CN109777817A - 一种褐藻胶裂解酶及其基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种褐藻胶裂解酶及其基因和应用，褐藻胶裂解酶基因的核酸序列如SEQ ID N0:1；所述核苷酸序列编码的褐藻胶裂解酶Alg3，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2。本发明还公开利用基因工程的技术方法，转化褐藻胶裂解酶基因的基因工程菌株为大肠杆菌，通过将所述褐藻胶裂解酶基因与载体连接，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌来制备的褐藻胶裂解酶。所述褐藻胶裂解酶能够专一性降解海藻酸钠生产褐藻寡糖，并且可以与纤维素酶共同使用水解海带，产生水溶性寡糖产物，因此可以用于褐藻寡糖的制备，且反应条件温和，能源消耗少，无污染物产生，具有重要的工业应用价。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种褐藻胶裂解酶及其基因和应用。
背景技术
褐藻寡糖是指聚合度为2-20个单糖组成的糖链，具有良好的亲水、稳定、高粘、无毒等特点，并且具有独特的生物活性，如促植物生长、提高抗逆性等，在医疗、肥料领域有广阔的应用潜力。褐藻寡糖由褐藻胶降解而来，传统的化学法使用强酸强碱或强氧化剂，产物以饱和寡糖为主。酶解法作用温和，主要断裂糖醛酸之间的化学键，得到的是不饱和寡糖，其生理活性更好；并且酶解法过程简单，副产物少，对环境友好，在未来必将替代化学方法。
褐藻胶裂解酶是指可以专一催化断裂褐藻胶分子中糖苷键的一类酶，目前已经有70多种从藻类、海洋动物及微生物种分离出来，但商品化的寥寥无几。根据褐藻胶裂解酶的性质不同具有不同的划分方式：根据褐降解底物专一性的不同褐藻胶裂解酶可分为三类：专一性酶解甘露糖醛酸片段(Poly M)的酶，专一降解古罗糖醛酸片段(Poly G)的酶以及两种片段都可裂解的双功能裂解酶。根据作用方式的不同，褐藻胶裂解酶可以分为以下两种：内切酶和外切酶。内切酶是以内切的方式将褐藻胶降解为三糖和二糖，而外切酶的降解终产物为单糖。目前，可溶性褐藻寡糖的制备仍然是一个难题，实际使用时使用褐藻(海带)直接作为底物，很难获得溶解性好、分子量小的褐藻寡糖，收率较低，且存在环境污染、过程繁琐、重复性差等弊端。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种褐藻胶裂解酶及其基因和应用，即一种能够降解海藻酸钠或降解海带生产褐藻寡糖的褐藻胶裂解酶，从而弥补现有技术不足。
本发明提供一种褐藻胶裂解酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1。
本发明提供所述核苷酸序列编码的褐藻胶裂解酶Alg3，其氨基酸序列如SEQ IDNo:2。
本发明提供一种转化有褐藻胶裂解酶基因的基因工程菌株，工程菌为大肠杆菌，通过将所述褐藻胶裂解酶基因与载体连接，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌获得。
本发明提供所述褐藻胶裂解酶及携带褐藻胶裂解酶基因的基因工程菌在催化生成褐藻寡糖上的应用。
本发明的有益效果包括：
(1)本发明的褐藻胶裂解酶能够降解海藻酸钠，还可以与纤维素酶协同作用水解海带生成水溶性寡糖，反应条件温和，无污染物产生，具有良好的应用前景；
(2)通过基因组数据库挖掘的方法分析了一些基因组序列，候选了一批在一些生物信息学上被预测为褐藻胶裂解酶或假定褐藻胶裂解酶基因序列。所述的挖掘方法具体为，以来自Flavobacterium sp.UMI-01的褐藻胶裂解酶FlAlyA的氨基酸序列为模板探针，在NCBI数据库中进行pBLAST搜索，筛选出与褐藻胶裂解酶FlAlyA同源性在30-80％的褐藻胶裂解酶或假定褐藻胶裂解酶序列。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1褐藻胶裂解酶的表达及纯化
按照常规方法，对SEQ ID NO:1.进行全基因合成，连接于原核表达载体pET-28a(+)，并在基因的上游添加BamHI酶切位点，在下游添加SacI酶切位点；
将合成的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，获得生产Alg3的基因工程菌BL21/Alg3；
将上述重组菌接种至LB培养基，于37℃培养至对数生长期后，加入IPTG至终浓度0.1mmol/L,16℃继续培养过夜诱导。离心收集菌体，并用生理盐水洗涤两次，加入一定量的缓冲液(50mM Na2HP04,0.3M NaCl,pH8.0)悬浮，配成褐藻胶裂解酶湿菌体悬浮液。然后在冰水浴中进行超声破菌(功率200-400W，工作3s，间隙5s，超声15min)，离心收集上清，此即为褐藻胶裂解酶的粗酶液。粗酶液中含有重组蛋白Alg3。
实施例2所述褐藻胶裂解酶的酶活检测
取酶液1ml，加入0.5％海藻酸钠溶液1ml及pH7.2的磷酸缓冲液5ml，40℃恒温水浴30min。还原糖采用DNS法，吸收波长540nm，灭活酶作为对照，计算相对酶活；
海藻酸钠经过褐藻胶裂解酶降解后产生的褐藻寡糖为还原糖。酶活力定义为：每分钟每克固定化酶催化底物，释放出1μg还原糖为一个酶活力单位(U)；
其中，X为样品的酶活力(U/g)，A为在波长540nm的吸光值，反应时间为30min，M为加入酶的质量(g)，D为稀释倍数；m、n分别为还原糖标曲参数。
实施例3所述褐藻胶裂解酶在海带降解中的应用
海带用清水冲洗干净，用粉碎机粉碎，过60目筛得到干粉；将海带粉投入到酶解罐中，加入海带粉重量12倍的水，搅拌至充分悬浮，加入海带粉重量2％的纤维素酶和10％的褐藻胶酶粗酶液，两种酶的比例为1:2，搅拌均匀；调节pH为5，在55℃条件下水解4h，得到海带水解物；将水解物在5000rpm转速下离心20min，分离出残渣，得到可溶性寡糖上清液；进行喷雾干燥，得到褐藻寡糖干粉。
所获得的海带水解寡糖干燥后为淡黄色，水溶性好，收率为6％，操作简单，无污染、无化学试剂添加，有潜在的应用价值。
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 青岛海大生物集团有限公司
<120> 一种褐藻胶裂解酶及其基因和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 0
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
<210> 2
<211> 288
<212> PRT
<213> 褐藻胶裂解酶氨基酸序列(amino acid sequence)
<400> 2
Met Asn Ile Gln Phe Ser Lys Ile Leu Leu Leu Thr Val Leu Ala Thr
1 5 10 15
Ala Thr Ile Ser Asn Ala Gln Leu Lys Lys Ser Lys Ser Lys Thr Ala
20 25 30
Lys Ile Leu Trp Ser His Trp Thr Val Thr Val Pro Lys Lys Asn Pro
35 40 45
Leu Lys Pro Gly Lys Pro Tyr Ser Leu Gly Tyr Pro Lys Ile Leu Asn
50 55 60
Tyr Ala Lys Leu Lys Ile Ala Ser Lys Tyr Met Tyr Leu Leu Pro Lys
65 70 75 80
Leu Lys Ser Val Val Phe Tyr Ala Phe Pro Ser Gly Val Thr Thr Ala
85 90 95
Asn Thr His Tyr Ser Arg Ser Lys Leu Arg Lys Thr Met Lys Thr Gly
100 105 110
Ser Asn Lys Val Asn Trp Thr Phe Ala Lys Gly Gly Lys Met Arg Gly
115 120 125
Thr Tyr Ala Ile Leu Leu Ile Ser Lys Lys Pro Leu Gly Lys Tyr Ser
130 135 140
Arg Val Ile Ile Ala Gln Ile His Gly Val Leu Thr Leu Lys Gln Arg
145 150 155 160
Leu Leu Ile Gly Gln Lys Leu Asn Asn Ala Pro Pro Ile Leu Lys Val
165 170 175
Tyr Trp Leu Lys Gly Lys Ile Arg Val Lys Thr Lys Val Leu Lys Leu
180 185 190
Leu Asn Ala Pro Tyr Lys Lys Met Leu Ser Lys His Ala Trp Gly Leu
195 200 205
Leu Lys Gly Arg Asn Phe Lys Lys Lys Ile Leu Leu Asn Thr Arg Phe
210 215 220
Thr Leu Lys Val Lys Val Ser Leu Gly Arg Met Lys Val Ile Leu Asn
225 230 235 240
Leu Thr Lys Ser Leu Val Tyr Leu Leu Ile His Met Lys Lys Trp Gly
245 250 255
Ile Phe Lys Asn Tyr Phe Lys Ala Gly Asn Tyr Phe Gln Ser Lys Thr
260 265 270
Pro Gly Thr Phe Ala Lys Val Lys Ile Tyr Ser Leu Gln Val Thr His
275 280 285
Claims (4)
1.一种褐藻胶裂解酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1。
2.权利要求1所述核苷酸序列编码的褐藻胶裂解酶Alg3，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
3.一种转化有权利要求1所述褐藻胶裂解酶基因的基因工程菌株，工程菌为大肠杆菌，通过将所述褐藻胶裂解酶基因与载体连接，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌获得。
4.权利要求2所述褐藻胶裂解酶Alg3或转化有权利要求1所述褐藻胶裂解酶基因的基因工程菌株在催化生成褐藻寡糖上的应用。
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| CN201811646173.5A CN109777817A (zh) | 2018-12-30 | 2018-12-30 | 一种褐藻胶裂解酶及其基因和应用 |
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-
2018
- 2018-12-30 CN CN201811646173.5A patent/CN109777817A/zh not_active Withdrawn
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