CN111454974B

CN111454974B - 一种内切型β-甘露聚糖水解酶Man01929及其突变成糖基转移酶的方法及应用

Info

Publication number: CN111454974B
Application number: CN202010307836.1A
Authority: CN
Inventors: 韩文君; 程媛媛; 宓延红; 古静燕; 李新; 卫洁
Original assignee: Jinan Aiketiwei Biotechnology Co ltd
Current assignee: Jinan Aiketiwei Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-04-17
Filing date: 2020-04-17
Publication date: 2021-01-19
Anticipated expiration: 2040-04-17
Also published as: WO2021208519A1; CN111454974A

Abstract

本发明涉及一种内切型β‑甘露聚糖水解酶Man01929及其突变成糖基转移酶的方法及应用，内切型β‑甘露聚糖酶Man01929的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码Man01929的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明对该酶进行定点突变，结果显示氨基酸序列的第118、119、124、323位点在Man01929对半乳甘露聚糖的识别、结合与降解等底物选择性作用过程中扮演了重要角色。这对促进GH5家族β‑甘露聚糖酶底物选择性机制的研究具有参考价值。另外，本发明还获得了具有转糖基能力的突变体D124Y，为揭示水解酶转变成糖基转移酶的催化机制的转换机理提供了重要参考。

Description

一种内切型β-甘露聚糖水解酶Man01929及其突变成糖基转移酶的方法及应用

技术领域

本发明涉及一种内切型β-甘露聚糖水解酶Man01929及其突变成糖基转移酶的方法及应用，属于生物技术领域，涉及蛋白质改进技术。

背景技术

甘露聚糖是一类具有复杂结构的多糖，根据糖单元组成结构的不同，可分为四类：纯甘露聚糖(pure mannan)、葡甘聚糖(glucomannan)、半乳甘露聚糖(galactomannan)以及半乳葡甘聚糖(galactoglucomannan)。甘露聚糖因结构复杂，故彻底水解时需要多种酶的协同作用，如β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)、β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)、乙酰甘露聚糖酯酶(EC 3.1.1.6)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)。β-甘露聚糖酶是一类糖基水解酶(Glycoside Hydrolase,GH)，在水解过程中起关键作用，它可以水解甘露聚糖主链内部的β-1,4糖苷键，产生甘露寡糖片段。甘露寡糖是由2-10个糖单元通过糖苷键链接而成的，具有多种生理活性，如抗肿瘤、调节免疫力、促进细胞分裂等。与化学方降解法相比，酶法降解甘露多糖制备寡糖的策略具有反应条件温和而可控性强，底物选择性清晰而产物明确等优势，因此β-甘露聚糖酶具有推广应用的潜质。随着研究的深入，β-甘露聚糖酶在食品、养殖业、洗涤剂行业、生物乙醇和石油钻探等各个领域的应用越来越广泛。

目前，虽然关于β-甘露聚糖酶的专利申请及科研文献数量较多，但主要集中在(1)β-甘露聚糖酶的产酶菌株及酶资源发掘；(2)优化异源表达的条件，从而提高酶的表达水平以应用于生产；(3)通过分子截短、定点突变以及构建糖基化修饰位点的手段，提高酶的催化效率、底物特异性、热稳定性以及耐酸碱的特性等。现有的研究仍然存在以下不足：

(1)β-甘露聚糖酶的底物选择性及其识别机制不明确。作为工具酶，既需要明确的底物选择性，也需要明确的底物选择机制，然而现有研究关于决定酶底物选择性的因素研究较少。这可能是由于两方面的原因造成的：第一，甘露聚糖底物中各种糖单元的大小或结构高度相似，给酶对底物的专一性识别、降解造成困难，大多数甘露聚糖酶具有底物广谱性恰恰是例证。第二，β-甘露聚糖酶本身具有柔性结构，可以识别、结合多种底物，但究竟是哪些糖基结合位点具体参与了底物的选择性识别与作用过程等机理研究甚少。仅少数文献报道了GH5家族β-甘露聚糖酶的-1亚位点和GH26家族β-甘露聚糖酶-2亚位点氨基酸残基参与半乳甘露聚糖的识别，是否存在其它类型活性位点残基也参与了酶对半乳甘露聚糖的识别与降解，未见报道。

(2)部分天然β-甘露聚糖酶，如GH5、GH113家族成员，既具有糖基水解酶的活性又有糖基转移酶的活性，这也对用于降解多糖制备寡糖的专一性工具酶的开发造成困难，需要了解同一个酶进行糖基水解酶、糖基转移酶两种催化机制转换调节的机理。

英文文献：Dilokpimol A,Nakai H,Gotfredsen C H,et al.Recombinantproduction and characterisation of two related GH5endo-β-1,4-mannanases fromAspergillus nidulans FGSC A4showing distinctly different transglycosylationcapacity[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Proteins and Proteomics,2011,1814(12):1720-1729.

Rosengren A,

P,Anderson L,et al.The role of subsite+2of theTrichoderma reeseiβ-mannanase TrMan5A in hydrolysis and transglycosylation[J].Biocatalysis and Biotransformation,2012,30(3):338-352.

上述文献已报道这种转糖基的能力与β-甘露聚糖酶+2亚位点的色氨酸(Trp)有关，但是其它亚位点的氨基酸残基是否参与了这种调节机制，以及是否存在其它类型氨基酸残基的参与，未见报道。

发明内容

针对现有技术的不同，本发明提供一种内切型β-甘露聚糖水解酶Man01929及其突变成糖基转移酶的方法及应用。所述β-甘露聚糖水解酶Man01929下面简称为β-甘露聚糖酶Man01929。

一种内切型β-甘露聚糖酶Man01929的编码基因man01929，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

所述内切型β-甘露聚糖酶Man01929，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组表达载体I，包含上述内切型β-甘露聚糖酶Man01929的编码基因man01929。

一种重组菌株I，包含上述内切型β-甘露聚糖酶Man01929的编码基因man01929。

上述内切型β-甘露聚糖酶Man01929的编码基因man01929、重组表达载体、重组菌在制备内切型β-甘露聚糖酶Man01929的应用。

上述内切型β-甘露聚糖酶Man01929在降解甘露聚糖中的应用。

根据本发明优选的，所述内切型β-甘露聚糖酶Man01929在降解葡甘聚糖和半乳甘露聚糖中的应用。

一种内切型β-甘露聚糖酶Man01929突变酶，氨基酸突变位点为内切型β-甘露聚糖酶Man01929氨基酸序列SEQ ID NO.2的第118、119、124、221、268、269、323位氨基酸之一或两者以上。

根据本发明优选的，所述突变酶，氨基酸突变位点为内切型β-甘露聚糖酶Man01929氨基酸序列SEQ ID NO.2的第118、119、124、221、268、269、323位氨基酸之一或两者以上；所述氨基酸为：

第118位氨基酸由天冬氨酸突变为丙氨酸、谷氨酸或酪氨酸；

第119位氨基酸由蛋氨酸突变为缬氨酸；

第124位氨基酸由天冬氨酸突变为丙氨酸、谷氨酸或酪氨酸；

第221位氨基酸由酪氨酸突变为丙氨酸；

第268位氨基酸由谷氨酸突变为丙氨酸；

第269位氨基酸由异亮氨酸突变为酪氨酸；

第323位氨基酸由谷氨酸突变为丙氨酸、天冬氨酸或酪氨酸。

进一步优选的，所述突变酶，氨基酸突变位点为内切型β-甘露聚糖酶Man01929氨基酸序列SEQ ID NO.2的第124位氨基酸由天冬氨酸突变为酪氨酸。

上述突变酶的编码基因，根据上述氨基酸的突变位点在上述内切型β-甘露聚糖酶Man01929的编码基因man01929上进行定点突变。

一种重组表达载体II，包含上述突变酶的编码基因。

一种重组菌株II，包含上述突变酶的编码基因。

上述突变酶的编码基因、重组表达载体II、重组菌株II在制备上述切型β-甘露聚糖酶Man01929突变酶的应用。

上述内切型β-甘露聚糖酶Man01929突变酶在降解甘露聚糖中的应用。

根据本发明优选的，所述内切型β-甘露聚糖酶Man01929突变酶在降解葡甘聚糖和半乳甘露聚糖中的应用。

根据本发明优选的，所述内切型β-甘露聚糖酶Man01929突变酶在降解甘露四糖生成甘露五糖中的应用。

上述内切型β-甘露聚糖酶Man01929及所述酶的突变体作为工具酶在揭示GH5家族成员底物选择性识别相关机制中的应用。

上述内切型β-甘露聚糖酶Man01929及所述酶的突变体作为工具酶在揭示GH5家族成员进行糖基水解酶、糖基转移酶两种催化机制的转换调节机理中的应用。

根据本发明优选的，所述酶的突变体为上述内切型β-甘露聚糖酶Man01929突变酶。

进一步优选的，所述作为工具酶的突变酶，氨基酸突变位点为内切型β-甘露聚糖酶Man01929氨基酸序列SEQ ID NO.2的第124位氨基酸由天冬氨酸突变为酪氨酸。

所述内切型β-甘露聚糖酶Man01929的编码基因man01929，全长共2799bp，所编码的蛋白质含有932个氨基酸，分子量大小为103.1kDa。

所述内切型β-甘露聚糖酶Man01929只有糖基水解酶活性、没有糖基转移酶活性。

所述内切型β-甘露聚糖酶Man01929是从还原端开始降解甘露聚糖。

所述内切型β-甘露聚糖酶Man01929既能降解魔芋来源葡甘聚糖，也能降解槐豆胶来源的半乳甘露聚糖，且最适多糖底物是魔芋来源的葡甘聚糖；因此，相比含有糖链分支的甘露聚糖，内切型β-甘露聚糖酶Man01929更适合降解没有分支的线性甘露聚糖。

所述内切型β-甘露聚糖酶Man01929含有5个功能模块，其中N端含一个Glycosidehydrolase family 5(GH5)功能模块，447-585位氨基酸为Coagulation factor 5/8C-terminal domain功能模块、595-766位氨基酸含有2个PKD/Chitinase domain功能模块、C端含有Carbohydrate-binding module 64(CBM64)和Secretion system C-terminalsorting domain两个功能模块。

所述内切型β-甘露聚糖酶Man01929在降解魔芋葡甘露寡糖(KGM)的最适温度为40℃，最适pH为8.0；降解槐豆胶(LBG)时，最适温度为50℃，最适pH为5.0。

所述内切型β-甘露聚糖酶Man01929在降解魔芋葡甘聚糖和槐豆胶时，均产生以二糖至四糖为主的寡糖终产物，且其中的二糖寡糖片段均以甘露糖-甘露糖(MM)为主。在降解槐豆胶半乳甘露聚糖时，其寡糖最终主产物如五糖、六糖、七糖片段中的半乳糖含量呈现较大幅度增加。

所述底物为纯甘露寡糖时，该酶的最小底物为甘露四糖(M4)，最小产物为甘露单糖(M)。

所述底物为荧光标记的甘露寡糖时，该酶的最小底物为还原端被邻氨基苯甲酰胺标记的甘露四糖(2-AB-M4)，最小产物为甘露单糖(M)。

本发明技术方案的有益效果

1、本发明首次公开了由火色杆菌属细菌(Flammeovirga yaeyamensis)MY04的基因组中获得一种内切型β-甘露聚糖酶Man01929的编码基因man01929，该酶Man01929既可以降解魔芋葡甘聚糖，也能降解槐豆胶等多种多糖底物；该酶具有一定的热稳定性(0-40℃)，以及较宽的pH耐受性(5.0-10.0)，理化性质稳定，具备工业应用的潜质。

2、本发明涉及的内切型β-甘露聚糖酶Man01929在降解系列纯甘露寡糖底物或还原端被荧光标的纯甘露寡糖底物时，主要从还原端切割糖链产生较小的寡糖产物，且具有可变的底物内切降解模式，可应用于制备不同聚合度的甘露寡糖产物。

3、本发明基于理性分析内切型β-甘露聚糖酶Man01929三维结构的基础上，对内切型β-甘露聚糖酶Man01929进行定点突变，还通过比较分析，确认了内切型β-甘露聚糖酶Man01929中与糖链底物非还原端识别并结合的关键位点残基D118、M119、D124、E323，以及这些残基位点对该酶的底物选择性的具体影响；本发明对于深入揭示内切型β-甘露聚糖酶Man01929的底物选择性机制提供了重要线索，同时对于揭示GH5家族其它β-甘露聚糖酶成员的底物选择性机理提供了有益的参考。

4、本发明通过基因定点突变的手段，成功的将内切型β-甘露聚糖酶Man01929的第124位氨基酸从天冬氨酸突变为酪氨酸后，突变体酶不仅仍然具有糖基水解酶活性，还获得了糖基转移酶的活性，这超出了科研人员的预料，这为揭示包括内切型β-甘露聚糖酶Man01929在内的GH5家族成员进行糖基水解酶、糖基转移酶两种催化机制转换调节的机理研究及应用提供了重要基础。

附图说明

图1、内切型β-甘露聚糖酶Man01929功能模块构成分析结果图；

图2、重组内切型β-甘露聚糖酶rMan01929表达与纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

图中：M、蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为170kDa，130kDa，100kDa，70kDa，55kDa，40kDa，35kDa，25kDa，15kDa，10kDa；泳道1、对照菌株破壁前菌体，上样量10μL；泳道2、重组菌破壁前菌体，上样量2μL；泳道3、重组菌的破壁后上清，上样量2μL；泳道4、经镍柱纯化的rMan01929，上样量2μL；

图3、温度对重组β-甘露聚糖酶rMan01929降解魔芋葡甘聚糖(A)和槐豆胶(B)活性的影响曲线图；

图4、pH对重组β-甘露聚糖酶rMan01929降解魔芋葡甘聚糖(A)和槐豆胶(B)稳定性的影响曲线图；

图5、温度对重组β-甘露聚糖酶rMan01929降解魔芋葡甘聚糖(A)和槐豆胶(B)稳定性的影响曲线图；

图6、pH值对重组β-甘露聚糖酶rMan01929降解魔芋葡甘聚糖(A)和槐豆胶(B)活性和稳定性的影响曲线图；

图7、金属离子及化学试剂对重组β-甘露聚糖酶rMan01929降解魔芋葡甘聚糖(A)和槐豆胶(B)活性的影响柱形图；

图8、重组β-甘露聚糖酶rMan01929降解魔芋葡甘聚糖(A)和槐豆胶(B)过程中的寡糖产物TLC分析图；

其中A图：横坐标中M，甘露糖-甘露六糖；1，对照；2-9，分别代表：10s、1min、10min、1h、6h、24h、48h、72h；

B图：横坐标中M，甘露糖-甘露六糖；1，对照；2-9，分别代表：酶液稀释50倍反应10s，酶液稀释10倍反应10s，10s、30s、1min、30min、48h、72h；

图9、用重组β-甘露聚糖酶rMan01929完全降解魔芋葡甘露寡糖(A)和槐豆胶(B)所制备寡糖片段的¹H-NMR图；

图10、重组β-甘露聚糖酶rMan01929完全降解系列大小甘露寡糖(M-M6)的寡糖产物TLC分析图；

其中A图：横坐标中：A：样品顺序：M：M1-M6；1:M1(-)；2:M1(+)；3:M2(-)；4:M2(+),；5:M3(-)；6:M3(+)；7:M4(-)；8:M4(+)；9:M5(-)；10:M5(+)；11:M6(-)；12:M6(+)；其中(-)为阴性对照组，(+)为实验组；

B图：横坐标中：M，M1-M6；1：对照；2:酶液稀释10倍反应10s；3:10s；4:24h；5，48h；

C图：横坐标中：M，M1-M6；1，对照；2，酶液稀释10倍反应10s；3-8，10s、10min、1h、4h、24h、48h；

图11、用重组β-甘露聚糖酶rMan01929降解2AB标记的系列大小甘露寡糖(2AB-M～2AB-M6)最终主产物的分析(A)、不同反应时间降解2AB标记的甘露五糖(2AB-M5)(B)和2AB标记的甘露六糖(2AB-M6)(C)的寡糖产物的HPLC分析图(荧光)；

图12、β-甘露聚糖酶Man01929与M6分子对接三维结构；

图13、β-甘露聚糖酶Man01929与M6糖配体

以内的潜在作用位点分析图；

图14、用重组酶β-甘露聚糖酶rMan01929的系列突变体分别降解魔芋葡甘聚糖(A)和槐豆胶(B)的相对活性分析；

图15、用重组β-甘露聚糖酶rMan01929的系列突变体分别降解魔芋葡甘聚糖(A)和槐豆胶(B)的寡糖产物TLC分析图；

其中，横坐标中：M，M1-M6；1，(-)；2，Man01929；3，D118A；4，D118E；5，D118Y；6，D124A；7，D124E；8，D124H；9，D124Y；10，E323A；11，E323A；12，E323Y；

图16、用β-甘露聚糖酶Man01929的Asp¹¹⁸突变为Ala或Glu、Asp¹²⁴突变为Tyr、Ala或His后降解甘露六糖(A)、甘露五糖(B)或甘露四糖(C)的TLC分析；

其中：M：M1-M6；1：阴性对照；2：Man01929；3：D124Y；4：D124A；5：D124H；6：D118A；7：D118E；

图17、重组酶β-甘露聚糖酶rMan01929-D124Y降解甘露六糖(A)、甘露五糖(B)和甘露四糖(C)过程中间隔时取样后产物的TLC分析；

其中A图：M，M1-M6；1，阴性对照；2，10min；3，1h；4，4h；5，6h；6，8h；7，24h；8，Man01929；

B图：M，M1-M6；1，阴性对照；2，1min；3，30min；4，2h；；5，12h；6，24h；7，48h；8，Man01929；

C图：M，M1-M6；1，阴性对照；2，3h；3，12h；4，24h；5，48h；6，Man01929。

具体实施方式

以下实施例的阐述，是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术，而不是为了限制本发明的应用范围。发明人已经尽最大努力确保实施例中个参数的准确性(例如量，温度，等等)，但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑，除非另有说明，本发明中分子量是指重均分子量，温度是摄氏度。

实验材料来源

火色杆菌(Flammeovirga yaeyamensis)MY04菌株来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2008年11月27日，保藏编号CGMCC NO.2777。

在以下实施例中简称火色杆菌MY04。

实施例中涉及的实验材料未给出具体来源的，均为普通市售产品。

实施例1

火色杆菌MY04菌株基因组DNA的提取

将火色杆菌MY04接种至液体培养基YT04中，在28℃、200rpm的条件下，振荡培养至其600nm吸光值(OD₆₀₀)为1.2；取培养菌液10mL，在12,000×g(g，地球引力常数)条件下，4℃离心15min，收集菌体沉淀；用10mL的溶菌酶缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.0)悬浮菌体，在12,000x g，4℃条件下离心15min，收集菌体沉淀。

上述液体培养基YT04，每升组分如下：

胰蛋白胨10g、酵母提取物5.0g、氯化钠30g，用水溶解并定容至1L，pH 7.2。

向上述菌体沉淀中，每管加入溶菌酶缓冲液6.0mL，得到约7.0mL的菌液，分别加入浓度为20mg/mL的溶菌酶溶液各280μL，使溶菌酶终浓度为800μg/mL；置于冰水浴中1.0h，然后转移至37℃水浴中，温育2h，至反应体系粘稠；加入浓度为100mg/mL的十六烷基磺酸钠溶液0.41mL、100mg/mL的蛋白酶K溶液30μL，在52℃温育1.0h；加入Tris-平衡过的酚/氯仿/异戊醇(体积比25：24：1)溶液7.5mL，轻轻颠倒混匀；在10,000×g、4℃条件下离心10min，收集上清，并加入1.0mL的NaAc-HAc(pH 5.2，3.0M)缓冲液，以及8.5mL的无水乙醇，充分混匀；用枪头挑出丝状DNA，转移至1.5mL的离心管中，以70％乙醇(贮于-20℃)，洗涤2次，微离心后弃掉上清；在10,000×g、4℃条件下离心2min，彻底弃掉上清；将DNA沉淀于无菌工作台中风吹干燥，然后用无菌去离子水在4℃过夜溶解DNA样品，制得基因组DNA。

实施例2

火色杆菌MY04菌株基因组的扫描及其序列分析

将实施例1制得的基因组DNA，采用焦磷酸测序技术进行基因组的扫描测序，由上海美吉生物公司完成。用NCBI(National Center for Biotechnology Information,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站的在线软件对DNA测序结果进行分析。所用到的NCBI网站的分析软件是Open Reading Frame Finder(ORF Finder,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和Basic Local Alignment Search Tool(BLAST,http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

用上述生物学软件分析的结果显示，火色杆菌MY04菌株基因组DNA上携带一个β-甘露聚糖酶的编码基因man01929，基因man01929的编码区长2799bp，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。基因man01929所编码的β-甘露聚糖酶Man01929共含有932个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

BLASTp在线分析与CAZy数据库、PDB数据库检索表明，在已见文献报导的酶中，Man01929与来自Blue Mussel Mytilus edulis的Man5A相似度最大(即与来自蓝色贻贝基因组中所编码Man5A的蛋白质序列相似度最大)，达到36.79％。如图1所示，由InterProScan综合分析功能模块可知，β-甘露聚糖酶Man01929是由五个功能模块组成，包括Glycosidehydrolase,family 5(GH5module)、Coagulation factor 5/8C-terminal domain、2个PKD/Chitinase domain、Carbohydrate-binding module 64(CBM 64module)、Secretionsystem C-terminal sorting domain；用生物学网站ExPASY进行分析，显示蛋白质β-甘露聚糖酶Man01929的理论分子量约为103.1kD；用信号肽在线预测软件SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线分析，该蛋白无信号肽。

实施例3

基因man01929在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中的重组表达：

以实施例1制得的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。引物序列如下：

man01929扩增的正向引物

Man01929-F：5’-gcgCATATGGCACTTTTTGCTCATGC-3’；

man01929扩增的反向引物

Man01929-F：5’-gcgCTCGAGTTGCTTGTAGATTCTCCTAAC-3’；

正向引物下划线标注的是限制性内切酶Nde I的专一性位点，反向引物下划线标注的是限制性内切酶Xho I的专一性位点。

所用高保真DNA聚合酶Prime STAR HS DNA Polymerase购自中国大连宝生物公司，所用PCR反应试剂按照该公司提供的产品说明进行操作。

PCR反应体系：

2×Primer star GC buffer 5μL，扩增的正向引物0.35μL，扩增的反向引物0.35μL，Template(1ng/μL)1μL，ddH₂O 3.3μL，polymerase 0.1μL，dNTP 0.8μL。

PCR反应条件：

95℃预变性4min；94℃变性40s，60℃退火30s，72℃延伸180s，35个循环；72℃延伸10min；4℃稳定10min。

将PCR产物用限制性内切酶Nde I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。将购于美国Invitrogen公司的产品pET-30a(+)质粒DNA，用Nde I和XhoI双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。限制性内切酶Nde I和Xho I均购于中国大连宝生物公司，酶切所用到的酶与底物反应的体系、温度和时间，均按照该公司提供的产品说明操作。

将经过Nde I和Xho I双酶切的PCR产物，与同样经过双酶切的pET-30a(+)质粒载体，在DNA连接酶的催化下进行接；连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani培养基固体平板上，37℃培养16h后，挑取单克隆；将单克隆接入含有50μg/mL卡那霉素的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；将质粒用扩增引物进行PCR验证，结果得到大小为2.8kb的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确；接着将该重组质粒进行测序，结果表明，在pET-30a(+)的Nde I和Xho I酶切位点之间插入SEQ ID NO.1所示的基因man01929，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将该重组质粒命名为pE30a-Man01929。将重组质粒pE30a-Man01929转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)(购自美国Invitrogen公司)，然后按照Invitrogen公司提供的操作步骤，使用终浓度为0.05mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行重组β-甘露聚糖酶Man01929的诱导表达；在8,000×g、4℃条件下离心15min，收集菌体，并用缓冲液A重悬菌体，冰水浴环境中超声破碎。在15,000×g、4℃条件下进一步离心30min，收集水溶性组分，并用Ni-琼脂糖凝胶对重组β-甘露聚糖酶rMan01929分别进行吸附。用含有咪唑浓度为10、50、100、250、500mM的缓冲液A进行梯度洗脱，纯化条件按照凝胶的产品手册操作。用聚丙烯酰胺凝变性胶电泳检测重组β-甘露聚糖酶rMan01929的纯化情况。结果如图2所示：重组质粒pE30a-Man01929在E.coliBL21(DE3)菌株中经IPTG诱导表达后，产物呈水溶性表达，经镍柱亲和层析纯化后的重组酶rMan01929在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合；将纯化后的重组酶rMan01929样品装入最小分子截留量为8-14kDa的透析袋，在4℃环境中对缓冲液A进行透析。所说缓冲液A的成分是50mM Tris、150mM NaCl，pH 7.9，制得重组β-甘露聚糖酶rMan01929酶液。

实施例4

重组酶β-甘露聚糖酶rMan01929最适温度的测定

用去离子水分别配制质量体积浓度为0.3％(w/v)的魔芋葡甘聚糖和槐豆胶，加热溶解后，分别置于0℃、10℃、20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃水浴环境中温育1h。分别向每900μL底物溶液中添加实施例3制得的重组β-甘露聚糖酶rMan01929的稀释液100μL，其中重组β-甘露聚糖酶rMan01929的稀释液浓度为10μg/mL，混匀后继续反应，隔时取样。每个温度条件下3个平行样品，以沸水浴灭活的重组酶制剂为对照组。

用DNS-还原糖法测定各反应体系中新生成还原糖的浓度(OD₅₄₀)，并计算平均值，进行偏差分析。最大吸收值对应的反应温度为重组酶的最适温度，相对酶活(RA)定义为：各吸收值与最大吸收值的百分比。结果如图3所示：以如上所述分别以等质量体积浓度的魔芋葡甘聚糖(简称KGM)和槐豆胶(简称LBG)为底物测定酶活时，重组β-甘露聚糖酶Man01929降解魔芋葡甘聚糖在40℃反应时达到最大活力，而降解槐豆胶在50℃达到最大反应活力，这表明该酶降解魔芋葡甘聚糖和槐豆胶的最适反应温度不同，分别是40℃和50℃。该结果还表明β-甘露聚糖酶Man01929的最适温度会因为底物的成分及结构不同而变化。

实施例5

重组β-甘露聚糖酶rMan01929最适pH的测定

分别用浓度为50mM的NaAc-HAC缓冲液、50mM的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液、50mM的Tris-HCl缓冲液，分别与魔芋葡甘聚糖和槐豆胶配制质量体积浓度(g/mL)为0.3％的魔芋葡甘聚糖或槐豆胶底物，所对应的pH值分别为(5、6)，(6、7、8)，(7、8、9、10)三个区段，各pH值均在最适温度下调定酶活。将各底物置于最适温度中孵育1h，然后向每900μL底物中添加实施例3制得的重组β-甘露聚糖酶rMan01929的稀释液100μL，混匀后开始反应，隔时取样。每个pH条件下3个平行样品，以沸水浴灭活的重组酶制剂为对照组。用DNS-还原糖法测定各反应体系中新生成的还原糖浓度(OD₅₄₀)，并计算平均值和偏差。相对酶(RA)活定义为：各组平均吸收值与最大吸收值的百分比。最大吸收值对应的pH为重组酶的最适pH。结果如图4所示：该酶降解魔芋葡甘聚糖的最适反应pH为8.0，降解槐豆胶的最适pH为5.0。该结果表明，β-甘露聚糖酶Man01929的最适pH也会因为底物的成分及结构不同而变化。

实施例6

重组β-甘露聚糖酶rMan01929的温度稳定性分析

将在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下热处理不同时间后的实施例3制得的重组β-甘露聚糖酶rMan01929酶液，分别与用蒸馏水配置的质量体积浓度(g/mL)为0.3％的魔芋葡甘聚糖或槐豆胶，按1：9(体积比)的比例混合，然后在最适温度下测定残余酶活，以不经过热处理的酶液酶活定义为100％相对活力。结果如图5所示：重组酶rMan01929在0-40℃温育24h后，降解魔芋葡甘聚糖时，残余活性>75％以上；当降解槐豆胶时，当重组酶rMan01929在0-20℃温育24h，残余活性为80％以上，而在30-40℃下温育大于4h后，残余活性>59％，表明：该酶在0-40℃下具有一定的热稳定性。

实施例7

重组β-甘露聚糖酶rMan01929的pH稳定性分析

将实施例3制得的重组β-甘露聚糖酶rMan01929的酶液，在冰水浴、不同的pH(pH5～10)环境中分别预孵育2h后，与质量体积浓度(g/mL)为0.3％、在最适温度下预处理1h的魔芋葡甘聚糖或槐豆胶底物溶液按1：9(体积比)的比例混合，然后在最适温度下测定残余酶活，以不经过预处理的酶液的酶活定义为100％，计算相对活力。结果如图6所示，重组酶rMan01929在pH5.0-10.0的缓冲溶液中预处理2h后，酶降解葡甘聚糖或槐豆胶的残余活性均大于80％，受pH影响较小。这表明：该酶具有广泛的pH耐受性。

实施例8

金属离子及化学试剂对重组β-甘露聚糖酶rMan01929活性的影响

将用去离子水配置的质量浓度为0.3％的魔芋葡甘聚糖或槐豆胶底物、实施例3制得的重组β-甘露聚糖酶rMan01929、以及水按5：1：4(体积比)的比例混合后，接着向反应体系中添加不同的金属离子，添加的离子终浓度为1mM或10mM，然后在最适条件下反应，按前述的DNS-还原糖法测酶的活力。对照组为不加任何金属离子时rMan01929的活性(设定为100％)。结果如图7所示，该酶在降解魔芋葡甘聚糖时(1)在1mM或10mM的Na⁺、K⁺、Li⁺等一价金属试剂对重组酶rMan01929的活性没有显著影响，仅Ag⁺对重组酶rMan1929具有微弱抑制作用；(2)10mM的Co²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺二价金属离子对重组酶rMan01929的活性具有促进作用且最高可将活性提高到145％，而1mM的Co²⁺、Cu²⁺显著抑制重组酶rMan01929的活性；(3)其余金属离子及化学试剂均对重组酶rMan01929的活性有不同程度的抑制作用。该酶降解槐豆胶时，与魔芋葡甘聚糖不同的是：(1)1mM的Mg²⁺、Pb²⁺与10mM的Mn²⁺等二价金属离子对酶的活性具有促进作用，而Cu²⁺、Co²⁺对酶的活性有显著抑制作用；(2)10mM的DTT对重组酶rMan01929的活性有显著促进作用。

实施例9

DNS-还原糖法测定重组β-甘露聚糖酶rMan01929的酶活

将用去离子水配置的质量浓度为0.3％的魔芋葡甘聚糖、槐豆胶、瓜尔胶底物，浓度为10μg/mL的重组β-甘露聚糖酶rMan01929酶液、最适缓冲液以及水按2：1：3：4(体积比)的比例混合后，最适温度下反应。将反应产物在沸水浴中加热10min，转入冰水浴中5min,在12,000×g、4℃条件下离心15min，收集上清；将一定体积的上清与等体积的DNS(3,5-对硝基二甲苯)-反应液混匀，在沸水浴中加热10min，降至室温，在540nm测定吸收值。用分析纯的甘露糖作标准品，同样方法操作，绘制甘露糖的摩尔浓度与OD₅₄₀之间的量效关系曲线。用购于上海生工生物工程有限公司的蛋白质定量试剂盒测定重组β-甘露聚糖酶rMan01929酶液中的蛋白质含量。按照国际标准定义计算酶的活力单位，即在标准条件下，每分钟内产生1μmol产物所需的酶量为1个IU。结果表明：重组β-甘露聚糖酶rMan01929能以魔芋葡甘聚糖或槐豆胶为底物，酶解并产生还原糖产物，酶活分别为552±2.1U/mg和516±8.3U/mg，但是该酶几乎不能降解所测试瓜尔胶多糖。

实施例10

重组β-甘露聚糖酶rMan01929降解魔芋葡甘聚糖和槐豆胶的寡糖产物的TLC分析

用去离子水配制质量体积浓度(g/mL)为0.3％的魔芋葡甘聚糖和槐豆胶底物，加热溶解后，分别置于40℃和50℃水浴环境中降温1h。向每100μL底物中添加实施例3制得的重组酶rMan01929的稀释液1-100μL，不足200μL体积时，用无菌去离子水补足；混匀后继续反应，隔时取样。将反应产物在沸水浴中加热10min，转入冰水浴中放置5min；在12,000×g、4℃条件下离心15min，收集上清。预先在沸水浴中灭活的重组β-甘露聚糖rMan01929酶液，做阴性对照反应。

使用薄层色谱(TLC)的方法分析产物，取4uL上清于层析板(TLC Silica 60F254，德国MERK)，展开剂为正丁醇∶乙醇∶水体积比为2∶1∶1，显色剂为二苯胺∶苯胺∶磷酸∶丙酮＝1g∶1mL∶5mL∶50mL的条件下染色10s，然后在110℃条件下显色10min，拍照。

上述其中酶液稀释50倍反应10s代表将实施例3制得酶液稀释50倍后反应10s，酶液稀释10倍反应10s代表将实施例3制得酶液稀释10倍后反应10s，其余为实施例3制得酶液进行反应10s、30s、1min、10min、1h、6h、24h、48h、72h。

如图8所示，在上述条件下，重组酶rMan01929降解魔芋葡甘聚糖(图8A)时，短时间内生成三糖及更大的寡糖；随着时间的延长，五糖及更大寡糖产物逐步被降解；在48h以后，最终以四糖-二糖为主产物。该结果初步表明，在本申请研究条件下，重组酶rMan01929在降解魔芋葡甘聚糖时为内切模式。重组酶rMan01929降解槐豆胶(图8B)时，在反应10s时，产物稳定。TLC分析显示的变化规律也表明重组酶rMan01929降解半乳甘露聚糖时为内切模式。

实施例11

重组β-甘露聚糖酶rMan01929彻底降解魔芋葡甘聚糖和槐豆胶的寡糖产物的¹H-NMR鉴定

用重组β-甘露聚糖酶rMan01929分别完全降解葡甘聚糖和槐豆胶，得到酶解产物后浓缩；使用高效液相凝胶色谱法对样品分离纯化；检测器为示差折光检测器(RID)，色谱柱为Superdex^TM 30Increase 10/300GL，流动相为0.2M碳酸氢铵，流速为0.4mL/min；

分离纯化样品分别进行多次冷冻干燥除盐，然后用重水(D₂O)溶解，冷冻干燥进行氢氘置换，最后¹H-NMR检测；

通过¹H-NMR数据分析上述重组β-甘露聚糖酶rMan01929降解魔芋葡甘聚糖(图9A)和槐豆胶(图9B)的寡糖产物的结构特征。

用重组酶rMan01929降解魔芋葡甘聚糖的最终产物经分子凝胶色谱柱分离获得二糖、三糖、四糖产物片段后，分别进行¹H-NMR分析，结果如图9(A)所示：5.266ppm和5.050ppm化学位移值分别为寡糖还原端的葡萄糖和甘露糖的异头氢信号，4.421ppm和4.778ppm化学位移值分别为寡糖非还原端的葡萄糖和甘露糖的异头氢信号。上述结果表明，重组酶rMan01929降解KGM产生的寡糖片段中二糖结构主要为XM(其中X为甘露糖或者葡萄糖，M为甘露糖)，少量XG，根据面积积分法计算得到二者摩尔比：4.27:1；三糖结构主要为XXM；四糖结构主要为XXXM。这表明：重组酶rMan01929可用于降解魔芋葡甘聚糖并制备还原端主要为甘露糖的系列寡糖产物片段

重组酶rMan01929降解槐豆胶的最终产物经分离，获得二糖～七糖产物片段，通过¹H-NMR进行结构鉴定；如图9(B)所示，5.046ppm化学位移值为寡糖还原端的甘露糖异头氢信号，4.890ppm化学位移值为半乳糖异头氢信号；以上信号峰表明：(1)二糖的结构为MM，表明酶解反应的主产物-二糖片段-主要是由MM构成的；(2)酶解反应的主产物三糖至七糖产物片段的结构中，半乳糖的比例逐渐增加；(3)四糖至七糖主产物中富含半乳糖成分。这还表明，在Man01929降解LBG的过程中，较小的寡糖产物(如二糖、三糖等)属于主动生成的，而更高分子量的寡糖产物(如四至七糖等片段)又因富含半乳糖，不利于深度酶学降解而被动成为寡糖主产物的主要成分。

实施例12

重组酶rMan01929降解甘露寡糖产物分析

取约含20μg系列甘露寡糖(M-M6)的溶液，150mmol/L的NaH₂PO4-Na₂HPO4(pH7.0)缓冲溶液、实施例3制得的重组β-甘露聚糖酶rMan01929的稀释液，按照体积比1:1:1混匀，分别在40℃反应24h。将反应体系置沸水浴中10min，转至冰水浴5min，在12,000×g、4℃条件下离心至少15min。收集上清，作为重组β-甘露聚糖酶rMan01929的寡糖降解产物。以预先在沸水浴中灭活的重组β-甘露聚糖rMan01929酶液，做阴性对照反应。

按照实施例10所述的展开条件，将重组β-甘露聚糖酶rMan01929酶解甘露寡糖寡糖(M-M6)的样品，取2uL检测。按照实施例10所述显色条件，进行显色，然后分析。

其中A图：横坐标中：A：样品顺序：M：M1-M6；1:M1(-)；2:M1(+)；3:M2(-)；4:M2(+),；5:M3(-)；6:M3(+)；7:M4(-)；8:M4(+)；9:M5(-)；10:M5(+)；11:M6(-)；12:M6(+)；其中(-)为阴性对照组，(+)为实验组。

上述其中酶液稀释10倍反应10s代表将实施例3制得酶液稀释10倍后反应10s，其余为实施例3制得酶液进行反应10s，10min，1h，4h，24h，48h。

结果如图10所示，本申请所述的重组β-甘露聚糖酶rMan01929：

(1)图10(A)可知，可以降解M4、M5、M6，不能降解M3、M2、M；降解M6或M5产生M4、M3、M2以及少量M；降解M4产生M3、M2以及少量M，且M4不能被彻底降解。

(2)图10(B)可知，降解M5时，生成模式可分为M&M4或者M2&M3；

(3)图10(C)可知，降解M6时，生成模式为M&M5、M2&M4以及M3&M3，且以M2&M4这种模式为主。

这些结果表明，重组酶rMan01929降解甘露寡糖时：最小底物是M4，最小产物M1。上述结果还表明，随着底物的增大，寡糖最小产物相应增大，因此甘露聚糖酶Man01929具有典型的可变的底物内切模式。

实施例13

重组β-甘露聚糖酶rMan01929酶切模式的荧光-高效液相色谱(HPLC)分析

取含10μg系列甘露寡糖(M-M6)底物溶液，分别旋转蒸干。加入含过量邻氨基苯甲酰胺(2-AB)、氰基硼氢化钠sodium cyanoborohydride的二甲亚砜(DMSO)溶液，混匀后置60℃水浴中温育2h。旋转蒸干，加入500μL去离子水溶解样品，将样品与200μL氯仿共振荡，离心，收集上清。继续用氯仿反复抽提，不少于7次，得到还原性末端被荧光标记了的甘露六糖(2AB-M6)、荧光标记的甘露五糖(2AB-M5)、荧光标记的甘露四糖(2AB-M4)、荧光标记的甘露三糖(2AB-M3)、荧光标记的甘露二糖(2AB-M2)、荧光标记的甘露糖(2AB-M)。

取上述2AB-M6、2AB-M5、2AB-M3、2AB-M2、2AB-M产物、实施例3制得的重组β-甘露聚糖酶rMan01929的稀释液、150mmol/L的NaH₂PO4-Na₂HPO4(pH7.0)缓冲液及水，按照体积比2：1：3：4混匀，置于40℃水浴中反应。将反应体系置沸水浴中10min，转至冰水浴5min，在12,000×g、4℃条件下离心至少15min。收集上清。以预先在沸水浴中加热10min的重组β-甘露聚糖酶rMan01929酶液，做阴性对照反应。

用浓度为0.20mol/L的NH₄HCO₃溶液，平衡Superdex^TM 30 Increase 10/300GL(GE公司，即美国通用电气公司)分子凝胶色谱柱，流速0.40mL/min，至少2柱床。将上述荧光标记的系列甘露寡糖的不同酶解时间的样品，以自动进样器加载20-200ng/样品，其它条件不变，330nm激发波长，420nm发射波长检测。用HPLC操作软件，分析各寡糖组分的积分面积，结合理论分子量大小，计算相对摩尔浓度。

如图11(A)所示，在上述条件下，重组酶rMan01929降解2AB-M6或2AB-M5时，最终主产物均以2AB-M2为主，含有少量2AB-M3；重组酶rMan01929仅能微弱降解2AB-M4，产生2AB-M2；重组酶rMan01929不能降解2AB-M3和2AB-M2。

如图11(B)和(C)所示，由重组酶rMan01929降解2AB-M6、2AB-M5的时间梯度可知：重组酶rMan01929降解2AB-M6或2AB-M5，短时间内即产生2AB-M2产物，随着时间的延长2AB-M2产物逐渐积累，还产生少量2AB-M3，且最终以2AB-M2为主，其中二者摩尔比为6.5:1。

这些结果表明，重组酶rMan01929降解荧光标记的甘露寡糖时：(1)最小底物为2AB-M4，最小产物为M1；(2)从还原端切割糖链，产生2AB-M2&M4；(3)降解模式表现为二糖外切。

实施例14

β-甘露聚糖酶Man01929的三维结构模拟

运用SWISS-MODEL在线网站以PDB号为5y6t的蛋白为模板对β-甘露聚糖酶Man01929进行在线同源建模，分析β-甘露聚糖酶Man01929的催化腔结构。

本申请所述的β-甘露聚糖酶Man01929的三维结构是通过SWISS-MODEL网站以EfMan^[4](PDB号为5y6t)为模板进行同源建模得到β-甘露聚糖酶Man01929的三维结构。

如图12所示，将β-甘露聚糖酶Man01929(简称Man01929)蛋白与甘露六糖M6糖进行分子对接：

(1)Man01929是典型的(β/α)₈TIM桶状结构，属于Clan-A超家族；

(2)Man01929催化腔长度约

(3)一个甘露糖分子长度约

(4)推测Man01929催化腔可容纳5-6个甘露糖单元；

(5)Man01929催化位点为Glu¹⁷²(酸碱催化)和Glu²⁸⁹(亲核催化)是严格保守的。

实施例15

β-甘露聚糖酶Man01929(简称Man01929)与甘露六糖(M6)分子对接

利用Ledock软件将β-甘露聚糖酶Man01929的三维结构与甘露六糖(M6)糖结构进行分子对接，然后通过PyMOL软件分析蛋白质的糖基结合为位点。

如图13所示，按照上述要求，通过PyMOL软件分析Man01929与M6糖配体的潜在作用位点可知：

(1)Man01929与M6配体相距

的氨基酸有：Trp³³、Phe³⁶、Asp¹¹⁸、Met¹¹⁹、Asp¹²⁴、Glu¹⁷²、Phe¹⁸⁰、Trp¹⁸²、His¹⁸⁴、Trp²¹⁸、Ser²¹⁹、Tyr²²¹、His²⁶⁰、Tyr²⁶¹、Tyr²⁶²、Asp²⁶³、Trp²⁶⁴、Glu²⁶⁸、Ile²⁶⁹、Ser²⁷⁰、Glu²⁸⁹、Trp³¹⁸、Trp³²⁰、Glu³²³总计24个氨基酸残基；其中具有潜在的作用的氨基酸有12个(Asp¹¹⁸、Met¹¹⁹、Asp¹²⁴、Glu¹⁷²、Trp¹⁸²、Trp²¹⁸、Ser²¹⁹、Tyr²²¹、Asp²⁶³、Glu²⁶⁸、Ile²⁶⁹、Glu³²³)；

(2)Man01929与M6采用-4至+2的方式与底物结合；

(3)-4亚位点的残基有Asp¹²⁴、Glu³²³，-3亚位点的残基有Met¹¹⁹、Asp¹¹⁸，+2亚位点的残基有Tyr²²¹、Glu²⁶⁸、Ile²⁶⁹。

实施例16

β-甘露聚糖酶Man01929的定点突变

以实施例3制得的重组质粒pET30a-Man01929为模板，进行PCR扩增，扩增引物如表1所示：

表1突变所用的引物

所用定点突变试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司，按照该公司试剂盒中所提供的实验操作步骤，进行定点突变，获得重组质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证，最后得到构建正确的重组质粒pET30a-Man01929-D118A、pET30a-Man01929-D118E、pET30a-Man01929-D118Y、pET30a-Man01929-M119V、pET30a-Man01929-D124A、pET30a-Man01929-D124E、pET30a-Man01929-D124Y、pET30a-Man01929-E172A、pET30a-Man01929-Y221A、pET30a-Man01929-E268A、pET30a-Man01929-I269Y、pET30a-Man01929-E289A、pET30a-Man01929-E323A、pET30a-Man01929-E323D、pET30a-Man01929-E323Y。

按照实施例3，对突变重组质粒进行诱导表达，超声破碎菌体后，离心，转移上清，获得突变后的重组酶突变体的粗酶液D118A、D118E、D118Y、M119V、D124A、D124E、D124Y、E172A、Y221A、E268A、I269Y、E289A、E323A、E323D、E323Y。

实施例17

β-甘露聚糖酶Man01929(简称Man01929)系列突变体的酶活分析

用去离子水配制质量体积浓度(g/mL)为0.3％的魔芋葡甘聚糖和槐豆胶底物，加热溶解后，分别置于40℃和50℃水浴环境中降温1h。向每100μL底物中添加实施例16制得的突变体粗酶液的稀释液10-100μL，不足200μL体积时，用无菌去离子水补足，混匀后继续反应，反应12h。将反应产物在沸水浴中加热10min，转入冰水浴中5min，在12,000×g、4℃条件下离心15min，收集上清。

用DNS-还原糖法测定各反应体系中新生成还原糖的浓度(OD₅₄₀)，并计算平均值，进行偏差分析。对照组为重组酶rMan01929的活性(设定为100％)最大吸收值,相对酶活(RA)定义为：各突变体寡糖产物的吸收值与最大吸收值的百分比。

Man01929的系列突变体降解魔芋葡甘聚糖(图14A)和槐豆胶(图14B)时，如图所示：当-4，-3以及+2亚位点的氨基酸残基突变后发现，-4和-3亚位点氨基酸残基(Asp¹¹⁸、Met¹¹⁹、Asp¹²⁴、Glu³²³)的突变，导致对LBG的活性明显减弱甚至失活，但重组酶突变体对KGM的酶活无明显变化。上述结果表明，β-甘露聚糖酶Man01929与糖链的非还原端具有潜在识别作用的氨基酸残基，不仅可以与底物结合，而且对葡甘聚糖底物具有非常强的底物识别，但对半乳甘露聚糖的识别微弱。

实施例18

β-甘露聚糖酶Man01929系列突变体降解魔芋葡甘聚糖和槐豆胶的产物分析

取实施案例17中β-甘露聚糖酶Man01929系列突变体降解魔芋葡甘聚糖和槐豆胶的产物进行TLC分析。

按照实施例10所述的展开条件，将β-甘露聚糖酶Man01929系列突变体酶解魔芋甘露寡糖和槐豆胶的产物，取2uL检测。按照实施例10所述显色条件，进行显色，然后分析。

结果如图15所示，本申请所述的β-甘露聚糖酶Man01929系列突变体降解魔芋葡甘聚糖(A)和槐豆胶(B)的产物分析可知：下述野生型为未突变的原始酶

(1)与野生型相比，D118A、D118E以及D124Y突变体无论降解KMG还是LBG时，均导致产物的聚合度发生变化，产物的平均分子量变大且主产物变为以四糖以及更大寡糖为主；

(2)突变体D124A、D124E、D124H、E323A、E323D、E323Y降解KGM、LBG的主产物，与野生型相比无明显变化。

上述结果表明，本发明中Man01929的-4亚位点的Asp¹¹⁸和Asp¹²⁴残基参与了底物的定位并影响或决定了寡糖主产物的大小。

实施例19

β-甘露聚糖酶Man01929(简称：Man01929)的D124、D118位点系列突变体降解甘露寡糖的产物分析

取约含20μg系列甘露寡糖(M4-M6)的溶液，150mmol/L的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH7.0)缓冲溶液、实施例16制得的重组β-甘露聚糖酶rMan01929突变体粗酶的稀释液，按照体积比1:1:1混匀，分别在40℃反应24h。将反应体系置沸水浴中10min，转至冰水浴5min，在12,000×g、4℃条件下离心至少15min。收集上清，作为重组β-甘露聚糖酶rMan01929突变体的寡糖降解最终主产物。以pET30a进行TPTG诱导表达后的上清，做阴性对照反应。

按照实施例10所述的展开条件，将重组β-甘露聚糖酶rMan01929突变体粗酶液酶解甘露寡糖(M-M6)的最终主产物样品，取2uL检测。按照实施例10所述显色条件，进行显色分析，然后分析。

结果如图16所示，D124、D118位点突变体降解甘露寡糖时，

(1)图16(A)可知，D118A、D118E和D124Y降解M6时，主产物为M4和M2；

(2)图16(B)可知，D118A、D118E和D124Y降解M5时，主产物为M4和M1；

(3)图16(C)可知，D118A、D118E不能降解M4，D124Y仅能微弱降解M4；

(4)D124A和D124H可以降解M6、M5和M4，但是与Man01929相比，对M4的活性明显减弱；

这些结果表明，Asp¹¹⁸或Asp¹²⁴位点突变为Ala¹¹⁸、Glu¹¹⁸或Tyr¹²⁴后，导致-4亚位点与底物的非还原端结合更加牢靠，不利于对四糖片段的降解，最终导致寡糖主产物发生成分变化。

实施例20

突变体D124Y糖基转移酶活性的分析

取约含20μg甘露寡糖(M4-M6)的溶液，150mmol/L的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(7.0)缓冲溶液、实施例16制得的D124Y突变酶的稀释液，按照体积比1:1:1混匀，分别在40℃反应，隔时取样。将反应体系置沸水浴中10min，转至冰水浴5min，在12,000×g、4℃条件下离心至少15min。收集上清，作为D124Y突变体的寡糖降解产物。以pET30a进行TPTG诱导表达后的上清，做阴性对照反应。

按照实施例10所述的展开条件，将D124Y突变体酶液酶解甘露寡糖(M-M6)的样品，取2uL检测。按照实施例10所述显色条件，进行显色分析，然后分析。如图17所示，D124Y突变体降解甘露寡糖时：

(1)图17(A)可知，降解M6时，主产物为M2和M4，仅少量的M3产生；

(2)图17(B)可知，降解M5时，主产物为M4和M1，少量M2和M3；

(3)图17(C)可知，仅能微弱降解M4，产生少量的M3、M2和M1；

(4)图17(C)可知，降解M4反应24h时，有微量的M5糖产生；通过荧光标记-高效液相色谱检测，进行面积积分计算，表明仅为M4糖的3‰。

这些结果表明：D124Y有糖基转移酶活性。推测其中-4亚位点Asp¹²⁴残基参与调节糖基水解酶和糖基转移酶活性的机制为：当Asp¹²⁴突变为含苯环侧链的Tyr¹²⁴后，导致该区域的电子云密度变大，从而增加了对供体(寡糖产物M2)的吸引力，从而使之利于与受体(寡糖产物M3)的结合，最终使突变体Man01929-D124Y在具有显著糖基水解酶功能的基础上，可发挥微弱糖基转移酶的活性。这与文献已报告的+2亚位点Trp残基可调节转换GH5家族甘露聚糖水解酶-糖基转移酶两种催化机制的机理有所不同：一是亚位点的位置不同，进一步的本发明涉及的是-4亚位点上的Asp¹²⁴突变Tyr¹²⁴；二是文献所说为天然酶，而本发明是通过理性设计后通过定点突变获得的突变体酶。

SEQUENCE LISTING

<110> 济南爱科替维生物科技有限公司

<120> 一种内切型β-甘露聚糖水解酶Man01929及其突变成糖基转移酶的方法及应

用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2799

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcacttt ttgctcatgc tcaagaaaac cgtttaatcg tagaaaagtc tgacggaact 60

aaaacaaaaa tcttcatgaa tggaggcaac ctagcttggg atcaatttgc aaatgatttt 120

ggccctggag cgacaaattt cgattatttt gatgaggtgt tcaccaactt tgaaaatgct 180

ggtggaaact ctatgcgtct ttggatccat attaatggag cgaacaatcc taacttggat 240

ggtaatggca aatgtatagg acttgaagaa agtcatattg aagacatgag aggtgttctc 300

aatttagctt ataatcacaa catcgtttta gtcatgagtt tgtggtcatt tgatatgctt 360

aataatcgtg actaccctct tgaggtttca gaacaagggt ataaaattct gacagaagaa 420

gcgaatgttc aagcgtatat agacaatgca ctaattccaa tggtagaagc ttttaaggat 480

catccggcgg taggtgcttg ggagattttt aacgaacctg aaggtatgag tgatgaattc 540

ggttggtcac atacaagaca tgttcctatg agtgttattc aacgatttgt caaccgttgt 600

acaggtgcaa ttcatagagt tgatcccgaa gcacaagtaa caaatggtac ttggtcgatg 660

tacgctggta cagatattta taattcacaa aatccaattt acaagaatta ttacagcgat 720

ggggagttaa ttaatgcagg tggtgatagc ttaggtgtac tagattttta tcagatacat 780

tattatgact ggatgaataa tgaaatctct gtaatgcatc atcctgcttc ttattggcaa 840

cttgataaac ctatcttggt aggtgagttt tatccattgg atgcaaaagg gatcgcttgg 900

cagacatatc atgatttact ttataactca gaatatgctg gagcgatgtc ttggcaatgg 960

tatggcgaaa aaggacaaat tgaaccttac cgtacaaata tggttgcttt aatggagagc 1020

atcagagatt atccagatat tcagattgaa tcaggaagaa accgtttccc aactatcagt 1080

aaaattgaca atggattatt ttatagaaat gcagatcctg tcagtaatta cgttgattta 1140

gattctatcg ctaatgaccc agataatgat ccactaacat tcagtgtaaa aagtaactcc 1200

aatccaagtt tagtttcggt tagtattaat agcgaaaatc aggtaggatt aagtttcact 1260

tctgaaatgg ttggtgaagc tacaattgtt atagaagtta cagatgcagg tggattaact 1320

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agaactacag tttatagttc ttcaaacgaa ccaggaacct ctacggcaga tcctattttt 1440

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tatgttgatt taggtgctac ttatcaggtt agtcaggtga aactattttg ggaagcagct 1560

tatggccaac gctacgagat acaattaagt gatgatgcca ctaattggac taccgtatac 1620

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ggagctactg attctacttc agtaacgatt gtagtaaacg atcctaacca tccaaatatc 2040

cctcctgtag ccgtaatatc agcaacacct gtttcaggta cagaaccact aactgttagt 2100

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ggagatggta ctacagatac aggtgtagaa gtaagttata cttttaatac aacaggaaca 2220

tatcaagttg tattacttgt tacagataac gaaggtgcat ctgctcaaga tacagttact 2280

attactgtag atccatgggc accttgcgag aatcctactc ctatctctgt gcctttcgtt 2340

aaaaatggtg ctggcgaatt ctgctgggta acatcagaac ctttcccaat tattaattct 2400

tggaatctag atttattaga aatcaatgga gttgatttaa cgaataagta tagtcaagac 2460

attcctaaac caatcaatgg tcagtggaca atccattaca tagggtcatt caattggtca 2520

cactttcata ttgaagctcc aaccactcct atggcagcta ctcaagcaca atctgtgtat 2580

cctaatccat ttacaaatac agtaacagtt gatttaaagg gaacgaatgc ctcaaaagtt 2640

gaactaattg atgaaaacgg tcaagtacta aattcataca gtggagatca attaaattct 2700

gatgaattaa acatagaaat caattcatca ggatcacaat tctttgttcg tatttatagt 2760

ggaaatgaaa ttattgttag gagaatctac aagcaataa 2799

<210> 2

<211> 932

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ala Leu Phe Ala His Ala Gln Glu Asn Arg Leu Ile Val Glu Lys

1 5 10 15

Ser Asp Gly Thr Lys Thr Lys Ile Phe Met Asn Gly Gly Asn Leu Ala

20 25 30

Trp Asp Gln Phe Ala Asn Asp Phe Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Asp

35 40 45

Tyr Phe Asp Glu Val Phe Thr Asn Phe Glu Asn Ala Gly Gly Asn Ser

50 55 60

Met Arg Leu Trp Ile His Ile Asn Gly Ala Asn Asn Pro Asn Leu Asp

65 70 75 80

Gly Asn Gly Lys Cys Ile Gly Leu Glu Glu Ser His Ile Glu Asp Met

85 90 95

Arg Gly Val Leu Asn Leu Ala Tyr Asn His Asn Ile Val Leu Val Met

100 105 110

Ser Leu Trp Ser Phe Asp Met Leu Asn Asn Arg Asp Tyr Pro Leu Glu

115 120 125

Val Ser Glu Gln Gly Tyr Lys Ile Leu Thr Glu Glu Ala Asn Val Gln

130 135 140

Ala Tyr Ile Asp Asn Ala Leu Ile Pro Met Val Glu Ala Phe Lys Asp

145 150 155 160

His Pro Ala Val Gly Ala Trp Glu Ile Phe Asn Glu Pro Glu Gly Met

165 170 175

Ser Asp Glu Phe Gly Trp Ser His Thr Arg His Val Pro Met Ser Val

180 185 190

Ile Gln Arg Phe Val Asn Arg Cys Thr Gly Ala Ile His Arg Val Asp

195 200 205

Pro Glu Ala Gln Val Thr Asn Gly Thr Trp Ser Met Tyr Ala Gly Thr

210 215 220

Asp Ile Tyr Asn Ser Gln Asn Pro Ile Tyr Lys Asn Tyr Tyr Ser Asp

225 230 235 240

Gly Glu Leu Ile Asn Ala Gly Gly Asp Ser Leu Gly Val Leu Asp Phe

245 250 255

Tyr Gln Ile His Tyr Tyr Asp Trp Met Asn Asn Glu Ile Ser Val Met

260 265 270

His His Pro Ala Ser Tyr Trp Gln Leu Asp Lys Pro Ile Leu Val Gly

275 280 285

Glu Phe Tyr Pro Leu Asp Ala Lys Gly Ile Ala Trp Gln Thr Tyr His

290 295 300

Asp Leu Leu Tyr Asn Ser Glu Tyr Ala Gly Ala Met Ser Trp Gln Trp

305 310 315 320

Tyr Gly Glu Lys Gly Gln Ile Glu Pro Tyr Arg Thr Asn Met Val Ala

325 330 335

Leu Met Glu Ser Ile Arg Asp Tyr Pro Asp Ile Gln Ile Glu Ser Gly

340 345 350

Arg Asn Arg Phe Pro Thr Ile Ser Lys Ile Asp Asn Gly Leu Phe Tyr

355 360 365

Arg Asn Ala Asp Pro Val Ser Asn Tyr Val Asp Leu Asp Ser Ile Ala

370 375 380

Asn Asp Pro Asp Asn Asp Pro Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Asn Ser

385 390 395 400

Asn Pro Ser Leu Val Ser Val Ser Ile Asn Ser Glu Asn Gln Val Gly

405 410 415

Leu Ser Phe Thr Ser Glu Met Val Gly Glu Ala Thr Ile Val Ile Glu

420 425 430

Val Thr Asp Ala Gly Gly Leu Thr Ala Ile Ser Glu Phe Asn Ile Ala

435 440 445

Val Arg Glu Ala Gly Thr Gly Asn Leu Ala Leu Phe Arg Thr Thr Val

450 455 460

Tyr Ser Ser Ser Asn Glu Pro Gly Thr Ser Thr Ala Asp Pro Ile Phe

465 470 475 480

Ala Thr Asp Gly Asp Tyr Asn Thr Arg Trp Ser Ser Ala Tyr Glu Asp

485 490 495

Pro Thr Trp Tyr Tyr Val Asp Leu Gly Ala Thr Tyr Gln Val Ser Gln

500 505 510

Val Lys Leu Phe Trp Glu Ala Ala Tyr Gly Gln Arg Tyr Glu Ile Gln

515 520 525

Leu Ser Asp Asp Ala Thr Asn Trp Thr Thr Val Tyr Thr Glu Asn Ser

530 535 540

Gly Asp Gly Gly Glu Asp Asp Ile Ile Phe Pro Ala Ser Ala Ala Arg

545 550 555 560

Tyr Val Arg Met Tyr Gly Val Gln Arg Gly Thr Ser Trp Gly Tyr Ser

565 570 575

Leu Phe Glu Phe Glu Val Tyr Gly Glu Gly Ser Val Asn Gln Ser Pro

580 585 590

Ser Ala Asn Ile Thr Ala Thr Pro Thr Ser Gly Asn Thr Pro Leu Asp

595 600 605

Val Ser Leu Asp Gly Ser Leu Ser Ser Asp Pro Asp Gly Ser Ile Val

610 615 620

Ser Tyr Glu Trp Asn Phe Gly Asp Asn Thr Ala Thr Gly Val Thr Ser

625 630 635 640

Ser Val Arg Tyr Thr Glu Lys Gly Thr Tyr Thr Ile Gln Leu Lys Val

645 650 655

Ile Asp Asp Lys Gly Ala Thr Asp Ser Thr Ser Val Thr Ile Val Val

660 665 670

Asn Asp Pro Asn His Pro Asn Ile Pro Pro Val Ala Val Ile Ser Ala

675 680 685

Thr Pro Val Ser Gly Thr Glu Pro Leu Thr Val Ser Phe Asn Ala Ser

690 695 700

Gly Ser Ser Asp Ser Asp Gly Ser Ile Ala Ser Tyr Asp Trp Asp Phe

705 710 715 720

Gly Asp Gly Thr Thr Asp Thr Gly Val Glu Val Ser Tyr Thr Phe Asn

725 730 735

Thr Thr Gly Thr Tyr Gln Val Val Leu Leu Val Thr Asp Asn Glu Gly

740 745 750

Ala Ser Ala Gln Asp Thr Val Thr Ile Thr Val Asp Pro Trp Ala Pro

755 760 765

Cys Glu Asn Pro Thr Pro Ile Ser Val Pro Phe Val Lys Asn Gly Ala

770 775 780

Gly Glu Phe Cys Trp Val Thr Ser Glu Pro Phe Pro Ile Ile Asn Ser

785 790 795 800

Trp Asn Leu Asp Leu Leu Glu Ile Asn Gly Val Asp Leu Thr Asn Lys

805 810 815

Tyr Ser Gln Asp Ile Pro Lys Pro Ile Asn Gly Gln Trp Thr Ile His

820 825 830

Tyr Ile Gly Ser Phe Asn Trp Ser His Phe His Ile Glu Ala Pro Thr

835 840 845

Thr Pro Met Ala Ala Thr Gln Ala Gln Ser Val Tyr Pro Asn Pro Phe

850 855 860

Thr Asn Thr Val Thr Val Asp Leu Lys Gly Thr Asn Ala Ser Lys Val

865 870 875 880

Glu Leu Ile Asp Glu Asn Gly Gln Val Leu Asn Ser Tyr Ser Gly Asp

885 890 895

Gln Leu Asn Ser Asp Glu Leu Asn Ile Glu Ile Asn Ser Ser Gly Ser

900 905 910

Gln Phe Phe Val Arg Ile Tyr Ser Gly Asn Glu Ile Ile Val Arg Arg

915 920 925

Ile Tyr Lys Gln

930

Claims

1.一种内切型β-甘露聚糖酶Man01929突变酶，其特征在于，氨基酸突变位点为内切型β-甘露聚糖酶Man01929氨基酸序列SEQ ID NO.2的第124位氨基酸，由天冬氨酸突变为酪氨酸。

2.权利要求1所述突变酶的编码基因，其特征在于，所述编码基因为根据权利要求1所述氨基酸的突变位点，在编码基因man01929的核苷酸序列SEQ ID NO.1上进行定点突变后的基因。

3.一种重组表达载体II，其特征在于，包含权利要求2所述突变酶的编码基因。

4.一种重组菌株II，其特征在于，包含权利要求2所述突变酶的编码基因。

5.权利要求2所述突变酶的编码基因、权利要求3所述重组表达载体II、权利要求4所述重组菌株II任一项在制备权利要求1所述内切型β-甘露聚糖酶Man01929突变酶中的应用。

6.权利要求1所述内切型β-甘露聚糖酶Man01929突变酶在揭示GH5家族甘露聚糖酶成员进行糖基水解酶、糖基转移酶两种催化机制的转换调节机理中的应用。