CN110029097B - 一种糖苷水解酶CmNAGase及其克隆表达与应用 - Google Patents

一种糖苷水解酶CmNAGase及其克隆表达与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种糖苷水解酶CmNAGase及其克隆表达与应用。将从土壤中筛到的菌株Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC‑H1进行基因组测序分析、克隆CmNAGase、构建重组菌株、表达CmNAGase蛋白、纯化HIS‑TAG，并鉴定重组蛋白具有糖苷水解酶的性质，在高温环境下仍保证良好的酶活性，属于内切酶，且能分别向几丁二糖、几丁三糖、几丁四糖、几丁五糖和几丁六糖的糖链转移一个乙酰氨基基葡萄糖使其糖链长度增加，可通过酶工程、合成生物学对其进行分子改造使该酶的酶促反应的方向朝增加糖链的方向进行，为人工合成几丁寡糖奠定基础。

Description

一种糖苷水解酶CmNAGase及其克隆表达与应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种糖苷水解酶CmNAGase及其克隆表达与应用。
背景技术
几丁质又称甲壳素、壳多糖，是由N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接的聚合物，是地球上除纤维素外含量最高的多聚糖。几丁质广泛存在于虾蟹壳、昆虫的外骨骼和真菌细胞壁中，其最终水解产物N-乙酰氨基葡萄糖可以保护软骨组织及骨关节。几丁质酶可以防治植物的真菌类病害，在食品、医药、农业以及化妆品等行业具有广泛应用。
以几丁质为底物制备N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）的方法主要可分为是化学法和酶法，目前工业上多采用化学法，即用强碱脱除乙酰基后，再用强酸水解，使其变成可溶性的氨基葡萄糖（GlcN）。然后再利用化学进行接乙酰基，从而合成GlcNAc。化学法存在反应过程控制较难，伴有副产物产生，且产物的生物活性差等缺陷。此外，在生产过程中涉及到大量强酸强碱，对环境污染严重，三废处理成本高。因此，寻找绿色高效的GlcNAc的制备方法具有重要意义。
几丁质酶是能专一水解几丁质生产GlcNAc及几丁寡糖的糖苷水解酶，因其反应条件温和、控制性强、产物生物活性好且绿色环保，这种生物酶法处理几丁质将成为现代几丁质产业发展方向，具有巨大的发展前景。几丁质酶包括内切几丁质酶（EC 3.2.1.14），外切几丁质酶（EC 3.2.1.20）和EC 3.2.1.201）和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAGases，EC3.2.1.52）。几丁质酶将几丁质水解为几丁寡糖，β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶将几丁寡糖降解为GlcNAc。
GlcNAc已广泛用于生产唾液酸、生物乙醇和单细胞蛋白质；在医药领域可以作为肠胃炎、骨关节炎的药物，还可应用于癌症诊断。NAGases除了水解N-乙酰基几丁寡糖外，其在细胞O-连接的GlcNAc调节数千种细胞内蛋白质的功能，包括在信号转导，基因表达，细胞周期和蛋白酶体降解中起重要作用 。
氨基酸序列同源性的比较结果显示NAGases属于糖苷水解酶（GH）3,20,73,84和85个家族（http://www.cazy.org /）。本发明的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶属于糖苷水解酶GH20家族。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种糖苷水解酶CmNAGase及其克隆表达与应用，该β-N -乙酰氨基葡萄糖酶水解几丁寡糖作用，并具有转糖基的作用。
一种糖苷水解酶CmNAGase，其氨基酸序列如SEN ID NO：2所示。
作为改进的是，编码所述氨基酸序列的核苷酸序列如SEN ID NO：1所示。
一种重组表达载体，含有所述编码糖苷水解酶CmNAGase基因的核苷酸序列的重组表达载体。
一种重组菌，含有上述糖苷水解酶CmNAGase基因的表达载体的重组菌。
一种糖苷水解酶CmNAGas基因的克隆表达， 包括以下步骤：
步骤1， PCR扩增SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
步骤2，构建重组质粒pET-28a(+)- Cmnagase
将PCR扩增的DNA序列和pET-28a(+)载体用同样的限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切，酶切产物经回收纯化，用T4DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到质粒载体pET-28a(+)- Cmnagase；
步骤3，将重组质粒pET-28a(+)- Cmnagase导入大肠杆菌BL21（DE3），得到含有重组质粒pET-28a(+)- Cmnagase的大肠杆菌BL21（DE3），命名为重组菌；
步骤4，挑选重组菌的单克隆，摇床过夜培养后，加入诱导剂诱导培养，收集菌液，离心后，收集沉淀；
步骤5，向沉淀中加入缓冲液重悬菌株，再超声裂解后，离心，收集上清后冷冻备用。
作为改进的是，步骤1中PCR扩增所用的引物为CmF-5’-CATATGATGAGCCGTCCCGCCGGATC-3’和CmR-5’- CTCGAGTCAGGCGCCCACCTGCACCG-3’。
上述糖苷水解酶CmNAGase在水解几丁寡糖上的应用。
作为改进的是，上述应用中糖苷水解酶CmNAGase的反应温度25~55°C、pH5.0~7.5。
作为改进的是，所述几丁寡糖为几丁二糖、几丁三糖、几丁四糖、几丁五糖或几丁六糖。
有益效果：
与现有技术相比，本发明糖苷水解酶CmNAGase即β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶高效水解几丁寡糖，对对硝基苯酚-N-乙酰氨葡萄糖的比活力为487 U/mg，最适温度40°C、最适pH5.4，在pH5.4~7.5时96 h后相对活力保持在70%以上。本发明的酶属于内切糖苷酶，并且具有一定转糖基的作用，它能分别向几丁二糖、几丁三糖、几丁四糖、几丁五糖和几丁六糖的糖链转移一个乙酰氨基葡萄糖使其糖链长度增加，在本发明的基础上，可以通过酶工程、合成生物学对其进行分子改造促使该酶促反应朝增加糖链长度的方向进行，最终可以实现人工合成几丁寡糖。
附图说明
图1为糖苷水解酶CmNAGase的保守结构域示意图；
图2为糖苷水解酶CmNAGase的SDS-PAGE图，其中，M为蛋白maker从上至下分别是180kDa，140 kDa，100 kDa，75 kDa，60 kDa，45 kDa，35 kDa，25 kDa，1为重组菌株诱导表达后的粗酶条带，2为粗酶浓缩后条带，3为纯化后的条带；
图3为本发明中温度对糖苷水解酶CmNAGase活性的影响，其中，（A）为最适温度，（B）为温度稳定性；
图4为本发明中pH对糖苷水解酶CmNAGase活性的影响，其中，（A）为最适pH，（B）为pH稳定性；
图5为酶CmNAGase的水解模式示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步描述，但不用于限制本发明的保护范围。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实例中所用到的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
菌株来源
（1）本发明所用用菌株 C. meiyuanensis SYBC-H1 由本实验室筛选并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC 3438）和美国典型微生物菌种保藏中心（ATCCBAA-2140）。
实施例2 克隆糖苷水解酶基因CmNAGase
(1)糖苷水解酶CmNAGase的基因，其核苷酸序列如SEN ID NO：1所示。
(2)设计PCR扩增引物CmF-5’- CATATGATGAGCCGTCCCGCCGGATC-3’和CmR-5’-CTCGAGTCAGGCGCCCACCTGCACCG-3’扩增出该基因的全长。
(3)上述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5 min；94°C 30sec、65℃ 30sec、72°C40sec，30个循环；最后在72°C下延伸10min。
(4)用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。
(5)用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切载体pET-28(+)a，回收载体骨架（约5400bp）。
(6)向上述步骤的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pET-28a(+)-Cmnagase。
实施例3 糖苷水解酶CmNAGase基因的克隆表达，包括以下步骤：
(1)将重组质粒pET-28a(+)-Cmnagase导入大肠杆菌BL21（DE3），得到含有重组质粒pET-28a(+)-Cmnagase的大肠杆菌BL21（DE3），命名为重组菌。
(2)挑选重组菌（表达含有His标签pET-28a(+)-Cmnagase）的单克隆，接至含100 μg/mL的卡那霉素5 mL LB培养基在37°C、200 rmp的振荡摇床中过夜培养。
(3)将上述菌液以1:100的体积比接种至100 mL LB含100 μg/mL卡那霉素的液体培养基，37°C、200 rmp的振荡培养至OD600达到0.6-0.8；
(4)然后加入IPTG（诱导剂）至浓度为1mmol/L，20°C、200rmp振荡培养20h。
(5)收集上述菌液到离心管中，4°C，6000 rmp/min离心10min，弃上清，收集沉淀。
(6)向细菌沉淀中加入10 mLPBS缓冲液重悬菌体。
(7)冰上超声裂解细菌。超声功率为300W，每次超声处理2s，间隔3s，共超声处理10min。
(8)4°C，6000 rmp/min离心10 min，收集细菌裂解液上清，并置于冰上。
(9)收集的上清液用AKTA蛋白纯化系统和该公司的HIS-TAG柱重组蛋白进行蛋白纯化。纯化后的重组蛋白溶液进行SDS-PAGE，获得85 kDa的蛋白条带(结果如图2所示）,且酶活力为487 U/mg。
实施例4 糖苷水解酶CmNAGase的即N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的鉴定
利用4-甲基伞形酮-N-乙酰-D葡萄糖胺可以定性的检测糖苷酶的活性，其在紫外下具有荧光。将所纯化得到的的纯酶与4-甲基伞形酮-N-乙酰-D-葡萄糖胺，以体积比1:10的比例反应，在波长450 nm处4-甲基伞形酮具有荧光。根据是否在450 nm处是否具有荧光可判定其是否具有活性。
实施例5 重组酶糖苷水解酶CmNAGase的的最适反应温度的测定
（1）以对硝基苯酚-N-乙酰氨基葡萄糖 (pNP -(GlcNAc))为底物时，酶活力通过测量释放的对硝基苯酚的量来的量来计算。1 μL的CmNAGase酶加到1 mL 的0.25 mmol/L p-NP -(GlcNAc)溶液在 pH为 5.4的底物在40°C反应10 min，加入1mL NaOH (0.5 mol/L)以终止反应。酶活力定义为40°C每分钟酶生成1μmol pNP -(GlcNAc)的酶量。
（2）蛋白含量测定参考考马斯亮蓝法，测得蛋白浓度为1.21g/L。
（3）在反应温度分别为：25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C时，测定CmNAGase的酶反应速率。结果为3次重复取平均值。
（4）结果如图3（A）所示，反应温度为40°C时酶活力最高41.51 U，以最高酶反应速率计为100%，计算其余酶活力作图。
实施例6 重组酶糖苷水解酶CmNAGase的温度稳定性的测定
（1）将CmNAGase的蛋白液分别置于25°C、30°C、35°C、40°C下孵育12 h。
（2）利用对硝基苯酚-N-乙酰氨基葡萄糖 (pNP -(GlcNAc))为底物，在40°C时，酶的添加量、反应时间都相同时加入1mL NaOH (0.5 mol/L)以终止反应，测定酶CmNAGase在1~12 h的剩余活力。酶活力定义为40°C每分钟酶生成1μmol pNP -(GlcNAc)的酶量。
（3）蛋白含量测定参考考马斯亮蓝法，测得蛋白浓度为1.21g/L。
（4）将不进行孵育的CmNAGase蛋白液的酶活力计为100%，计算各个个温度预处理的相对酶活（%），结果如图3（B）所示。
（5）结果表明：CmNAGase在处理2小时后，25°C、30°C、35°C、40°C分别为未预处理的酶反应速率的91%、89%、88%、20%。温度大于等于最适温度即40°C时稳定性急剧下降。
实施例7 重组酶糖苷水解酶CmNAGase的最适pH的测定
（1）以对硝基苯酚-N-乙酰氨基葡萄糖 (pNP -(GlcNAc))为底物，1 μL的CmNAGase酶加到1 mL 的0.25 mmol/L p-NP -(GlcNAc)溶液,在pH=3.4-9.0的缓冲液中在，40°C下反应10min，加入1mL NaOH (0.5 mol/L)以终止反应测定酶反应。所用缓冲液分别为：pH=3.0-6.0时，缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠，pH=6.0-8.0时，缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，pH=8.0-9.0时，缓冲液为Tris—HCl，pH=9.0-10，缓冲液甘氨酸-氢氧化钠。
（2）酶活力定义为40°C每分钟酶生成1μmol pNP -(GlcNAc)的酶量。
（3）蛋白含量测定参考考马斯亮蓝法，测得蛋白浓度为1.21g/L。
（4）pH为5.4时酶活力45.38 U，将最高酶反应速率计为100%，其他pH下的反应速率除以最高反应速率得到相对应的相对反应速率，结果如图4（A）所示。
（5）结果表明CmNAGase作为糖苷水解酶的最适pH为5.4，在pH=5.0~7.0范围内活性较高。
实施例8 重组酶糖苷水解酶CmNAGase的pH稳定性测试
（1）将CmNAGase蛋白液与不同pH的缓冲液按照等体积混合，25℃孵育12小时；当所用缓冲液分别为pH=3.0-6.0时，缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠，pH=6.0-8.0时，缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，pH=8.0-9.0时，缓冲液为Tris—HCl，pH=9.0-10，缓冲液甘氨酸-氢氧化钠；
（2）将上述预处理后的蛋白液，以0.25 mmol/L对硝基苯酚-N-乙酰氨基葡萄糖(pNP -(GlcNAc))为底物，在40°C，pH5.4，以相同的加酶量1μL反应时间10 min加入1mLNaOH (0.5 mol/L)以终止反应，测定各个时间的剩余活力；
（3）酶活力定义为40°C每分钟酶生成1μmol pNP -(GlcNAc)的酶量；
（4）蛋白含量测定参考考马斯亮蓝法，测得蛋白浓度为1.21g/L；
（5）结果如图4（B）所示，CmNAGase蛋白液保存于pH为5.4、6.0、6.5、7.0、7.5时相对活力（计算方法同实施例6）依次为：76.4%、87.3%、81.9%、70.9%、80.1%；
（6）结果表明CmNAGase蛋白液在pH5.4-7.5范围内较稳定。说明其在中性条件下具有较好的pH稳定性。
实施例9 重组酶糖苷水解酶CmNAGase的水解模式的测定
（1）将购买的的几丁寡糖（GlcNAc）2-6标准品配制成10 g/L的水溶液；
（2）使用上述（1）中的几丁寡糖为底物，通过高效液相色谱（HPLC），采用ALLTECH的Prevail Carbohydrate ES 5u色谱柱分析结果；
（3）流动相成分为乙腈和甲醇，梯度洗脱条件为：0min，75%乙腈，7min，75%乙腈；8min，65%乙腈；15min，65%乙腈；16min，75%乙腈；22min，75%乙腈。柱温箱温度为40°C，流速为1mL/min。
（4）结果如图5所示，酶CmNAGase从糖链的非还原性末端逐一切割糖链，可作用的底物（GlcNAc）2-6，最终产物为N-乙酰氨基葡萄糖，其中对几丁二糖和几丁三糖的切割效率比较高。并能分别向几丁二糖、几丁三糖、几丁四糖、几丁五糖和几丁六糖的糖链转移一个乙酰氨基葡萄糖使其糖链长度增加。
因此，本发明的酶催化的酶促反应，它能分别向几丁二糖、几丁三糖、几丁四糖、几丁五糖和几丁六糖的糖链转移一个乙酰氨基葡萄糖使其糖链长度增加，在本发明的基础上，可以通过酶工程、合成生物学对其进行分子改造使该酶的酶促反应的方向朝增加糖链的方向进行，最终可以人工合成几丁寡糖。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种糖苷水解酶CmNAGase及其克隆表达与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2511
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagccgtc ccgccggatc gcagctgaag ctcagctggg aatgcgtttc caaccactac 60
gacggcgaca ccttcctcgc ccgcctgacg ctgaccaacc actcggatgc gccgttgacg 120
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tacttcgatc tggcctacga aaaggacccg aaggagcccg gctactactg gggtggcttc 1920
atcaacaccc gcaaggccta cgaattctgc ccgctcgaca tctacaccac ggccacgctc 1980
aacctgttcg gccatgacct tggcgattcg ctgaaggaca aggcccgcct caccgccgag 2040
ggcaccaaga acgtgatcgg cttgcagggc gaattgtggg cggagaatgc tcgtagtagc 2100
gcccgcgtcg agcaccttgc catgccgcgc atcatcgcgc tgggcgagcg cgcatgggcc 2160
aaggatccgg gctggacctt catcgccgac aaggccgcgc gcgatgcgaa gatggacgcc 2220
gactggaacc agttcgccaa ccgccttggt cagcgcgaac tggcacggct ggacggtttc 2280
ctcggcggct atggctaccg cgtaccggtg ccgggcgcaa agctggaagg cggcaagctc 2340
tacgccaacc tcgaaagccc aggcctgacg ctgcgctaca ccaccgatgg cagcgaaccg 2400
actgctgcct cgtccgccta caccggtccg gtggcggtca gcggcacggt gaccatcgcg 2460
gctttcacca gcaccaaccg tcgcggtcgc gcggtgcagg tgggcgcctg a 2511
<210> 2
<211> 836
<212> PRT
<213> 氨基酸(Abies alba)
<400> 2
Met Ser Arg Pro Ala Gly Ser Gln Leu Lys Leu Ser Trp Glu Cys Val
1 5 10 15
Ser Asn His Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Leu Ala Arg Leu Thr Leu Thr
20 25 30
Asn His Ser Asp Ala Pro Leu Thr Gly Thr Asp Trp Ala Leu Tyr Phe
35 40 45
Asn Thr Cys Arg Lys Ile Lys Pro Glu Thr Val Thr Gly Gly Val Ala
50 55 60
Thr Ser His Val Asn Gly Asp Leu Ser Lys Leu Thr Pro Thr Ala Glu
65 70 75 80
Phe Gly Thr Leu Ala Pro Gly Glu Thr Arg Val Ile Glu Tyr Ile Gly
85 90 95
Ile Phe Trp Val Ile Gln Glu Thr Asp Ala Pro Leu Gly Phe Tyr Ile
100 105 110
Val Tyr Gly Asp Gly Ser Thr Thr Ala Arg Ala Glu Ala Ile Gly Asp
115 120 125
Pro Thr Ile Val Pro Phe Val Arg Pro Glu Gln Arg Asn Arg Ser Leu
130 135 140
Ala Asp Lys Val Pro Leu Ala Thr Pro Glu Ser Arg Tyr Ala Asp Asn
145 150 155 160
Glu Gln Leu Thr Leu Leu Pro Ala Gly Glu Val Gly Lys Ile Thr Pro
165 170 175
Thr Pro Leu Glu Ala Ser Tyr Gly Asn Gly Thr Phe Val Ile Asp Arg
180 185 190
Asp Thr Leu Val Val Phe Pro Ala Glu Leu Ala Ala Glu Ala Ala Phe
195 200 205
Leu Arg Gln Ser Leu Lys Asp Leu Thr Gly Ala Asp Phe His Gly Ala
210 215 220
Ser Ala Gly Lys Gly Ile Val Leu Lys Leu Gly Lys Ile Asp Val Ala
225 230 235 240
Glu Thr Gly Ala Leu Ala Glu Ala Tyr Thr Leu Ala Val Asn Ala Gly
245 250 255
Gly Val Glu Ile Val Gly Asn Ser Pro Ala Gly Val Phe Asn Gly Ile
260 265 270
Gln Ser Leu Arg Gln Leu Leu Pro Val Ala Ala Trp Thr Asn Pro Gln
275 280 285
Ala Val Leu Ala Val Pro His Val Gln Val Lys Asp Ala Pro Arg Phe
290 295 300
Ala Tyr Arg Gly Met His Leu Asp Val Gly Arg Asn Phe Ser Ser Lys
305 310 315 320
Glu Thr Val Leu Arg Leu Leu Asp Cys Met Ala Leu Tyr Lys Leu Asn
325 330 335
Gln Phe His Phe His Leu Thr Asp Asp Glu Gly Trp Arg Leu Glu Ile
340 345 350
Pro Thr Leu Pro Glu Leu Thr Glu Ile Gly Ser Lys Arg Gly Phe Thr
355 360 365
Ile Asp Glu Arg Asp Asn Leu Val Pro Cys Phe Gly Ser Gly Ala Glu
370 375 380
Val Glu Gly Ser His Gly Thr Gly Tyr Tyr Ser Arg Ala Asp Phe Ile
385 390 395 400
Glu Ile Leu Lys Phe Ala Thr Ala Arg His Ile Glu Val Val Pro Glu
405 410 415
Phe Asp Val Pro Gly His Ala Arg Ser Ala Ile Lys Ala Met Asn Val
420 425 430
Arg Tyr Glu Arg Leu Val Lys Ala Gly Lys Gln Ala Glu Ala Glu Gln
435 440 445
Tyr Leu Leu Ala Asp Phe Asp Asp Ala Ser Lys Tyr Glu Ser Val Gln
450 455 460
Leu Trp His Asp Asn Val Ile Cys Ile Ala Met Glu Gly Gly Tyr Asn
465 470 475 480
Phe Ile Glu Thr Val Ile Arg Asp Val Lys Val Met Tyr Asp Glu Ala
485 490 495
Gly Ala Pro Trp Thr Thr Leu His Thr Gly Gly Asp Glu Val Pro Ala
500 505 510
Gly Ala Trp Glu Gly Ser Pro Lys Cys Gln Ala Phe Met Gln Ala Asn
515 520 525
Asn Leu Lys Asn Thr Arg Glu Leu Leu Asp Tyr Phe Leu Gly Arg Tyr
530 535 540
Arg Asp Ile Leu Lys Lys Tyr Asn Leu Thr Phe Gly Gly Trp Glu Glu
545 550 555 560
Ile Ala Leu Thr His Glu His Val Asn Gly Ala Asn Val His Lys Pro
565 570 575
Asn Pro Lys Phe Val Asn Ala Asn Phe Gln Pro Tyr Val Trp Asn Asn
580 585 590
Val Trp Gly Trp Gly Gln Glu Asp Phe Ala Tyr Gln Leu Ala Asn Ala
595 600 605
Gly Tyr Lys Val Val Leu Cys Asn Val Thr Asn Leu Tyr Phe Asp Leu
610 615 620
Ala Tyr Glu Lys Asp Pro Lys Glu Pro Gly Tyr Tyr Trp Gly Gly Phe
625 630 635 640
Ile Asn Thr Arg Lys Ala Tyr Glu Phe Cys Pro Leu Asp Ile Tyr Thr
645 650 655
Thr Ala Thr Leu Asn Leu Phe Gly His Asp Leu Gly Asp Ser Leu Lys
660 665 670
Asp Lys Ala Arg Leu Thr Ala Glu Gly Thr Lys Asn Val Ile Gly Leu
675 680 685
Gln Gly Glu Leu Trp Ala Glu Asn Ala Arg Ser Ser Ala Arg Val Glu
690 695 700
His Leu Ala Met Pro Arg Ile Ile Ala Leu Gly Glu Arg Ala Trp Ala
705 710 715 720
Lys Asp Pro Gly Trp Thr Phe Ile Ala Asp Lys Ala Ala Arg Asp Ala
725 730 735
Lys Met Asp Ala Asp Trp Asn Gln Phe Ala Asn Arg Leu Gly Gln Arg
740 745 750
Glu Leu Ala Arg Leu Asp Gly Phe Leu Gly Gly Tyr Gly Tyr Arg Val
755 760 765
Pro Val Pro Gly Ala Lys Leu Glu Gly Gly Lys Leu Tyr Ala Asn Leu
770 775 780
Glu Ser Pro Gly Leu Thr Leu Arg Tyr Thr Thr Asp Gly Ser Glu Pro
785 790 795 800
Thr Ala Ala Ser Ser Ala Tyr Thr Gly Pro Val Ala Val Ser Gly Thr
805 810 815
Val Thr Ile Ala Ala Phe Thr Ser Thr Asn Arg Arg Gly Arg Ala Val
820 825 830
Gln Val Gly Ala
835
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catatgatga gccgtcccgc cggatc 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcgagtcag gcgcccacct gcaccg 26

Claims (9)

1. 一种糖苷水解酶CmNAGase，其特征在于，其氨基酸序列如SEN ID NO：2所示。
2. 根据权利要求1所述的糖苷水解酶CmNAGase，其特征在于，编码所述氨基酸序列的核苷酸序列如SEN ID NO：1所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述编码糖苷水解酶CmNAGase基因的核苷酸序列的重组表达载体。
4.一种重组菌，含有权利要求3所述的重组表达载体的重组菌。
5.一种如权利要求1所述的糖苷水解酶CmNAGase的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，PCR扩增SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；步骤2，构建重组质粒pET-28a(+)-Cmnagase：将PCR扩增的DNA序列和pET-28a(+)载体用同样的限制性内切酶进行双酶切，酶切产物经回收纯化，用T4DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到重组质粒；pET-28a(+)-Cmnagase；步骤3，将重组质粒pET-28a(+)-Cmnagase导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有重组质粒pET-28a(+)-Cmnagase的大肠杆菌BL21(DE3)，命名为重组菌；步骤4，挑选重组菌的单克隆，摇床过夜培养后，加入诱导剂诱导培养，收集菌液，离心后，收集沉淀；步骤5，向沉淀中加入缓冲液重悬菌株，再超声裂解后，离心，收集上清后冷冻备用。
6.根据权利要求5中所述的制备方法，其特征在于，步骤1中PCR扩增所用的引物为CmF-5’- CATATGATGAGCCGTCCCGCCGGATC-3’和CmR-5’- CTCGAGTCAGGCGCCCACCTGCACCG-3’。
7.基于权利要求5所得糖苷水解酶CmNAGase在水解几丁寡糖上的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，糖苷水解酶CmNAGase的反应温度25~55°C、pH5.0~7.5。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述几丁寡糖为几丁二糖、几丁三糖、几丁四糖、几丁五糖或几丁六糖。
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