类芽胞杆菌HB172198发酵方法可以获得褐藻胶裂解酶，但发酵产物组成复杂，褐藻胶裂解酶氨基酸序列与空间结构无从知晓，获得的发酵产物中褐藻胶裂解酶纯度较低，分离纯化成本高。因此，如何在降低分离纯化成本的情况下获得高纯度褐藻胶裂解酶，成为了研究人员需要攻克的技术难题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了褐藻胶裂解酶ALB00773及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用。本发明通过基因组测序与生物信息学技术，获得了编码褐藻胶裂解酶ALB00773的基因及酶的氨基酸序列，并开发了利用大肠杆菌重组表达的方法生产该酶及其应用方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种褐藻胶裂解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了编码上述褐藻胶裂解酶的基因，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了一种褐藻胶裂解酶，其氨基酸序列在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸。

本发明还提供了编码褐藻胶裂解酶的基因；该褐藻胶裂解酶的氨基酸序列在SEQID NO:1所示氨基酸序列基础上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸。

本发明还提供了一种重组质粒，重组质粒为插入上述基因的质粒载体。

作为优选，质粒载体为pET-28a质粒载体。

本发明还提供了一种工程菌株，工程菌株为转入所得重组质粒的大肠杆菌。

作为优选，大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还提供了一种生产上述褐藻胶裂解酶的方法，将所得工程菌株接种于LB培养基中进行培养，诱导表达后离心，得到上清液I和菌体；

将菌体裂解后离心，得到上清液II；

将上清液I和上清液II合并，采用Ni-NTA柱纯化表达的蛋白，经过淋洗、洗脱，获得粗蛋白液；

粗蛋白液经过透析、PEG包埋浓缩，获得褐藻胶裂解酶。

本发明还提供了上述褐藻胶裂解酶在降解褐藻胶或褐藻中的应用。

本发明还提供了上述褐藻胶裂解酶在降解病原微生物胞外多糖、提高抗生素对病原微生物杀灭效果中的应用。

本发明提供了褐藻胶裂解酶ALB00773及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用。该褐藻胶裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明具有的有益效果为：

1.本发明公开了一种新型褐藻胶裂解酶ALB00773及编码该酶的基因序列和氨基酸序列，不但为市场提供了新的褐藻胶裂解酶资源，而且通过公开的基因序列和氨基酸序列，可实现褐藻胶裂解酶的异源表达应用和异源表达生产。

2.开发了利用大肠杆菌重组表达生产褐藻胶裂解酶ALB00773的方法与工艺，利用本方法，不但实现褐藻胶裂解酶ALB00773的重组生产，而且利用Ni-NTA柱特异性吸附表达的蛋白，纯化效率大大提高。

3.利用褐藻胶裂解酶ALB00773生产褐藻寡糖。

4.将褐藻胶裂解酶ALB00773与抗生素配合使用，提高对病原微生物的杀灭效果，为杀灭病原微生物提供了新技术。

附图说明

图1褐藻胶裂解酶ALB00773的三维结构；

图2重组表达的褐藻胶裂解酶ALB00773的电泳检测；图注：左边为蛋白marker(14-120kD)；右边为重组表达的褐藻胶裂解酶ALB00773；

图3褐藻寡糖的TLC检测；注：左边为标准品单糖、三糖和五糖；右边为酶解产物。

具体实施方式

本发明公开了褐藻胶裂解酶ALB00773及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明申请人通过基因组测序与生物信息学技术，获得了编码褐藻胶裂解酶ALB00773的基因及酶的氨基酸序列，并开发了利用大肠杆菌重组表达的方法生产该酶及其应用方法，具体如下：

1.通过基因组测序与生物信息学技术，获得褐藻胶裂解酶氨基酸序列；

2.利用大肠杆菌重组表达的方法生产褐藻胶裂解酶ALB00773；

3.利用褐藻胶裂解酶ALB00773降解褐藻胶和褐藻，制备褐藻寡糖；

4.利用褐藻胶裂解酶降解病原微生物胞外多糖，提高抗生素对病原微生物的杀灭效果。

本发明提供的褐藻胶裂解酶ALB00773及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1新型褐藻胶裂解酶的来源及序列分析

对菌株HB172198采用PacBio RSII和IlluminaX10测序平台测序，获得长度为4,475,055bp、GC含量51.2％的基因组完成图。通过褐藻胶裂解酶CAZyme家族分类预测与分析，发现共有41个蛋白与CAZy数据库有匹配，包括30个糖苷水解酶(GlycosideHydrolases，GHs)、7个糖基转移酶(Glycosyl Transferases，GTs)、3个糖类酯酶(Carbohydrate Esterases，CEs)、以及1个辅助酶(AuxiliaryActivities，AAs)。基于CAZy数据库菌株HB172198全基因组多糖裂解酶家族(Polysaccharide Lyases，PLs)的氨基酸序列进行预测，发现3个褐藻胶裂解酶基因alb02660、alb00773和alb02668，分别对应3个褐藻胶裂解酶ALB02660、ALB00773和ALB02668，经检索，褐藻胶裂解酶ALB00773属于多糖裂解酶PL5家族，其编码氨基酸序列最高相似度仅为42.46％，该褐藻胶裂解酶ALB00773氨基酸序列、编码褐藻胶裂解酶ALB00773对应的基因alb00773序列如下序列所示，褐藻胶裂解酶ALB00773的三维结构图见图1。

褐藻胶裂解酶ALB00773氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：

MYTMRSLRRKGLNLMVGFMIIASLSLVACSGLVEAAVYTGEKPNRTVQFTVSELLEQNTVLYAPLDKVLEGFGYTSSLDEKSKKVSITAGRKSIEMKLGEPFGYLNSLEISLQKPALTVDGVVYVPLTFFSDILNLEVNVKDPIINISEQKEKNISRTGKLIYYNEALMDKSRENLLRGVKSYVAAFDKIQTDAEKFMNAPLNPVTKKTLLPPSKDKHDYISTAPYFWPDPAKPDGLPWIPKDGQVNPASRGDDTDFTRTSEMFHGIGNLTLSYYFTEDPKYLDKAYEVIKVWFINEETKMNPHIKYGQSVPGGVDGRPLGVIEWTSIVDIVTAMQmLEKQDMISKDDVDAVIDWFTAYASWLTRSDMGIQEKQQHNNHGSVYDYQLAGILLYLNNYKDAVQLFEEAKVERIEDYIEPDGSLPYELRRTKSVNYQNTCLWPLIQVAEIAERFTEVDLWNYTSDKGVSLGKAFENLAPYAKSEKEWKWEQIQDSAEIKMATMIRPLFLKTSNIFHYPIDGILDQSIMVSAEDILKYNIQGNDKGILSATFILQPTAEESTIRINWMVQKTGVTKYVLYRKDSEDEMYSELIKINSSNLKQYVDKKDLEYGKTYYYKIQALDEHDVIIDELESNEIKFSSKWIDLKGKLVNALAGEKITINLYKCEKIPYFIFNTIKGKDIEFLIKTDSEIAGAGVSWVINGTSIEKSITADILFDVTNKFSLVPNENMTKLPKGAKTYMKLGRVHTSPFGFQAKLHVNVGAKYANDVAKLYAFGAQGVVEVHSGVEISQDGSVVFDNISTPDYVIAIYGADTTAPVTTDNVPAGWSNTDVTVKLIATDEETGIATTYYSINGSEPSTGSTISFESEGVHILQYWSVDHAGNQEDVKTTLIRIDKTAPTLEIVLSKKVLWPPNHRmLPVKATISAQDSLSDVNVVLQSITSNEPDDGLGDGDRQNDIQEAEWNTYDLEFmLRAERSGTGTGRTYTVTYLATDEAGNQATASVEVRVPHSVSIEKK

褐藻胶裂解酶ALB00773对应的基因alb00773序列(SEQ ID NO:2)：

ATGTATACGATGAGGAGCCTAAGAAGAAAGGGGTTAAATTTAATGGTAGGATTTATGATTATCGCTAGTTTGTCACTGGTAGCGTGTTCGGGCTTAGTGGAAGCTGCAGTATATACAGGAGAAAAGCCGAACCGCACAGTACAATTTACTGTAAGTGAACTCTTAGAGCAAAATACAGTATTATATGCACCGCTTGATAAGGTGCTCGAAGGTTTTGGATATACCTCAAGTCTAGATGAAAAATCCAAAAAAGTTAGTATCACTGCTGGTCGGAAAAGTATAGAGATGAAGCTCGGAGAGCCATTTGGATATTTAAACAGTCTGGAAATCTCTCTCCAGAAGCCAGCCCTAACAGTTGATGGTGTTGTATATGTACCTCTTACATTTTTCTCTGACATTTTGAATCTTGAGGTAAATGTAAAAGATCCAATAATTAATATTTCTGAGCAAAAAGAAAAAAATATAAGCAGGACAGGTAAGCTCATTTACTATAACGAAGCTTTGATGGATAAATCAAGAGAAAATTTACTCAGAGGTGTAAAGTCTTACGTTGCCGCATTTGACAAAATTCAAACCGATGCTGAAAAATTTATGAATGCACCCCTTAACCCAGTAACTAAGAAAACTCTATTACCGCCAAGCAAGGATAAGCATGATTATATCAGTACCGCGCCATACTTCTGGCCAGATCCAGCGAAGCCTGATGGACTCCCATGGATACCCAAAGATGGTCAGGTGAATCCTGCTTCAAGAGGAGATGATACAGACTTTACTCGTACAAGCGAAATGTTTCATGGCATTGGAAATTTAACTCTTAGCTATTATTTTACAGAGGATCCTAAGTACCTTGATAAAGCTTATGAGGTCATTAAGGTATGGTTTATAAATGAAGAAACAAAAATGAATCCACACATAAAGTATGGTCAGAGTGTCCCCGGAGGTGTAGATGGAAGACCTCTGGGTGTAATTGAATGGACCTCTATTGTTGATATTGTTACTGCAATGCAGATGCTTGAAAAGCAGGACATGATATCTAAGGATGATGTTGATGCAGTGATAGACTGGTTTACAGCGTATGCATCCTGGCTCACAAGAAGCGATATGGGAATTCAAGAAAAGCAACAGCATAATAATCATGGCTCTGTTTATGATTATCAGTTAGCGGGAATTTTATTGTATTTAAACAACTATAAGGATGCGGTTCAACTATTCGAAGAGGCTAAGGTCGAAAGAATTGAGGATTATATTGAGCCAGACGGAAGCCTGCCATATGAACTTAGGAGAACCAAGTCAGTTAATTACCAAAACACTTGCTTGTGGCCATTGATACAAGTTGCTGAGATCGCAGAACGTTTTACAGAGGTAGATCTTTGGAATTATACATCAGACAAAGGAGTGTCTTTAGGCAAAGCTTTCGAAAATCTTGCTCCATATGCAAAGAGTGAAAAAGAGTGGAAATGGGAGCAAATTCAGGATTCAGCAGAAATTAAAATGGCCACAATGATAAGACCTCTTTTCCTTAAAACAAGTAACATATTTCATTATCCTATTGATGGCATACTAGATCAGTCTATTATGGTATCAGCTGAGGATATTTTAAAATACAACATTCAGGGAAATGATAAAGGGATCCTCTCCGCTACGTTTATTCTTCAACCTACAGCAGAGGAGTCGACCATAAGAATAAACTGGATGGTTCAGAAAACAGGAGTTACAAAATATGTACTCTACCGAAAAGATTCTGAAGATGAAATGTATTCAGAATTGATAAAAATTAATTCTTCAAATTTAAAACAATATGTAGACAAAAAGGATCTTGAATATGGAAAAACATATTATTATAAGATTCAGGCATTAGATGAACACGATGTTATTATTGATGAGCTTGAGTCAAATGAAATCAAGTTCTCAAGTAAATGGATTGATTTGAAAGGAAAATTGGTTAATGCACTTGCTGGTGAGAAAATTACAATAAATCTTTATAAATGCGAAAAAATACCTTACTTCATTTTTAATACCATTAAAGGAAAGGATATTGAATTTTTGATCAAGACAGATAGTGAGATTGCAGGAGCTGGTGTTTCATGGGTTATAAATGGCACTTCAATAGAAAAATCTATTACAGCAGACATACTTTTTGATGTAACCAATAAGTTTTCTCTTGTTCCTAATGAAAACATGACAAAGCTCCCAAAAGGTGCAAAAACATATATGAAGCTTGGTAGAGTTCATACTTCACCATTCGGTTTTCAAGCGAAACTCCATGTAAATGTTGGTGCGAAATATGCGAATGATGTGGCTAAATTATATGCTTTTGGAGCCCAGGGAGTAGTTGAAGTGCATTCTGGTGTCGAGATTAGCCAAGATGGCAGCGTCGTATTTGATAATATAAGTACACCAGATTATGTTATTGCAATTTATGGTGCGGATACTACCGCGCCGGTTACGACGGATAATGTACCAGCGGGCTGGTCTAACACTGATGTGACGGTAAAGCTGATCGCAACAGATGAGGAGACCGGTATTGCAACAACGTATTATTCTATTAATGGAAGCGAACCGTCAACAGGCTCGACGATATCATTTGAAAGCGAAGGAGTTCATATCTTGCAATATTGGAGCGTCGATCACGCAGGTAATCAGGAAGATGTGAAAACTACGCTTATTCGAATCGATAAAACAGCCCCGACGTTAGAGATTGTTTTATCCAAAAAGGTGCTGTGGCCGCCGAACCATCGTATGCTTCCAGTAAAAGCTACCATTAGTGCACAGGACTCGCTTTCAGACGTGAACGTCGTCCTCCAATCCATTACCAGTAATGAGCCAGACGATGGTTTGGGCGACGGGGATAGGCAGAACGATATTCAAGAAGCAGAATGGAATACGTATGATCTTGAGTTCATGCTCCGTGCGGAACGGTCGGGCACAGGAACAGGCAGAACCTACACGGTTACTTATCTTGCCACCGATGAGGCTGGTAACCAAGCCACTGCTTCGGTAGAGGTGAGAGTTCCTCATTCGGTATCTATTGAGAAGAAATAA

实施例2利用大肠杆菌重组表达的方法生产褐藻胶裂解酶ALB00773

按照基因工程标准操作方法，将褐藻胶裂解酶基因与pET-28a质粒载体进行重组，将重组质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，获得可以产生褐藻胶裂解酶的工程菌株。将工程菌株接种于100mL含卡纳抗生素的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600的生物量为0.4。在菌液中加入终浓度为0.1mM的IPTG，20℃诱导20小时，4℃、13000rpm下离心15min，获得上清液Ⅰ。对于离心获得的菌体，向离心管中加入10mL裂解液，将菌体吹打混匀。液氮速冻3min，放在4℃冰箱自然化开后，用超声仪破碎30min，4℃、13000rpm下离心15min，获得上清液Ⅱ。合并上清液Ⅰ和上清液Ⅱ。采用Ni-NTA柱纯化表达的蛋白，经过淋洗、洗脱，获得粗蛋白液。然后经过透析、PEG包埋浓缩，获得表达产物。经电泳和活性检测，表达产物为褐藻胶裂解酶ALB00773，图2为重组表达的褐藻胶裂解酶ALB00773的电泳检测。

实施例3褐藻胶裂解酶ALB00773降解褐藻胶制备褐藻寡糖

配制质量百分含量为2％的海藻酸钠溶液，加入表达的褐藻胶裂解酶，反应温度30℃，反应2、6、10、14、20、32、48h时分别取溶液5mL加无水乙醇至终浓度为70％，离心，取上清，冷冻干燥，加少量水溶解进行薄层层析(TLC)。展开剂为正丁醇∶甲酸∶水＝4∶5∶1，用5％的硫酸乙醇作为显色剂，110℃下保持10min显色，结果表明，获得的褐藻寡糖聚合度在2～9之间，如图3。

实施例4褐藻胶裂解酶与抗生素联合使用杀灭病原微生物

采用微生物药敏分析测试板测试褐藻胶裂解酶与抗生素联合使用杀灭病原微生物的效果，病原菌为临床分离的铜绿假单胞菌并设不添加褐藻胶裂解酶的对照试验组。将铜绿假单胞菌在Luria-Bertani固体培养基上经35℃培养18～24小时，挑取纯培养菌落于稀释液瓶制作细菌悬液，浓度为OD600＝0.14。分装两瓶LB液体培养基，各10mL。实验组培养基中加入50μL细菌悬液和200μL酶液，对照组培养基中加入50μL细菌悬液，分别混匀。测试板每孔液体加入量为100μL。实验结果如表1，由表可知，在头孢吡肟、哌拉西林、多粘菌素B、氧氟沙星、奈替米星、替卡西林、氯霉素、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦等抗菌药物的作用下，实验组的抑菌效果较对照组显著增强。实验结果证明，褐藻胶裂解酶在一定程度上可以有效降解铜绿假单胞菌生物膜，提高抗菌药物药效性，可辅助治疗铜绿假单胞菌感染。

表1药敏分析实验结果

注：“+”表示有抑菌效果；“++”表示有抑菌效果较强；空白表示无抑菌效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120> 褐藻胶裂解酶ALB00773及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用

<130> MP2002456

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1013

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Tyr Thr Met Arg Ser Leu Arg Arg Lys Gly Leu Asn Leu Met Val

1 5 10 15

Gly Phe Met Ile Ile Ala Ser Leu Ser Leu Val Ala Cys Ser Gly Leu

20 25 30

Val Glu Ala Ala Val Tyr Thr Gly Glu Lys Pro Asn Arg Thr Val Gln

35 40 45

Phe Thr Val Ser Glu Leu Leu Glu Gln Asn Thr Val Leu Tyr Ala Pro

50 55 60

Leu Asp Lys Val Leu Glu Gly Phe Gly Tyr Thr Ser Ser Leu Asp Glu

65 70 75 80

Lys Ser Lys Lys Val Ser Ile Thr Ala Gly Arg Lys Ser Ile Glu Met

85 90 95

Lys Leu Gly Glu Pro Phe Gly Tyr Leu Asn Ser Leu Glu Ile Ser Leu

100 105 110

Gln Lys Pro Ala Leu Thr Val Asp Gly Val Val Tyr Val Pro Leu Thr

115 120 125

Phe Phe Ser Asp Ile Leu Asn Leu Glu Val Asn Val Lys Asp Pro Ile

130 135 140

Ile Asn Ile Ser Glu Gln Lys Glu Lys Asn Ile Ser Arg Thr Gly Lys

145 150 155 160

Leu Ile Tyr Tyr Asn Glu Ala Leu Met Asp Lys Ser Arg Glu Asn Leu

165 170 175

Leu Arg Gly Val Lys Ser Tyr Val Ala Ala Phe Asp Lys Ile Gln Thr

180 185 190

Asp Ala Glu Lys Phe Met Asn Ala Pro Leu Asn Pro Val Thr Lys Lys

195 200 205

Thr Leu Leu Pro Pro Ser Lys Asp Lys His Asp Tyr Ile Ser Thr Ala

210 215 220

Pro Tyr Phe Trp Pro Asp Pro Ala Lys Pro Asp Gly Leu Pro Trp Ile

225 230 235 240

Pro Lys Asp Gly Gln Val Asn Pro Ala Ser Arg Gly Asp Asp Thr Asp

245 250 255

Phe Thr Arg Thr Ser Glu Met Phe His Gly Ile Gly Asn Leu Thr Leu

260 265 270

Ser Tyr Tyr Phe Thr Glu Asp Pro Lys Tyr Leu Asp Lys Ala Tyr Glu

275 280 285

Val Ile Lys Val Trp Phe Ile Asn Glu Glu Thr Lys Met Asn Pro His

290 295 300

Ile Lys Tyr Gly Gln Ser Val Pro Gly Gly Val Asp Gly Arg Pro Leu

305 310 315 320

Gly Val Ile Glu Trp Thr Ser Ile Val Asp Ile Val Thr Ala Met Gln

325 330 335

Met Leu Glu Lys Gln Asp Met Ile Ser Lys Asp Asp Val Asp Ala Val

340 345 350

Ile Asp Trp Phe Thr Ala Tyr Ala Ser Trp Leu Thr Arg Ser Asp Met

355 360 365

Gly Ile Gln Glu Lys Gln Gln His Asn Asn His Gly Ser Val Tyr Asp

370 375 380

Tyr Gln Leu Ala Gly Ile Leu Leu Tyr Leu Asn Asn Tyr Lys Asp Ala

385 390 395 400

Val Gln Leu Phe Glu Glu Ala Lys Val Glu Arg Ile Glu Asp Tyr Ile

405 410 415

Glu Pro Asp Gly Ser Leu Pro Tyr Glu Leu Arg Arg Thr Lys Ser Val

420 425 430

Asn Tyr Gln Asn Thr Cys Leu Trp Pro Leu Ile Gln Val Ala Glu Ile

435 440 445

Ala Glu Arg Phe Thr Glu Val Asp Leu Trp Asn Tyr Thr Ser Asp Lys

450 455 460

Gly Val Ser Leu Gly Lys Ala Phe Glu Asn Leu Ala Pro Tyr Ala Lys

465 470 475 480

Ser Glu Lys Glu Trp Lys Trp Glu Gln Ile Gln Asp Ser Ala Glu Ile

485 490 495

Lys Met Ala Thr Met Ile Arg Pro Leu Phe Leu Lys Thr Ser Asn Ile

500 505 510

Phe His Tyr Pro Ile Asp Gly Ile Leu Asp Gln Ser Ile Met Val Ser

515 520 525

Ala Glu Asp Ile Leu Lys Tyr Asn Ile Gln Gly Asn Asp Lys Gly Ile

530 535 540

Leu Ser Ala Thr Phe Ile Leu Gln Pro Thr Ala Glu Glu Ser Thr Ile

545 550 555 560

Arg Ile Asn Trp Met Val Gln Lys Thr Gly Val Thr Lys Tyr Val Leu

565 570 575

Tyr Arg Lys Asp Ser Glu Asp Glu Met Tyr Ser Glu Leu Ile Lys Ile

580 585 590

Asn Ser Ser Asn Leu Lys Gln Tyr Val Asp Lys Lys Asp Leu Glu Tyr

595 600 605

Gly Lys Thr Tyr Tyr Tyr Lys Ile Gln Ala Leu Asp Glu His Asp Val

610 615 620

Ile Ile Asp Glu Leu Glu Ser Asn Glu Ile Lys Phe Ser Ser Lys Trp

625 630 635 640

Ile Asp Leu Lys Gly Lys Leu Val Asn Ala Leu Ala Gly Glu Lys Ile

645 650 655

Thr Ile Asn Leu Tyr Lys Cys Glu Lys Ile Pro Tyr Phe Ile Phe Asn

660 665 670

Thr Ile Lys Gly Lys Asp Ile Glu Phe Leu Ile Lys Thr Asp Ser Glu

675 680 685

Ile Ala Gly Ala Gly Val Ser Trp Val Ile Asn Gly Thr Ser Ile Glu

690 695 700

Lys Ser Ile Thr Ala Asp Ile Leu Phe Asp Val Thr Asn Lys Phe Ser

705 710 715 720

Leu Val Pro Asn Glu Asn Met Thr Lys Leu Pro Lys Gly Ala Lys Thr

725 730 735

Tyr Met Lys Leu Gly Arg Val His Thr Ser Pro Phe Gly Phe Gln Ala

740 745 750

Lys Leu His Val Asn Val Gly Ala Lys Tyr Ala Asn Asp Val Ala Lys

755 760 765

Leu Tyr Ala Phe Gly Ala Gln Gly Val Val Glu Val His Ser Gly Val

770 775 780

Glu Ile Ser Gln Asp Gly Ser Val Val Phe Asp Asn Ile Ser Thr Pro

785 790 795 800

Asp Tyr Val Ile Ala Ile Tyr Gly Ala Asp Thr Thr Ala Pro Val Thr

805 810 815

Thr Asp Asn Val Pro Ala Gly Trp Ser Asn Thr Asp Val Thr Val Lys

820 825 830

Leu Ile Ala Thr Asp Glu Glu Thr Gly Ile Ala Thr Thr Tyr Tyr Ser

835 840 845

Ile Asn Gly Ser Glu Pro Ser Thr Gly Ser Thr Ile Ser Phe Glu Ser

850 855 860

Glu Gly Val His Ile Leu Gln Tyr Trp Ser Val Asp His Ala Gly Asn

865 870 875 880

Gln Glu Asp Val Lys Thr Thr Leu Ile Arg Ile Asp Lys Thr Ala Pro

885 890 895

Thr Leu Glu Ile Val Leu Ser Lys Lys Val Leu Trp Pro Pro Asn His

900 905 910

Arg Met Leu Pro Val Lys Ala Thr Ile Ser Ala Gln Asp Ser Leu Ser

915 920 925

Asp Val Asn Val Val Leu Gln Ser Ile Thr Ser Asn Glu Pro Asp Asp

930 935 940

Gly Leu Gly Asp Gly Asp Arg Gln Asn Asp Ile Gln Glu Ala Glu Trp

945 950 955 960

Asn Thr Tyr Asp Leu Glu Phe Met Leu Arg Ala Glu Arg Ser Gly Thr

965 970 975

Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Thr Val Thr Tyr Leu Ala Thr Asp Glu Ala

980 985 990

Gly Asn Gln Ala Thr Ala Ser Val Glu Val Arg Val Pro His Ser Val

995 1000 1005

Ser Ile Glu Lys Lys

1010

<210> 2

<211> 3042

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtatacga tgaggagcct aagaagaaag gggttaaatt taatggtagg atttatgatt 60

atcgctagtt tgtcactggt agcgtgttcg ggcttagtgg aagctgcagt atatacagga 120

gaaaagccga accgcacagt acaatttact gtaagtgaac tcttagagca aaatacagta 180

ttatatgcac cgcttgataa ggtgctcgaa ggttttggat atacctcaag tctagatgaa 240

aaatccaaaa aagttagtat cactgctggt cggaaaagta tagagatgaa gctcggagag 300

ccatttggat atttaaacag tctggaaatc tctctccaga agccagccct aacagttgat 360

ggtgttgtat atgtacctct tacatttttc tctgacattt tgaatcttga ggtaaatgta 420

aaagatccaa taattaatat ttctgagcaa aaagaaaaaa atataagcag gacaggtaag 480

ctcatttact ataacgaagc tttgatggat aaatcaagag aaaatttact cagaggtgta 540

aagtcttacg ttgccgcatt tgacaaaatt caaaccgatg ctgaaaaatt tatgaatgca 600

ccccttaacc cagtaactaa gaaaactcta ttaccgccaa gcaaggataa gcatgattat 660

atcagtaccg cgccatactt ctggccagat ccagcgaagc ctgatggact cccatggata 720

cccaaagatg gtcaggtgaa tcctgcttca agaggagatg atacagactt tactcgtaca 780

agcgaaatgt ttcatggcat tggaaattta actcttagct attattttac agaggatcct 840

aagtaccttg ataaagctta tgaggtcatt aaggtatggt ttataaatga agaaacaaaa 900

atgaatccac acataaagta tggtcagagt gtccccggag gtgtagatgg aagacctctg 960

ggtgtaattg aatggacctc tattgttgat attgttactg caatgcagat gcttgaaaag 1020

caggacatga tatctaagga tgatgttgat gcagtgatag actggtttac agcgtatgca 1080

tcctggctca caagaagcga tatgggaatt caagaaaagc aacagcataa taatcatggc 1140

tctgtttatg attatcagtt agcgggaatt ttattgtatt taaacaacta taaggatgcg 1200

gttcaactat tcgaagaggc taaggtcgaa agaattgagg attatattga gccagacgga 1260

agcctgccat atgaacttag gagaaccaag tcagttaatt accaaaacac ttgcttgtgg 1320

ccattgatac aagttgctga gatcgcagaa cgttttacag aggtagatct ttggaattat 1380

acatcagaca aaggagtgtc tttaggcaaa gctttcgaaa atcttgctcc atatgcaaag 1440

agtgaaaaag agtggaaatg ggagcaaatt caggattcag cagaaattaa aatggccaca 1500

atgataagac ctcttttcct taaaacaagt aacatatttc attatcctat tgatggcata 1560

ctagatcagt ctattatggt atcagctgag gatattttaa aatacaacat tcagggaaat 1620

gataaaggga tcctctccgc tacgtttatt cttcaaccta cagcagagga gtcgaccata 1680

agaataaact ggatggttca gaaaacagga gttacaaaat atgtactcta ccgaaaagat 1740

tctgaagatg aaatgtattc agaattgata aaaattaatt cttcaaattt aaaacaatat 1800

gtagacaaaa aggatcttga atatggaaaa acatattatt ataagattca ggcattagat 1860

gaacacgatg ttattattga tgagcttgag tcaaatgaaa tcaagttctc aagtaaatgg 1920

attgatttga aaggaaaatt ggttaatgca cttgctggtg agaaaattac aataaatctt 1980

tataaatgcg aaaaaatacc ttacttcatt tttaatacca ttaaaggaaa ggatattgaa 2040

tttttgatca agacagatag tgagattgca ggagctggtg tttcatgggt tataaatggc 2100

acttcaatag aaaaatctat tacagcagac atactttttg atgtaaccaa taagttttct 2160

cttgttccta atgaaaacat gacaaagctc ccaaaaggtg caaaaacata tatgaagctt 2220

ggtagagttc atacttcacc attcggtttt caagcgaaac tccatgtaaa tgttggtgcg 2280

aaatatgcga atgatgtggc taaattatat gcttttggag cccagggagt agttgaagtg 2340

cattctggtg tcgagattag ccaagatggc agcgtcgtat ttgataatat aagtacacca 2400

gattatgtta ttgcaattta tggtgcggat actaccgcgc cggttacgac ggataatgta 2460

ccagcgggct ggtctaacac tgatgtgacg gtaaagctga tcgcaacaga tgaggagacc 2520

ggtattgcaa caacgtatta ttctattaat ggaagcgaac cgtcaacagg ctcgacgata 2580

tcatttgaaa gcgaaggagt tcatatcttg caatattgga gcgtcgatca cgcaggtaat 2640

caggaagatg tgaaaactac gcttattcga atcgataaaa cagccccgac gttagagatt 2700

gttttatcca aaaaggtgct gtggccgccg aaccatcgta tgcttccagt aaaagctacc 2760

attagtgcac aggactcgct ttcagacgtg aacgtcgtcc tccaatccat taccagtaat 2820

gagccagacg atggtttggg cgacggggat aggcagaacg atattcaaga agcagaatgg 2880

aatacgtatg atcttgagtt catgctccgt gcggaacggt cgggcacagg aacaggcaga 2940

acctacacgg ttacttatct tgccaccgat gaggctggta accaagccac tgcttcggta 3000

gaggtgagag ttcctcattc ggtatctatt gagaagaaat aa 3042

Claims

1.一种褐藻胶裂解酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.编码权利要求1所述褐藻胶裂解酶的基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种褐藻胶裂解酶，其特征在于，其氨基酸序列在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸。

4.编码权利要求3所述褐藻胶裂解酶的基因。

5.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为插入权利要求2或4所述基因的质粒载体。

6.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述质粒载体为pET-28a质粒载体。

7.一种工程菌株，其特征在于，所述工程菌株为转入权利要求5或6所述重组质粒的大肠杆菌。

8.一种生产权利要求1或3所述褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，将权利要求7所述工程菌株接种于LB培养基中进行培养，诱导表达后离心，得到上清液I和菌体；

将菌体裂解后离心，得到上清液II；

粗蛋白液经过透析、PEG包埋浓缩，获得褐藻胶裂解酶。

9.权利要求1或3所述褐藻胶裂解酶在降解褐藻胶或褐藻中的应用。

10.权利要求1或3所述褐藻胶裂解酶在降解病原微生物胞外多糖、提高抗生素对病原微生物杀灭效果中的应用。