CN110564748A

CN110564748A - 一种茯苓纤维素内切酶基因及其表达载体和蛋白

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Publication number: CN110564748A
Application number: CN201911006003.5A
Authority: CN
Inventors: 李洪波; 胡兴
Original assignee: Huaihua University
Current assignee: HUNAN BUSKY PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.
Priority date: 2019-10-22
Filing date: 2019-10-22
Publication date: 2019-12-13
Anticipated expiration: 2039-10-22
Also published as: CN110564748B

Abstract

本发明涉及一种编码茯苓纤维素内切酶的人工合成基因，该基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片：1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。按照本发明所述的基因序列进一步构建重组载体并转化酵母，可实现该重组茯苓纤维素内切酶在甲醇诱导下的分泌表达，通过硫铵沉淀和DEAE离子交换柱进行纯化，可得到纯度高于95％重组茯苓纤维素内切酶，该酶具有很强的将纤维素成分降解并产生葡萄糖的能力，将为分解纤维素并应用于饲料、纺织、食品和生物能源的生产提供高活力的重组酶。

Description

一种茯苓纤维素内切酶基因及其表达载体和蛋白

技术领域

本发明属于生物分子克隆技术领域，涉及一种编码茯苓纤维素内切酶基因及其表达载体和蛋白。

背景技术

纤维素是由葡萄糖以β-1，4糖苷键构成的多糖，是构成植物细胞壁的重要组分。纤维素在植物体中的含量最多，约占植物干重的1/2，是自然界数量最大的可再生自然资源，由2000-10000个葡萄糖分子组成的长链大分子。纤维素是自然界中十分丰富的资源，如麻、麦秆、稻草、甘蔗渣等，都是纤维素的丰富来源。目前，纤维素的利用率还非常低，如何提高纤维素的利用率仍是一个世界级的课题。纤维素的高效利用离不开降解纤维素相关的酶类。纤维素酶复合体是一种超分子结构的多酶蛋白复合体，由多个亚基构成。非复合体纤维素酶由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶组成。非复合体纤维素酶主要由好氧的丝状真菌产生，它们是分解纤维素的最重要的酶源。

目前虽然发现产纤维素酶的生物群种很多，如细菌、真菌、放线菌及昆虫、软体动物等，但是随着纤维素酶在工、农、畜和医学等领域都有广泛的需求，其需求量正日益增大，纤维素酶制剂供不应求，前景十分广阔。而我国的纤维素酶工业制备还处于研究开发阶段，纤维素酶的生产还存在纤维素酶活力较低，生产成本较高，生产周期较长等问题使得纤维素酶的应用受到限制，因此，需要克服纤维素酶大量生产的瓶颈。纤维素酶系包含内切酶、外切酶和糖苷转移酶3种酶。其中，纤维素内切酶对纤维素的分解起重要作用。目前市售纤维素酶都是各种酶的混合物，很少有利用基因工程手段获得大最高纯度和高活性的纤维素内切酶的相关产品和技术。

目前，纤维素酶的研究已引起国内外学术界的广泛关注。纤维素酶作为一种高效、安全的生物催化剂，应用前景非常广阔。但是，纤维素酶产生菌仍存在产量低、成本高，易失活，添加量和添加方式不明确等一系列问题。除继续加强菌种选育和发酵工艺等基础研究工作，应特别是要注意利用DNA基因重组技术的应用，来选育出活性高、产酶量大的重组菌。以提高纤维素酶的产量和质量，加速纤维素酶的生产和推广应用，保证其应用效果，创造出更好的经济效益和社会效益。在申请号为201811240264.9和201811281667.8中，以pET28和pET32为载体利用大肠杆菌系统对纤维素内切酶进行了表达并纯化得到一定量活性好的重组蛋白，但利用上述两种载体表达的蛋白都是胞内蛋白，纯化时需要先破碎菌体，纯化步骤比较麻烦且回收率较低。而且在大肠杆菌中表达，可能因为LPS的存在而产生毒性，因此往往需要对表达纯化产物的毒性进行分析测定。最后，要得到高纯度的蛋白往往需要经过多步纯化操作处理，纯化的步骤越多，蛋白质的得率就会越低，且更可能导致目标产物的失活。酵母是一种高效的外源基因表达体系，以Pichia pastoris(毕赤巴斯德酵母)为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。但每一种蛋白能否实现在酵母中的高水平分泌表达需要合适的基因序列、筛选高水平分泌表达的转化子、优化表达条件和建立高效的蛋白纯化方法。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一种茯苓纤维素内切酶重组基因、蛋白、重组表达载体及其制备蛋白的方法与应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、本发明提供基因，为编码茯苓纤维素内切酶类蛋白的基因，为如下(1)-(2)中任意一种的DNA分子：

(1)由序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子；

(2)与(1)限定的DNA序列至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有水解纤维素活性的蛋白的DNA分子。

其中，序列表中的SEQ ID No.1由1125个脱氧核苷酸组成，本序列包括茯苓纤维素内切酶基因的成熟蛋白全长读码框和终止密码子，编码具有序列表中SEQ ID No.2的氨基酸残基序列的蛋白质。

由上述序列表中的SEQ ID No.1编码得到的蛋白属于本发明的保护范围。

2、本发明提供蛋白，是如下(1)或(2)：

(1)由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的由SEQ ID No.2衍生的蛋白质。

其中，序列表中的SEQ ID No.2由374个氨基酸残基组成，其编码基因的读码框包含1125个核苷酸。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

3、含有上述基因的重组载体、表达盒或重组菌也属于本发明的保护范围。

进一步，所述重组载体由空载体和插入该空载体的目的基因组成，具体为将上述基因合成后直接插入表达空载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。

进一步，所述重组载体具体为将上述基因插入表达空载体pPICZαA的Xho I和XbaI酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。

4、本发明的第四个目的是提供一种制备茯苓纤维素内切酶蛋白的方法，包括以下步骤：

S1：将技术方案1所述的基因和表达载体pPICZαA分别用Xho I和Xba I双酶切并纯化回收，然后利用连接酶在16℃连接，得重组载体pPICZαA-茯苓纤维素内切酶；

S2：将所述重组载体pPICZαA-茯苓纤维素内切酶用Sac I单酶切线性化，并用氯化锂转化法转化到毕赤酵母宿主菌中，再经过Zeocin筛选得到阳性克隆；

S3：高水平表达纤维素内切酶转化子的筛选：将PCR验证后的阳性克隆转接至含有1500μg/mL Zeocin的YPD平板，筛选得到高Zeocin抗性的转化子，用含有10ml BMGY培养液的50毫升离心管培养高抗性的转化子，28℃、250rpm培养至OD₆₀₀＝10～12，离心收集菌体并加入2ml的BMMY培养基，28℃、250rpm培养2天，每隔24小时向离心管中加入30μl的甲醇，诱导结束后，离心取上清，取上清液20μl，SDS-PAGE检测目标蛋白的表达情况。另外，将上清液20μl加入到80μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品50μl和2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。同时，以葡萄糖标准品制作标准曲线。吸光值最大的转化子即为最高水平表达茯苓纤维素内切酶的转化子。

S4：将高水平表达茯苓纤维素内切酶的转化子用BMGY大量生长培养，之后用BMMY培养基重悬细胞并在28℃继续诱导培养，用于大量分泌纤维素内切酶重组蛋白，并补加甲醇使其质量分数保持在1～1.5％。

进一步，将所述高表达纤维素内切酶的转化子用1L的BMGY培养基扩大培养至OD600为10～15，离心所得菌体用100ml的BMMY培养基重悬后，诱导培养用于大量分泌纤维素内切酶重组蛋白，诱导培养的条件是：28℃、250rpm、每隔24小时向离心管中加入1ml的甲醇，共诱导3-4天。

BMGY扩大生长培养后，一般以生长培养基1/10-1/5体积的诱导培养基BMMY来诱导培养。

优选地，在步骤S4之后，还包括纯化蛋白的如下步骤：

S5：将所述S4发酵后的培养液离心，用相对饱和度为80％的硫铵溶液沉淀目标蛋白，经pH 8的10mM Tris-HCl透析去除盐离子，再利用蛋白纯化系统，先用pH 8的10mMTris-HCl缓冲液平衡DEAE层析柱，再将经离心和过滤处理的透析液上清液过柱，用200ml含20mM NaCl的pH 8的PBS缓冲液漂洗柱子直至蛋白纯化系统检测到的280nm处的吸光值接近于基线；

S6：然后用含200NaCl的pH 8的20mM PBS将目标蛋白洗脱下来即当蛋白纯化系统检测到的280nm处的吸光值接近0.1AU时收集洗脱液即可得到目标蛋白，将得到的洗脱液利用分子量为10kDa的透析袋于20mM PBS缓冲液中透析，然后超滤浓缩。

优选地，在步骤S5之后，还包括保存蛋白的如下步骤：

S7：将所述超滤浓缩得到的产品在-80℃下速冻，然后冷冻干燥。

根据上述任一种制备蛋白的方法制备得到的蛋白也属于本发明的保护范围。

通过步骤S3筛选得到的稳定且能高水平分泌表达茯苓纤维素内切酶的酵母转化子也属于本发明保护的范围。

上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒也是本发明保护的范围。

本发明提供的技术方案具有以下优点：一是根据本发明所提供的SEQ ID No.1所示的基因利用毕赤酵母表达质粒pPICZαA为载体，可实现目标蛋白在毕赤酵母宿主菌X33中的高水平重组分泌表达，且所提供的表达方法能分泌表达和纯化得到具有酶解纤维素为葡萄糖生物活性的重组纤维素内切酶。同时能够有效防止宿主菌对表达产物的降解，减轻宿主细胞代谢的负荷和表达产物对宿主的毒性作用；二是利用酵母载体pPICZαA-茯苓纤维素内切酶上的分泌信号α-因子信号肽引导目的蛋白的基因分泌表达，目的蛋白会大量分泌到培养液中，且能形成准确的空间结构，从而保持茯苓纤维素内切酶的天然活性；三是通过筛选得到了稳定且能高水平分泌表达得茯苓纤维素内切酶的酵母转化子；四是摸索出用真核宿主毕赤酵母来表达茯苓纤维素内切酶的方法和快速高效纯化茯苓纤维素内切酶的方法，可以降低成本且实现大量生产；六是表达的重组蛋白可以利用镍亲合层析快速纯化，纯化的蛋白具有很强的水解纤维素的生物活性。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例中的表达载体pPICZαA-茯苓纤维素内切酶构建示意图。

图2为本发明实施例中高Zeocin抗性茯苓纤维素内切酶的酵母转化子培养液上清的SDS-PAGE检测结果图。

图3为本发明实施例中在扩大培养条件下，不同时间点目标蛋白表达情况的SDS-PAGE检测结果图。

图4为本发明实施例中200mM NaCl洗脱纯化得到的茯苓纤维素内切酶蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图5为茯苓纤维素内切酶重组蛋白其中一段肽段的质谱结果。

图6为对比例酵母转化子上清液中蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图7为本发明实施例中重组茯苓纤维素内切酶蛋白的生物学活性检测的薄层层析结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

本发明选用毕赤酵母菌株和整合性表达质粒pPICZαA均购自美国Invritrogen公司。

所用培养基配方如下：

1)酵母生长培养基(BMGY)

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到800mL。121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却到室温，加入100mL 1M磷酸钾溶液，100mI YNB，2mL 500×生物素，20mL 50％灭菌甘油；

2)酵母诱导培养基(BMMY)

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到800mL。121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却到室温，加入100mL 1M磷酸钾溶液，100mL YNB，2mL500×生物素，10mL甲醇；

3)YPD培养基

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到900mL，121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却至70℃左右再加入100mL 20％灭菌葡萄糖溶液。在其中加入1.6-1.8％的琼脂可制得YPD固体培养基。

实施例1

本实施例提供了一种优化的人工合成的C-端带有6×His标签的茯苓纤维素内切酶基因，具体序列如序列表中的SEQ ID No.1所示，该基因所对应的蛋白质序列如序列表中的SEQ ID No.2所示。优化后的DNA序列经NCBI比对，没有明显相似性。

甲醇酵母表达系统是应用最广泛的酵母表达系统，以Pichia pastoris(毕赤巴斯德酵母)为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。酵母是单细胞低等真核生物，酵母表达系统与昆虫表达系统、哺乳动物表达系统相比，兼具两者优点，同时酵母表达系统具有操作简单，成本低廉，可大规模进行发酵等特点，因此是比较理想的重组真核蛋白质生产制备工具。酵母表达产物长期广泛地应用于食品工业，不产生毒素，安全性好，已被认定为安全性生物，其表达产物不需经过大量宿主安全性实验。但是也有不足，易产生不正确的蛋白糖基化，分泌效率低，对于30KD大小的蛋白不易表达。

将本发明根据纤维素内切酶基因自身序列特点和酵母密码子偏好性合成的SEQID No.1 DNA序列连接至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA上，得到重组载体，然后利用Invitrogen公司操作手册提供的氯化锂转化法分别将重组载体转化到毕赤酵母宿主菌X-33中，转化后分别用含有100μg/mL Zeocin抗生素的YPD平板进行筛选。将100μg/ml Zeocin抗生素的YPD平板生长的毕赤酵母转化子用无菌水洗下，涂布接种至终浓度为250μg/mlZeocin抗生素的YPD平板，该抗性平板生长的转化子再涂布到500μg/ml Zeocin抗生素的YPD平板；将500μg/ml Zeocin抗生素的YPD平板生长的毕赤酵母转化子用无菌水洗下，涂布接种至终浓度为1000μg/ml Zeocin抗生素的YPD平板；将1000μg/ml Zeocin抗生素的YPD平板生长的毕赤酵母转化子用无菌水洗下，涂布接种至终浓度为1500μg/ml Zeocin抗生素的YPD平板，最终得到在1500μg/ml Zeocin抗生素的YPD平板能正常生长的高抗性毕赤酵母转化子。将筛选得到高Zeocin抗性的转化子，用含有10ml BMGY培养液的50毫升离心管于28℃、250rpm条件下培养至OD₆₀₀＝10～12，离心收集菌体并加入2ml的BMMY培养基，28℃、250rpm培养2天，每隔24小时向离心管中加入30μl的甲醇，诱导结束后，离心取上清，离心取上清，取上清液20μl用于SDS-PAGE检测，分析目标蛋白的表达情况，结果观察到目标蛋白的大量表达。同时，将20μl上清液加入到80μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品10μl、2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值，结果表明，SDS-PAGE检测到了高水平表达目标蛋白的转化子其上清液中同样存在很高的酶活。说明利用本发明提供的序列和方法可以筛选到的转化子可以高水平地分泌表达目标蛋白，且目标蛋白能将纤维素分解产生葡萄糖。

实施例2

本实施例提供一种制备茯苓纤维素内切酶蛋白的方法，具体包括如下步骤：

S1：构建表达载体及转化：将实施例1的基因自身序列特点和酵母密码子偏好性合成的DNA序列即SEQ ID No.1所示的DNA连接至毕赤酵母诱导型分泌型表达载体pPICZαA，得到重组载体pPICZαA-茯苓纤维素内切酶，载体构建如图1所示，图1为本发明实施例中的真核表达载体pPICZαA-茯苓纤维素内切酶构建示意图。主要的载体构建步骤优选如下：

(1)用Xho I和Xba I双酶切含合成的茯苓纤维素内切酶基因的人工合成质粒，获得目的片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(2)用Xho I和Xba I双酶切pPICZαA，获得载体片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(3)将步骤(1)和(2)得到的目的片断和载体片断用DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行。

(4)将步骤(3)回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶(购自大连TAKARA公司)进行连接反应，目的基因准确插入到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内，反应体系如下：

S2：重组质粒的转化：将所述重组载体pPICZαA-茯苓纤维素内切酶用Sac I单酶切线性化，按照Invitrogen公司操作手册提供的氯化锂转化法，将重组载体转化到毕赤酵母宿主菌中，本实施例选用的是X-33。转化后用含有100μg/mL Zeocin抗生素的YPD平板进行筛选。将100μg/ml Zeocin抗生素的YPD平板生长的毕赤酵母转化子用无菌水洗下，涂布接种至终浓度为250μg/ml Zeocin抗生素的YPD平板，该抗性平板生长的转化子再涂布到500μg/ml Zeocin抗生素的YPD平板；将500μg/ml Zeocin抗生素的YPD平板生长的毕赤酵母转化子用无菌水洗下，涂布接种至终浓度为1000μg/ml Zeocin抗生素的YPD平板；将1000μg/mlZeocin抗生素的YPD平板生长的毕赤酵母转化子用无菌水洗下，涂布接种至终浓度为1500μg/ml Zeocin抗生素的YPD平板，最终得到在1500μg/ml Zeocin抗生素的YPD平板能正常生长的高抗性毕赤酵母转化子。

S3：高水平分泌表达酵母转化子的筛选和蛋白的表达：将PCR验证后的高Zeocin抗性的转化子，用含有10ml BMGY培养液的50毫升离心管于28℃、250rpm条件下培养至OD₆₀₀＝10～12，离心收集菌体并加入2ml的BMMY培养基，28℃、250rpm培养2天，每隔24小时向离心管中加入30μl的甲醇，诱导结束后，离心取上清液20μl用于SDS-PAGE检测，筛选得到了数株高水平分泌表达重组茯苓纤维素内切酶蛋白的转化子。同时，将20μl上清液加入到80μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品10μl、2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。根据目标蛋白条带的浓度和吸光值的大小确定最高水平表达茯苓纤维素内切酶的转化子，结果表明，数株高水平分泌表达重组茯苓纤维素内切酶的转化子同样检测到了很高的吸光值即这数株转化子的上清液具有很强的酶活。

S4：将S3筛选到的1株高表达茯苓纤维素内切酶的转化子用BMGY培养基扩大培养至OD600为10～12，离心所得菌体用BMMY培养基重悬细胞并在28℃继续诱导培养，用于大量分泌茯苓纤维素内切酶重组蛋白，并补加甲醇使其质量分数保持在1～1.5％。

进一步，将所述高表达茯苓纤维素内切酶的转化子用1L的BMGY培养基扩大培养至OD600为10～12，离心所得菌体用100ml的BMMY培养基重悬后，诱导培养用于大量分泌茯苓纤维素内切酶重组蛋白，诱导培养的条件是：28℃、250rpm、每隔24小时向离心管中加入1ml的甲醇，共诱导3-4天。

优选地，在步骤S4之后，还包括纯化蛋白的如下步骤：

S5：将所述S4发酵后的培养液离心，用相对饱和度为80％的硫铵溶液沉淀蛋白，沉淀的离心去上清后，用pH 8的10mM Tris-HCl溶解，再经pH 8的10mM Tris-HCl透析去除盐离子，再利用蛋白纯化系统，先用pH 8的10mM Tris-HCl缓冲液平衡DEAE层析柱，再将经离心和过滤处理的透析液上清液过柱，用200ml含20mM NaCl的pH 8的PBS缓冲液漂洗柱子直至蛋白纯化系统检测到的280nm处的吸光值接近于基线；

S6：然后用含200mM NaCl的pH 8的20mM PBS将目标蛋白洗脱下来即当蛋白纯化系统检测到的280nm处的吸光值接近0.1AU时收集洗脱液即可得到目标蛋白，将得到的洗脱液利用分子量为10kDa的透析袋于20mM PBS缓冲液中透析，然后超滤浓缩。

需要说明的是，将高Zeocin抗性的转化子用BMMY培养基小量表达，经SDS-PAGE分析，从高抗性(抗性水平为1500μg/mL Zeocin)转化子中筛选得到了数株稳定且高水平分泌表达茯苓纤维素内切酶的酵母转化子，而从抗性水平低于500μg/mL Zeocin YPD平板的转化子分泌表达目标蛋白的能力明显低于高抗性的转化子且酶活检测具有同样的结果，部分高Zeocin抗性转化子分泌目标蛋白的SDS-PAGE结果如图2所示。

同样需要说明的是，用SDS-PAGE检测不同时间目标蛋白表达情况分析，电泳结果如图3所示，图3为本发明实施例中在甲醇诱导下不同时间点目标蛋白表达情况的SDS-PAGE检测结果图。经培养1～4天，通过继续补加甲醇，培养得到的目的蛋白总量更高，具体目的蛋白占上清液蛋白的总量结果如下表1所示。

表1总蛋白含量

诱导时间	1天	2天	3天	4天
					总蛋白浓度(mg/L)	120	270	630	880

取培养1～4天的发酵液上清，经SDS-PAGE，在45kDa左右有明显目的蛋白表达，且通过继续补加甲醇，培养得到的目的蛋白总量更高，SDS-PAG胶的灰度扫描结果显示，目标蛋白的比例与培养时间成正相关，SDS-PAGE的检测结果如图3所示。另外，目的蛋白占上清液总蛋白的比例结果如下表2所示。

表2不同诱导时间得到的目的蛋白占上清液蛋白的百分比含量结果

诱导时间	1天	2天	3天	4天
					百分比含量(％)	28	35	50	65

经计算，目的蛋白含量结果如下表3所示，经4天的诱导目标蛋白的总量可达570mg/L。

表3目标蛋白总量

诱导时间	1天	2天	3天	4天
					茯苓纤维素内切酶(mg/L)	35	95	320	580

取培养1～4天的发酵液上清，20μl上清液加入到80μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品10μl、2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。所得的吸光值变化如表4所示。从结果可以看出，在培养到第4天之后，酶活力达最大值，但从结果看也在诱导3天后，酶活增加的幅度开始下降。

表4吸光值变化结果

诱导时间	1天	2天	3天	4天
					340nm测定吸光值	0.18	0.55	2.21	2.75

经计算，在诱导培养96小时后，上清液中的纤维素内切酶的酶活力达到180.2IU/mL。需要说明的是，在经过4天的甲醇诱导后，对目标蛋白进行了高效纯化，纯化方法优选如下：

S5：将所述发酵后的培养液离心，用相对饱和度为80％的硫铵溶液沉淀目标蛋白，经pH8的10mM Tris-HCl透析去除盐离子，再利用蛋白纯化系统，先用pH 8的10mM Tris-HCl缓冲液平衡DEAE层析柱，再将经离心和过滤处理的透析液上清液过柱，用200ml含20mMNaCl的pH 8的PBS缓冲液漂洗柱子直至蛋白纯化系统检测到的280nm处的吸光值接近于基线；

S6：然后用含200mM NaCl的pH 8的20mM PBS将目标蛋白洗脱下来，即当蛋白纯化系统检测到的280nm处的吸光值接近0.1AU时开始收集洗脱液即可得到目标蛋白，其中目标蛋白的洗脱曲线和目标蛋白的SDS-PAGE验证结果如图4所示。将得到的洗脱液利用分子量为10kDa的透析袋于20mM PBS缓冲液中透析，然后超滤浓缩。

本发明提供的SEQ ID No.1以pPICZαA为表达载体，X33为表达菌株，经发酵后每100mL发酵液可以纯化到的目标蛋白为38毫克，最终目标蛋白的回收率都大于80％且纯度都在95％以上，可见本发明提供的SEQ ID No.1以毕赤酵母为表达系统，pPICZαA为表达载体，X33为表达菌株，目标蛋白的表达水平高且易于纯化。

表5发酵液上清蛋白纯化结果

纯化步骤	总体积	内切酶(mg)	目标蛋白纯度(％)	回收率(％)
					纯化前	100	58	72	100
镍亲合纯化	20	49	>95	84
					透析	21	49	>95	84
超滤浓缩	15	47	>95	81

优选地，在步骤S6之后，还包括保存蛋白的如下步骤：

S7：将所述超滤浓缩得到的产品在-80℃下速冻，然后冷冻干燥，即得到冻干粉蛋白。冻干粉溶解于生理盐水中，4℃、15000g的转速离心20分钟，取上清液进行SDS-PAGE分析，检测到了目标蛋白且目标蛋白具有很高纯度，同时将目标蛋白进行了质谱鉴定，得到了数段肽段均属于重组茯苓纤维素内切酶中的一段，其中的一段肽段的质谱结果如图5所示，该肽段序列是：SGATTCVAGSVCSK，其与目标蛋白中的第14-30肽段序列完全一致，说明纯化到的蛋白是我们需要的茯苓纤维素内切酶重组蛋白，且该蛋白处理的方法不会使蛋白大量变性蛋白仍呈可溶解状态。

对比例

发明人利用转录组技术对茯苓的纤维素内切酶基因的表达谱进行分析发现了几个高丰度的纤维素分解的酶基因。利用转录组得到的数据，设计引物，经RT-PCR扩增目标基因并连接至克隆载体，扩增的目标基因天然序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；同样，也合成了另几种仅仅按酵母密码子偏爱性优化后合成的人工DNA序列分别连接至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA上，其中的一种仅按酵母密码子偏爱性优化后合成的人工序列如序列表中SEQ ID NO.4所示(以该序列为代表)。将上述茯苓纤维素内切酶基因序列用Xho I和Xba I双酶切，并连接到同样经Xho I和Xba I双酶切的pPICZαA表达载体。重组载体pPICZαA-茯苓纤维素内切酶用Sac I单酶切线性化，并用氯化锂转化法转化到毕赤酵母宿主菌中，再经过Zeocin筛选得到阳性克隆。将PCR验证后的毕赤酵母高抗性转化子再划线接种至含有1500μg/mL Zeocin的YPD平板，将能正常生长的转化子，用含有10ml BMGY培养液的50毫升离心管于28℃、250rpm条件下培养至OD₆₀₀＝10～12，离心收集菌体并加入2ml的BMMY培养基，28℃、250rpm培养2天，每隔24小时向离心管中加入30μl的甲醇，诱导结束后，离心取上清20μl并加入到80μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品10μl、2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。结果显示仅本发明提供的序列能实现目标蛋白的大量表达且具有很高的酶活。同时，以SDS-PAGE检测上清蛋白中目标蛋白的表达情况，SDS-PAGE的检测结果如图6所示，未在目标位置检测到目标蛋白条带。结果说明，只有本发明提供的根据茯苓纤维素内切酶基因自身序列特点和酵母密码子偏好性合成的DNA序列表SEQ ID NO.1所示的序列转化到毕赤酵母中才能实现目标蛋白的高水平分泌表达。

实施例3

本实施例对纯化的可溶性茯苓纤维素内切酶的酶活力进行检测，具体步骤和结果如下：

本发明采用葡萄糖己糖激酶(HK)法测定茯苓纤维素内切酶水解羧甲基纤维素钠(CMC-Na)产生葡萄糖的能力，己糖激酶在有ATP存在下催化葡萄糖(D-Glucose)使其磷酸化生成葡萄糖-6磷酸(G-6-P)，G-6-P和辅酶NAD在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的作用下生成NADH和6-磷酸葡萄糖酸，可通过分光光度法测定NADH在340nm波长下的吸光度变化，定量检测样品中葡萄糖的浓度，具体步骤和结果如下：将2μl浓度为1mg/mL的纯化的茯苓纤维素内切加入到98μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品10μl、2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。同时，以葡萄糖标准品制作标准曲线。所得的标准曲线方程为：Y＝0.0102X-0.0062，相关系数r＝0.9959，标准品的检测结果表如表6示。

表6标准品的检测结果

标准品浓度(ng/mL)	0	4	8	12	16	20	24
								OD<sub>340</sub>	0	0.036	0.072	0.112	0.151	0.198	0.248

(2)根据(1)的方法，分别利用pH 3，pH3.5，pH4，pH4.5，pH5的磷酸盐缓冲液，对酶活力进行了检测。在不同pH值下，相对活力(设定酶活力最高时pH下的酶活力为100％，其它情况下的相对酶活力是测得该pH条件下产生的葡萄糖总量与酶活力最高pH条件下产生的葡萄糖总量的比值)。表7为相对酶活力的检测结果，说明其最适pH在4.5左右。

表7不同pH值下相对酶活

(3)根据(1)的方法，分别利用4的磷酸盐缓冲液，对不同温度下的酶活进行了检测。酶活检测的结果如表7所示，从表中可以看出，该酶的最适温度为45℃左右。表8为不同温度下相对酶活检测结果(设定酶活最高时的温度下的相对酶活为100％，其它情况下的相对酶活是测得该温度条件下产生的葡萄糖总量与酶活力最高的温度下产生的葡萄糖总量的比值)。

表8不同温度下相对酶活

温度(℃)	40	45	50	55	60
						相对酶活(％)	87	100	92	84	72

因此，根据以上结果，本发明所制备的新的茯苓纤维素内切酶是一种能分解羧甲基纤维素钠产生葡萄糖的、最适pH为4.5左右、最适温度为45℃左右的小分子重组茯苓纤维素内切酶重组蛋白。

实施例4

本实施例对纯化的可溶性茯苓纤维素内切酶的分解羧甲基纤维素钠水解活力进行薄层层析检测，具体步骤和结果如下：

将终浓度为1mg/ml的重组茯苓纤维素内切酶100μl加入到等量的1％(质量百分比)CMC-Na溶液中，45℃下分别反应0、1、2和4小时。取硅胶G板于100℃烘箱活化后冷却至室温，用毛细管点样1μL，点样位置为从硅胶板下端1.5cm，两侧2～3cm，每个样品点相距1～1.5cm。将展层剂(乙酸乙酯∶乙酸∶水＝2∶1∶1)于层析缸中平衡，数分钟后，将硅胶板放入。当展层剂移至距上端2～3cm时，取出硅胶板吹干，均匀喷上显色剂(25％硫酸)，于100℃显色5～30min后从烘箱取出。显色结果如图7所示，从图中可以看出，不加纤维素酶时CMC-Na在仅在原点出现了染溶液没有染色班点，在加入茯苓纤维素内切酶反应1小时后出现了显色条带，且随着反应时间的延长，条带越多且着色更深，当反应到4小时时，在与葡萄糖标准品相同的位置出现了染色带，说明加入茯苓纤维素内切酶使CMC-Na出现了水解的现象且产生了少量的葡萄糖，即表明本发明生产的茯苓纤维素内切酶能高效地水解纤维素。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，而并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，而并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

序列表

<110> 怀化学院

<120> 一种茯苓纤维素内切酶基因及其表达载体和蛋白

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1125

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caatctccac aatggggtca gtgtggtggt attggttggt ctggtgctac tacttgtgtt 60

gccggttctg tttgctccaa gctgaacgac tactactccc agtgtattcc aggtgcttct 120

gctccagctt ctactactac ttcagctcca ccaactggta cttcccaacc atctactcca 180

gctggtgctt tgccaagact tggtggtgtt aatactgccg gttacgactt ctctgtttcc 240

actgacggtt ctttcaagcc accatactct gttccaccag cttctcaata ctcccacttc 300

actgctgagg gtgtcaactt gtacagaatc cctttcgctt ggcagttgat gaccccaact 360

cttggtggtt ctatcgacaa cggtttcttc tccacttacg acgctactgt tcagtccgct 420

ttgaactctg gttccaacgt tcacgtcatc atcgacttgc acaactacgc tagatggaac 480

ggtgctgtta ttgctcaagg tggtccaact aacgaccagt acgcttcttt gtggactcag 540

ttggctcaaa agtacggttc caaccagaga atcatcttcg gtatcatgaa cgagccacac 600

gacgttccat ccgtttctac ttgggttgac actgttcagc agaccgttaa cgctatcaga 660

aaggctggtg ccaccaacta cttgttgctt ccaggatctt cttgggcttc cgctcaggct 720

tttccaactg aagctggtcc tgctttggtt aaggttactg atccacttgg tggaaccgac 780

agattgatct tcgacgttca caagtacctg gactctgaca actctggtac tcacgctgaa 840

tgtaccactg acaacgtttc cgtcttgcag accttggttt ccttcctgca acaaaacggt 900

aacagacagg ctatcttgtc cgaaactggt ggtggaaaca ctgcttcttg tgagcagttg 960

ttgggtaacg agttggccta cgttaagtct gcttacccaa ctttggccgg tttcgctgtt 1020

tggtctgctg gtgcctttga cacttcttac gttttgtccg tcgttccaaa cggtgaccaa 1080

gatcaaccac tttggactca ggctgtcaag ccaaacttgc cataa 1125

<210> 2

<211> 374

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Ser Pro Gln Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Ser Gly Ala

1 5 10 15

Thr Thr Cys Val Ala Gly Ser Val Cys Ser Lys Leu Asn Asp Tyr Tyr

20 25 30

Ser Gln Cys Ile Pro Gly Ala Ser Ala Pro Ala Ser Thr Thr Thr Ser

35 40 45

Ala Pro Pro Thr Gly Thr Ser Gln Pro Ser Thr Pro Ala Gly Ala Leu

50 55 60

Pro Arg Leu Gly Gly Val Asn Thr Ala Gly Tyr Asp Phe Ser Val Ser

65 70 75 80

Thr Asp Gly Ser Phe Lys Pro Pro Tyr Ser Val Pro Pro Ala Ser Gln

85 90 95

Tyr Ser His Phe Thr Ala Glu Gly Val Asn Leu Tyr Arg Ile Pro Phe

100 105 110

Ala Trp Gln Leu Met Thr Pro Thr Leu Gly Gly Ser Ile Asp Asn Gly

115 120 125

Phe Phe Ser Thr Tyr Asp Ala Thr Val Gln Ser Ala Leu Asn Ser Gly

130 135 140

Ser Asn Val His Val Ile Ile Asp Leu His Asn Tyr Ala Arg Trp Asn

145 150 155 160

Gly Ala Val Ile Ala Gln Gly Gly Pro Thr Asn Asp Gln Tyr Ala Ser

165 170 175

Leu Trp Thr Gln Leu Ala Gln Lys Tyr Gly Ser Asn Gln Arg Ile Ile

180 185 190

Phe Gly Ile Met Asn Glu Pro His Asp Val Pro Ser Val Ser Thr Trp

195 200 205

Val Asp Thr Val Gln Gln Thr Val Asn Ala Ile Arg Lys Ala Gly Ala

210 215 220

Thr Asn Tyr Leu Leu Leu Pro Gly Ser Ser Trp Ala Ser Ala Gln Ala

225 230 235 240

Phe Pro Thr Glu Ala Gly Pro Ala Leu Val Lys Val Thr Asp Pro Leu

245 250 255

Gly Gly Thr Asp Arg Leu Ile Phe Asp Val His Lys Tyr Leu Asp Ser

260 265 270

Asp Asn Ser Gly Thr His Ala Glu Cys Thr Thr Asp Asn Val Ser Val

275 280 285

Leu Gln Thr Leu Val Ser Phe Leu Gln Gln Asn Gly Asn Arg Gln Ala

290 295 300

Ile Leu Ser Glu Thr Gly Gly Gly Asn Thr Ala Ser Cys Glu Gln Leu

305 310 315 320

Leu Gly Asn Glu Leu Ala Tyr Val Lys Ser Ala Tyr Pro Thr Leu Ala

325 330 335

Gly Phe Ala Val Trp Ser Ala Gly Ala Phe Asp Thr Ser Tyr Val Leu

340 345 350

Ser Val Val Pro Asn Gly Asp Gln Asp Gln Pro Leu Trp Thr Gln Ala

355 360 365

Val Lys Pro Asn Leu Pro

370

<210> 3

<211> 1125

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caatcaccgc aatggggcca atgcggaggt attggctggt ctggcgcaac tacttgcgtt 60

gccgggtcgg tctgcagcaa gctaaatgat tactactcgc aatgtattcc cggagcttca 120

gcccccgcct ctaccactac cagtgcccct ccaactggta catcgcaacc ctcaacaccc 180

gctggcgccc ttcctcgtct cggaggtgtc aacactgctg gttacgattt ctccgtcagc 240

acggatggaa gtttcaagcc accttattcc gttcctcctg cttcgcagta ttcccacttt 300

actgccgagg gtgtcaacct ctaccgtatt ccatttgcat ggcagcttat gactcctacc 360

ctcggtggta gcatcgacaa tgggttcttc tcgacctacg atgccactgt tcagtccgct 420

ttgaactccg gatctaacgt ccatgttatc atcgaccttc acaactatgc tcgctggaat 480

ggtgccgtta tcgctcaagg tggaccaacc aacgaccagt acgcaagctt gtggacgcaa 540

cttgcacaga agtacggcag caaccaacgt atcatctttg gtatcatgaa tgagccccac 600

gatgtgccct ccgtctctac ctgggttgac actgtccagc aaaccgtcaa cgctatccgt 660

aaggctggtg ctaccaacta cctgcttctt cccggaagca gctgggcctc tgcgcaggct 720

ttccctactg aggccggtcc tgctctcgtg aaggtcaccg accctcttgg tggaactgac 780

aggctcatct tcgatgtcca caagtacctc gacagtgata acagcggaac acatgccgag 840

tgcactacag ataacgtctc tgtcctccag accctcgtct ctttcctcca gcagaacggt 900

aacagacagg ctatcctcag tgagactggt ggcggcaaca ctgctagctg cgagcaactc 960

ctcggcaacg agctcgccta tgtcaagagt gcatacccaa cgctcgccgg cttcgctgtt 1020

tggtctgctg gtgccttcga tacctcatat gttctgtcgg tggtccccaa cggcgaccag 1080

gatcagccac tctggaccca ggccgttaag cccaacctcc cttga 1125

<210> 4

<211> 1122

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cagagtccgc agtggggtca gtgtggtggt attggttgga gcggtgcaac cacctgtgtt 60

gcaggtagcg tttgtagcaa actgaatgat tattacagcc agtgtattcc gggtgcaagc 120

gcaccggcaa gcaccaccac aagtgcaccg cctaccggca ccagccagcc gagtacaccg 180

gctggtgcac tgcctcgttt aggtggtgtt aataccgcag gttatgattt tagcgttagc 240

accgatggta gctttaaacc gccttatagc gttccgcctg caagccagta tagccatttt 300

accgcagaag gtgttaatct gtatcgtatt ccgtttgcat ggcagctgat gaccccgacc 360

ttaggtggta gcattgataa tggttttttc agcacctatg atgcaaccgt tcagagcgca 420

ctgaatagcg gtagcaatgt tcatgttatt atcgacctgc ataactatgc acgttggaat 480

ggtgcagtta ttgcacaagg tggtccgacc aatgatcagt atgcaagcct gtggacccag 540

ctggcacaga aatatggtag caatcagcgt attatcttcg gcattatgaa tgaaccgcat 600

gatgttccga gcgtgagcac ctgggttgat accgttcagc agaccgttaa tgcaattcgt 660

aaagccggtg ccaccaatta tctgctgctg cctggtagca gctgggccag cgcacaggca 720

tttccgaccg aagcaggtcc ggcactggtt aaagttaccg atccgttagg tggcacagat 780

cgtctgattt ttgatgtgca taaatatctg gatagcgata atagcggcac ccatgcagaa 840

tgtaccaccg ataatgttag cgttctgcag accctggtga gctttctgca gcagaatggt 900

aatcgtcagg caattctgag cgaaaccggt ggtggcaata ccgccagctg tgaacagctg 960

ctgggtaatg aactggcata tgttaaaagc gcatatccga cactggcagg ttttgcagtt 1020

tggagtgccg gtgcatttga taccagctat gttctgagcg ttgttccgaa tggtgatcag 1080

gatcagccgc tgtggacaca ggcagttaaa ccgaatctgc cg 1122

Claims

1.一种茯苓纤维素内切酶基因，其特征在于，所述基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片段：

1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；

2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或至少具有90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的基因编码得到的茯苓纤维素内切酶。

3.根据权利要求2所述的茯苓纤维素内切酶，其特征在于：所述茯苓纤维素内切酶为如下(1)或(2)的蛋白：

(1)蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；

(2)序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有茯苓纤维素内切酶活性的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。

4.含有权利要求1所述基因的重组载体、表达盒或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，其特征在于，所述目的基因为权利要求1所述的基因。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述空载体为pPICZαA载体。

7.一种权利要求2或3所述的茯苓纤维素内切酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将权利要求1所述的基因重组到构建到pPICZαA载体中，经转化到毕赤酵母宿主菌细胞中并用1500μg/mL Zeocin的YPD平板筛选得到高Zeocin抗性的转化子；

2)将步骤1)所得的转化子用BMGY培养基培养至OD₆₀₀为10～12，离心收集细胞沉淀，用BMMY培养基重悬细胞，加入甲醇并使其质量分数为1％～1.5％，诱导1-3天，筛选高水平分泌表达茯苓纤维素内切酶的酵母转化子；

3)高水平分泌表达茯苓纤维素内切酶的酵母转化子用BMGY扩大生长培养，之后用BMMY培养基重悬细胞并在28℃继续诱导培养3-4天，每24小时补加甲醇使其质量分数保持在1％～1.5％。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤3)诱导培养中，BMMY诱导培养基的体积为BMGY生长培养基1/10-1/5体积。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，还包括蛋白纯化步骤：相对饱和度为80％的硫铵溶液沉淀目标蛋白，经pH 8的10mM Tris-HCl缓冲液溶解并去除盐离子，先用pH8的10mM Tris-HCl缓冲液平衡DEAE层析柱，再将经离心和过滤处理的蛋白液过柱，用含20mM NaCl的pH 8的10mM Tris-HCl缓冲液漂洗柱子，然后用含200mM NaCl的pH 8的20mMPBS将目标蛋白洗脱下来即可得到高纯度目标蛋白。

10.根据权利要求7-9任一项所述制备方法得到的蛋白及该蛋白在饲料、纺织、食品和生物能源领域中的应用。