CN111518795A

CN111518795A - 褐藻胶裂解酶alb02668及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用

Info

Publication number: CN111518795A
Application number: CN202010372198.1A
Authority: CN
Inventors: 鲍时翔; 黄惠琴; 郑志国; 朱军; 邹潇潇; 孟天; 胡永华
Original assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2020-05-06
Filing date: 2020-05-06
Publication date: 2020-08-11

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及褐藻胶裂解酶ALB02668及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用。该褐藻胶裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明公开了一种新型褐藻胶裂解酶ALB02668及编码该酶的基因序列和氨基酸序列，不但为市场提供了新的褐藻胶裂解酶资源，而且通过公开的基因序列和氨基酸序列，可实现褐藻胶裂解酶的异源表达应用和异源表达生产。本发明开发了利用大肠杆菌重组表达生产褐藻胶裂解酶ALB02668的方法与工艺，利用本方法，不但实现褐藻胶裂解酶ALB02668的重组生产，而且利用Ni‑NTA柱特异性吸附表达的蛋白，纯化效率大大提高。

Description

褐藻胶裂解酶ALB02668及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及褐藻胶裂解酶ALB02668及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用。

背景技术

褐藻胶是褐藻中含量最丰富的线性多糖，由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸两种糖醛酸单体通过α/β-1,4糖苷键以不同的组合模式共同构成多聚古罗糖醛酸(poly-G)、多聚甘露糖醛酸(poly-M)和古罗糖醛酸与甘露糖醛酸随机聚合的杂合片段(poly-GM)。褐藻寡糖是褐藻胶的寡聚物，相对分子质量低、水溶性好、稳定性高及安全无毒，可以用作植物生长促进剂、抗氧化剂和肿瘤抑制剂等，在农业、食品和制药工业中有很好的应用前景。目前，褐藻寡糖主要通过酸法、氧化降解法、酶法等方法制备，酶法制备具有条件温和、容易控制、产物专一等优点，成为当前国内外研究热点之一。

褐藻胶裂解酶是一类多糖裂解酶，能够通过β消除反应生成寡糖产物。褐藻胶裂解酶可以基于底物特异性分为三种，一是聚古罗糖醛酸裂解酶，二是聚甘露糖醛酸裂解酶，三是对聚古罗糖醛酸和聚甘露糖醛酸同时具有活性。就作用方式而言，褐藻胶裂解酶可分为内切酶和外切酶，内切酶切割褐藻胶内糖苷键并释放不饱和低聚糖(二糖、三糖和四糖)，而外切酶可以进一步将寡糖降解为单体。褐藻胶裂解酶分布于7个多糖裂解酶家族中，分别是PL-5、 PL-6、PL-7、PL-14、PL-15、PL-17和PL-18家族。褐藻胶裂解酶来源广泛，海洋藻类、海洋软体动物和微生物(包括细菌、真菌和一些病毒)等都有产生褐藻胶裂解酶的报道，其中关于微生物来源的报道最多。细菌主要包括假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)、弧菌(Vibrio)、黄杆菌(Flavobacterium)、芽孢杆菌(Bacillus)、链霉菌(Streptomyces)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、固氮菌(Azotobacter)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、棒杆菌(Corynebacterium)、类单胞菌(Alteromonas)、肠杆菌(Enterobacter)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)等。真菌报道较少，在国外报道有Asteromyces cruciatus、Corouospora intermedia、Dendryphiella arenaria、Dendryphiella salina 等。2018年高杨报道从南大洋沉积物中分离出红酵母属(Rhodotorula)、青霉菌属(Penicillium)和曲霉属(Aspergillus)共10株产褐藻胶裂解酶真菌。 1999年Suda首次在小球藻病毒基因中发现了有关褐藻胶裂解酶的基因片段，并对该基因表达的蛋白进行了表征。

褐藻胶裂解酶不仅在褐藻寡糖制备领域具有广泛应用，在医药领域同样备受人们关注。自1928年发现青霉素至今，以青霉素为代表的抗生素从病魔手中挽救了无数的生命，给感染性疾病的治疗带来了巨大的变化。抗生素是通过抑制细胞壁、细胞膜、核酸或蛋白质等生命物质的合成，对细菌产生毒性的。然而，抗生素的长期使用，导致抗生素耐药菌株的出现，如对β-内酰胺类、氨基糖苷类、氯霉素和四环素等抗生素耐药并呈上升趋势。近年来，由金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌等引起的细菌感染导致的死亡率和治疗费用也在持续增加。英国政府2016年抗生素耐药性评估报告显示，全球每年约有70万人死于耐药菌感染，到2050年死亡人数可能达到1000万。世界卫生组织等监管机构宣布，抗生素的耐药性正在对全球健康构成威胁，发现新的治疗细菌感染的方法已迫在眉睫。国内外研究发现，细菌合成并附着在其表面的生物膜是细菌在生长过程中为适应生存环境而形成的一种天然屏障，起到保护功能。病原细菌生物膜一方面使细菌逃避机体免疫系统的作用，阻碍细胞吞噬作用，另外，可以阻止抗生素的渗透，降低了病原细菌对抗生素的敏感性。多糖是细菌生物膜的重要组分，降解细菌生物膜多糖，是提高抗生素疗效的新途径。

本发明的褐藻胶裂解酶来源于申请人分离获得的类芽胞杆菌HB172198(Paenibacillus sp.)，该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为：CGMCC No.15412，保藏日期为：2018年03 月05日。申请人已就该菌株及其应用申请了专利(一种类芽胞杆菌菌株 HB172198及其应用，申请号201810891281.2)。在该专利中，申请人就菌株 HB172198、菌株HB172198发酵产酶工艺、菌株HB172198产生的酶在降解褐藻上的应用申请保护。虽然通过类芽胞杆菌HB172198发酵方法可以获得褐藻胶裂解酶，但发酵产物组成复杂，褐藻胶裂解酶氨基酸序列与空间结构无从知晓，获得的发酵产物中褐藻胶裂解酶纯度较低，分离纯化成本高。因此，如何在降低分离纯化成本的情况下获得高纯度褐藻胶裂解酶，成为了研究人员需要攻克的技术难题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了褐藻胶裂解酶ALB02668及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用。本发明通过基因组测序与生物信息学技术，获得了编码褐藻胶裂解酶ALB02668的基因及酶的氨基酸序列，并开发了利用大肠杆菌重组表达的方法生产该酶及其应用方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种褐藻胶裂解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了编码上述褐藻胶裂解酶的基因，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了一种褐藻胶裂解酶，其氨基酸序列在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸。

本发明还提供了编码褐藻胶裂解酶的基因；该褐藻胶裂解酶的氨基酸序列在SEQID NO:1所示氨基酸序列基础上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸。

本发明还提供了一种重组质粒，重组质粒为插入上述基因的质粒载体。

作为优选，质粒载体为pET-28a质粒载体。

本发明还提供了一种工程菌株，工程菌株为转入所得重组质粒的大肠杆菌。

作为优选，大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还提供了一种生产上述褐藻胶裂解酶的方法，将所得工程菌株接种于LB培养基中进行培养，诱导表达后离心，得到上清液I和菌体；

将菌体裂解后离心，得到上清液II；

将上清液I和上清液II合并，采用Ni-NTA柱纯化表达的蛋白，经过淋洗、洗脱，获得粗蛋白液；

粗蛋白液经过透析、PEG包埋浓缩，获得褐藻胶裂解酶。

本发明还提供了上述褐藻胶裂解酶在降解褐藻胶或褐藻中的应用。

本发明还提供了上述褐藻胶裂解酶在降解病原微生物胞外多糖、提高抗生素对病原微生物杀灭效果中的应用。

本发明提供了褐藻胶裂解酶ALB02668及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用。该褐藻胶裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1 所示。本发明具有的有益效果为：

1.本发明公开了一种新型褐藻胶裂解酶ALB02668及编码该酶的基因序列和氨基酸序列，不但为市场提供了新的褐藻胶裂解酶资源，而且通过公开的基因序列和氨基酸序列，可实现褐藻胶裂解酶的异源表达应用和异源表达生产。

2.开发了利用大肠杆菌重组表达生产褐藻胶裂解酶ALB02668的方法与工艺，利用本方法，不但实现褐藻胶裂解酶ALB02668的重组生产，而且利用Ni-NTA柱特异性吸附表达的蛋白，纯化效率大大提高。

3.利用褐藻胶裂解酶ALB02668生产褐藻寡糖

4.将褐藻胶裂解酶ALB02668与抗生素配合使用，提高对病原微生物的杀灭效果，为杀灭病原微生物提供了新技术。

附图说明

图1褐藻胶裂解酶ALB02668的三维结构；

图2褐藻胶裂解酶ALB02668的诱导表达电泳检测；图注：左边为蛋白marker(14-120kD)；中间为未诱导组全蛋白；右边为诱导组全蛋白；

图3褐藻寡糖的TLC检测；注：1：五糖；2：三糖；3：单糖；4：酶解产物。

具体实施方式

本发明公开了褐藻胶裂解酶ALB02668及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明申请人通过基因组测序与生物信息学技术，获得了编码褐藻胶裂解酶ALB02668的基因及酶的氨基酸序列，并开发了利用大肠杆菌重组表达的方法生产该酶及其应用方法，具体如下：

1.通过基因组测序与生物信息学技术，获得褐藻胶裂解酶氨基酸序列；

2.利用大肠杆菌重组表达的方法生产褐藻胶裂解酶ALB02668；

3.利用褐藻胶裂解酶ALB02668降解褐藻胶和褐藻，制备褐藻寡糖；

4.利用褐藻胶裂解酶降解病原微生物胞外多糖，提高抗生素对病原微生物的杀灭效果。

本发明提供的褐藻胶裂解酶ALB02668及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1新型褐藻胶裂解酶的来源及序列分析

对菌株HB172198采用PacBio RSII和IlluminaX10测序平台测序，获得长度为4,475,055bp、GC含量51.2％的基因组完成图。通过褐藻胶裂解酶 CAZyme家族分类预测与分析，发现共有41个蛋白与CAZy数据库有匹配，包括30个糖苷水解酶(GlycosideHydrolases，GHs)、7个糖基转移酶(Glycosyl Transferases，GTs)、3个糖类酯酶(Carbohydrate Esterases，CEs)、以及1 个辅助酶(AuxiliaryActivities，AAs)。基于CAZy数据库菌株HB172198全基因组多糖裂解酶家族(Polysaccharide Lyases，PLs)的氨基酸序列进行预测，发现3个褐藻胶裂解酶基因alb02660、alb00773和alb02668，分别对应3个褐藻胶裂解酶ALB02660、ALB00773和ALB02668，经检索，褐藻胶裂解酶 ALB00773属于多糖裂解酶PL7家族，其编码氨基酸序列最高相似度仅为 75％，该褐藻胶裂解酶ALB02668氨基酸序列序列、编码褐藻胶裂解酶 ALB02668对应的基因alb02668序列序列如下序列所示，褐藻胶裂解酶 ALB02668的三维结构图见图1。

褐藻胶裂解酶ALB02668氨基酸序列序列(SEQ ID NO:1)：

MMNYRIARKTGIAVLGSALLLGSAGLSTGALAAEGEIPSAQAAPSSHSMNALSPSQ PPSQNFNLTKWKLTLPDASEITNLSNYSNAKWFYTDSATGGMVFVAPNLGSTTTNSSYT RSELREmLNASAGTTSYGNNWVTSTSSSSIKAQAGGVDGTMKATLRVDRVSTSGDTSK LGRVVVGQIHGPDTEPIRLYFHKRPSDSKGAIYFGTDDLNNNNTWVNVLGGPSSLNPSN GIALGQKWSYEIKVVGLKMTVKVTPEGGSTTTVNYNLPSGYNNKYLYYKAGVYNQNNTDTTSDKSDHVKATFFSLTHVHP

褐藻胶裂解酶ALB02668对应的基因alb02668序列(SEQ ID NO:2)：

ATGATGAACTACCGTATCGCTCGGAAGACAGGAATCGCTGTATTGGGATCGGC CTTGCTGCTCGGCTCCGCCGGCTTAAGCACTGGAGCTTTAGCTGCCGAAGGAGAAAT CCCATCTGCCCAGGCTGCTCCATCATCTCATTCTATGAATGCGCTTTCTCCAAGCCAG CCGCCTTCTCAGAATTTTAATCTTACGAAATGGAAGCTTACGCTGCCTGACGCTTCG GAGATTACTAACCTCAGTAATTACAGCAACGCCAAATGGTTCTATACCGATTCCGCG ACAGGCGGTATGGTATTTGTGGCTCCGAACCTGGGCAGTACGACGACCAACAGCAG CTACACCCGTTCCGAGCTTCGGGAAATGCTGAACGCTTCGGCGGGCACCACCTCGTA TGGTAACAACTGGGTGACCTCTACCTCCTCTTCTTCAATTAAGGCTCAGGCCGGCGG AGTAGACGGCACCATGAAAGCCACGCTGCGAGTAGACCGCGTCTCAACCAGTGGAG ATACCTCCAAGCTCGGCCGTGTCGTTGTAGGCCAGATTCATGGACCGGATACAGAGC CGATTCGCTTGTATTTCCACAAGCGTCCCAGCGACAGCAAGGGTGCCATTTACTTTG GCACGGACGATCTGAACAATAACAACACATGGGTCAATGTTCTCGGAGGACCATCC AGCCTCAATCCTTCCAATGGCATTGCACTGGGCCAGAAATGGAGCTATGAAATCAA GGTTGTCGGCTTGAAAATGACGGTCAAGGTAACTCCGGAGGGTGGATCAACAACAA CCGTCAACTATAATCTGCCGTCAGGCTATAACAACAAATATTTGTATTACAAGGCTG GCGTCTATAACCAAAACAATACGGATACTACAAGCGACAAGTCCGACCATGTAAAG GCCACCTTCTTCTCGCTCACACATGTTCATCCGTAA

实施例2利用大肠杆菌重组表达的方法生产褐藻胶裂解酶ALB02668

按照基因工程标准操作方法，将褐藻胶裂解酶基因与pET-28a质粒载体进行重组，将重组质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，获得可以产生褐藻胶裂解酶的工程菌株。将工程菌株接种于100mL含卡纳抗生素的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600的生物量为0.4。在菌液中加入终浓度为0.1mM 的IPTG，20℃诱导20小时，4℃、13000rpm下离心15min，获得上清液Ⅰ。对于离心获得的菌体，向离心管中加入10mL裂解液，将菌体吹打混匀。液氮速冻3min，放在4℃冰箱自然化开后，用超声仪破碎30min，4℃、13000 rpm下离心15min，获得上清液Ⅱ。合并上清液Ⅰ和上清液Ⅱ。采用Ni-NTA 柱纯化表达的蛋白，经过淋洗、洗脱，获得粗蛋白液。然后经过透析、PEG 包埋浓缩，获得表达产物。经电泳和活性检测，表达产物为褐藻胶裂解酶 ALB02668，图2为重组表达的褐藻胶裂解酶ALB02668的电泳检测。

实施例3褐藻胶裂解酶ALB02668降解褐藻胶制备褐藻寡糖

配制质量百分含量为2％的海藻酸钠溶液，加入表达的褐藻胶裂解酶，反应温度30℃，反应2、6、10、14、20、32、48h时分别取溶液5mL加无水乙醇至终浓度为70％，离心，取上清，冷冻干燥，加少量水溶解进行薄层层析(TLC)。展开剂为正丁醇∶甲酸∶水＝4∶5∶1，用5％的硫酸乙醇作为显色剂，110℃下保持10min显色，结果表明，获得的褐藻寡糖聚合度在2～9之间，如图3。

实施例4褐藻胶裂解酶与抗生素联合使用杀灭病原微生物

采用微生物药敏分析测试板测试褐藻胶裂解酶与抗生素联合使用杀灭病原微生物的效果，病原菌为临床分离的铜绿假单胞菌并设不添加褐藻胶裂解酶的对照试验组。将铜绿假单胞菌在Luria-Bertani固体培养基上经35℃培养 18～24小时，挑取纯培养菌落于稀释液瓶制作细菌悬液，浓度为OD600＝0.14。分装两瓶LB液体培养基，各10mL。实验组培养基中加入50μL细菌悬液和 200μL酶液，对照组培养基中加入50μL细菌悬液，分别混匀。测试板每孔液体加入量为100μL。实验结果如表1，由表可知，在头孢吡肟、哌拉西林、多粘菌素B、氧氟沙星、奈替米星、替卡西林、氯霉素、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦等抗菌药物的作用下，实验组的抑菌效果较对照组显著增强。实验结果证明，褐藻胶裂解酶在一定程度上可以有效降解铜绿假单胞菌生物膜，提高抗菌药物药效性，可辅助治疗铜绿假单胞菌感染。

表1药敏分析实验结果

注：“+”表示有抑菌效果；“++”表示有抑菌效果较强；空白表示无抑菌效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120> 褐藻胶裂解酶ALB02668及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用

<130> MP2002457

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 312

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Met Asn Tyr Arg Ile Ala Arg Lys Thr Gly Ile Ala Val Leu Gly

1 5 10 15

Ser Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Gly Leu Ser Thr Gly Ala Leu Ala

20 25 30

Ala Glu Gly Glu Ile Pro Ser Ala Gln Ala Ala Pro Ser Ser His Ser

35 40 45

Met Asn Ala Leu Ser Pro Ser Gln Pro Pro Ser Gln Asn Phe Asn Leu

50 55 60

Thr Lys Trp Lys Leu Thr Leu Pro Asp Ala Ser Glu Ile Thr Asn Leu

65 70 75 80

Ser Asn Tyr Ser Asn Ala Lys Trp Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Thr Gly

85 90 95

Gly Met Val Phe Val Ala Pro Asn Leu Gly Ser Thr Thr Thr Asn Ser

100 105 110

Ser Tyr Thr Arg Ser Glu Leu Arg Glu Met Leu Asn Ala Ser Ala Gly

115 120 125

Thr Thr Ser Tyr Gly Asn Asn Trp Val Thr Ser Thr Ser Ser Ser Ser

130 135 140

Ile Lys Ala Gln Ala Gly Gly Val Asp Gly Thr Met Lys Ala Thr Leu

145 150 155 160

Arg Val Asp Arg Val Ser Thr Ser Gly Asp Thr Ser Lys Leu Gly Arg

165 170 175

Val Val Val Gly Gln Ile His Gly Pro Asp Thr Glu Pro Ile Arg Leu

180 185 190

Tyr Phe His Lys Arg Pro Ser Asp Ser Lys Gly Ala Ile Tyr Phe Gly

195 200 205

Thr Asp Asp Leu Asn Asn Asn Asn Thr Trp Val Asn Val Leu Gly Gly

210 215 220

Pro Ser Ser Leu Asn Pro Ser Asn Gly Ile Ala Leu Gly Gln Lys Trp

225 230 235 240

Ser Tyr Glu Ile Lys Val Val Gly Leu Lys Met Thr Val Lys Val Thr

245 250 255

Pro Glu Gly Gly Ser Thr Thr Thr Val Asn Tyr Asn Leu Pro Ser Gly

260 265 270

Tyr Asn Asn Lys Tyr Leu Tyr Tyr Lys Ala Gly Val Tyr Asn Gln Asn

275 280 285

Asn Thr Asp Thr Thr Ser Asp Lys Ser Asp His Val Lys Ala Thr Phe

290 295 300

Phe Ser Leu Thr His Val His Pro

305 310

<210> 2

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgatgaact accgtatcgc tcggaagaca ggaatcgctg tattgggatc ggccttgctg 60

ctcggctccg ccggcttaag cactggagct ttagctgccg aaggagaaat cccatctgcc 120

caggctgctc catcatctca ttctatgaat gcgctttctc caagccagcc gccttctcag 180

aattttaatc ttacgaaatg gaagcttacg ctgcctgacg cttcggagat tactaacctc 240

agtaattaca gcaacgccaa atggttctat accgattccg cgacaggcgg tatggtattt 300

gtggctccga acctgggcag tacgacgacc aacagcagct acacccgttc cgagcttcgg 360

gaaatgctga acgcttcggc gggcaccacc tcgtatggta acaactgggt gacctctacc 420

tcctcttctt caattaaggc tcaggccggc ggagtagacg gcaccatgaa agccacgctg 480

cgagtagacc gcgtctcaac cagtggagat acctccaagc tcggccgtgt cgttgtaggc 540

cagattcatg gaccggatac agagccgatt cgcttgtatt tccacaagcg tcccagcgac 600

agcaagggtg ccatttactt tggcacggac gatctgaaca ataacaacac atgggtcaat 660

gttctcggag gaccatccag cctcaatcct tccaatggca ttgcactggg ccagaaatgg 720

agctatgaaa tcaaggttgt cggcttgaaa atgacggtca aggtaactcc ggagggtgga 780

tcaacaacaa ccgtcaacta taatctgccg tcaggctata acaacaaata tttgtattac 840

aaggctggcg tctataacca aaacaatacg gatactacaa gcgacaagtc cgaccatgta 900

aaggccacct tcttctcgct cacacatgtt catccgtaa 939

Claims

1.一种褐藻胶裂解酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.编码权利要求1所述褐藻胶裂解酶的基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种褐藻胶裂解酶，其特征在于，其氨基酸序列在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸。

4.编码权利要求3所述褐藻胶裂解酶的基因。

5.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为插入权利要求2或4所述基因的质粒载体。

6.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述质粒载体为pET-28a质粒载体。

7.一种工程菌株，其特征在于，所述工程菌株为转入权利要求5或6所述重组质粒的大肠杆菌。

8.一种生产权利要求1或3所述褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，将权利要求7所述工程菌株接种于LB培养基中进行培养，诱导表达后离心，得到上清液I和菌体；

将菌体裂解后离心，得到上清液II；

粗蛋白液经过透析、PEG包埋浓缩，获得褐藻胶裂解酶。

9.权利要求1或3所述褐藻胶裂解酶在降解褐藻胶或褐藻中的应用。

10.权利要求1或3所述褐藻胶裂解酶在降解病原微生物胞外多糖、提高抗生素对病原微生物杀灭效果中的应用。