CN102864136A - 一种高密度培养基因工程菌制备褐藻胶裂解酶的方法 - Google Patents

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Abstract

一种高密度培养基因工程菌生产褐藻胶裂解酶的方法：将褐藻胶裂解酶基因工程菌从保藏的甘油管接种于LB液体培养基中，35-37℃,150rpm，培养10-12h，得到活化液菌种；将活化液菌种转接至LB种子培养基中，在35-37℃,150rpm，摇瓶培养10-12h，得到种子液；将2%种子液转接至含有3L发酵培养基的5L发酵罐中，进行高密度发酵培养，待发酵到第4h时开始流加补充培养基；并在发酵到第4.5h后进行IPTG诱导；发酵过程中罐内参数设定为：温度35-37℃，转速280rpm，溶氧40%-50%，发酵24h得到发酵液；将发酵液在4℃下、经12000rpm/min离心10min去除上清液后收集菌体，将收集的菌体在冰浴下进行超声波破碎处理；随后将超声波破碎液在4℃下、12000rpm/min离心10min去除细胞碎片沉淀，收集上清液得到粗酶液。

Description

一种高密度培养基因工程菌制备褐藻胶裂解酶的方法
技术领域
本发明涉及一种裂解酶的制备方法，尤其是一种高密度培养基因工程菌制备褐藻胶裂解酶的方法。
背景技术
褐藻胶又称海藻酸钠，它是从海带、马尾藻、巨藻等褐藻植物中提取的天然高分子多糖聚合物，是褐藻细胞壁的主要组成物质之一；由α-L-1,4-古罗糖醛酸(G)及其差向异构体β-D-1,4-甘露糖醛酸(M)组合而成。褐藻胶分子中包含三种结构区域：多聚古罗糖醛酸(poly(G))、多聚古罗糖醛酸(poly(M))和杂聚的随机序列(poly(MG))。
近年来，随着海洋生物制药业的蓬勃发展，海藻多糖的研究日益受到重视，并且随着海藻寡糖具有促生长、增强免疫力、抗肿瘤、抑菌、抗氧化、整肠、解毒、降血糖血脂、免疫调节等多种生理活性的发现，海藻寡糖在生物医药领域巨大的应用潜力也越来越受到关注。
褐藻胶裂解酶能通过β-消除反应裂解褐藻胶的糖苷键，产生在非还原末端有C4,5不饱和双键且在230~240nm有强吸收功能的不饱和糖类醛酸、以及饱和单糖醛酸。根据降解褐藻胶部位与片段的不同可以分为三大类：专一性水解聚古罗糖醛酸的1,4-α-古罗糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.11)；专一性水解聚甘露糖醛酸的1,4-β-甘露糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.3)；第三类是既可降解聚古罗糖醛酸，也可降解聚甘露糖醛酸褐藻胶裂解酶。褐藻胶裂解酶越来越多地被应用于分子生物学、海洋生物学、医药、化工、农业等领域，褐藻胶裂解酶日益成为海洋生物资源研究开发的竞争热点。
已有研究表明：褐藻胶裂解酶是研究褐藻胶的化学结构以及细菌的褐藻胶代谢等方面的必备工具酶；褐藻胶裂解酶还用作海藻解壁酶，以获得DNA、单细胞和原生质体。此外，褐藻胶裂解酶本身具有一定药用价值，能降解绿脓杆菌的生物膜，恢复病原菌对抗生素的敏感性，可用于辅助治疗绿脓杆菌引起的慢性感染，治疗肺部囊性纤维化(Cystic Fibrosis,CF)。因此褐藻胶裂解酶的研究生产有着深远的理论意义和应用价值，已成为目前的热点。
同时，随着近年来褐藻胶裂解酶越来越多的应用于医药、食品、化工、农业、分子生物学、海洋生物学等领域，褐藻胶裂解酶日益成为海洋生物资源研究开发竞争的热点。
目前，国内外对于褐藻胶及其裂解酶的研究主要集中在一下几个方面：
1、褐藻胶降解工艺的研究；
2、褐藻寡糖的功能性研究；
3、褐藻胶裂解酶的分子生物学研究等几个方面。
到现在为止，国内外市场均未见有褐藻胶裂解酶制剂的产品，并且对于褐藻胶裂解酶的制备、生产方面的研究报道也较少，即使进行了相关的研究，得到的褐藻胶裂解酶的活性较低，不能满足深入研究及工业生产使用的要求。
发明内容
本发明的目的在于：针对现在已经报道的褐藻胶裂解酶基因工程菌摇瓶发酵制备的酶活性较低的问题，提供一种利用基因工程菌制备褐藻胶裂解酶，并提高其活性的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
这种利用褐藻胶裂解酶基因工程菌的高密度培养生产褐藻胶裂解酶的方法步骤如下：
1)将褐藻胶裂解酶基因工程菌从保藏的甘油管取出接种于LB液体培养基中，35-37℃,转速为150r/min，培养10-12h，得到活化液菌种；
2)将上述活化液菌种转接至LB种子培养基中，在35-37℃,转速为150r/min，摇瓶培养10-12h，得到种子液；
3）将上述2%种子液转接至含有3L发酵培养基的5L发酵罐中，进行高密度发酵培养，待发酵到第4h时开始流加补充培养基；并在发酵到第4.5h后进行IPTG诱导；发酵过程中发酵罐的参数设定为：温度35-37℃，转速280rpm/min，溶氧40%-50%，发酵24h，得到发酵液；
4）将上述发酵液在4℃下、经12000rpm/min离心10min去除上清液，收集菌体，将菌体在冰浴下进行超声波破碎，超声波破碎液在4℃下、12000rpm/min离心10min去除细胞碎片沉淀，收集上清液得到粗酶液。
所述的发酵培养基的组成物包括：葡萄糖10g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO4 5g/L，K2HPO4 3.5g/L，（NH4）2HPO4 4.0 K2HPO4，MgSO4·7H2O1.2g/L，柠檬酸1.7g/L；以及微量元素液1ml/L，卡那霉素10mg/ml600μl。
其中所述的微量元素液的组成物包括：FeSO4·7H2O 1.0g/L，ZnSO4·7H2O0.225g/L，(NH4)6MO·4H2O 0.15g/L，CuSO4·H2O 0.15g/L，CaCl2·H2O 0.2g/L，MnSO4·H2O 0.05g/L，Na2B4O4·H2O 0.002g/L组成。
所述的补充培养基的组成物包括：葡萄糖150g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L配制，并将补充培养基的pH控制在7.0～7.2。
所述的超声波破碎的条件为：菌液体积50ml,NaCl浓度为0.15mol/l,破碎强度50%，总工作时间5min,工作/间歇时间为4s/8s。
本发明的优点是：菌种易培养、发酵时间短，褐藻胶裂解酶重组蛋白的表达率高，含杂蛋白少，经过超声破碎并离心后得到褐藻胶裂解酶粗酶液。产品的活性高，稳定性好，能够实现工业化生产。
利用基因工程菌发酵生产的褐藻胶裂解酶的工作温度范围为30-37°C，最佳反应温度为35°C，反应pH 6.0~7.5，最佳pH6.6，Ca2+、Mg2+是重组褐藻胶裂解酶激活剂，而Ba2+、Zn2+起到抑制作用，螯合剂EDTA较强地抑制重组褐藻胶裂解酶活性，该褐藻胶裂解酶属于金属酶。经过高密度发酵后制取粗酶液，酶活力达26.37U/ml。
附图说明
图1为重组大肠杆菌的分批发酵示意图；
图2为重组大肠杆菌的分批补料发酵示意图。
具体实施方式
以下结合附图进一步阐述本发明，并给出本发明的实施例。
这种利用褐藻胶裂解酶基因工程菌的高密度培养生产褐藻胶裂解酶的方法步骤如下：
1)将褐藻胶裂解酶基因工程菌从保藏的甘油管接种于LB液体培养基中，35-37℃,转速为150r/min，培养10-12h，得到活化液菌种；
2)将上述活化液菌种转接至LB种子培养基中，在35-37℃,转速为150r/min，摇瓶培养10-12h，得到种子液；
3）将上述2%种子液转接至含有3L发酵培养基的5L发酵罐中，进行高密度发酵培养，待发酵到第4h时开始流加补充培养基；并在发酵到第4.5h后进行IPTG诱导；发酵过程中发酵罐的参数设定为：温度35-37℃，转速280rpm，溶氧40%-50%，发酵24h，得到发酵液；
4）将上述发酵液在4℃下、12000rpm/min离心10min去除上清液，收集菌体，将菌体在冰浴下进行超声波破碎，超声波破碎液在4℃下、12000rpm/min离心10min去除细胞碎片沉淀，收集上清液得到粗酶液。
所述的发酵培养基的组成以g/L为单位计：葡萄糖10g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO4 5g/L，K2HPO4 3.5g/L，（NH4）2HPO4 4.0 K2HPO4，MgSO4·7H2O 1.2g/L，柠檬酸1.7g/L；微量元素液（1ml/L），卡那霉素（10mg/ml）600μl。
其中所述的微量元素液由FeSO4·7H2O 1.0g/L，ZnSO4·7H2O 0.225g/L，(NH4)6MO·4H2O 0.15g/L，CuSO4·H2O 0.15g/L，CaCl2·H2O 0.2g/L，MnSO4·H2O0.05g/L，Na2B4O4·H2O 0.002g/L。
所述的补充培养基的组成以g/L为单位计，并按葡萄糖150g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L配制，并将补充培养基的pH7.0~7.2。
所述的超声波破碎的条件为：菌液体积50ml,NaCl浓度为0.15mol/l,破碎强度50%，总工作时间5min,工作/间歇时间为4s/8s。
实施例1 褐藻胶裂解酶基因工程菌的分批发酵
1 生物反应器
以下实施例使用的发酵罐为上海国强生化工程装备有限公司生产的FMG-5L发酵罐。
2 发酵培养基
按以下配料：葡萄糖10g/l，酵母提取物510g/l，蛋白胨2010g/l，K2HPO4510g/l，KH2PO4 3.510g/l，（NH4）2HPO4 4.010g/l，MgSO4·7H2O 1.210g/l，柠檬酸1.710g/l，微量元素液（1ml/L），卡那霉素（10mg/ml）600μl。其中微量元素液（g/L）：FeSO4·7H2O 1.0，ZnSO4·7H2O 0.225，(NH4)6MO·4H2O0.15，CuSO4·H2O 0.15，CaCl2·H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.05，Na2B4O4·H2O 0.002，H2O 1000ml；组成发酵培养基。
3 发酵培养
将含表达褐藻胶裂解酶重组质粒的工程菌E.coli BL21在LB培养基中进行活化，按2%接种量接种于LB培养基中，150r/mim，35-37℃，培养10h，OD600约0.7-0.8。摇瓶培养后的种子液按5%的接种量接种于5L发酵罐中，培养基体积为3L。控制的几个关键参数为：溶氧量控制在30%-40%，转速280rpm；在第5h加入1mmol/L的IPTG诱导表达，诱导前发酵温度自动控制在35-37℃，诱导后发酵温度设定为30℃；发酵进行24h。重组大肠杆菌的菌体密度在12h达到最大，OD600为10.83，细胞干重（DCW）5.95g/L。
4 酶液制备
将上述发酵液在4℃下、经12000rpm离心10min去除上清液，收集菌体，将菌体在冰浴下进行超声波破碎，超声波破碎液在4℃下、12000rpm离心10min去除细胞碎片沉淀，收集上清液得到粗酶液。
利用紫外吸收法测定粗酶液的酶活，达4.81U/ml，发酵过程曲线见图1。
实施例2 褐藻胶裂解酶基因工程菌的分批补料发酵
1 生物反应器
同实施例1中“1”。
2 发酵培养基
按以下配料：葡萄糖10g/l，酵母提取物510g/l，蛋白胨2010g/l，K2HPO4510g/l，KH2PO4 3.510g/l，（NH4）2HPO4 4.010g/l，MgSO4·7H2O 1.210g/l，柠檬酸1.710g/l，微量元素液（1ml/L），卡那霉素（10mg/ml）600μl。其中微量元素液（g/L）：FeSO4·7H2O 1.0，ZnSO4·7H2O 0.225，(NH4)6MO·4H2O0.15，CuSO4·H2O 0.15，CaCl2·H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.05，Na2B4O4·H2O 0.002，H2O 1000ml；组成发酵培养基。
3 补充培养基
按葡萄糖150g，蛋白胨20g，酵母提取物10g，MgSO4·7H2O 1.2g，H2O1000ml，pH7.0-7.2组成补充培养基。
4 发酵培养
将含表达褐藻胶裂解酶重组质粒的工程菌E.coli BL21在LB培养基中进行活化，按2%接种量接种于LB培养基中，150r/mim，37℃，培养10h，OD600约0.7-0.8。摇瓶培养后的种子液按5%的接种量接种于5L发酵罐中，培养基体积为3L。控制的几个关键参数为：溶氧量控制在30%-40%，转速280rpm；在第5h加入1mmol/L的IPTG诱导表达，诱导前发酵温度自动控制在35-37℃，诱导后发酵温度设定为30℃；发酵进行24h。重组大肠杆菌的菌体密度在12h达到最大，OD600为10.83，细胞干重（DCW）5.95g/L。
从第4h开始流加补料培养基，4-10h的流加速率为100ml/h，10-16h加速率设定为200ml/h。补料期间仍然流加30%（v/v）的氨水保持pH稳定；使pH保持在7.0-7.2,溶氧量控制在30%-40%，转速400rpm；温度设定为37℃。在第24h获得细胞密度OD600值为99.24。
5 酶液制备
将上述发酵液在4℃下、经12000rpm离心10min去除上清液，收集菌体，将菌体在冰浴下进行超声波破碎，超声波破碎液在4℃下、12000rpm离心10min去除细胞碎片沉淀，收集上清液得到粗酶液。
利用紫外吸收法测定粗酶液的酶活，达14.81U/ml，发酵过程曲线见图2。
实施例3 褐藻胶裂解酶基因工程菌的分批补料发酵过程中IPTG诱导条件的优化
1 生物反应器
同实施例1中“1”。
2 发酵培养基
按以下配料：葡萄糖10g/l，酵母提取物510g/l，蛋白胨2010g/l，K2HPO4510g/l，KH2PO4 3.510g/l，（NH4）2HPO4 4.010g/l，MgSO4·7H2O 1.210g/l，柠檬酸1.710g/l，微量元素液（1ml/L），卡那霉素（10mg/ml）600μl。其中微量元素液（g/L）：FeSO4·7H2O 1.0，ZnSO4·7H2O 0.225，(NH4)6MO·4H2O0.15，CuSO4·H2O 0.15，CaCl2·H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.05，Na2B4O4·H2O 0.002，H2O 1000ml；组成发酵培养基。
3 补充培养基
按葡萄糖150g，蛋白胨20g，酵母提取物10g，MgSO4·7H2O 1.2g，H2O1000ml，pH7.0-7.2组成补充培养基。
4 发酵培养
将含表达褐藻胶裂解酶重组质粒的工程菌E.coli BL21在LB培养基中进行活化，按2%接种量接种于LB培养基中，150r/mim，37℃，培养10h，OD600约0.7-0.8。摇瓶培养后的种子液按5%的接种量接种于5L发酵罐中，培养基体积为3L。控制的几个关键参数为：溶氧量控制在30%-40%，转速280rpm；在第5h加入1mmol/L的IPTG诱导表达，诱导前发酵温度自动控制在35-37℃，诱导后发酵温度设定为30℃；发酵进行24h。重组大肠杆菌的菌体密度在12h达到最大，OD600为10.83，细胞干重（DCW）5.95g/L。
从第4h开始流加补料培养基，4-10h的流加速率为100ml/h，10-16h加速率设定为200ml/h。补料期间仍然流加30%（v/v）的氨水保持pH稳定；使pH保持在7.0-7.2,溶氧量控制在30%-40%，转速400rpm；温度设定为37℃。在第24h获得细胞密度OD600值为99.24。
5 IPTG诱导条件的优化
（1）单因素试验——诱导时间
在重组大肠杆菌的分批补料发酵过程，在诱导温度为30°C，IPTG浓度为1mmol/L的情况下，分别在第2、4、8、12、16h进行诱导后，分批发酵30h，考察诱导时间对褐藻胶裂解酶高效表达的影响。
（2）单因素试验——IPTG浓度
在重组大肠杆菌的分批补料发酵过程，在诱导温度为30°C，诱导时间为4h的情况下，分别以IPTG终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L对重组菌进行诱导表达，分批发酵30h，考察诱导时间对褐藻胶裂解酶高效表达的影响。
（3）单纯形优化法
根据单因素试验结果进行单纯形优化试验，利用均匀设计表构造初始单纯形，分别进行重组大肠杆菌分批补料发酵试验。
6 酶液制备
同实施例1中“4”进行。
最终，测得发酵过程中最高酶活为26.37U/ml。

Claims (5)

1.一种利用褐藻胶裂解酶基因工程菌的高密度培养生产褐藻胶裂解酶的方法步骤如下：
1)将褐藻胶裂解酶基因工程菌从保藏的甘油管接种于LB液体培养基中，35-37℃,转速为150r/min，培养10-12h，得到活化液菌种；
2)将上述活化液菌种转接至LB种子培养基中，在35-37℃,转速为150r/min，摇瓶培养10-12h，得到种子液；
3）将上述2%种子液转接至含有3L发酵培养基的5L发酵罐中，进行高密度发酵培养，待发酵到第4h时开始流加补充培养基；并在发酵到第4.5h后进行IPTG诱导；发酵过程中发酵罐的参数控制为：温度35-37℃，转速280r/min，溶氧40%-50%，发酵24h，得到发酵液；
4）将上述发酵液在4℃下、经12000rpm/min离心10min去除上清液后收集菌体，将收集的菌体在冰浴下进行超声波破碎处理；随后将超声波破碎液在4℃下、12000rpm/min离心10min去除细胞碎片沉淀，收集上清液得到粗酶液。
2.如权利要求1所述的一种利用褐藻胶裂解酶基因工程菌的高密度培养生产褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于：所述的发酵培养基的组成以g/L为单位计：其中葡萄糖10g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO4 5g/L，KH2PO4 3.5g/L，（NH4）2HPO4 4.0g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，柠檬酸1.7g/L；微量元素液1ml/L，卡那霉素（10mg/ml）600μ/l。
3.如权利要求1所述的一种利用褐藻胶裂解酶基因工程菌的高密度培养 生产褐藻胶裂解酶的方法，其中微量元素液g/L：FeSO4·7H2O 1.0g/L，ZnSO4·7H2O 0.225g/L，(NH4)6MO·4H2O 0.15g/L，CuSO4·H2O 0.15g/L，CaCl2·H2O0.2g/L，MnSO4·H2O 0.05g/L，Na2B4O4·H2O 0.002g/L。
4.如权利要求1所述的一种利用褐藻胶裂解酶基因工程菌的高密度培养生产褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于：所述的补充培养基的组成以g/L为单位计，葡萄糖150，蛋白胨20，酵母提取物10，MgSO4·7H2O 1.2，pH7.0~7.2。
5.如权利要求1所述的一种利用褐藻胶裂解酶基因工程菌的高密度培养生产褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于：所述的超声波破碎的条件为：菌液体积50ml,NaCl浓度为0.15mol/l,破碎强度50%，总工作时间5min,工作/间歇时间为4s/8s。 
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