CN103013957B - 几丁质酶chi-x及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种几丁质酶CHI-X及其编码基因与应用。所述蛋白CHI-X是如下（a）或（b）的蛋白质：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有几丁质酶功能的由序列表序列1衍生的蛋白质。本发明所提供的蛋白CHI-X在作为几丁质酶时具有如下优点：可以采用较高的反应温度；具有良好的热稳定性；可以在酸性条件下作用；具有良好的pH稳定性。本发明对现代几丁质产业发展具有重要意义。

Description

几丁质酶CHI-X及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种几丁质酶CHI-X及其编码基因与应用。

背景技术

几丁质酶（EC.3.2.1.14）是一类能催化水解至少含有一个N-乙酰葡萄糖胺基团糖苷键的酶，几丁质酶能水解几丁质生成几丁寡糖、几丁二糖或N-乙酰-D-氨基葡萄糖等。根据其作用位点和酶解产物，可把几丁质酶分为外切几丁质酶（exochitinase）和内切几丁质酶（endochitinase）。内切几丁质酶从几丁质链的任一部位切割，产生几丁质寡聚糖，如Glc(NAG)₂、Glc(NAG)₃等；外切几丁质酶一般又分为几丁二糖酶（EC.3.2.1.29）和N-乙酰基葡萄糖苷酶（EC.3.2.1.30），几丁二糖酶作用于几丁质长链的非还原端端部，水解几丁质生成N-乙酰葡萄糖胺二聚体Glc(NAG)₂。几丁质酶根据其氨基酸序列特征可分成6类，I、II、IV型归于糖基化水解酶的第19家族，主要存在于植物中；III、V型归于第18家族，广泛存在于病毒、细菌、真菌、昆虫、节肢动物、植物和哺乳动物中，其氨基酸序列与19家族缺乏同源性，而N-乙酰葡萄糖胺酶被归于第20家族。

目前发现，自然界中的很多微生物能够合成几丁质酶，从而降解几丁质，产生N-乙酰胺基葡萄糖及几丁寡糖等利用价值较高的衍生物，具有巨大的发展前景。科技的进步为研究利用几丁质提供了越来越多的方法，对几丁质的研究不断加深，范围不断拓广。作为效率高、控制性强且对环境友好的生物酶法处理几丁质将是现代几丁质产业的发展方向。

几丁质资源很丰富，其水解产物应用也十分广泛，但因没有有效的几丁质处理手段而受到极大的限制，作为几丁质工业发展方向的酶法，目前因为几丁质酶活力较低还不能满足工业化生产的需要。因此，发现具有高活力、符合现代生物工程要求的几丁质酶是一项非常有意义的工作。

发明内容

本发明的目的是提供一种几丁质酶CHI-X及其编码基因与应用。

本发明所提供的蛋白CHI-X，来自柠檬酸杆菌（Citrobacter sp.），具有几丁质酶功能，为如下（a）或（b）的蛋白质：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有几丁质酶功能的由序列表序列1衍生的蛋白质。

为了使（a）或（b）中的蛋白CHI-X便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基数	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述蛋白CHI-X可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述蛋白CHI-X的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1）或2）或3）的DNA分子：

1）序列表中序列2所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码具有几丁质酶活性的蛋白的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有几丁质酶活性的蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5% SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1% SDS和1×SSC,0.1% SDS各洗膜一次。

含有以上任一所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体具体可为将所述基因插入载体pET-28a(+)的多克隆位点得到的重组质粒。

本发明保护扩增以上任一所述基因全长或其任意片段的引物对。

本发明保护所述蛋白在降解几丁质或制备几丁质酶中的应用。

在上述应用中，所述几丁质具体为胶体几丁质。

所述胶体几丁质的制备方法如下：将几丁质粉末加入浓盐酸中充分搅拌至糊状，静置后过滤，将滤液缓缓加入到体积百分含量50%乙醇溶液中，边加边剧烈搅拌，静置过夜，获得析出的胶体几丁质。

在上述应用中，所述降解的pH值可为2.0—11.0，或3.0—10.0，或3.0—9.0，或3.0—8.0，或3.0—4.0，或4.0—8.0，或4.0—7.0，或4.0—6.0，或4.0—5.0；具体可为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0或11.0。

在上述应用中，所述降解的温度可为0—80℃，或20—70℃，或30—70℃，或40—70℃，或50—70℃，或50—60℃，或60—70℃；具体可为0℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃或80℃。

实验证明，本发明所提供的蛋白CHI-X，具有几丁质酶活性，其比活力为137.657U/mg，对胶体几丁质的K_m值和V_max值分别为15.44444mg/mL和370.3704μmol/(mg·h)。蛋白CHI-X作为几丁质酶具有如下优点：可以采用较高的反应温度，最适反应温度为60℃，并且在50—60℃间具有较高的活性，保持60.0%以上的活性；具有良好的热稳定性，在60℃预处理120分钟后剩余酶活仍达60%以上；可以在酸性条件下作用，最适反应pH为4，在pH3.0–8.0范围内酶活性可以维持在60%以上；具有良好的pH稳定性，在pH范围为3.0-11.0范围内较稳定，可保持90%以上的酶活。本发明对现代几丁质产业发展具有重要意义。

附图说明

图1为CHI-X蛋白的三维结构预测图。

图2为在大肠杆菌中诱导表达CHI-X蛋白的SDS-PAGE。其中，1为分子量标准，从上至下依次为170kD、130kD、100kD、70kD、55kD、43kD、34kD、26kD、17kD，2为对照菌得到的上清液，3为重组菌得到的上清液。

图3为N-乙酰胺基葡萄糖（GlcNAc）在540nm下的吸光度值标准曲线。

图4为纯化后CHI-X蛋白液的SDS-PAGE。其中，右泳道为纯化后CHI-X蛋白液，左泳道为分子量标准，从上至下依次为170kD、130kD、100kD、70kD、55kD、43kD、34kD、26kD、17kD。

图5为蛋白质组质谱测定目的片段蛋白的氨基酸含量结果。其中，横坐标代表核质比，纵坐标代表相对离子丰度。

图6为CHI-X蛋白作为几丁质酶的最适pH（a）及pH稳定性（b）测定结果。

图7为CHI-X蛋白作为几丁质酶的最适温度（a）及热稳定性（b）测定结果。

图8为不同试剂对CHI-X蛋白作为几丁质酶酶活的影响。其中，*与☆分别表示与5mmol、1mmol对照结果相比在P﹤0.05差异显著，**与☆☆分别表示与5mmol、1mmol对照结果相比在P﹤0.01差异极显著。

图9为不同蛋白酶对CHI-X蛋白作为几丁质酶酶活的影响。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

载体pET-28a(+)：Novagen，GR201023。

大肠杆菌BL21(DE3)：北京全式金生物技术有限公司，CD601-01。

胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶购自sigma公司。

下述实施例中所用的胶体几丁质是按照如下方法制备得到的：取几丁质粉末加入浓盐酸中充分搅拌至糊状，静置后过滤，将滤液缓缓加入到体积百分含量50%乙醇溶液中，边加边剧烈搅拌，静置过夜，获得析出的胶体几丁质，调至相应pH值后再用水或缓冲溶液定容即可。

实施例1、野生菌的获得

一、产几丁质酶菌株筛选

液体培养基：NaNO₃ 1.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，KH₂PO₄ 3g/L，FeSO₄·7H₂O 0.15g,10g/L胶体几丁质200mL。

筛选培养基：NaNO₃ 1.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，KH₂PO₄ 3g/L，FeSO₄·7H₂O 0.15g，琼脂18g/L，10g/L胶体几丁质200ml。

筛选：样品为饲用冰鲜大黄鱼内容物，该大黄鱼为福建省宁德市某养殖基地饲养，饲养试验于2011年11月1日开始，2011年12月14日结束，取样时间为2011年12月21日，4℃条件甘油保存样品。将样品用无菌水进行十倍梯度稀释，取100微升涂布在几丁质酶产生菌筛选培养基上，28℃下培养48h。取单菌落再划线分离纯菌。将得到的其中一个单菌株（命名为菌株P）接入液体培养基，28℃过夜培养，菌种采用500μL菌液和500μL 40%甘油混合，-70℃保藏。

二、菌株的鉴定

提取菌株P基因组DNA，并采用16S rDNA通用引物27F和1492R进行16S rDNA的PCR扩增。

27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

1492R：5’-TACCTTGTTACGACTT-3’。

反应体系：10×PCR buffer 5μL，dNTP mix(2.5mmol/L)4μL、r Taq(5U/μL)0.5μL、27F(25μmol/L)1μL、1492R(25μmol/L)1μL、模板DNA 1μL、ddH₂O补足至体积50μL。

PCR反应条件：95℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min30s，32个循环后；72℃延伸10min。

测序所得16S rDNA基因序列长度约1500bp，在GenBank核酸数据库进行比对，结果与弗氏柠檬酸杆菌菌株UMS5/10（Citrobacter freundii strain UMS5/10)具有较高相似性，判断菌株P属于柠檬酸杆菌（Citrobacter sp.）。

三、几丁质酶的发现

从菌株P中发现一个具有几丁质酶功能的蛋白，将其命名为CHI-X蛋白，其氨基酸序列如序列表的序列1所示。将编码CHI-X蛋白的基因命名为CHI-X基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示。CHI-X蛋白的三维结构预测图如图1所示。

实施例2、CHI-X蛋白的制备

一、重组表达载体的构建

1、合成序列表序列2所示的DNA；

2、以步骤1获得的DNA为模板，用PF和PR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

上述PCR扩增的引物序列如下：

PF:5’-CAGCAAATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGACTAACAGCAAACTGGTAC-3’(下划线为限制性内切酶EcoR I的酶切识别序列)；

PR:5’-GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCCTTCGTAATACCTTTAAAATAGAAC-3’(下划线为限制性内切酶Xho I的酶切识别序列)。

上述PCR扩增的反应条件：95℃预变性5min；94℃ 30sec、60℃ 30sec、72℃ 2min，30个循环；最后72℃延伸10min。

3、用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切载体pET-28a(+)，回收载体骨架（约5300bp）。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pET-28a–P。根据测序结果，对重组质粒pET-28a–P进行结构描述如下：在载体pET-28a(+)的EcoRI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第1至1482位核苷酸所示的双链DNA分子（插入的双链DNA分子的3’末端与载体上的His标签编码基因融合，以便于进行后续的蛋白纯化）。

二、重组菌的构建

将重组质粒pET-28a–P导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有重组质粒pET-28a–P的大肠杆菌BL21(DE3)，命名为重组菌。

将载体pET-28a(+)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有载体pET-28a(+)的大肠杆菌BL21(DE3)，命名为对照菌。

三、CHI-X蛋白的表达和鉴定

1、将步骤二获得的重组菌或对照菌接种至5mL LB液体培养基(含100μg/mL卡那霉素)，37℃、200rpm振荡培养过夜。

2、将步骤1的菌液以1：100的体积比接种至20mL LB液体培养基(含100μg/mL卡那霉素)，37℃、200rpm振荡培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8；然后加入IPTG（诱导剂）至浓度为1mmo/L，20℃、200rpm振荡培养12小时。

3、取步骤2得到的菌液离心并收集菌体，然后将菌体进行超声破碎（功率300W、总工作时间90min，每工作5s间歇8s），12000rpm离心10min，收集上清液。

4、将步骤3得到的重组菌上清液和对照菌上清液进行SDS-PAGE，结果如图2所示。重组菌得到的上清液中具有分子量为54.7kD的预期蛋白条带，而对照菌得到的上清液不显示该蛋白条带。将重组菌得到的54.7kD目的蛋白从SDS-PAGE上切下来，送天津生物芯片技术有限公司进行一级质谱鉴定。结果表明，该蛋白确实为序列表的序列1所示的CHI-X蛋白。

5、将步骤3得到的重组菌上清液和对照菌上清液分别作为待测溶液进行几丁质酶活检测，具体方法如下：

1）制作标准曲线：用pH 7.0的0.2mmol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液将N-乙酰胺基葡萄糖（GlcNAc）配成1mmol/L母液，将母液分别稀释90、70、60、50、40、30倍，获得不同浓度的GlcNAc标准溶液，分别取0.25mL不同浓度的GlcNAc标准溶液于各个试管中，再向各个试管中加入0.25mL pH 7.0的0.2mmol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液制成的10g/L胶体几丁质溶液，再分别准确加入DNS试剂（溶剂为水，溶质及其浓度分别为四水合酒石酸钾钠300g/L、NaOH 16g/L、3,5-二硝基水杨酸10g/L）2ml，沸水浴5min，流水冷却，用水补足到2.5mL，分光光度计测定各管内溶液在540nm波长下的吸光度值（即OD₅₄₀）。制作的标准曲线如图3所示，标准曲线方程为y=23.01x+0.0782（R²=0.9997），y代表溶液中单糖GlcNAc的含量（单位为μmol），x代表OD₅₄₀。

2）根据几丁质酶将胶体几丁质降解为还原糖，还原糖与3,5-二硝基水杨酸在沸水中有显色反应的原理，采用分光光度法检测待测溶液（或其稀释液）的几丁质酶活性。具体操作过程如下：

a反应体系：使用pH 7.0的0.2mol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液稀释待测溶液，并使用pH 7.0的0.2mol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液配制10g/L胶体几丁质溶液，将试管分为对照管和样品管，对照管中加入0.25mL已高温煮沸灭活的待测溶液（或其稀释液）与0.25mL 10g/L胶体几丁质（底物）溶液混匀；样品管中加入0.25mL待测溶液（或其稀释液）与0.25mL 10g/L胶体几丁质（底物）溶液混匀；

b反应条件：温度37℃、水浴1h；

c终止反应并测定OD₅₄₀：每个试管加入2mL DNS试剂以终止反应，沸水浴5min，离心取上清液，采用分光光度计测定OD₅₄₀。

l个几丁质酶酶活单位的定义：在pH4.0、60℃条件下，每小时分解胶体几丁质释放1μmol GlcNAc所需要的酶量，酶活计算公式如下：A=([A_t-A₀]×K+C₀)×4×n；其中，A代表待测溶液的酶活(U/mL)，A_t代表反应后样品管的光吸收值，A₀代表反应后对照管的光吸收值，K代表GlcNAc标准曲线的斜率（23.01），C₀代表GlcNAc标准曲线的截距（0.0782），n代表稀释倍数。

3）结果：步骤3得到的重组菌上清液的几丁质酶酶活为60.23U/mL，步骤3得到的对照菌上清液的几丁质酶酶活为0U/mL。

四、CHI-X蛋白的表达和纯化

1、将步骤二获得的重组菌接种至50mL LB液体培养基(含100μg/mL卡那霉素)，37℃、200rpm振荡培养过夜。

2、将4mL步骤1的菌液接种至200mL LB液体培养基(含100μg/mL卡那霉素)，37℃、200rpm振荡培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8；然后加入IPTG（诱导剂）至浓度为1mmo/L，20℃、200rpm振荡培养12小时。

3、取步骤2得到的菌液离心并收集菌体，然后将菌体进行超声破碎（功率300W、总工作时间90min，每工作5s间歇8s），12000rpm离心10min，收集上清液。

4、将步骤3得到的上清液进行亲和层析（镍柱），采用NTA柱（New England BioLabs,产品目录编号E0001V），其内径为1.5cm，长度为10cm，体积为15mL。

洗脱过程中的缓冲液（pH均为7.6）如下：NTA-0：含20mmol/L Tris-HCl、0.5mol/LNaCl和10g/100mL甘油；NTA-20：含20mmol/L Tris-HCl、20mmol/L咪唑、0.5mol/LNaCl和10g/100mL甘油；NTA-200：含20mmol/L Tris-HCl、200mmol/L咪唑、0.5mol/LNaCl和10g/100mL甘油。

洗脱过程：（1）柱子用10-20mL水平衡，每次加5mL待流净后再加，以后皆同；（2）用NTA-0平衡15-20mL，然后上样5mL步骤3得到的上清液；（3）用5mL NTA-20进行洗脱，以去除杂蛋白；（4）用5mL NTA-200洗脱目的蛋白，收集过柱后的溶液，即为CHI-X蛋白液。

5、将步骤4得到的CHI-X蛋白液装入截留量为14kDa的透析袋（经科宏达生物有限公司，产品货号MD44-14）中封紧，将透析袋放入装有纯水的烧杯中，4℃进行透析处理。

6、将步骤5得到的CHI-X蛋白液进行SDS-PAGE，结果如图4所示，结果表明，亲和层析后得到了电泳纯的CHI-X蛋白。

7、切下步骤6中的目的条带用蛋白质组质谱分析仪（4700 Proteomics Analyzer，ABI）进行质谱测定氨基酸含量，结果如图5所示，结果表明，该目的条带的蛋白确实为序列表的序列1所示的CHI-X蛋白。

采用实施例2的步骤四的经步骤5透析的CHI-X蛋白液进行实施例3、4、5、6的各个实验。

实施例3、CHI-X蛋白作为几丁质酶的性质鉴定

一、最适pH及pH稳定性测定

1、最适pH测定

方法：测定CHI-X蛋白液在不同pH反应条件下的几丁质酶酶活，按实施例2的步骤三中5的方法进行，差异仅在于将该方法中所使用的pH 7.0的0.2mmol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液替换为如下pH值不同的不同缓冲液：

pH2.0或3.0的0.2mmol/L Gly-HCl缓冲液；

pH4.0、5.0、6.0、7.0或8.0的0.2mol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液；

pH8.0或9.0的0.2mol/L Tris-HCl缓冲液；

pH9.0、10.0、11.0或12.0的0.2mol/L Gly-NaOH缓冲液。几丁质酶在pH4.0的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液中反应时酶活最高，将该最高酶活作为100%，计算几丁质酶在其它pH反应体系中的相对酶活（%）。

结果：如图6中的a图所示。采用Gly-HCl缓冲液，pH为2.0时的相对酶活为6.8%，pH为3.0时的相对酶活为61.7%，采用柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液，pH为4.0时相对酶活为100%，pH为5.0时的相对酶活为80.6%，pH为6.0时的相对酶活为74.2%，pH为7.0时的相对酶活为66.4%，pH为8.0时的相对酶活为65.6%，采用Tris-HCl缓冲液，pH为8.0时的相对酶活为64.8%，pH为9.0时的相对酶活为48.8%，采用Gly-NaOH缓冲液，pH为9.0时的相对酶活为43%，pH为10.0时的相对酶活为25.5%，pH为11.0时的相对酶活为12.3%，pH为12.0时的相对酶活为5.3%。

结果表明，CHI-X蛋白作为几丁质酶的最适pH为4，在pH3.0—8.0范围内酶活性可以维持在60%以上，pH在2以下或9以上时酶活较低。

2、pH稳定性测定

预处理：将1体积份CHI-X蛋白液与10体积份不同缓冲液混合，37℃处理60min。分别采用如下缓冲液：pH2.0、3.0的0.2mmol/L Gly-HCl缓冲液、pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的0.2mol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液和pH9.0、10.0、11.0、12.0的0.2mol/LGly-NaOH缓冲液。

方法：将预处理后的蛋白液按实施例2的步骤三中5的方法进行酶活测定，差异仅在于将该方法中所使用的pH 7.0的0.2mmol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液替换为pH4.0的0.2mol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液。

结果：CHI-X蛋白液在使用pH4.0的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液进行预处理时酶活最高，将该最高酶活作为100%，计算采用其它预处理条件下的相对酶活（%），结果如图6中的b图所示。

结果表明，CHI-X蛋白在pH 3.0-11.0范围内较稳定，剩余几丁质酶酶活保持90%以上，说明此酶在酸性、中性及碱性条件下具有较好的pH稳定性。

二、最适温度及热稳定性测定

1、最适温度测定

方法：将CHI-X蛋白液按实施例2的步骤三中5的方法进行酶活测定，差异仅在于差异仅在于将该方法中所使用的pH 7.0的0.2mmol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液替换为pH4.0的0.2mol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液并且采用不同的反应温度（0-80℃）。

结果：反应温度为60℃时酶活最高，将该最高酶活作为100%，计算其它反应温度下的相对酶活（%），结果如图7中的a图所示。在反应温度分别为0、20、30、40、50、60、70、80℃时，相对酶活依次为：5.4%、10.8%、24.4%、39.8%、64.8%、100%、28.9%、16.2%。

结果表明：CHI-X蛋白作为几丁质酶的最适反应温度为60℃，并且在50—60℃间具有较高的活性，保持60.0%以上的活性。

2、热稳定性测定

方法：将CHI-X蛋白液在不同温度（60℃、70℃、80℃）下预处理120分钟，并分别于处理5、20、40、60、80、120分钟时取样按实施例2的步骤三中5的方法进行酶活测定，差异仅在于将该方法中所使用的pH 7.0的0.2mmol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液替换为pH4.0的0.2mol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液并且采用60℃的反应温度。

结果：将不进行预处理的CHI-X蛋白液的酶活作为100%，计算采用各温度预处理的相对酶活（%），结果如图7中的b图所示。

结果表明：CHI-X蛋白在60℃预处理120分钟后剩余酶活仍达60%以上，表明CHI-X蛋白在60℃条件下酶活较稳定。

三、不同金属离子及相关化学试剂对酶活影响的测定

在实施例2的步骤三的5中2）的几丁质酶酶活测定的反应体系中加入不同试剂（金属离子或化学试剂，如图8所示），检测不同试剂对CHI-X蛋白的几丁质酶酶活的影响，差异仅在于将该方法中所使用的pH 7.0的0.2mmol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液替换为pH4.0的0.2mol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液。试剂在反应体系中终浓度为1mmol/L或5mmol/L。以不加入试剂的反应体系作为对照（CK）。

以CK处理组的酶活作为100%，计算各个处理组的相对酶活（%），结果如图8所示。在低浓度（1mmol/L）时，Li⁺、K⁺、Ni⁺、Mn²⁺和Fe³⁺对CHI-X蛋白的几丁质酶酶活有明显的激活作用，Pb²⁺和Ag⁺对CHI-X蛋白的几丁质酶酶活有明显的抑制作用，其中Ag⁺对CHI-X蛋白的抑制作用极为显著，而其它金属离子的影响不明显。在5mmol/L浓度下，Mn²⁺和Co²⁺对CHI-X蛋白的几丁质酶酶活有明显的激活作用，Cr³⁺、Pb²⁺、Fe³⁺、Ag⁺和SDS对CHI-X蛋白的几丁质酶酶活有明显的抑制作用。

四、抗蛋白酶能力测定

预处理：将1体积份CHI-X蛋白液与10体积份不同蛋白酶溶液混合，37℃处理60min。所用蛋白酶溶液的浓度为1mg/mL。分别采用如下蛋白酶溶液：胃蛋白酶（pH2.0）、胰蛋白酶（pH 7.0）、糜蛋白酶（pH 8.0）。设置不进行上述预处理的对照（CK）。

方法：将预处理后的CHI-X蛋白液按实施例2的步骤三中5的方法进行酶活测定，差异仅在于采用pH4.0的0.2mol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液替换pH 7.0的0.2mmol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液。

结果：以CK处理组的酶活作为100%，计算各个处理组的相对酶活（%），结果如图9所示。CHI-X蛋白经胃蛋白酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶处理后仍具有80%以上的几丁质酶活性，说明该酶具有良好的蛋白酶抗性。

实施例4、CHI-X蛋白作为几丁质酶对不同底物特异性的测定

方法：将CHI-X蛋白液作为待测溶液按实施例2的步骤三中5的方法进行酶活测定，差异如下：（1）采用不同底物进行酶活反应，不同底物分别为：胶体几丁质溶液、几丁质粉末、虾壳几丁质粉末、β-1,3-1,4-葡聚糖、羧甲基纤维素或乙二醇壳聚糖；（2）采用pH4.0的0.2mol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液替换pH 7.0的0.2mmol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液。

结果：CHI-X蛋白只对胶体几丁质溶液有降解作用，具底物特异性强的特点。

实施例5、CHI-X蛋白作为几丁质酶的动力学常数测定

1、将CHI-X蛋白液作为待测溶液按实施例2的步骤三中5的方法进行酶活测定，差异如下：（1）采用pH4.0的0.2mol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液替换pH 7.0的0.2mmol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液；（2）依次在反应10、20、40、60、80、100、120min时终止酶活反应。

通过计算酶活性与反应时间的比值大小，如该酶在某个时间段内比值不变时，则在该时间段内的酶促反应为一级反应，来确定此时间内为测K_m和V_max的反应最佳时间。

根据确定的一级反应时间，测定CHI-X的K_m值及V_max的反应时间为60min。

2、将CHI-X蛋白液作为待测溶液按实施例2的步骤三中5的方法进行酶活测定，差异如下：（1）采用pH4.0的0.2mol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液替换pH 7.0的0.2mmol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液；（2）依次采用10g/L、8g/L、6g/L、4g/L、3g/L、2g/L的胶体几丁质溶液为底物；（3）采用步骤1确定的反应时间（即60min）。

通过上述不同的底物浓度[S]测定相对应的反应速度V，求出两者的倒数，以1/V对1/[S]作图，即采用米氏方程双倒数方法（方程如下）求得K_m值及V_max：

$\frac{1}{v}=\frac{K_m}{V_{\max }}\×\frac{1}{\left[S\right]}+\frac{1}{V_{\max }}$

结果：CHI-X蛋白对胶体几丁质的K_m=15.44444mg/mL，V_max=370.3704umol/(mg·h)。

实施例6、CHI-X蛋白作为几丁质酶的比活力测定

比活力单位的定义为：每毫克酶蛋白所含的酶活力单位。

方法：将CHI-X蛋白液作为待测溶液按实施例2的步骤三中5的方法进行酶活测定，差异为采用pH4.0的0.2mol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液替换pH 7.0的0.2mmol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液。通过Bradford蛋白定量试剂盒（天根生化科技(北京)有限公司，产品目录编号PA102）测定CHI-X蛋白液中的蛋白浓度。酶活与蛋白浓度的比值即为CHI-X蛋白的比活力。

结果：以胶体几丁质为底物计算得到CHI-X蛋白的比活力是137.657U/mg。

Claims (15)

1.一种蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。

3.根据权利要求2所述基因，其特征在于：所述基因为序列表中序列2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是将所述基因插入载体pET-28a(+)的多克隆位点得到的。

6.含有权利要求2或3所述基因的表达盒。

7.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。

8.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。

9.权利要求1所述蛋白在降解几丁质或制备几丁质酶中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述几丁质为胶体几丁质。

11.根据权利要求9或10所述的应用，其特征在于：所述降解的pH值为2.0—11.0。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述降解的pH值为3.0—10.0。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：所述降解的pH值为4.0—5.0。

14.根据权利要求9或10所述的应用，其特征在于：所述降解的温度为0—80℃。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于：所述降解的温度为50—60℃。

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