CN112831511A

CN112831511A - 一种外切褐藻胶裂解酶、其编码基因及应用

Info

Publication number: CN112831511A
Application number: CN202110202885.3A
Authority: CN
Inventors: 邵宗泽; 周梅先; 陈琳
Original assignee: Third Institute of Oceanography MNR
Current assignee: Third Institute of Oceanography MNR
Priority date: 2021-02-23
Filing date: 2021-02-23
Publication date: 2021-05-25
Anticipated expiration: 2041-02-23
Also published as: CN112831511B

Abstract

本发明公开了一种外切褐藻胶裂解酶、其编码基因及应用。本发明以弧菌Vibriosp.MCCC 1A13243的基因组DNA为模板，设计并合成引物，通过PCR扩增外切褐藻胶裂解酶基因,将该基因克隆入pET‑22b表达载体上，在大肠杆菌E.coli BL21中进行诱导表达，采用Ni‑Sepharose亲和层析纯化得到较高纯度的重组外切褐藻胶裂解酶蛋白。该酶的最适温度为30℃，最适pH为8.5，在pH4.5～10.0范围内保温30min仍能保持50％以上的相对酶活力；Mn²⁺和Co²⁺对该酶活性具有明显促进作用；该酶对海藻酸钠具有良好的底物特异性，其降解终产物主要是单糖组分，在褐藻资源开发利用方面应用前景良好。

Description

一种外切褐藻胶裂解酶、其编码基因及应用

技术领域

本发明涉及采用基因工程手段获得一种外切褐藻胶裂解酶及其制备方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

褐藻胶是一类主要从褐藻细胞壁中提取的水溶性酸性多糖，它是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)两种单体随机排列组成的多聚物，这两种单体通过1，4-糖苷键连接能形成三种不同形式的多糖片段：聚β-D-甘露糖醛酸(Polymannuronic acid，PolyM)片段、聚α-L-古罗糖醛酸(Polyguluronic acid，PolyG)片段以及二者杂合片段(PolyMG)。褐藻胶因其具有抗肿瘤、降血压等生理活性，被广泛应用于食品、医疗、农业、能源等方面。

目前生物酶法是降解褐藻胶的重要方法，相较于会污染环境、低效率、反应条件难以控制的化学和物理降解法，生物酶法具有反应条件温和可控、专一性强等优势。褐藻胶裂解酶可通过β-消除反应将褐藻胶降解为一系列不饱和糖醛酸寡糖和单体，这些降解产物具有促进植物生长、缓解植物胁迫、抗炎、抑菌、抗肿瘤及抗氧化等生理活性，因此，褐藻寡糖的生产极为重要。按照作用方式不同，褐藻胶裂解酶分为内切型和外切型两种。到目前为止，在CAZy(Carbohydrate-Active Enzymes)数据库中，褐藻胶裂解酶分属于12个多糖裂解酶家族(Polysaccharide Lyases，PLs)，包括PL5、PL6、PL7、PL14、PL15、PL17、PL18、PL31、PL32、PL34、PL36和PL39。

褐藻胶裂解酶来源广泛，目前在藻类、细菌、海洋软体动物、真菌和病毒中均有发现。微生物来源的褐藻胶裂解酶种类最为丰富，这些微生物包括弧菌属(Vibrio)，假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)，微泡菌属(Microbulbifer)，黄杆菌属(Flavobacterium)，芽孢杆菌属(Bacillus)和链霉菌属(Streptomyces)等的成员。

随着基因组测序技术的发展，越来越多的褐藻胶裂解酶基因被注释出来，通过基因工程等手段对其进行功能研究，但是对外切型褐藻胶裂解酶的研究相对较少。海藻作为生产生物燃料的一种理想燃料，成为国内外广泛关注的热点，由于工业微生物不能代谢海藻多糖组分，使得海藻生产乙醇的潜能未完全被激发出来。外切型褐藻胶裂解酶能将海藻降解为不饱和单体，这些单体是藻酸盐生理代谢的中间体，也是获取生物燃料的潜在碳源。目前发现的外切型褐藻胶裂解酶对酸碱和金属离子耐受性比较差，在工业应用上受到很大的限制。

发明内容

本发明的主要目的是针对现有技术的不足，提供一种外切褐藻胶裂解酶(命名为VAL1)。

该酶的最适温度为30℃，最适pH为8.5，在pH4.5～10.0范围内保温30min仍能保持50％以上的相对酶活力；Mn²⁺和Co²⁺对该酶活性具有明显促进作用；该酶对海藻酸钠具有良好的底物特异性，其降解终产物主要是单糖组分。

编码该酶的核苷酸序列如下：(SEQ ID NO:1)

其中5’端57bp片段为编码信号肽序列。

该酶的氨基酸序列如下：(SEQ ID NO:2)

其中，N端19个氨基酸为信号肽序列。

本发明的另一目的，在于提供一种外切褐藻胶裂解酶的制备方法，它包括如下步骤：

(1)基于弧菌(Vibrio sp.MCCC 1A13243)基因组测序数据分析获得外切褐藻胶裂解酶基因VAL1。

(2)设计并合成扩增去除信号肽编码序列的外切褐藻胶裂解酶基因VAL1的引物，其序列如下：

上游引物VAL1F:5’-GATCACATATGGATGTTGTAAACAATGGC-3’(SEQ ID NO:3)

下游引物VAL1R:5’-GATCACTCGAGTTTCCCGTTTAGCTTAAG-3’(SEQ ID NO:4)。

(3)PCR扩增及重组质粒的构建：

用VAL1F和VAL1R引物，以弧菌(Vibrio sp.MCCC 1A13243)的基因组DNA为模板进行扩增。PCR扩增条件如下：95℃预变性3min；95℃20s，52℃20s，72℃1min，30个循环。PCR产物经限制性内切酶NdeI和XhoI酶切后被连接到经同样限制性内切酶酶切的表达载体pET-22b上，将连接产物转化大肠杆菌Escherichia coli TOP10受体菌株，筛选含有外切褐藻胶裂解酶基因的重组质粒，并进行双酶切和测序验证。

(4)外切褐藻胶裂解酶的表达与纯化：

将含有外切褐藻胶裂解酶基因的重组质粒转化入大肠杆菌E.coli BL21受体菌株，用IPTG诱导外切褐藻胶裂解酶蛋白表达，采用Ni-Sepharose亲和层析(NiSepharoseTM6Fast Flow试剂盒)纯化蛋白。纯化后的外切褐藻胶裂解酶的SDS-PAGE电泳检测结果如图1所示。

本发明的外切褐藻胶裂解酶属于PL7家族，在低温条件下具有较高的酶活，且具有较宽的pH作用范围，多种常见金属离子对其酶活性影响不大，在利用大型褐藻生产生物燃料方面更具优势。

附图说明

图1为纯化后的酶蛋白的SDS-PAGE电泳；

图2为不同温度对酶活力的影响；

图3为酶在不同温度条件下的稳定性检测；

图4为不同pH对酶活力的影响；

图5为酶在不同pH条件下的稳定性检测；

图6为不同金属离子和酶抑制剂对酶活力的影响；

图7为酶对不同底物水解作用的效果；

图8为酶的降解产物分析

具体实施方式

实施例1外切褐藻胶裂解酶的制备

步骤如下：

实验材料

弧菌Vibrio sp.MCCC 1A13243(由中国海洋微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为1A13243，可通过购买方式得到)，大肠杆菌E.coli TOP10、大肠杆菌E.coil BL21(DE3)(购自ThermoFisher公司)、表达载体pET-22b(购自ThermoFisher公司)；赛百盛细菌基因组DNA提取试剂盒(购自厦门精聚公司)；DNA聚合酶(购自全式金公司)；限制性内切酶Nde I和Xho I(购自全式金公司)；T4连接酶(购自Takara公司)；LB培养基(每升含蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 10g)；结合缓冲液(1×PBS缓冲液：10mM磷酸盐，pH7.2～7.4)；漂洗缓冲液(500mM NaCl,20～50mM咪唑，20mM磷酸盐，pH 7.4)；洗脱缓冲液(500mM NaCl，500mM咪唑，20mM磷酸盐，pH 7.4)；3，5－二硝基水杨酸(DNS)(购自上海生工)；氨苄青霉素(购自上海生工)；Ni Sepharose^TM6Fast Flow试剂盒(购自泰京公司)；10kDa超滤管(购自泰京公司)；聚α-L-古罗糖醛酸(PolyG)、聚β-D-甘露糖醛酸(PolyM)、褐藻胶寡糖及单糖(购自博智汇力公司)；海藻酸钠(购自上海国药集团)。本发明中使用的含氨苄青霉素的LB培养基，其氨苄青霉素浓度均为100μg/mL。

实验步骤

(1)基于VAL1全长序列，设计并合成扩增去除信号肽编码序列的外切褐藻胶裂解酶基因VAL1的引物，其序列如下：

上游引物VAL1F:5’-GATCACATATGGATGTTGTAAACAATGGC-3’

下游引物VAL1R:5’-GATCACTCGAGTTTCCCGTTTAGCTTAAG-3’

(2)PCR扩增及重组质粒的构建

利用赛百盛细菌基因组DNA提取试剂盒提取弧菌Vibrio sp.MCCC 1A13243的基因组DNA。以弧菌Vibrio sp.MCCC 1A13243基因组DNA为模板，使用VAL1F和VAL1R引物进行扩增。扩增体系(50μL)如下：VAL1F(10μM)1μL，VAL1R(10μM)1μL，5×TransStart FastPfu FlyBuffer 10μL，dNTP(2.5mM)4μL，基因组DNA 2μL，TransStart FastPfu DNAPolymerase 1μL，ddH₂O 31μL。扩增条件如下：95℃预变性3min；95℃20s，52℃20s，72℃1min，30个循环。将PCR产物进行胶回收，对pET-22b载体及相应的目的片段用限制性内切酶NdeI和XhoI进行酶切后，用T4连接酶进行连接；将连接产物与受体菌E.coli Top10感受态混合，冰上放置30min，42℃热激90s后，加入800μL LB液体培养基，37℃、100rpm复苏1h，离心后涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养，筛选重组质粒，并对重组质粒进行双酶切和测序验证，获得去掉N-端信号肽的外切褐藻胶裂解酶的相关核苷酸序列。

(3)基因的诱导表达及粗酶液的制备

将重组质粒转化入E.coli BL21(DE3)中，获得含有外切褐藻胶裂解酶基因的重组菌株。将重组菌株接种于5mL含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中过夜培养，取5mL过夜培养物按1:100接种于500mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养至OD₆₀₀为0.4～0.5左右，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L进行诱导，18℃、180rpm条件下诱导表达24h，5000rpm离心10min收集菌体。将菌体用结合缓冲液清洗2～3次，然后将菌体重悬于60mL结合缓冲液中，分两管，4℃放置2～3h后，以功率300W，工作/间隙时间为3s/4s超声破碎30min，4℃、5000rpm离心20min，收集上清即得到粗酶液。

(4)酶的纯化

将制备的粗酶液加入至预先平衡好的His纯化柱Ni Sepharose^TM 6 Fast Flow，4℃混匀2～3h，然后弃去废液。之后先用20mL含有20mM咪唑的漂洗缓冲液漂洗两次，再用20mL含有50mM咪唑的漂洗缓冲液漂洗两次。漂洗结束后用8mL的洗脱缓冲液洗脱三次，分批收集洗脱液，对洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测其纯度。用10kDa超滤管进行超滤以去除咪唑和高浓度的NaCl，获得纯化好的酶液。

实施例2

外切褐藻胶裂解酶的酶学性质

(1)褐藻胶裂解酶活性测定方法

采用DNS法测定还原糖含量。将50μL稀释的酶液和200μL 0.3％海藻酸钠底物混合，在30℃条件下反应30min。反应完成后加入500μL DNS试剂，煮沸5min，立即置于冰水中冷却，短暂离心后取上清，测定OD₅₄₀值(以灭活酶液作为对照)，根据标准曲线计算还原糖量和酶活力。酶活力单位定义：在上述测定条件下，每分钟裂解海藻酸钠产生1μmol还原糖所需酶量定义为一个酶活力单位(U)。

(2)酶的作用温度

将稀释的酶液在10～60℃范围内，以100mM Glycine-NaOH(pH 8.5)缓冲液配制的0.3％的海藻酸钠作为底物进行酶活测定，以最大酶活力为100％，计算不同温度下的相对酶活力。结果表明，在pH为8.5时，该外切褐藻胶裂解酶的最适反应温度为30℃，在15～40℃范围内酶活力较高，结果见图2。

(3)酶在不同温度条件下的稳定性

将酶液在不同温度(10～60℃)下保温30min后，再与100mM Glycine-NaOH(pH8.5)缓冲液配制的0.3％的海藻酸钠反应进行酶活测定，以未经处理的酶的活力为100％，计算不同处理的酶的相对活力。结果表明，该酶在10～35℃范围内稳定性较好，保温30min后剩余酶活力为80％以上，而在40～60℃保温30min后，该酶几乎完全失活，结果见图3。

(4)酶的作用pH

将稀释的酶液在30℃下，以不同缓冲液(100mM Na-acetate缓冲液，pH4.5～6.0；100mM Na-phosphate缓冲液，pH6.0～7.5；100mM Tris-HCl缓冲液，pH7.0～8.5；100mMGlycine-NaOH，pH8.5～10.0)配制的0.3％的海藻酸钠作为底物进行酶活测定，以最大酶活力为100％，计算不同pH下该酶的相对活力。结果表明，该酶的最适pH为8.5，具有宽泛的pH作用范围，在pH 5.5～9.0范围内酶活力较高，在酸性条件下最适pH为5.5～6.0，结果见图4。

(5)酶在不同pH条件下的稳定性

将酶液在不同缓冲液(100mM Na-acetate缓冲液，pH4.5～6.0；100mM Na-phosphate缓冲液，pH6.0～7.5；100mM Tris-HCl缓冲液，pH7.0～8.5；100mM Glycine-NaOH，pH8.5～10.0)中于4℃保温30min后，在30℃下，与100mM Glycine-NaOH(pH 8.5)缓冲液配制的0.3％的海藻酸钠反应进行酶活测定，以未经处理的酶的活力为100％，计算不同处理的酶的相对活力。结果表明，该酶在常用缓冲液中稳定性较好，在不同缓冲液中分别保温30min后，其剩余酶活力均能保持50％以上，结果见图5。

(6)金属离子及酶抑制剂对酶的作用

在30℃、pH 8.5条件下，在反应体系中分别加入终浓度为1.0mM的不同金属离子和酶抑制剂，然后测定酶活，以未添加任何金属离子或酶抑制剂条件下的相对酶活力为100％，计算不同金属离子和酶抑制剂影响下的酶的相对活力。结果表明，Mn²⁺对该酶的促进作用最为明显，酶活力提升近2倍，Ca²⁺和Co²⁺对重组酶也有明显促进作用；Fe²⁺和EDTA完全抑制重组酶活性，Fe³⁺和SDS对酶活也有明显抑制作用；其余金属离子和咪唑(Imidazole)对酶活基本无影响，结果见图6。

(7)酶的底物特异性

在30℃、pH 8.5条件下，分别以0.3％的海藻酸钠、PolyG和PolyM为底物进行酶活测定，以最大酶活力为100％，计算外切褐藻胶裂解酶水解不同底物的相对活力。结果表明该酶对海藻酸钠、PolyG和PolyM三种底物均有降解活性，其中对海藻酸钠底物特异性作用最为显著，说明该酶是一种底物偏好性的双功能酶，结果见图7。

(8)降解产物分析

采用薄层层析(TLC)法分析外切褐藻胶裂解酶产物。将50μL的纯酶加入200μL的含有0.3％海藻酸钠的100mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)中，混匀后于30℃条件下过夜反应，上样量为3μL。展开剂为正丁醇：甲酸：水(4：6：1，v/v/v)，显色剂为10％硫酸乙醇。结果显示，该酶降解海藻酸钠底物的终产物主要组分为单糖，表明该酶是一种外切型褐藻胶裂解酶，结果见图8。

序列表

<110> 自然资源部第三海洋研究所

<120> 一种外切褐藻胶裂解酶、其编码基因及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1041

<212> DNA

<213> 弧菌(Vibrio sp. MCCC 1A13243)

<400> 1

atgaaacaaa gtttggttct cgctggttct cttcttctcg ctctgcctgc aatggccgat 60

gttgtaaaca atggcgtctc ttaccctgtg ccagcagata aattcgatat gcgtaactgg 120

aagatcacta tcccatcgga tatcaaccaa gatggtcgcg tggatgagat cgaaggcgtt 180

gctatgatga gttactccca ctccgacttc ttcttcctag acgaagacgg caacatggtg 240

tttgaggtgc ataacaaggc tatcactacc aagaactcta agaacgcccg ctctgaactg 300

cgtcagatgg ctcgtggcgc agatttttct atcggcaccc atgataatct gaacaactgg 360

gccctttcta gtcatccaga tgccaaaacc ttcagtgcag ttggtggcac cctagaggca 420

acccttaagg ttaaccatgt ctctctgcat gctaaatatc ctgaaaaata ccctgcacac 480

tcagttgtag taggtcagat ccacgcggac aaagacaatg cacagatcaa ggctaagaca 540

ggttatggtc acggtaatga gcctatcaag atcttctata agaagttccc tggtcacaag 600

atgggttcag tgttctggaa ctacgagcgt aacctagaaa agaacgaccc cgatcgcgcg 660

gatatcgcat acccagtgtg gggcaacact tgggaaaacc caaatgagcc aggtgatgca 720

ggtatcgcac taggtgaaga gtttagctat aagatcgaag taaaagacac caccatgtat 780

ctcaccttcg agaccaagcg acacgacaca gttacctatg agattgacct tgctaagggc 840

atcgataaca aagaccaccc aaccggttat gcaaaagatt ctttctactt caaagctggg 900

gcttatggcc agtgtagcgt tcaagactca cacccagtat ggggcccagg ctgtgaaggt 960

actggtgact tcgctatcga taagaagaac ggcgactaca acagcgtgac cttctctgcg 1020

cttaagctaa acgggaaata a 1041

<210> 2

<211> 346

<212> PRT

<213> 弧菌(Vibrio sp. MCCC 1A13243)

<400> 2

Met Lys Gln Ser Leu Val Leu Ala Gly Ser Leu Leu Leu Ala Leu Pro

1 5 10 15

Ala Met Ala Asp Val Val Asn Asn Gly Val Ser Tyr Pro Val Pro Ala

20 25 30

Asp Lys Phe Asp Met Arg Asn Trp Lys Ile Thr Ile Pro Ser Asp Ile

35 40 45

Asn Gln Asp Gly Arg Val Asp Glu Ile Glu Gly Val Ala Met Met Ser

50 55 60

Tyr Ser His Ser Asp Phe Phe Phe Leu Asp Glu Asp Gly Asn Met Val

65 70 75 80

Phe Glu Val His Asn Lys Ala Ile Thr Thr Lys Asn Ser Lys Asn Ala

85 90 95

Arg Ser Glu Leu Arg Gln Met Ala Arg Gly Ala Asp Phe Ser Ile Gly

100 105 110

Thr His Asp Asn Leu Asn Asn Trp Ala Leu Ser Ser His Pro Asp Ala

115 120 125

Lys Thr Phe Ser Ala Val Gly Gly Thr Leu Glu Ala Thr Leu Lys Val

130 135 140

Asn His Val Ser Leu His Ala Lys Tyr Pro Glu Lys Tyr Pro Ala His

145 150 155 160

Ser Val Val Val Gly Gln Ile His Ala Asp Lys Asp Asn Ala Gln Ile

165 170 175

Lys Ala Lys Thr Gly Tyr Gly His Gly Asn Glu Pro Ile Lys Ile Phe

180 185 190

Tyr Lys Lys Phe Pro Gly His Lys Met Gly Ser Val Phe Trp Asn Tyr

195 200 205

Glu Arg Asn Leu Glu Lys Asn Asp Pro Asp Arg Ala Asp Ile Ala Tyr

210 215 220

Pro Val Trp Gly Asn Thr Trp Glu Asn Pro Asn Glu Pro Gly Asp Ala

225 230 235 240

Gly Ile Ala Leu Gly Glu Glu Phe Ser Tyr Lys Ile Glu Val Lys Asp

245 250 255

Thr Thr Met Tyr Leu Thr Phe Glu Thr Lys Arg His Asp Thr Val Thr

260 265 270

Tyr Glu Ile Asp Leu Ala Lys Gly Ile Asp Asn Lys Asp His Pro Thr

275 280 285

Gly Tyr Ala Lys Asp Ser Phe Tyr Phe Lys Ala Gly Ala Tyr Gly Gln

290 295 300

Cys Ser Val Gln Asp Ser His Pro Val Trp Gly Pro Gly Cys Glu Gly

305 310 315 320

Thr Gly Asp Phe Ala Ile Asp Lys Lys Asn Gly Asp Tyr Asn Ser Val

325 330 335

Thr Phe Ser Ala Leu Lys Leu Asn Gly Lys

340 345

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gatcacatat ggatgttgta aacaatggc 29

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatcactcga gtttcccgtt tagcttaag 29

Claims

1.一种表达外切褐藻胶裂解酶的基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种表达外切褐藻胶裂解酶的基因序列，其特征在于，其由权利要求1所述的外切褐藻胶裂解酶基因去除其5’端57bp片段得到。

3.一种重组载体，其含有权利要求1或2所述的一种表达外切褐藻胶裂解酶的基因序列。

4.一种重组菌，其含有权利要求3所述的重组载体。

5.重组菌突变体，其特征在于：其外源序列与权利要求1或2所述的基因序列的相似性大于98％。

6.一种外切褐藻胶裂解酶，其特征在于：其蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。

7.一种外切褐藻胶裂解酶，其特征在于：其由权利要求6所述的外切褐藻胶裂解酶的蛋白序列去除其N端19个氨基酸得到。

8.如权利要求6或7所述的外切褐藻胶裂解酶的用途，其用于褐藻利用和生物燃料生产。

9.一种外切褐藻胶裂解酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)获取弧菌Vibrio sp.MCCC 1A13243的基因组DNA作为模板，所述的模板含外切褐藻胶裂解酶基因VAL1；

(2)设计并合成扩增去除信号肽编码序列的外切褐藻胶裂解酶基因VAL1的引物；

(3)PCR扩增及重组质粒的构建：采用步骤(2)的引物以步骤(1)的基因组DNA为模板进行扩增；PCR产物经限制性内切酶NdeI和XhoI酶切后被连接到经同样限制性内切酶酶切的表达载体pET-22b上，将连接产物转化大肠杆菌Escherichia coli TOP10受体菌株，筛选含有外切褐藻胶裂解酶基因的重组质粒，并进行双酶切和测序验证；(4)外切褐藻胶裂解酶的表达与纯化：将含有外切褐藻胶裂解酶基因的重组质粒转化入大肠杆菌E.coli BL21受体菌株，诱导外切褐藻胶裂解酶蛋白表达，并纯化，获得纯化后的外切褐藻胶裂解酶。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)的引物包括：

上游引物VAL1F:5’-GATCACATATGGATGTTGTAAACAATGGC-3’

下游引物VAL1R:5’-GATCACTCGAGTTTCCCGTTTAGCTTAAG-3’。