CN113774042A - 一种二糖外切型β-甘露聚糖水解酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种外切型β‑甘露聚糖水解酶，该酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。该酶既能降解葡甘聚糖，也能降解半乳甘露聚糖，其最终主产物是还原端以甘露糖单元为主的一系列寡糖。该酶降解纯甘露聚糖时，从非还原端开始，以甘露二糖(M2)为单元持续切割糖链，因此该酶适合专一性制备甘露二糖。此外，该酶的寡糖终产物甘露二糖或甘露糖的摩尔数与底物糖链的摩尔数一致，因此该酶具有分子计数器的功能。

Description

一种二糖外切型β-甘露聚糖水解酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域；具体地说，本发明涉及一种二糖外切型甘露聚糖 酶及其编码基因与应用。

背景技术

半纤维素是构成植物细胞壁的结构多糖，通常与纤维素和木质素紧密结合， 形成木质纤维素生物质。在半纤维素的众多组成类型中，甘露聚糖(mannan)和木 聚糖(xylan)这两种多糖与人们的生活密切相关，它们主要应用于食品、医药、纺 织、制浆造纸以及生物燃料等工业领域。甘露聚糖是自然界中含量第二高的半纤维 素，它是一类具有复杂结构的多糖，根据糖单元组成结构不同，可分四类：纯甘露 聚糖(pure mannan)、葡甘聚糖(glucomannan)、半乳甘露聚糖(galactomannan)以及 半乳葡甘聚糖(galactoglucomannan)。

这些甘露聚糖，除了以甘露糖单元为主成分的共性特征之外，其多糖骨架结 构还具有多种糖单元随机杂聚、局部组成模块化等复杂性特征，且甘露聚糖的侧链 结构也具有类似特征。因此，要想彻底地降解这些聚糖，就需要多种类型酶(酶系) 的协同作用。

相比化学或物理学方法，酶法降解甘露多糖从而制备寡糖的策略，具有因反 应条件温和而可控性强、因底物选择性清晰而产物明确等优点。因此，作为寡糖制 备的工具酶甘露聚糖酶具有重要的研发价值和的经济价值。目前，β-甘露聚糖酶已 广泛应用于食品、动物养殖、造纸、生物燃料和石油钻探等各个领域。在食品行业， β-甘露聚糖酶作为饲料添加剂，可作用于食物中的甘露聚糖，辅助产生甘露寡糖益 生元。在洗涤剂行业中，许多类型的日化产品和食品，如发胶、洗发水、护发素、 牙膏、冰淇淋和烧烤酱等，都含有一定量的甘露聚糖成分作为增稠剂或稳定剂，而 这些成分一旦形成污渍，通常难以去除。如果通过β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖进行 处理，则从难溶多糖变成易溶于水的寡糖片段，从而更容易去除污渍。在造纸业、 纸浆和纸的行业中，使用β-甘露聚糖酶可以促进纸浆中木质素的去除，产生与碱预 处理相当的结果，且可以很大程度上减少环境污染。

目前，虽然关于β-甘露聚糖酶的专利申请及科研文献数量较多，但关于β-甘露 聚糖酶的底物选择机制、多糖/寡糖底物的降解模式、寡糖产物的生成特性，及其 与催化机制的内在联系等基础研究则相对较少。这种不足则造成两方面的行业困 境：(1)目前虽然有一定数量的甘露聚糖酶产品已经实现了产业化和商品化销售， 但可以精确应用的工具酶的数量和类型都极其稀少；(2)酶资源的深入开发与定向 改造缺少指导性的理论和技术借鉴，这在一定程度上限制了工具酶的研发水平。

综上，为满足工具型甘露聚糖外切酶的重要应用需求，亟需从加大酶学新资 源开发、加强酶的核心应用价值与应用特色分析，并探讨分子酶学改造所需新型指 导理论与技术途径等多个角度和层次，全面地开展相关的研究与探索。

发明内容

针对现有技术的不同，本发明提供一种二糖外切型β-甘露聚糖水解酶 Man02066及其编码基因与应用。

在第一方面，本发明提供一种外切型β-甘露聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在优选的实施方式中，所述外切型β-甘露聚糖酶降解含有糖链分支的甘露聚糖或没有糖链分支的线性甘露聚糖；优选地，所述外切型β-甘露聚糖酶降解没有糖链 分支的线性甘露聚糖。

在优选的实施方式中，所述甘露聚糖是葡甘聚糖、半乳甘露聚糖、纯甘露聚 糖；优选纯甘露聚糖。

在优选的实施方式中，所述外切型β-甘露聚糖酶能降解魔芋来源葡甘聚糖(KGM)、槐豆胶来源的半乳甘露聚糖(LBG)；优选地，所述外切型β-甘露聚糖酶的 多糖底物是魔芋来源的葡甘聚糖。

在优选的实施方式中，所述外切型β-甘露聚糖酶仅由一个Glycoside hydrolasefamily 26domain模块组成。

在优选的实施方式中，所述外切型β-甘露聚糖酶降解甘露聚糖的反应温度为 0-40℃，pH为6.0-8.0。

在优选的实施方式中，所述外切型β-甘露聚糖酶降解魔芋葡甘露聚糖(KGM) 和槐豆胶(LBG)的最适温度为40℃，最适pH为6.0。

在优选的实施方式中，所述外切型β-甘露聚糖酶还可以降解甘露寡糖，能降解 的最小底物为甘露三糖(M3)，最小产物为甘露单糖(M)。

在第二方面，本发明提供第一方面所述的外切型β-甘露聚糖酶的编码核苷酸序列。

在具体的实施方式中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含第二方面所述的 核苷酸序列。

在第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含第三方面所述的 表达载体或其基因组上整合有第二方面所述的核苷酸序列。

在优选的实施方式中，所述宿主细胞是用于生产所述外切型β-甘露聚糖酶或用于降解β-甘露聚糖的宿主细胞。

在第五方面，本发明提供第一方面所述的外切型β-甘露聚糖酶在降解甘露聚糖中的应用。

在优选的实施方式中，所述甘露聚糖含有糖链分支的甘露聚糖或没有糖链分 支的线性甘露聚糖；优选地，所述甘露聚糖是没有糖链分支的线性甘露聚糖。

在优选的实施方式中，所述甘露聚糖是葡甘聚糖、半乳甘露聚糖、纯甘露聚 糖；优选纯甘露聚糖。

在第六方面，本发明提供第一方面所述的外切型β-甘露聚糖酶在分析、测定其 原始多糖底物糖链的摩尔数和判断原始底物的奇偶状况中的应用。

在第七方面，本发明提供一种外切型β-甘露聚糖酶，所述外切型β-甘露聚糖酶 是第一方面所述的外切型β-甘露聚糖酶突变体。

在具体的实施方式中，所述外切型β-甘露聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示，但在第188和/或296位发生突变。

在优选的实施方式中，所述外切型β-甘露聚糖酶的氨基酸序列中第188位氨基 酸由谷氨酸突变为丙氨酸，和/或第296位氨基酸由谷氨酸突变为丙氨酸。

在第八方面，本发明提供一种甘露聚糖降解产物，所述降解产物利用第一方 面所述的外切型β-甘露聚糖酶降解甘露聚糖制得。

在优选的实施方式中，所述甘露聚糖是含有糖链分支的甘露聚糖或没有糖链 分支的线性甘露聚糖；优选地，所述甘露聚糖是没有糖链分支的线性甘露聚糖。

在优选的实施方式中，所述甘露聚糖是葡甘聚糖、半乳甘露聚糖、纯甘露聚 糖；优选纯甘露聚糖。

在优选的实施方式中，所述甘露聚糖是魔芋来源葡甘聚糖(KGM)、槐豆胶来 源的半乳甘露聚糖(LBG)；优选地，所述甘露聚糖是魔芋来源的葡甘聚糖。

在第九方面，本发明还提供了所述外切型β-甘露聚糖酶及其突变酶作为工具酶在研究甘露聚糖酶的催化机制中的应用。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为外切型β-甘露聚糖酶Man02066功能模块构成分析结果图；

图2为重组外切型β-甘露聚糖酶rMan02066表达与纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；图中：M、蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为116kDa、66.2kDa、45kDa、 35kDa、25kDa、18.4kDa、14.4kDa；泳道1、对照菌株破壁前菌体，上样量10μL； 泳道2、重组菌破壁前菌体，上样量2μL；泳道3、重组菌的破壁后上清，上样量2 μL；泳道4、经镍柱纯化的rMan02066，上样量2μL；

图3为温度对重组β-甘露聚糖酶rMan02066降解魔芋葡甘聚糖(A)和槐豆胶(B) 活性的影响曲线图；

图4为pH对重组β-甘露聚糖酶rMan02066降解魔芋葡甘聚糖(A)和槐豆胶(B)稳 定性的影响曲线图；

图5为温度对重组β-甘露聚糖酶rMan02066降解魔芋葡甘聚糖(A)和槐豆胶(B) 稳定性的影响曲线图；

图6为pH值对重组β-甘露聚糖酶rMan02066降解魔芋葡甘聚糖(A)和槐豆胶(B) 活性和稳定性的影响曲线图；

图7为金属离子及化学试剂对重组β-甘露聚糖酶rMan02066降解魔芋葡甘聚糖(A)和槐豆胶(B)活性的影响柱形图；

图8为重组β-甘露聚糖酶rMan02066降解魔芋葡甘聚糖(A)和槐豆胶(B)过程中 的寡糖产物TLC分析图；其中A图：横坐标中M，甘露糖-甘露六糖；1，对照；2-10， 分别代表：10s、1min、10min、1h、4h、6h、24h、48h、72h；B图：横坐标 中M，甘露糖-甘露六糖；1，对照；2-9，分别代表：10s、1min、10min、1h、6 h、24h、48h、72h；

图9为用重组β-甘露聚糖酶rMan02066完全降解魔芋葡甘露聚糖(A)和槐豆胶 (B)所制备寡糖片段的¹H-NMR图；

图10为重组β-甘露聚糖酶rMan02066完全降解系列大小甘露寡糖(M-M6)的寡 糖产物TLC分析图；其中A图：横坐标中：A：样品顺序：M：M1-M6；1:M1(-)； 2:M1(+)；3:M2(-)；4:M2(+)；5:M3(-)；6:M3(+)；7:M4(-)；8:M4(+)；9:M5(-)； 10:M5(+)；11:M6(-)；12:M6(+)；其中(-)为阴性对照组，(+)为实验组；B图：横 坐标中：M，M1-M6；1：对照；2：酶液稀释10倍反应10s；3-8：10s、1min、30min、 3h、12h、48h；C图：横坐标中：M，M1-M6；1，对照；2，酶液稀释10倍反应 10s；3-5，10s、1min、48h；

图11为用重组β-甘露聚糖酶rMan02066降解2AB标记的系列大小甘露寡糖 (2AB-M～2AB-M6)最终主产物的分析(A)、不同反应时间降解2AB标记的甘露五糖 (2AB-M5)(B)和2AB标记的甘露六糖(2AB-M6)(C)的寡糖产物的HPLC分析图(荧 光)；

图12为β-甘露聚糖酶Man02066与GH26家族β-甘露聚糖酶多序列比对；

图13为β-甘露聚糖酶Man02066突变体分别降解魔芋葡甘聚糖(A)和槐豆胶 (B)的相对活性分析。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地从火色杆菌属细菌(Flammeovirgayaeyamensis)MY04中获得一种二糖外切型β-甘露聚糖酶Man02066；该酶既可以降 解魔芋葡甘聚糖，也能降解槐豆胶等其它多种多糖底物，并且具有一定的热稳定性 (0-40℃)，从而可用于甘露二糖的专一性制备。在此基础上完成了本发明。

本文利用的所有科学或技术术语具有本发明所属领域的普通技术人员理解的 常规含义。为清晰起见，对本文用到的一些术语或概念定义或解释如下。但提供以 下定义或解释只是为了技术人员更好地理解本发明的实质，并非要以任何方式显示 本发明的保护范围。

β-甘露聚糖酶

本文所用的“β-甘露聚糖酶”具有本领域技术人员常规理解的含义，是指一类 能够水解含有β-1,4甘露糖苷键的甘露寡糖和甘露多糖(包括甘露聚糖、葡甘聚糖、 半乳甘露聚糖以及半乳葡甘聚糖)的水解酶。

根据酶的底物选择性和催化模式的特点，β-甘露聚糖酶又可分为内切型β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)和外切型β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.100)。其中，内切型β-甘露聚 糖酶可以水解甘露聚糖主链内部的β-1,4糖苷键，产生一系列聚合度不同的甘露寡 糖片段；而外切型β-甘露聚糖酶是从非还原链末端连续作用于底物糖链中的β-1,4 糖苷键，切割并产生固定大小的糖单元产物，如甘露二糖。β-甘露聚糖酶广泛存在 于自然界生物体内，包括：动物、植物和微生物。深入研究表明，微生物是生产β- 甘露聚糖酶的主要来源，尤其细菌、真菌和放线菌等。相比之下，动、植物来源的 β-甘露聚糖酶较少，主要分布与豆科植物的种子和软体动物的消化液中。

目前，国内外关于外切型甘露聚糖酶的研究整体较为薄弱，与内切酶相比， 科研文献或专利申请的数量都较少，而且：(1)迄今为止，文献所报道的内切型甘 露聚糖水解酶多达数十上百个，主要归类于碳水化合物活性酶数据库(CAZy， http://www.cazy.org/)所收录的糖基水解酶家族GH5、GH26、GH113或GH34家族， 而外切型甘露聚糖酶只有少数几个，且归类于GH26家族。在GH26家族成员中，已 系统进行鉴定的外切型甘露聚糖水解酶仅有2种，包括来自Bacteroides fragilis NCTC 9343的BfMan26A(K.Kawaguchi,T.Senoura,S.Ito,T.Taira,H.Ito,J.Wasaki, S.Ito,The mannobiose-forming exo-mannanaseinvolved in a new mannan catabolic pathway in Bacteroides fragilis,Arch.Microbiol.196(2014)17-23)和来自Cellvibrio japonicus Ueda107的CjMan26C(K.Kawaguchi,T.Senoura,S.Ito,T.Taira,H.Ito,J. Wasaki,S.Ito,The mannobiose-forming exo-mannanase involved in a new mannan catabolic pathway inBacteroides fragilis,Arch.Microbiol.196(2014)17-23)。相比之 下，GH26家族成员中仍然以内切型甘露聚糖水解酶居多，如Cellvibrio japonicus Ueda107的CjMan26A(Ducros,V.,Zechel,D.L.,Murshudov,G.,Gilbert,H.J.,Szabo, L.,Stoll,D.,Withers,S.G.,Davies,G.J.(2002)Angew Chem Int Ed Engl 41:2824)、 Bacteroides ovatus的BoMan26B(Bagenholm,V.,Wiemann,M.,Reddy,S.K., Bhattacharya,A.,Rosengren,A.,Logan,D.T.,Stalbrand,H.(2019)J Biol Chem 294: 9100-9117)，也有少量催化模式不明确的，如uncultured Bacteroidetes bacterium的 GH26i(Mackenzie AK,Naas AE,KracunSK,et al.A polysaccharide utilization locus from an uncultured bacteroidetesphylotype suggests ecological adaptation and substrate versatility.ApplEnviron Microbiol.2015；81(1):187-195)。因此，要想获得更多工具 酶，亟需加大外切型甘露聚糖酶新资源的发掘力度。(2)其次，分析GH26家族收 录的外切型甘露聚糖酶(EC3.2.1.100)的文献，目前仅知BfMan26A和CjMan26C是严 格从底物糖链的非还原端持续切割二糖单元从而彻底降解甘露聚糖的，且最终寡糖 主产物以二糖为主，因而都是典型的二糖外切型甘露聚糖水解酶。与之不同的是， Bacteroides ovatus的BoMan26A可以从底物糖链非还原端切割二糖或者三糖单元， 且最终以甘露二糖为主产物(

V,ReddyS K,Bouraoui H,et al. Galactomannan Catabolism Conferred by a PolysaccharideUtilization Locus of Bacteroides ovatus ENZYME SYNERGY AND CRYSTAL STRUCTUREOF A β-MANNANASE[J].Journal of Biological Chemistry,2017,292(1):229-243)。然而， 从底物降解模式与寡糖生成特性这两点催化特性进行分析，BoMan26A并不属于严 格型的二糖外切型甘露聚糖酶，且参照本专利申请的发明人对内切酶Man01929的 研究结果，推测BoMan26A应该是一个典型的、具有可变的底物降解模式的内切型 甘露糖水解酶。此外，对Reticulitermes speratus来自的RsMan26H多糖降解模式的研 究还发现，短时间(10min)内以聚合度高的寡糖(DP5-DP20)为主，随着时间(10-30 min)的延长甘露五糖和甘露六糖不断积累，最后(反应30min后)甘露三糖、甘露二 糖、甘露糖不断积累，因而文献将RsMan26H报道为内切型甘露聚糖酶(Tsukagoshi H,Nakamura A,Ishida T,et al.TheGH26 β-mannanase RsMan26H from a symbiotic protist of the termiteReticulitermes speratus is an endo-processive mannobiohydrolase: heterologousexpression and characterization.Biochem Biophys Res Commun.2014； 452(3):520-525)。文献关于uncultured Bacteroidetes bacterium来源的GH26i的催化模 式与寡糖生成特性的结论不清。因此，为获取工具，还需加强对酶的底物降解模式 与寡糖生成特性等酶的核心应用价值与特色的分析与阐释。(3)上述GH26家族5个 甘露聚糖水解酶成员的共同特征是，可以专一性的识别甘露糖-甘露糖(MM)内的糖 苷键，但是它们对底物的识别、结合与降解是否会受到半乳糖基修饰的影响，且关 键活性位点残基的具体贡献仍有待深入研究。

本发明的β-甘露聚糖酶

在本文中，“本发明的外切型β-甘露聚糖酶”、“本发明的β-甘露聚糖酶”、 “本发明的β-甘露聚糖水解酶”、“β-甘露聚糖酶Man02066”、“β-甘露聚糖水解 酶Man02066”等术语具有相同的含义。

在具体的实施方式中，本发明的外切型β-甘露聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明的外切型β-甘露聚糖酶可以降解含有糖链分支的甘露聚糖，也 可以降解没有糖链分支的线性甘露聚糖；但没有糖链分支的线性甘露聚糖是本发明 的外切型β-甘露聚糖酶的最佳底物。

本发明的外切型β-甘露聚糖酶具有一定的温度耐受性，其降解甘露聚糖的反应温度为0-40℃，优选20-40℃；此外，本发明的外切型β-甘露聚糖酶降解甘露聚糖的 pH条件为6.0-8.0。

在具体的实施方式中，本发明的外切型β-甘露聚糖酶降解魔芋葡甘露聚糖 (KGM)和槐豆胶(LBG)的最适温度为40℃，最适pH为6.0。

本发明的外切型β-甘露聚糖酶在降解甘露聚糖底物时，能够以甘露二糖为单 位，从非还原端连续切割糖链直至结束，因此可用于甘露二糖的专一性制备。

本发明的外切型β-甘露聚糖酶还可以用于分析、测定其原始多糖底物糖链的摩尔数和判断原始底物的奇偶状况。

在本发明的外切型β-甘露聚糖酶的基础上，本发明人进一步发现可以所述外切型β-甘露聚糖酶的保守性催化位点，从而为进一步改造该酶奠定了基础。

在具体的实施方式中，本发明的外切型β-甘露聚糖酶的保守性催化位点在第 188和296位。

在优选的实施方式中，所述外切型β-甘露聚糖酶的氨基酸序列中第188位氨基 酸由谷氨酸突变为丙氨酸，和/或第296位氨基酸由谷氨酸突变为丙氨酸可以获得无 活性的突变体。因此，本发明的外切型β-甘露聚糖酶及其突变酶可以作为工具酶研 究甘露聚糖酶的催化机制。

本发明的有益效果

1.本发明首次公开了由火色杆菌属细菌(Flammeovirga yaeyamensis)MY04 获得二糖外切型β-甘露聚糖酶Man02066；

2.该酶Man02066既可以降解魔芋葡甘聚糖，也能降解槐豆胶等其它多种多糖 底物；

3.该酶具有一定的热稳定性(0-40℃)，以及较窄的pH耐受性(6.0-8.0)；

3.该酶在降解系列纯甘露寡糖底物或还原端被荧光标的纯甘露寡糖底物时， 以甘露二糖为单位，从非还原端连续切割糖链直至结束，因此可用于甘露二糖的专 一性制备；

4.本发明确认了该酶的催化位点残基为Glu188(酸/碱催化)与Glu296(亲核催化)，从而为外切型β-甘露聚糖酶的研究奠定了基础；

5.该酶在降解还原端被邻氨基苯甲酰胺标记的系列甘露寡糖底物时，可以从 非还原端连续切割M2糖，直至剩余甘露二糖(2AB-M2)或甘露糖(2AB-M)，且当终 产物是2AB-M2时，所对应的原始底物是偶数糖链，且与之摩尔数相等；而终产物 是2AB-M1时，所对应的原始底物是奇数糖链，且摩尔数与之相等。因此，理论上 该酶或其重组酶，与糖链底物的荧光标记及分析相结合，可用于分析、测定其原始 多糖底物糖链的摩尔数，即用作多糖底物的摩尔计数器，还可以判断原始底物的奇 偶状况。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通 常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份 数按重量计算。

实施例

实验材料来源

火色杆菌(Flammeovirga yaeyamensis)MY04菌株来源于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微 生物研究所，保藏日期2008年11月27日，保藏编号CGMCC NO.2777。

在以下实施例中简称火色杆菌MY04。

实施例中涉及的实验材料未给出具体来源的，均为普通市售产品。

实施例1.火色杆菌MY04菌株基因组DNA的提取

将火色杆菌MY04接种至液体培养基YT04中，在28℃、200rpm的条件下，振 荡培养至600nm吸光值(OD₆₀₀)为1.2；取培养菌液10mL，在12,000×g条件下，4℃ 离心15min，收集菌体沉淀；用10mL的溶菌酶缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.0) 悬浮菌体，在12,000x g，4℃条件下离心15min，收集菌体沉淀。

上述液体培养基YT04，每升组分如下：

胰蛋白胨10g、酵母提取物5.0g、氯化钠30g，用水溶解并定容至1L，pH 7.2。

向上述菌体沉淀中，每管加入溶菌酶缓冲液6.0mL，得到约7.0mL的菌液，分 别加入浓度为20mg/mL的溶菌酶溶液各280μL，使溶菌酶终浓度为800μg/mL；置 于冰水浴中1.0h，然后转移至37℃水浴中，温育2h，至反应体系粘稠；加入浓度 为100mg/mL的十六烷基磺酸钠溶液0.41mL、100mg/mL的蛋白酶K溶液30μL， 在52℃温育1.0h；加入Tris-平衡过的酚/氯仿/异戊醇(体积比25：24：1)溶液7.5mL， 轻轻颠倒混匀；在10,000×g、4℃条件下离心10min，收集上清，并加入1.0mL的 NaAc-HAc(pH 5.2，3.0M)缓冲液，以及8.5mL的无水乙醇，充分混匀；用枪头挑 出丝状DNA，转移至1.5mL的离心管中，以70％乙醇(贮于-20℃)，洗涤2次，微离 心后弃掉上清；在10,000×g、4℃条件下离心2min，彻底弃掉上清；将DNA沉淀于 无菌工作台中风吹干燥，然后用无菌去离子水在4℃过夜溶解DNA样品，制得基因 组DNA。

实施例2.火色杆菌MY04菌株基因组的扫描及其序列分析

本发明人在实施例1制得的火色杆菌MY04菌株基因组DNA中发现一β-甘露聚 糖酶的编码基因man02066，基因man02066的编码区长1137bp，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。基因man02066所编码的β-甘露聚糖酶Man02066共含有378个氨基 酸，其氨基酸序列如SEQID NO:2所示。

实施例3.基因man02066在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中的重组表达

以实施例1制得的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。引物序列如下：

man02066扩增的正向引物

Man02066-F：5’-gcgCATATGGAAGATAAGGCAAAGACACC-3’(SEQ ID NO:3)；

man02066扩增的反向引物

Man02066-F：5’-gcgCTCGAGATTCACTTTCATATTCATCAAATC-3’(SEQ ID NO:4)；

正向引物下划线标注的是限制性内切酶Nde I的专一性位点，反向引物下划线 标注的是限制性内切酶Xho I的专一性位点。

所用高保真DNA聚合酶Prime STAR HS DNA Polymerase购自中国大连宝生物 公司，所用PCR反应试剂按照该公司提供的产品说明进行操作。

PCR反应体系：

2×Primer star GC buffer 5μL，扩增的正向引物0.35μL，扩增的反向引物0.35μL， Template(1ng/μL)1μL，ddH₂O 3.3μL，polymerase 0.1μL，dNTP 0.8μL。

PCR反应条件：

95℃预变性4min；94℃变性40s，60℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环； 72℃延伸10min；4℃稳定10min。

将PCR产物用限制性内切酶Nde I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回 收酶切后的PCR产物。将购于美国Invitrogen公司的产品pET-30a(+)质粒DNA，用 Nde I和XhoI双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。限制性内切 酶Nde I和Xho I均购于中国大连宝生物公司，酶切所用到的酶与底物反应的体系、 温度和时间，均按照该公司提供的产品说明操作。

将经过Nde I和Xho I双酶切的PCR产物，与同样经过双酶切的pET-30a(+)质粒 载体，在DNA连接酶的催化下进行接；连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，涂布于 含有50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani培养基固体平板上，37℃培养16h后，挑取 单克隆；将单克隆接入含有50μg/mL卡那霉素的液体Luria-Bertani培养基中培养， 分离纯化质粒DNA；将该质粒用扩增引物进行PCR验证，结果得到大小为2.8kb的 扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确；接着将该重组质粒进行测序，结果表明， 在pET-30a(+)的Nde I和Xho I酶切位点之间插入SEQ ID NO.1所示的基因 man02066，且插入方向正确，从而进一步证明构建的重组质粒正确。

将正确的重组质粒命名为pE30a-Man02066，转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)(购 自美国Invitrogen公司)，然后按照Invitrogen公司提供的操作步骤，使用终浓度为 0.05mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行重组β-甘露聚糖酶Man02066的诱导表达； 在8,000×g、4℃条件下离心15min，收集菌体，并用缓冲液A重悬菌体，冰水浴环 境中超声破碎。在15,000×g、4℃条件下进一步离心30min，收集水溶性组分，并 用Ni-琼脂糖凝胶对重组β-甘露聚糖酶rMan02066分别进行吸附。用含有咪唑浓度为10、50、100、250、500mM的缓冲液A进行梯度洗脱，纯化条件按照凝胶的产品手 册操作。用聚丙烯酰胺凝变性胶电泳检测重组β-甘露聚糖酶rMan02066的纯化情况。 结果如图2所示：重组质粒pE30a-Man02066在E.coli BL21(DE3)菌株中经IPTG诱导 表达后，产物呈水溶性表达，经镍柱亲和层析纯化后的重组酶rMan02066在电泳胶 上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合；将纯化后的重组酶rMan02066样品 装入最小分子截留量为8-14kDa的透析袋，在4℃环境中对缓冲液A进行透析。所说 缓冲液A的成分是50mM Tris、150mM NaCl，pH 8.0，制得重组β-甘露聚糖酶rMan02066酶液。

实施例4.重组酶β-甘露聚糖酶rMan02066最适温度的测定

用去离子水分别配制质量体积浓度为0.3％(w/v)的魔芋葡甘聚糖和槐豆胶，加热溶解后，分别置于0℃、10℃、20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃、 70℃、80℃水浴环境中温育1h。分别向每900μL底物溶液中添加实施例3制得的重 组β-甘露聚糖酶rMan02066的稀释液100μL，其中重组β-甘露聚糖酶rMan02066的稀 释液浓度为10μg/mL，混匀后继续反应，隔时取样。每个温度条件下3个平行样品， 以沸水浴灭活的重组酶制剂为对照组。

用DNS-还原糖法测定各反应体系中新生成还原糖的浓度(OD₅₄₀)，并计算平均 值，进行偏差分析。最大吸收值对应的反应温度为重组酶的最适温度，相对酶活(RA) 定义为：各吸收值与最大吸收值的百分比。结果如图3所示：以如上所述分别以等 质量体积浓度的魔芋葡甘聚糖(简称KGM)和槐豆胶(简称LBG)为底物测定酶活 时，重组β-甘露聚糖酶Man02066降解KGM和LBG时均在40℃反应时达到最大活力， 这表明该酶降解KGM和LBG的最适反应温度一致，均为40℃。

实施例5.重组β-甘露聚糖酶rMan02066最适pH的测定

分别用浓度为50mM的NaAc-HAC缓冲液、50mM的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲 液、50mM的Tris-HCl缓冲液，分别与魔芋葡甘聚糖和槐豆胶配制质量体积浓度 (g/mL)为0.3％的魔芋葡甘聚糖或槐豆胶底物，所对应的pH值分别为(5、6)，(6、7、 8)，(7、8、9、10)三个区段，各pH值均在最适温度下测定酶活。将各底物置于最 适温度中孵育1h，然后向每900μL底物中添加实施例3制得的重组β-甘露聚糖酶 rMan02066的稀释液100μL，混匀后开始反应，隔时取样。每个pH条件下3个平行 样品，以沸水浴灭活的重组酶制剂为对照组。用DNS-还原糖法测定各反应体系中 新生成的还原糖浓度(OD₅₄₀)，并计算平均值和偏差。相对酶(RA)活定义为：各组 平均吸收值与最大吸收值的百分比。最大吸收值对应的pH为重组酶的最适pH。结果如图4所示：该酶降解KGM和LBG时的最适反应pH均为6.0。

实施例6.重组β-甘露聚糖酶rMan02066的温度稳定性分析

将在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下热处理不同 时间后的实施例3制得的重组β-甘露聚糖酶rMan02066酶液，分别与用蒸馏水配置的 质量体积浓度(g/mL)为0.3％的魔芋葡甘聚糖或槐豆胶，按1:9(体积比)的比例混合， 然后在最适温度下测定残余酶活，以不经过热处理的酶液酶活定义为100％相对活 力。结果如图5所示：重组酶rMan02066在0-40℃温浴24h后，降解KGM时，残余 活性大于75％；降解LBG时，残余活性大于60％。上述结果表明：β-甘露聚糖酶 Man02066在0-40℃下较为稳定。

实施例7.重组β-甘露聚糖酶rMan02066的pH稳定性分析

将实施例3制得的重组β-甘露聚糖酶rMan02066的酶液，在冰水浴、不同的pH (pH5～10)环境中分别预孵育2h后，与质量体积浓度(g/mL)为0.3％、在最适温度 下预处理1h的魔芋葡甘聚糖或槐豆胶底物溶液按1:9(体积比)的比例混合，然后在 最适温度下测定残余酶活，以不经过预处理的酶液的酶活定义为100％，计算相对 活力。结果如图6所示：重组酶rMan02066在pH5.0-10.0的缓冲溶液中预处理2h后， 无论是降解葡甘露糖(KGM)还是槐豆胶(LBG)，当pH小于6.0或大于8.0时均导致 重组酶rMan02066的残余活性急剧下降。上述结果表明：β-甘露聚糖酶Man02066 不耐酸碱变化，易失活。

实施例8.金属离子及化学试剂对重组β-甘露聚糖酶rMan02066活性的影响

将用去离子水配置的质量浓度为0.3％的魔芋葡甘聚糖或槐豆胶底物、实施例3制得的重组β-甘露聚糖酶rMan02066、以及水按5:1:4(体积比)的比例混合后，接着 向反应体系中添加不同的金属离子，添加的离子终浓度为1mM或10mM，然后在 最适条件下反应，按前述的DNS-还原糖法测酶的活力。对照组为不加任何金属离 子时rMan02066的活性(设定为100％)。结果如图7所示：重组酶rMan02066降解 KGM时，(1)10mM的Ag+能显著抑制重组酶rMan02066的活性，相对酶活仅有7％； (2)除Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺还有1mM的Co²⁺、Fe²⁺外，其余二价和三价金属离子均可 以使重组酶rMan02066失活；(3)10mM的EDTA以及1mM或10mM的SDS可以显 著抑制重组酶rMan02066的活性甚至失活。该酶降解LBG时与KGM不同的是：(1)10mM的K⁺可以显著抑制重组酶rMan02066的活性；(2)Co²⁺可使重组酶rMan02066失 活；(3)10mM的DTT可以显著抑制重组酶rMan02066的活性。

实施例9.DNS-还原糖法测定重组β-甘露聚糖酶rMan02066的酶活

将用去离子水配置的质量浓度为0.3％的魔芋葡甘聚糖、槐豆胶、瓜尔胶底物， 浓度为10μg/mL的重组β-甘露聚糖酶rMan02066酶液、最适缓冲液以及水按2:1:3: 4(体积比)的比例混合后，最适温度下反应。将反应产物在沸水浴中加热10min，转 入冰水浴中5min,在12,000×g、4℃条件下离心15min，收集上清；将一定体积的 上清与等体积的DNS(3,5-对硝基二甲苯)-反应液混匀，在沸水浴中加热10min，降 至室温，在540nm测定吸收值。用分析纯的甘露糖作标准品，同样方法操作，绘制 甘露糖的摩尔浓度与OD₅₄₀之间的量效关系曲线。用购于上海生工生物工程有限公 司的蛋白质定量试剂盒测定重组β-甘露聚糖酶rMan02066酶液中的蛋白质含量。按 照国际标准定义计算酶的活力单位，即在标准条件下，每分钟内产生1μmol产物所 需的酶量为1个IU。结果表明：重组β-甘露聚糖酶rMan02066能以魔芋葡甘聚糖或 槐豆胶为底物，酶解并产生还原糖产物，酶活分别为30.67±1.2U/mg和12.44±1.5 U/mg，但是该酶几乎不能降解测试所用的瓜尔胶多糖。

实施例10.重组β-甘露聚糖酶rMan02066降解魔芋葡甘聚糖和槐豆胶的寡糖 产物的TLC分析

用去离子水配制质量体积浓度(g/mL)为0.3％的魔芋葡甘聚糖和槐豆胶底物， 加热溶解后，分别置于40℃和50℃水浴环境中降温1h。向每100μL底物中添加实 施例3制得的重组酶rMan02066的稀释液1-100μL，不足200μL体积时，用无菌去离 子水补足；混匀后继续反应，隔时取样。将反应产物在沸水浴中加热10min，转入 冰水浴中放置5min；在12,000×g、4℃条件下离心15min，收集上清。预先在沸水 浴中灭活的重组β-甘露聚糖rMan02066酶液，做阴性对照反应。

使用薄层色谱(TLC)的方法分析产物，取4uL上清于层析板(TLC Silica 60 F254，德国MERK)，展开剂为正丁醇:乙醇:水体积比为2:1:1，显色剂为二苯胺: 苯胺:磷酸:丙酮＝1g:1mL:5mL:50mL的条件下染色10s，然后在110℃条件下 显色10min，拍照。

图8是重组β-甘露聚糖酶rMan02066降解魔芋葡甘聚糖(A)和槐豆胶(B)过程 中的寡糖产物TLC分析图；

其中A图：横坐标中M，甘露糖-甘露六糖；1，对照；2-10，分别代表：10s、 1min、10min、1h、4h、6h、24h、48h、72h；

B图：横坐标中M，甘露糖-甘露六糖；1，对照；2-9，分别代表：10s、1min、 10min、1h、6h、24h、48h、72h。

结果如图8(A)所示，重组酶rMan02066降解KGM时，短时间内生成一系列寡 糖，随着时间延长48h后，最终以四糖至二糖为主。又如图8(B)所示，重组酶 rMan02066降解LBG时，差异较大，即短时间内寡糖主产物是二糖，且随着时间延 长，二糖产物逐渐积累，最终显著地以二糖为主。综合分析后初步推测：重组酶 rMan02066降解KGM时是二糖外切模式，但由于rMan02066对KGM的活性低以及 KGM主链结构中葡萄糖单元存在，造成酶解过程中会产生一系列不同大小的寡糖 产物，而与重组酶rMan02066降解LBG时的寡糖产物在TLC分析中有一定差异。因 此，重组酶rMan02066在降解KGM、LBG等不同甘露聚糖底物时，底物的组成与结 构、酶切速度大小等会造成底物降解行为的不同。

实施例11.重组β-甘露聚糖酶rMan02066彻底降解魔芋葡甘聚糖和槐豆胶的 寡糖产物的¹H-NMR鉴定

用重组β-甘露聚糖酶rMan02066分别完全降解葡甘聚糖和槐豆胶，得到酶解产 物后浓缩；使用高效液相凝胶色谱法对样品分离纯化；检测器为示差折光检测器 (RID)，色谱柱为Superdex^TM 30Increase 10/300GL，流动相为0.2M碳酸氢铵，流速 为0.4mL/min。

分离纯化样品分别进行多次冷冻干燥除盐，然后用重水(D₂O)溶解，冷冻干燥 进行氢氘置换，最后¹H-NMR检测。

通过¹H-NMR数据分析上述重组β-甘露聚糖酶rMan02066降解魔芋葡甘聚糖 (图9A)和槐豆胶(图9B)的寡糖产物的结构特征。

将重组酶rMan02066降解KGM的最终主产物经分子凝胶色谱柱分离获得二 糖、三糖、四糖产物片段，分别进行¹H-NMR结构鉴定，如图9(A)所示，5.26ppm 和5.04ppm化学位移值分别为对应寡糖还原端的葡萄糖和甘露糖异头氢信号。从上 述结果推测重组酶rMan02066与rMan01929类似，降解KGM后倾向于产生还原端为 甘露糖为主的系列寡糖终产物片段。

重组酶rMan02066降解LBG的最终主产物经分离，获得二糖～四糖、六糖-八糖 等寡糖片段，未能获得五糖产物片段。通过¹H-NMR测试，结果如图9(B)所示，同 样方法分析后，认为：(1)酶解反应中的主产物二糖片段主要为MM，含少量MG(G 为半乳糖)；(2)在酶解LBG的反应中，更大寡糖产物片段中半乳糖含量较高，阻遏 了重组酶rMan02066对这些产物的进一步降解。这表明，在Man02066降解LBG的过 程中，二糖产物MM属于主动生成的，而更高分子量的寡糖产物因富含半乳糖，不 利于进一步被深度酶学降解而被动成为了寡糖最终主产物的成分。

实施例12.重组酶rMan02066降解系列甘露寡糖的终产物分析

取约含20μg系列甘露寡糖(M-M6)的溶液，150mmol/L的NaH₂PO4-Na₂HPO₄ (pH 7.0)缓冲溶液、实施例3制得的重组β-甘露聚糖酶rMan02066的稀释液，按照体 积比1:1:1混匀，分别在40℃反应24h。将反应体系置沸水浴中10min，转至冰水 浴5min，在12,000×g、4℃条件下离心至少15min。收集上清，作为重组β-甘露聚 糖酶rMan02066的寡糖降解产物。以预先在沸水浴中灭活的重组β-甘露聚糖 rMan02066酶液，做阴性对照反应。

按照实施例10所述的展开条件，将重组β-甘露聚糖酶rMan02066酶解甘露寡糖(M-M6)的样品，取2uL检测。按照实施例10所述显色条件，进行显色，然后分析。

图10是重组β-甘露聚糖酶rMan02066完全降解系列大小甘露寡糖(M-M6)的寡 糖产物TLC分析图；

其中A图：横坐标中：A：样品顺序：M：M1-M6；1:M1(-)；2:M1(+)；3:M2(-)； 4:M2(+)；5:M3(-)；6:M3(+)；7:M4(-)；8:M4(+)；9:M5(-)；10:M5(+)；11:M6(-)； 12:M6(+)；其中(-)为阴性对照组，(+)为实验组；

B图：横坐标中：M，M1-M6；1：对照；2:酶液稀释10倍反应10s；3-8:10s、 1min、30min、3h、12h、48h；

C图：横坐标中：M，M1-M6；1，对照；2，酶液稀释10倍反应10s；3-5，10 s、1min、48h。

上述其中酶液稀释10倍反应10s代表将实施例3制得酶液稀释10倍后反应10s， 其余为实施例3制得酶液进行反应10s，1min，30min，3h，12h，48h。

结果如图10所示，本申请所述的重组β-甘露聚糖酶rMan02066：

(1)图10(A)可知，可以降解M3-M6糖，不能降解M2以及M1；降解M6或者M4 时最终产物为M2，降解M5或者M3时，最终产物为M2和M1；

(2)图10(B)可知，降解M5时，短时间内产生M3&M2，随着时间的延长，M3 逐渐降解，产生M2&M1；

(3)图10(C)可知，降解M6时，短时间内产生M4&M2，随着时间延长，M4逐 渐降解为M2，最终主产物为M2。

这些结果表明，重组酶rMan02066降解甘露寡糖时：(1)最小底物为M3，最小 产物为M1；(2)当奇数糖为底物时，最终主产物为M2和M1；偶数糖为底物时，最 终主产物为M2；(3)rMan02066降解甘露寡糖时，推测为二糖持续外切模式。

实施例13.重组β-甘露聚糖酶rMan02066酶切模式的荧光-高效液相色谱 (HPLC)分析

取一系列含10μg甘露寡糖(M-M6)的溶液，分别旋转蒸干。加入含过量邻氨基 苯甲酰胺(2-AB)、氰基硼氢化钠sodium cyanoborohydride的二甲亚砜(DMSO)溶液， 混匀后置60℃水浴中温育2h。旋转蒸干，加入去离子水溶解样品，将样品与氯仿共 振荡，离心，收集上清。继续用氯仿反复抽提，不少于7次，得到还原性末端分别 被2-AB标记了的甘露六糖(2AB-M6)、甘露五糖(2AB-M5)、甘露四糖(2AB-M4)、 甘露三糖(2AB-M3)、甘露二糖(2AB-M2)、甘露糖(2AB-M)等系列底物糖链。

取上述2AB-M6、2AB-M5、2AB-M3、2AB-M2、2AB-M产物、实施例3制得 的重组β-甘露聚糖酶rMan02066的稀释液、150mmol/L的NaH₂PO4-Na₂HPO₄ (pH7.0)缓冲液及水，按照体积比2:1:3:4混匀，置于40℃水浴中反应。将反应体系 置沸水浴中10min，转至冰水浴5min，在12,000×g、4℃条件下离心至少15min。 收集上清。以预先在沸水浴中加热10min，然后冰水浴10min失活的重组β-甘露聚 糖酶rMan02066酶液，做阴性对照反应。

用浓度为0.20mol/L的NH₄HCO₃溶液，平衡Superdex^TM 30Increase 10/300GL (GE公司，即美国通用电气公司)分子凝胶色谱柱，流速0.40mL/min，至少2柱床。 将上述荧光标记的系列甘露寡糖的不同酶解时间的样品，以自动进样器加载 20-200ng/样品，其它条件不变，330nm激发波长，420nm发射波长检测。用HPLC 操作软件，分析各寡糖组分的积分面积，结合理论分子量大小，计算相对摩尔浓度。

结果如图11(A)所示，可知重组酶rMan02066降解还原端被2AB标记的甘露寡 糖时：(1)降解偶数糖链底物2AB-M6或2AB-M4时，终产物以2AB-M2&M2为主； (2)降解奇数糖链底物2AB-M5时，终产物以2AB-M&M&M2为主；(3)降解2AB-M3 时，终产物以2AB-M&M2为主；(4)该酶不能降解2AB-M2和2AB-M；(5)此外， 经面积积分法得知，降解2AB-M4时，产生的2AB-M2的摩尔数与底物糖链的摩尔 数相等，而降解2AB-M3时，产生的2AB-M的摩尔数与底物糖链的摩尔数相等。

如图11(B)和(C)所示，重组酶rMan02066降解2AB-M5和2AB-M6的时间梯度 知：(1)降解奇数糖链底物2AB-M5时，短时间内产生2AB-M3，随着时间的延长 2AB-M3逐渐减少，最终产生2AB-M，且其面积积分与底物糖链的面积积分(即摩 尔数)相等；(2)降解偶数糖链底物2AB-M6时，短时间内产生2AB-M4糖，随着时 间的延长2AB-M4逐渐减少，最终产生2AB-M2，且其与底物糖链等面积积分(即摩 尔数相等)。

上述结果表明：重组酶rMan02066降解荧光标记的甘露寡糖时(1)最小底物为2AB-M3，最小产物为M；(2)从底物糖链底物的非还原端持续切割M2，并表现为 二糖外切模式；(3)当含荧光标记的终产物是2AB-M2时，所对应的原始底物是偶 数糖链，且与之摩尔数相等；而含荧光标记的终产物是2AB-M1时，所对应的原始 底物是奇数糖链，且摩尔数与之相等。因此，理论上该酶或其重组酶可用于分析、 测定其原始多糖底物糖链的摩尔数，即用作多糖底物的摩尔计数器，还可以判断原 始底物的奇偶状况。

实施例14.Man02066的多序列比对分析

使用利用DNAMAN软件对Man02066和已鉴定的GH26家族的甘露聚糖酶的蛋 白质序列比对。

如图12所示，将β-甘露聚糖酶Man02066(简称Man02066)蛋白序列与GH26家族 的甘露聚糖酶的蛋白质序列比对：

(1)通过Blast P分析，在已鉴定的酶中，Man02066与CjMan26A、CjMan26C、 Mana-2、Man26A的相似度最高分别为：35.59％、42.82％、42.18％、35.15％；

(2)通过DNAMAN 8.0进行多序列比对分析可知：Man02066序列中保守性的催 化位点残基为Glu¹⁸⁸(酸/碱催化)和Glu²⁹⁶(亲核催化)。

实施例15.Man02066的基因突变

以实施例3制得的重组质粒pET30a-Man02066为模板，进行PCR扩增，扩增引 物如表1所示：

表1.突变所用的引物

所用定点突变试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司，按照该公司试剂盒 中所提供的实验操作步骤，进行定点突变，获得重组质粒送至生工生物工程(上海) 股份有限公司测序验证，最后得到构建正确的重组质粒pET30a-Man02066-E188A 和pET30a-Man02066-E296A。

按照实施例3，对突变重组质粒进行诱导表达，超声破碎菌体后，离心，转移 上清，获得突变后的重组酶突变体的粗酶液E188A和E296A。

实施例17.rMan02066(简称Man02066)突变体的酶活分析

用去离子水配制质量体积浓度(g/mL)为0.3％的魔芋葡甘聚糖和槐豆胶底物， 加热溶解后，分别置于40℃和50℃水浴环境中降温1h。向每100μL底物中添加实 施例16制得的突变体粗酶液的稀释液10-100μL，不足200μL体积时，用无菌去离 子水补足，混匀后继续反应，反应12h。将反应产物在沸水浴中加热10min，转入 冰水浴中5min，在12,000×g、4℃条件下离心15min，收集上清。

用DNS-还原糖法测定各反应体系中新生成还原糖的浓度(OD₅₄₀)，并计算平 均值，进行偏差分析。对照组为重组酶rMan02066的活性(设定为100％)最大吸收 值,相对酶活(RA)定义为：各突变体寡糖产物的吸收值与最大吸收值的百分比。

结果Man02066的系列突变体在降解KGM(图13A)和LBG(图13B)时，如图所 示：E188、E296残基突变后，酶突变体均失活，因此证实该两个谷氨酸残基为 Man02066的保守催化位点残基。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领 域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权 利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海绿谷制药有限公司

<120> 一种二糖外切型β-甘露聚糖水解酶及其应用

<130> P2020-1101

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1137

<212> DNA

<213> 火色杆菌(Flammeovirga yaeyamensis)

<400> 1

atgagaaaga gattagtagc agcttctttt cttataggac ttctcacact aaactttgga 60

acagccgaag ataaggcaaa gacaccaaag ctaaatgata agaaagcaac gaaggagacg 120

gtagcattat acgagcaatt acatcaggtg agcgtaagtg gaaaaacaat ttttggacat 180

caagacgact tggcttatgg ataccattgg tggggcgatg gatcggatgt aaagaatgtg 240

acaggagatt accctggcct ttatggttgg gatatgggac atattggaga ggaaaaaaac 300

ttggatggtg ttcctttcga ggacatcaaa agatatatca aagagtcgta ttcgagagga 360

ggcattacca ctttgagttg gcacatgatc aatttaaaag aaaagagcag ttcttgggat 420

accacaagag tacttcatga aatgatggag ggaggtaagt atcaccaaga ctttattaaa 480

aagcttgact tgtttgccga atttgtggat gacctagaat tagaaggtaa gaaaattcca 540

gtattattta gaccatggca cgaacacaat ggttcatggt tttggtgggg aggaaagaat 600

gtggagatca aagattataa aacactttgg caattcacag tggaatattt gagagataaa 660

aaggggattc ataacattat ctacgtttat tctacagatg ccttcgattc ggaagaaagt 720

tatttagagc gttatcctgg cgacaaatat gtcgatgttt taggatttga tgattacggt 780

gcctaccgtg ctaacgctac tccagaaaga gaacaatgga ttataagaga attggaaacg 840

gtagccaaat tggcccaaca aaaaaataaa atctgtgcgt ttacagaatc tggtttggaa 900

gcagtgactg acgatcagtt ttttaccacc aagttattgg acaagctaaa tcacaatgaa 960

tggacaaaga aagccgctta tgtgatgctt tggagaaacg ccaactatca aaaagaacag 1020

agagatcatt tttatgtgcc ttacaaaggt cactcttctg ccaaagactt tatcaaattc 1080

aaagaagatc caagcattct ctttgagtct gatttgatga atatgaaagt gaattaa 1137

<210> 2

<211> 378

<212> PRT

<213> 火色杆菌(Flammeovirga yaeyamensis)

<400> 2

Met Arg Lys Arg Leu Val Ala Ala Ser Phe Leu Ile Gly Leu Leu Thr

1 5 10 15

Leu Asn Phe Gly Thr Ala Glu Asp Lys Ala Lys Thr Pro Lys Leu Asn

20 25 30

Asp Lys Lys Ala Thr Lys Glu Thr Val Ala Leu Tyr Glu Gln Leu His

35 40 45

Gln Val Ser Val Ser Gly Lys Thr Ile Phe Gly His Gln Asp Asp Leu

50 55 60

Ala Tyr Gly Tyr His Trp Trp Gly Asp Gly Ser Asp Val Lys Asn Val

65 70 75 80

Thr Gly Asp Tyr Pro Gly Leu Tyr Gly Trp Asp Met Gly His Ile Gly

85 90 95

Glu Glu Lys Asn Leu Asp Gly Val Pro Phe Glu Asp Ile Lys Arg Tyr

100 105 110

Ile Lys Glu Ser Tyr Ser Arg Gly Gly Ile Thr Thr Leu Ser Trp His

115 120 125

Met Ile Asn Leu Lys Glu Lys Ser Ser Ser Trp Asp Thr Thr Arg Val

130 135 140

Leu His Glu Met Met Glu Gly Gly Lys Tyr His Gln Asp Phe Ile Lys

145 150 155 160

Lys Leu Asp Leu Phe Ala Glu Phe Val Asp Asp Leu Glu Leu Glu Gly

165 170 175

Lys Lys Ile Pro Val Leu Phe Arg Pro Trp His Glu His Asn Gly Ser

180 185 190

Trp Phe Trp Trp Gly Gly Lys Asn Val Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Thr

195 200 205

Leu Trp Gln Phe Thr Val Glu Tyr Leu Arg Asp Lys Lys Gly Ile His

210 215 220

Asn Ile Ile Tyr Val Tyr Ser Thr Asp Ala Phe Asp Ser Glu Glu Ser

225 230 235 240

Tyr Leu Glu Arg Tyr Pro Gly Asp Lys Tyr Val Asp Val Leu Gly Phe

245 250 255

Asp Asp Tyr Gly Ala Tyr Arg Ala Asn Ala Thr Pro Glu Arg Glu Gln

260 265 270

Trp Ile Ile Arg Glu Leu Glu Thr Val Ala Lys Leu Ala Gln Gln Lys

275 280 285

Asn Lys Ile Cys Ala Phe Thr Glu Ser Gly Leu Glu Ala Val Thr Asp

290 295 300

Asp Gln Phe Phe Thr Thr Lys Leu Leu Asp Lys Leu Asn His Asn Glu

305 310 315 320

Trp Thr Lys Lys Ala Ala Tyr Val Met Leu Trp Arg Asn Ala Asn Tyr

325 330 335

Gln Lys Glu Gln Arg Asp His Phe Tyr Val Pro Tyr Lys Gly His Ser

340 345 350

Ser Ala Lys Asp Phe Ile Lys Phe Lys Glu Asp Pro Ser Ile Leu Phe

355 360 365

Glu Ser Asp Leu Met Asn Met Lys Val Asn

370 375

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcgcatatgg aagataaggc aaagacacc 29

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcgctcgaga ttcactttca tattcatcaa atc 33

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggcacgca cacaatggtt catggttttg gtg 33

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cattgtgtgc gtgccatggt ctaaataata ctgg 34

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgtttacagc atctggtttg gaagcagtga ctg 33

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

accagatgct gtaaacgcac agattttatt tttttg 36

Claims (10)

1.一种外切型β-甘露聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.权利要求1所述的外切型β-甘露聚糖酶的编码核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求2或3所述的核苷酸序列。

5.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求4所述的表达载体或其基因组上整合有权利要求2或3所述的核苷酸序列。

6.如权利要求1所述的外切型β-甘露聚糖酶在降解甘露聚糖中的应用。

7.如权利要求1所述的外切型β-甘露聚糖酶在分析、测定其原始多糖底物糖链的摩尔数和判断原始底物的奇偶状况中的应用。

8.一种外切型β-甘露聚糖酶，其特征在于，所述外切型β-甘露聚糖酶是权利要求1所述的外切型β-甘露聚糖酶突变体。

9.如权利要求8所述的外切型β-甘露聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，但在第188和/或296位发生突变。

10.一种甘露聚糖降解产物，所述降解产物利用权利要求1所述的外切型β-甘露聚糖酶降解甘露聚糖制得。

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