CN114231546B

CN114231546B - 一种中性纤维素酶优化基因及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114231546B
Application number: CN202111596403.3A
Authority: CN
Inventors: 黄火清; 周樱; 詹志春; 张成杰; 辜玲芳; 刘文悦
Original assignee: Wuhan Sunhy Biological Co ltd
Current assignee: Wuhan Sunhy Biological Co ltd
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2023-06-06
Anticipated expiration: 2041-12-24
Also published as: CN114231546A

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体提供了一种中性纤维素酶优化基因及其制备方法和应用。本发明在不改变中性纤维素酶氨基酸序列的前提下，综合考虑密码子偏好性，密码子适应指数，不稳定序列的删除，mRNA二级结构等因素，对编码中性纤维素酶的HiZX基因进行多种策略的改造，最终筛选出一条编码中性纤维素酶的优化基因序列HiZX‑m1，将优化基因HiZX‑m1转入到毕赤酵母中进行表达时，中性纤维素酶的分泌表达量显著提高、酶活力显著增强。

Description

一种中性纤维素酶优化基因及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种中性纤维素酶优化基因HiZX-m1及其制作方法和应用。

背景技术

纤维素酶是指能水解纤维素的β-1，4葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称。纤维素酶是由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三个主要成分组成的诱导型复合酶系，按最适作用pH值不同，纤维素酶可分为酸性纤维素、中性纤维素酶、碱性纤维素酶。中性纤维素酶在纺织、食品、饲料和制药等行业均具有广泛的应用前景，尤其是在纺织领域已得到广泛应用。在纺织品整理方面，中性纤维素酶与酸性纤维素酶相比，其处理效果具有高反差外观的优点。中性纤维素酶能让织物具有反差大和背着色低的外观，蓝、白色的对比非常强，简化或省略了清洁工序。中性纤维素酶不会使处理后的服装产生严重的背面沾污，具有抗返染，次品率低，产品质量均匀、手感好等特点。另外，中性纤维素酶能在较广的pH值范围内使用，这对工艺的灵活性非常重要。操作人员只需对pH值进行少量控制便可获得稳定的磨蚀效果。中性纤维素酶具有较强的线性剂量反应，与传统酸性纤维素酶相比，只需使用较少剂量的这种酶便能迅速获得高水平的磨毛效果。使用较高剂量时，这种酶的作用与磨毛程度成正比。

然而，目前商品化的纤维素酶主要以酸性纤维素酶为主，中性纤维素酶种类较少，价格较高，且国内外对中性纤维素酶的发酵生产的研究报道尚少。因此，对中性纤维素酶基因进行多种策略的改造，得到分泌表达量有显著提高的中性纤维素酶优化基因，具有重要的经济价值。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中中性纤维素酶种类较少，价格较高，且国内外对中性纤维素酶的发酵生产的研究尚少的问题。

为此，本发明提供了一种优化的中性纤维素酶基因HiZX-m1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了上述优化的中性纤维素酶基因HiZX-m1的制备方法，包括以下步骤：

(1)获取中性纤维素酶基因HiZX，其序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)根据表达宿主密码子使用偏好性对HiZX进行优化，得到优化基因HiZX-m1；HiZX-m1编码的氨基酸与HiZX编码的氨基酸序列一致；HiZX-m1序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了包含上述优化的中性纤维素酶基因HiZX-m1的重组载体；所示重组载体的起始表达载体优选为pPIC9K质粒。

具体的，将优化的中性纤维素酶基因HiZX-m1插入到pPIC9K质粒的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该基因位于pPIC9K启动子的下游并受其调控，得到重组载体pPIC9K-HiZX-m1。

本发明还提供了包含上述优化的中性纤维素酶基因HiZX-m1的重组菌株，优选为重组毕赤酵母。

本发明提供了这种优化的中性纤维素酶基因HiZX-m1可用于生产中性纤维素酶。

本发明还提供了一种生产中性纤维素酶的方法，包括以下步骤：

(1)将上述优化的中性纤维素酶基因HiZX-m1插入表达载体的限制性酶切位点之间，得到重组载体；

(2)使用重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

(3)培养重组菌株，诱导重组中性纤维素酶表达；

(4)回收并纯化所表达的中性纤维素酶。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明在不改变中性纤维素酶氨基酸序列的前提下，综合考虑密码子偏好性，密码子适应指数(CAI)，不稳定序列的删除，mRNA二级结构等因素，对编码中性纤维素酶的HiZX基因进行多种策略的改造，最终筛选出一条编码中性纤维素酶的优化基因序列HiZX-m1，将优化基因HiZX-m1转入到毕赤酵母中进行表达时，中性纤维素酶的分泌表达量显著提高、酶活力显著增强。

以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1是本发明实施例2中HiZX密码子使用频率统计图。

图2是本发明实施例2中HiZX-m1密码子使用频率统计图。

图3是本发明实施例2中HiZX-m2密码子使用频率统计图。

图4是本发明实施例2中HiZX-m3密码子使用频率统计图。

图5是本发明实施例2中HiZX(A)、HiZX-m1(B)、HiZX-m2(C)和HiZX-m3(D)基因的mRNA二级结构预测图。

图6是本发明实施例4中SDS-PAGE检测中性纤维素酶的表达结果图；其中，M为分子量标准；1为HiZX表达菌株发酵上清液；2为HiZX-m1表达菌株发酵上清液；3为HiZX-m2表达菌株发酵上清液；4为HiZX-m3表达菌株发酵上清液。

图7是本发明实施例4中中性纤维素酶活力测定结果图。

图8是本发明实施例5中以CMC-Na为底物时重组中性纤维素酶的酶学性质结果图；其中，A为pH对酶活力的影响；B为pH稳定性；C为温度对酶活力的影响；D为不同温度下的热稳定性。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。

下面通过具体实施例对本发明的中性纤维素酶优化基因HiZX-m1的效果进行研究。

实施例1：目的基因的克隆及序列分析

本实施例中使用的H.insolens Y1购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCCNo.4573。

将H.insolens Y1接种于发酵培养基中，42℃，200rpm振荡培养4d，收集菌体，提取总RNA并进行反转录。以总cDNA为模板，利用引物

HiZXF：5’-ATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3’

和

HiZXR：5’-TTACAGGCACTGATGGTACC-3’

扩增糖苷水解酶的编码基因HiZX，将目的片段连入克隆载体pEASY-Blunt，测序验证。

将得到的序列通过Blast在线服务器进行全长基因的同源性比对；通过SigalP5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0)预测蛋白质的信号肽序列。

测序及序列分析结果显示，HiZX的DNA序列全长974bp，包含一个内含子，其成熟cDNA序列全长918bp，编码305个氨基酸和一个终止密码子，成熟蛋白的理论分子量和等电点分别为32.2kDa和6.83。SignalP预测结果显示，HiZX的N端21个氨基酸为可能的信号肽。

HiZX基因序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

GCTGATGGCAAGTCCACCCGCTACTGGGACTGCTGCAAGCCTTCGTGCGGCTGGGCCAAGAAGGCTCCCGTGAACCAGCCTGTCTTCTCCTGCAACGCCAACTTCCAGCGTCTCACTGACTTCGACGCCAAGTCCGGCTGCGAGCCGGGCGGTGTCGCCTACTCGTGCGCCGACCAGACCCCATGGGCTGTGAACGACGACTTCGCGTTCGGTTTTGCTGCCACCTCTATTGCCGGCAGCAATGAGGCGGGCTGGTGCTGCGCCTGCTACGAGCTCACCTTCACATCCGGTCCTGTTGCTGGCAAGAAGATGGTCGTCCAGTCCACCAGCACTGGCGGTGATCTTGGCAGCAACCACTTCGATCTCAACATCCCCGGCGGCGGCGTCGGCATCTTCGACGGATGCACTCCCCAGTTCGGCGGTCTGCCCGGCCAGCGCTACGGCGGCATCTCGTCCCGCAACGAGTGCGATCGGTTCCCCGACGCCCTCAAGCCCGGCTGCTACTGGCGCTTCGACTGGTTCAAGAACGCCGACAACCCGAGCTTCAGCTTCCGTCAGGTCCAATGCCCAGCCGAGCTCGTCGCTCGCACCGGATGCCGCCGCAACGACGACGGCAACTTCCCTGCCGTCCAGATCCCCTCCAGCAGCACCAGCTCTCCGGTCGGCCAGCCTACCAGTACCAGCACCACCTCCACCTCCACCACCTCGAGCCCGCCCGTCCAGCCTACGACTCCCAGCGGCTGCACTGCTGAGAGGTGGGCTCAGTGCGGCGGCAATGGCTGGAGCGGCTGCACCACCTGCGTCGCTGGCAGCACCTGCACGAAGATTAATGACTGGTACCATCAGTGCCTG

基因编码的氨基酸序列SEQ ID NO.5所示。

SEQ ID NO.5：

ADGKSTRYWDCCKPSCGWAKKAPVNQPVFSCNANFQRLTDFDAKSGCEPGGVAYSCADQTPWAVNDDFAFGFAATSIAGSNEAGWCCACYELTFTSGPVAGKKMVVQSTSTGGDLGSNHFDLNIPGGGVGIFDGCTPQFGGLPGQRYGGISSRNECDRFPDALKPGCYWRFDWFKNADNPSFSFRQVQCPAELVARTGCRRNDDGNFPAVQIPSSSTSSPVGQPTSTSTTSTSTTSSPPVQPTTPSGCTAERWAQCGGNGWSGCTTCVAGSTCTKINDWYHQCL

实施例2：中性纤维素酶基因的优化

对H.insolens Y1中克隆获得的中性纤维素酶野生型基因HiZX的序列进行优化，优化过程主要根据以下原则：1)不改变纤维素酶基因HiZX所编码的氨基酸序列；2)根据表达宿主密码子使用偏好性，尽可能减少稀有密码子串联的概率；3)根据毕赤酵母中密码子偏好性，改变其CAI值分布范围；4)控制基因序列中GC含量和分布区域；5)避免高GC和连续AT区域的出现；6)对mRNA的茎环结构(能量)进行优化以延长mRNA的半衰期。

通过优化设计，我们得到3条序列HiZX-m1，HiZX-m2和HiZX-m3，其基因序列依次如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO.2：

GCTGATGGTAAGAGTACGAGATACTGGGATTGTTGCAAGCCCAGTTGCGGATGGGCAAAGAAGGCACCCGTGAATCAGCCGGTCTTTAGTTGTAACGCAAATTTTCAGCGACTCACTGATTTTGACGCGAAATCAGGGTGTGAACCAGGGGGCGTTGCATATTCATGCGCCGACCAAACGCCGTGGGCCGTAAACGATGACTTCGCGTTTGGTTTCGCGGCGACTTCCATTGCGGGATCAAACGAGGCCGGTTGGTGTTGTGCATGCTATGAACTAACATTCACTAGCGGGCCTGTAGCTGGCAAGAAAATGGTCGTGCAATCTACTTCCACAGGCGGAGATCTAGGGTCAAACCACTTCGATTTAAATATCCCGGGTGGCGGTGTGGGGATTTTCGACGGATGCACCCCACAGTTTGGGGGATTGCCTGGCCAGCGCTACGGAGGTATCAGCTCTAGGAATGAGTGTGATCGCTTTCCTGACGCGTTGAAACCTGGCTGCTACTGGCGTTTCGACTGGTTTAAAAATGCTGACAATCCCTCGTTCTCTTTCCGACAAGTTCAATGTCCTGCTGAGTTAGTTGCCAGGACTGGTTGTCGGCGGAACGACGACGGAAACTTTCCAGCTGTGCAAATACCGTCGTCCTCCACCTCGAGCCCCGTTGGACAGCCTACATCCACGTCTACGACCAGTACATCGACAACCTCAAGTCCCCCAGTACAACCGACCACGCCCTCGGGTTGTACTGCCGAAAGATGGGCCCAATGCGGGGGAAACGGGTGGAGCGGCTGCACGACATGCGTCGCGGGCTCTACCTGCACAAAAATAAATGATTGGTATCATCAGTGTCTG

SEQ ID NO.3：

GCTGATGGTAAGTCTACTAGATACTGGGATTGTTGTAAGCCATCTTGTGGTTGGGCTAAAAAGGCTCCAGTTAATCAACCAGTTTTCTCTTGTAATGCTAATTTTCAAAGACTGACTGATTTCGATGCTAAATCTGGTTGTGAACCTGGTGGTGTTGCTTATTCTTGTGCTGATCAAACTCCTTGGGCTGTTAATGATGATTTCGCTTTTGGTTTTGCTGCTACTTCTATTGCTGGTTCTAATGAAGCTGGTTGGTGTTGTGCTTGTTACGAATTGACTTTTACTTCTGGTCCTGTTGCTGGTAAAAAGATGGTTGTTCAATCTACTTCTACTGGTGGTGATTTGGGTTCTAATCATTTTGATTTGAACATCCCTGGTGGTGGTGTTGGTATTTTCGATGGTTGTACTCCACAATTCGGTGGTTTGCCTGGTCAAAGATACGGTGGTATTTCTTCTAGAAATGAATGTGATAGATTCCCTGATGCTTTGAAGCCTGGTTGTTATTGGAGATTTGATTGGTTCAAGAATGCTGATAACCCATCTTTCTCTTTTAGACAAGTTCAATGTCCAGCTGAATTGGTTGCTAGAACTGGTTGTAGAAGAAACGATGATGGTAACTTCCCTGCTGTTCAAATTCCATCTTCTTCTACTTCTTCTCCAGTTGGTCAACCTACTTCTACTTCTACCACTTCTACTTCCACTACTTCTTCTCCTCCAGTTCAACCTACTACTCCATCTGGTTGTACTGCTGAAAGATGGGCTCAATGTGGTGGTAATGGTTGGTCTGGTTGTACCACTTGTGTTGCTGGTTCTACTTGTACTAAGATTAACGATTGGTATCATCAATGTTTG

SEQ ID NO.4：

GCTGATGGTAAATCTACTAGATATTGGGATTGTTGTAAGCCATCTTGTGGTTGGGCTAAGAAGGCTCCAGTTAATCAACCTGTTTTCTCTTGTAACGCTAACTTTCAAAGATTGACTGATTTCGATGCTAAGTCTGGTTGTGAACCTGGTGGTGTTGCTTATTCTTGTGCTGATCAAACTCCTTGGGCTGTTAACGATGATTTTGCTTTCGGTTTTGCTGCTACTTCTATTGCTGGTTCTAATGAAGCTGGTTGGTGTTGTGCTTGTTACGAATTGACTTTTACTTCTGGTCCAGTTGCTGGTAAAAAGATGGTTGTTCAATCTACTTCTACTGGTGGTGACTTGGGTTCTAACCATTTTGATTTGAATATCCCAGGTGGTGGTGTTGGTATTTTTGATGGTTGTACTCCTCAATTCGGTGGTTTGCCAGGTCAAAGATATGGTGGTATTTCTTCTAGAAACGAATGTGATAGATTCCCAGATGCTTTGAAGCCAGGTTGTTACTGGAGATTTGATTGGTTTAAGAATGCTGATAACCCTTCTTTCTCTTTCAGACAAGTTCAATGTCCTGCTGAATTGGTTGCTAGAACTGGTTGTAGAAGAAACGATGATGGTAACTTCCCAGCTGTTCAAATTCCATCTTCTTCTACTTCTTCTCCAGTTGGTCAACCTACTTCTACTTCTACCACTTCTACTTCCACTACTTCTTCTCCTCCTGTTCAACCAACTACTCCATCTGGTTGTACTGCTGAAAGATGGGCTCAATGTGGTGGTAATGGTTGGTCTGGTTGTACCACTTGTGTTGCTGGTTCTACTTGTACTAAAATTAATGATTGGTACCACCAATGTTTG

如表1所示，优化基因与野生型基因序列相比，GC含量明显降低。

表1基因序列优化前后GC含量的变化

如图1-5所示，优化后基因的密码子使用频率及mRNA二级结构与野生型基因相比也具有明显差异。

实施例3：构建重组载体和重组菌株

一、构建重组载体

将去除自身信号肽编码序列的HiZX基因及其突变体基因HiZX-m1，HiZX-m2和HiZX-m3用EcoRI和NotI双酶切后回收纯化，连入经相同酶切的表达载体pPIC9K，构建得到重组载体pPIC9K-HiZX，pPIC9K-HiZX-m1，pPIC9K-HiZX-m2和pPIC9K-HiZX-m3。

二、构建重组毕赤酵母

将构建得到的中性纤维素酶表达质粒pPIC9K-HiZX、pPIC9K-HiZX-m1、pPIC9K-HiZX-m2和pPIC9K-HiZX-m3转化毕赤酵母GS115感受态细胞，使其整合至毕赤酵母染色体上，小规模发酵筛选具有中性纤维素酶活力的转化子，具体操作如下：

1、制备毕赤酵母感受态细胞

1)在YPD固体平板上采用划线分离法得到毕赤酵母受体菌GS115(His-，Mut+)的单菌落，挑取单菌落接种于10mL YPD液体培养基中，28℃，200rpm摇床培养过夜；

2)将已经活化的新制备的GS115菌液依据1％的比例接于100mL YPD液体培养基中培养，28℃，200rpm培养到菌体OD600为1.3-1.5，再将其放置于冰上进行降温；

3)将菌液转移到50mL离心管中，4℃，4500rpm离心5min，弃上清；

4)100mL预冷的无菌ddH2O重悬菌体，4℃，4500rpm离心10min，弃上清；

5)50mL 1M预冷的山梨醇溶液重悬菌体，4℃，4500rpm离心10min，弃上清；

6)20mL 1M预冷的山梨醇溶液重悬菌体，4℃，4500rpm离心10min，弃上清；

7)1.5mL 1M预冷的山梨醇溶液重悬菌体，100μL/支分装到1.5mL的离心管中，以备转化。

2、重组质粒转化毕赤酵母

1)用70％的乙醇反复浸泡洗涤干净的2mm的电转杯，置于超净台内挥发完全，冰上预冷备用；

2)取1支GS115感受态细胞置于冰上，在感受态细胞刚刚融化时，加入20μL重组载体线性化回收产物，用移液枪轻柔混匀并转入预冷的电转杯底部；

3)设定电转仪参数：电压参数12500V/cm，电击时间>4msec；

4)电击结束后，向电转杯中迅速加入预冷的500μL 1M山梨醇溶液，用移液器轻轻混匀并转移至新的无菌1.5mL Eppendorf管中，30℃培养箱静置复苏1h；

5)将菌液涂布于MD筛选平板上，待菌液晾干后倒置于30℃恒温培养箱中。

3、筛选产中性纤维素酶的重组毕赤酵母

借助灭菌后的牙签在MD平板上选取单克隆菌株，依据早晚顺序标号，点到对应标号的MD板上；将MD板放在30℃培育箱里培育48h。依据标号选择正常成长的转化子接种于含有600μL BMGY培养基的离心管中，带有BMGY培养基的离心管必须经过严格灭菌并被八层纱布包绕。将离心管于28℃、200rpm摇床上培育48h；摇床培育48h后的菌液于3000rpm离心10min，除去上清液，向离心管里添加600μL BMMY培养基，放置在28℃、200rpm诱导培育。每隔12h补加一次甲醇，补加量为保持体系中甲醇终浓度为0.5％。诱导培育48h后，把得到的菌液放置在8000rpm离心3min，选择上清液检查测定酶活性，从中筛选出具有中性纤维素酶活性的转化子。

对最初筛选的有中性纤维素酶活性的转化子再次进行筛选：把上述转化子接种于含有10mL BMGY培养基中，28℃，200rpm培育48h，4000rpm离心5min，除去上清，添加5mLBMMY甲醇诱导培养基重新悬浮后，28℃，200rpm培养，每隔12h补加一次甲醇，补加量为保持体系中甲醇终浓度为0.5％，诱导48h后取样检测中性纤维素酶活。筛选出酶活最高的转化子。

实施例4：发酵罐重组中性纤维素酶的表达

选取实施例3复筛中酶活最高的转化子研究其在发酵装置里的表达水平。将该转化子的单个菌落接种在50mL YPD液体培养基中，在28℃摇床上培养12h后全部转入含有200mL YPD液体培养基中，28℃，200rpm培养24h，然后将其接入3L发酵培养基中，在28℃，1000rpm发酵培养，用甲醇诱导132h后下罐；发酵过程中定时取样测定中性纤维素酶的酶活。

采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定中性纤维素酶活性：在各试管中加入1.5％(w/v)的羧甲基纤维素钠溶液0.9mL，反应温度水浴平衡后，加入适当稀释的酶液0.1mL(空白先不加)，振荡混合均匀。反应温度水浴保温30min，迅速冷却。向各试管中加入1.5mL DNS试剂，再向空白中加酶液0.1mL，混合均匀。在沸水中煮5min，迅速冷却。以0号管为参比，测定540nm的吸光度。每分钟生成1μmol还原糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

采用SDS-PAGE对样品蛋白质的纯度进行分析，如图6所示，HiZX及其突变体基因在毕赤酵母中均成功实现了高效表达。

图7中不同发酵时间点中性纤维素酶活力测定结果表明，HiZX表达菌株发酵168小时未浓缩粗酶液中中性纤维素酶活力为4284U/mL，优化基因HiZX-m1，HiZX-m2和HiZX-m3表达菌株发酵168小时未浓缩粗酶液中中性纤维素酶活力分别为6426U/mL，3855.6U/mL，1285.2U/mL。

结果表明，特异腐质霉来源中性纤维素酶基因HiZX经多种策略改造后得到的3个优化基因中，HiZX-m1(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)能够明显提高该酶在毕赤酵母中的分泌表达量，而其它优化基因经优化后仍不能提高表达水平(HiZX-m2)，甚至出现表达水平大幅下降(HiZX-m3)。

实施例5：中性纤维素酶的性质测定

分离纯化实施例4发酵上清液中的中性纤维素酶，对其性质进行测定。

1、中性纤维素酶的最适pH和pH稳定性

37℃下，在不同pH的缓冲液中进行酶促反应测定中性纤维素酶的酶活，结果如图8A所示，中性纤维素酶具有宽泛的作用pH，在pH 5.0-10.0范围内均具有不低于50％的酶活力，最适pH为8.0。

将中性纤维素酶于不同pH的缓冲液中37℃处理1h后测定酶活性，以研究酶的pH耐性，结果如图8B所示，中性纤维素酶在pH2.0-10.0之间均很稳定，在此pH范围内处理1h后仍保留80％以上的酶活力。

2、中性纤维素酶的最适温度及热稳定性

不同温度下，使用中性纤维素酶在pH为8.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液体系中进行酶促反应，测定结果如图8C所示，中性纤维素酶最适温度为60℃。

将中性纤维素酶在不同温度下处理不同时间后，进行酶活性测定，热稳定性试验结果如图8D所示，在80℃及以下温度具有良好的稳定性，在80℃下温育1h，酶活力仍保留60％以上。

以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉新华扬生物股份有限公司

<120> 一种中性纤维素酶优化基因及其制备方法和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 852

<212> DNA

<213> H. insolens Y1

<400> 1

gctgatggca agtccacccg ctactgggac tgctgcaagc cttcgtgcgg ctgggccaag 60

aaggctcccg tgaaccagcc tgtcttctcc tgcaacgcca acttccagcg tctcactgac 120

ttcgacgcca agtccggctg cgagccgggc ggtgtcgcct actcgtgcgc cgaccagacc 180

ccatgggctg tgaacgacga cttcgcgttc ggttttgctg ccacctctat tgccggcagc 240

aatgaggcgg gctggtgctg cgcctgctac gagctcacct tcacatccgg tcctgttgct 300

ggcaagaaga tggtcgtcca gtccaccagc actggcggtg atcttggcag caaccacttc 360

gatctcaaca tccccggcgg cggcgtcggc atcttcgacg gatgcactcc ccagttcggc 420

ggtctgcccg gccagcgcta cggcggcatc tcgtcccgca acgagtgcga tcggttcccc 480

gacgccctca agcccggctg ctactggcgc ttcgactggt tcaagaacgc cgacaacccg 540

agcttcagct tccgtcaggt ccaatgccca gccgagctcg tcgctcgcac cggatgccgc 600

cgcaacgacg acggcaactt ccctgccgtc cagatcccct ccagcagcac cagctctccg 660

gtcggccagc ctaccagtac cagcaccacc tccacctcca ccacctcgag cccgcccgtc 720

cagcctacga ctcccagcgg ctgcactgct gagaggtggg ctcagtgcgg cggcaatggc 780

tggagcggct gcaccacctg cgtcgctggc agcacctgca cgaagattaa tgactggtac 840

catcagtgcc tg 852

<210> 2

<211> 852

<212> DNA

<213> H. insolens Y1

<400> 2

gctgatggta agagtacgag atactgggat tgttgcaagc ccagttgcgg atgggcaaag 60

aaggcacccg tgaatcagcc ggtctttagt tgtaacgcaa attttcagcg actcactgat 120

tttgacgcga aatcagggtg tgaaccaggg ggcgttgcat attcatgcgc cgaccaaacg 180

ccgtgggccg taaacgatga cttcgcgttt ggtttcgcgg cgacttccat tgcgggatca 240

aacgaggccg gttggtgttg tgcatgctat gaactaacat tcactagcgg gcctgtagct 300

ggcaagaaaa tggtcgtgca atctacttcc acaggcggag atctagggtc aaaccacttc 360

gatttaaata tcccgggtgg cggtgtgggg attttcgacg gatgcacccc acagtttggg 420

ggattgcctg gccagcgcta cggaggtatc agctctagga atgagtgtga tcgctttcct 480

gacgcgttga aacctggctg ctactggcgt ttcgactggt ttaaaaatgc tgacaatccc 540

tcgttctctt tccgacaagt tcaatgtcct gctgagttag ttgccaggac tggttgtcgg 600

cggaacgacg acggaaactt tccagctgtg caaataccgt cgtcctccac ctcgagcccc 660

gttggacagc ctacatccac gtctacgacc agtacatcga caacctcaag tcccccagta 720

caaccgacca cgccctcggg ttgtactgcc gaaagatggg cccaatgcgg gggaaacggg 780

tggagcggct gcacgacatg cgtcgcgggc tctacctgca caaaaataaa tgattggtat 840

catcagtgtc tg 852

<210> 3

<211> 852

<212> DNA

<213> H. insolens Y1

<400> 3

gctgatggta agtctactag atactgggat tgttgtaagc catcttgtgg ttgggctaaa 60

aaggctccag ttaatcaacc agttttctct tgtaatgcta attttcaaag actgactgat 120

ttcgatgcta aatctggttg tgaacctggt ggtgttgctt attcttgtgc tgatcaaact 180

ccttgggctg ttaatgatga tttcgctttt ggttttgctg ctacttctat tgctggttct 240

aatgaagctg gttggtgttg tgcttgttac gaattgactt ttacttctgg tcctgttgct 300

ggtaaaaaga tggttgttca atctacttct actggtggtg atttgggttc taatcatttt 360

gatttgaaca tccctggtgg tggtgttggt attttcgatg gttgtactcc acaattcggt 420

ggtttgcctg gtcaaagata cggtggtatt tcttctagaa atgaatgtga tagattccct 480

gatgctttga agcctggttg ttattggaga tttgattggt tcaagaatgc tgataaccca 540

tctttctctt ttagacaagt tcaatgtcca gctgaattgg ttgctagaac tggttgtaga 600

agaaacgatg atggtaactt ccctgctgtt caaattccat cttcttctac ttcttctcca 660

gttggtcaac ctacttctac ttctaccact tctacttcca ctacttcttc tcctccagtt 720

caacctacta ctccatctgg ttgtactgct gaaagatggg ctcaatgtgg tggtaatggt 780

tggtctggtt gtaccacttg tgttgctggt tctacttgta ctaagattaa cgattggtat 840

catcaatgtt tg 852

<210> 4

<211> 852

<212> DNA

<213> H. insolens Y1

<400> 4

gctgatggta aatctactag atattgggat tgttgtaagc catcttgtgg ttgggctaag 60

aaggctccag ttaatcaacc tgttttctct tgtaacgcta actttcaaag attgactgat 120

ttcgatgcta agtctggttg tgaacctggt ggtgttgctt attcttgtgc tgatcaaact 180

ccttgggctg ttaacgatga ttttgctttc ggttttgctg ctacttctat tgctggttct 240

aatgaagctg gttggtgttg tgcttgttac gaattgactt ttacttctgg tccagttgct 300

ggtaaaaaga tggttgttca atctacttct actggtggtg acttgggttc taaccatttt 360

gatttgaata tcccaggtgg tggtgttggt atttttgatg gttgtactcc tcaattcggt 420

ggtttgccag gtcaaagata tggtggtatt tcttctagaa acgaatgtga tagattccca 480

gatgctttga agccaggttg ttactggaga tttgattggt ttaagaatgc tgataaccct 540

tctttctctt tcagacaagt tcaatgtcct gctgaattgg ttgctagaac tggttgtaga 600

agaaacgatg atggtaactt cccagctgtt caaattccat cttcttctac ttcttctcca 660

gttggtcaac ctacttctac ttctaccact tctacttcca ctacttcttc tcctcctgtt 720

caaccaacta ctccatctgg ttgtactgct gaaagatggg ctcaatgtgg tggtaatggt 780

tggtctggtt gtaccacttg tgttgctggt tctacttgta ctaaaattaa tgattggtac 840

caccaatgtt tg 852

<210> 5

<211> 284

<212> PRT

<213> H. insolens Y1

<400> 5

Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys

1 5 10 15

Gly Trp Ala Lys Lys Ala Pro Val Asn Gln Pro Val Phe Ser Cys Asn

20 25 30

Ala Asn Phe Gln Arg Leu Thr Asp Phe Asp Ala Lys Ser Gly Cys Glu

35 40 45

Pro Gly Gly Val Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val

50 55 60

Asn Asp Asp Phe Ala Phe Gly Phe Ala Ala Thr Ser Ile Ala Gly Ser

65 70 75 80

Asn Glu Ala Gly Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser

85 90 95

Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly

100 105 110

Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn Ile Pro Gly Gly Gly

115 120 125

Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly

130 135 140

Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Asn Glu Cys Asp Arg Phe Pro

145 150 155 160

Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp Trp Phe Lys Asn

165 170 175

Ala Asp Asn Pro Ser Phe Ser Phe Arg Gln Val Gln Cys Pro Ala Glu

180 185 190

Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp Asp Gly Asn Phe Pro

195 200 205

Ala Val Gln Ile Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser Pro Val Gly Gln Pro

210 215 220

Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Ser Pro Pro Val

225 230 235 240

Gln Pro Thr Thr Pro Ser Gly Cys Thr Ala Glu Arg Trp Ala Gln Cys

245 250 255

Gly Gly Asn Gly Trp Ser Gly Cys Thr Thr Cys Val Ala Gly Ser Thr

260 265 270

Cys Thr Lys Ile Asn Asp Trp Tyr His Gln Cys Leu

275 280

Claims

1.一种优化的中性纤维素酶基因HiZX-m1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种优化的中性纤维素酶基因HiZX-m1的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获取中性纤维素酶基因HiZX，其序列如SEQ ID NO.1所示；

3.一种包含如权利要求1所述优化的中性纤维素酶基因HiZX-m1的重组载体。

4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所示重组载体的起始表达载体为pPIC9K质粒。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，将优化的中性纤维素酶基因HiZX-m1插入到pPIC9K质粒的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该基因位于pPIC9K启动子的下游并受其调控，得到重组载体pPIC9K-HiZX-m1。

6.一种包含如权利要求1所述优化的中性纤维素酶基因HiZX-m1的重组菌株。

7.如权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母。

8.如权利要求1所述优化的中性纤维素酶基因HiZX-m1在中性纤维素酶生产中的应用。

9.一种生产中性纤维素酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将权利要求1所述优化的中性纤维素酶基因HiZX-m1插入表达载体的限制性酶切位点之间，得到重组载体；

(2)使用重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

(3)培养重组菌株，诱导重组中性纤维素酶表达；

(4)回收并纯化所表达的中性纤维素酶。