CN110184290B - 一种用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒及工程菌与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒，所述遗传重组质粒是将CovR基因或CovS基因和长度为221bp的Ppgk启动子插入pSET4s::oriB.s载体的多克隆位点处，构建成功。本发明工程菌的HA产量明显高于野生型，以工程菌CovR/OP进行透明质酸的发酵生产，其透明质酸的产量比野生型菌株提高10％，透明质酸分子量比野生型提高10％；以工程菌CovS/OP进行透明质酸的发酵生产，其透明质酸的产量比野生型菌株提高20％，透明质酸分子量比野生型提高15％；本发明丰富了透明质酸的分子量类型，满足市场对不同分子量透明质酸的需求。

Description

一种用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒及工程菌与 应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其是一种用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒及工程菌与应用。

背景技术

HA是一种天然的、由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺通过β-1-3和β-1-4糖苷键交替连接而成的一种高分子的规则线性的酸性粘多糖。由于HA是复杂的多种酸性粘多糖的混合物，因而它的分子量并不是一个固定的值，且不同分子量的HA具有不同的功能。大分子量HA主要用于医药领域，小分子量HA主要用于化妆品中；为了满足不同的市场需求，越来越多的研究集中于怎样改变HA的分子量，以期获得更多不同分子量的HA。目前，不同分子量的透明质酸制备方法主要通过物理方法、化学方法和酶法。三种方法分别具有需要条件剧烈、环境污染严重、不适合规模化生产的缺点。利用发酵工程手段直接发酵生产不同分子量的HA可以避免上述缺点，成为当前的一个研究热点。目前生产用菌株的主要缺陷之一是生产的透明质酸分子量偏低，针对这一问题，研究人员通过不同策略获得了不同类型的大分子量透明质酸工程菌株，比如，野生型菌株通过敲除hylB基因获得突变株ΔhylB，可稳定生产平均分子量为3.9MDa的透明质酸(CN201310737032.5)；也有报道通过高表达hasD，获得的重组菌株产生的透明质酸分子量可达5.4MDa(Journal of Biological Chemistry,284(27),18007–18014.)。但是，目前大分子量透明质酸工程菌所对应的分子量类型较少，不能满足市场对不同分子量透明质酸的需求。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中市场对大分子量透明质酸的巨大需求，而现有工程菌所生产的HA分子量类型少、范围窄的问题，提供一种用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒及工程菌与应用，丰富了透明质酸的分子量类型，满足市场对不同分子量透明质酸的需求。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒，所述遗传重组质粒是将CovR基因或CovS基因与长度为221bp的Ppgk启动子插入pSET4s::oriB.s载体的多克隆位点处，构建成功pSET4s::oriB.s::CovR或pSET4s::oriB.s::CovS；

其中，所述Ppgk启动子的序列为SEQ ID NO.3所示，所述基因表达载体pSET4s::oriB.s的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。

而且，所述CovR基因的长度为687bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该CovR基因始于起始密码子ATG上游6bp，结束于终止密码子TAA；或者，所述CovS基因的长度为1363bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，该CovS基因始于起始密码子TTG上游15bp，结束于终止密码子TAG。

而且，所述CovR基因、CovS基因来源于兽疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus)ATCC 39920基因组。

一种含有如上所述的用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒的工程菌。

而且，所述工程菌的构建方法为：

将用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒转入宿主菌，构建工程菌；其中，所述宿主菌为兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC39920。

而且，所述转入为电转入。

一种利用如上所述的工程菌在制备大分子量透明质酸方面中的应用。

而且，所述应用为在以蔗糖为底物发酵生产透明质酸方面的应用。

一种利用如上所述的工程菌制备大分子量透明质酸的方法，使用所述工程菌发酵获得。

而且，步骤如下：

取工程菌的发酵培养基，按接种量2％向发酵培养基中接入工程菌，37℃，pH7.0，转速200r/min，发酵24小时，即得大分子量透明质酸；

其中，所述工程菌的发酵培养基为：蔗糖：50g/L，酵母提取物：3.5g/L，酪蛋白胨：l0g/L，NaCl：1.5g/L，K₂HP0₄：2g/L，MgSO₄·7H₂O：0.4g/L。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明工程菌(CovR/OP和CovS/OP)的HA产量明显高于野生型，以工程菌CovR/OP进行透明质酸的发酵生产，其透明质酸的产量比野生型菌株提高10％，透明质酸分子量比野生型提高10％。以工程菌CovS/OP进行透明质酸的发酵生产，其透明质酸的产量比野生型菌株提高20％，透明质酸分子量比野生型提高15％；丰富了透明质酸的分子量类型，满足市场对不同分子量透明质酸的需求。

2、本发明构建表达载体pSET4s::oriB.s::CovR和pSET4s::oriB.s::CovS在兽疫链球菌中，能够稳定复制，在发酵培养过程不需要添加抗生素。

3、本发明两株工程菌CovR/OP和CovS/OPHA的分子量明显高于野生型，CovR/OP和CovS/OP菌株产生的透明质酸分子量分别为19.5MDa和20.4MDa，均高于野生型的分子量17.8MDa。

4、本发明是在本申请人对CovR/S双组分调控系统功能的深入研究的基础上实现的。CovR基因与CovS基因在兽疫链球菌基因组上相邻，分别编码应答调控因子和组氨酸传感激酶，二者共同构成一组双组分调控系统。CovR/S同源基因在A群链球菌(Group AStreptococci,GAS)以及其他一些菌株中的作用机理已经研究的相当清楚。相关文献报道在GAS中CovR基因缺失能够促进透明质酸荚膜的合成，表明CovR/S双组分调控系统对透明质酸的产生具有负调控作用。与在GAS中的研究结论截然不同，本申请人的研究发现在兽疫链球菌中CovR/S双组分调控系统正调控HA产量及及分子量。基于此发现，本发明构建了新型大分子量透明质酸工程菌。

附图说明

图1为本发明中CovR基因表达载体；

图2为本发明中CovS基因表达载体；

图3为本发明中CovR基因表达载体的菌落PCR验证图，其中，M为DNA Marker,N为阴性对照，P为阳性对照，以基因组为模板，1和2为PCR扩增CovR基因，大小为687bp；

图4为本发明中CovR基因表达载体酶切验证图，其中，M为DNA Marker；1和2为SphI和SalI双酶切验证质粒；

图5为本发明中CovS基因表达载体的菌落PCR验证图，其中，M为为DNA Marker,N为阴性对照，P为阳性对照，以基因组为模板，1和2为PCR扩增CovR基因，大小为1363bp；

图6为本发明中CovR基因表达载体酶切验证图，其中，M为DNA Marker；1和2为SphI和SalI双酶切验证质粒；

图7为本发明中构建的菌株CovR/OP、CovS/OP以及WT摇瓶发酵合成HA的产量图；

图8为本发明中构建的菌株CovR/OP、CovS/OP以及WT摇瓶发酵蔗糖残余量图；

图9为本发明中构建的菌株CovR/OP、CovS/OP以及WT摇瓶发酵HA的分子量图。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒，所述遗传重组质粒是将CovR基因或CovS基因与长度为221bp的Ppgk启动子插入pSET4s::oriB.s载体的多克隆位点处，构建成功pSET4s::oriB.s::CovR或pSET4s::oriB.s::CovS；

其中，所述Ppgk启动子的序列为SEQ ID NO.3所示，所述基因表达载体pSET4s::oriB.s的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。

较优地，所述CovR基因的长度为687bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该CovR基因始于起始密码子ATG上游6bp，结束于终止密码子TAA；或者，所述CovS基因的长度为1363bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，该CovS基因始于起始密码子TTG上游15bp，结束于终止密码子TAG。

较优地，所述CovR基因、CovS基因来源于兽疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus)ATCC 39920基因组。

一种含有如上所述的用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒的工程菌。

较优地，所述工程菌的构建方法为：

将用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒转入宿主菌，构建工程菌；其中，所述宿主菌为兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC39920。

较优地，所述转入为电转入。

一种利用如上所述的工程菌在制备大分子量透明质酸方面中的应用。

较优地，所述应用为在以蔗糖为底物发酵生产透明质酸方面的应用。

一种利用如上所述的工程菌制备大分子量透明质酸的方法，使用所述工程菌发酵获得。

较优地，步骤如下：

取工程菌的发酵培养基，按接种量2％向发酵培养基中接入工程菌，37℃，pH7.0，转速200r/min，发酵24小时，即得大分子量透明质酸；

其中，所述工程菌的发酵培养基为：蔗糖：50g/L，酵母提取物：3.5g/L，酪蛋白胨：l0g/L，NaCl：1.5g/L，K₂HP0₄：2g/L，MgSO₄·7H₂O：0.4g/L。

具体地，本发明以兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC39920基因组为模板，将基因CovR和CovS分别克隆至载体pSET4s::oriB.s上，并经过菌落PCR，结果如图3和图5所示，双酶切，结果如图4和图6，和测序验证后，成功构建了CovR表达载体pSET4s::oriB.s::CovR和CovS表达载体pSET4s::oriB.s::CovS，结果如图1、图2所示。将两个表达载体分别电转至宿主菌兽疫链球菌ATCC 39920野生型菌株中，成功获得过表达菌株CovR/OP和CovS/OP，经过对上述重组菌进行发酵分析，整个发酵过程中，野生型菌株蔗糖消耗量均低于过表达菌株，且过表达菌株蔗糖最终消耗完毕，但野生型菌株仍有部分残余。CovR/OP,CovS/OP菌株的HA产量明显高于野生型，且CovS/OP菌株的HA产量比野生型高20％左右，CovR/OP菌株HA产量比野生型高10％左右。CovR/OP,CovS/OP菌株的HA分子量显著提高，CovR/OP菌株的HA分子量比野生型高约10％，CovS/OP菌株HA分子量比野生型高约15％。

发酵生产透明质酸的方法是：将WT、CovR/OP和CovS/OP菌株分别接种到FSB液体培养基中，经发酵培养，每4小时收集一次发酵液，经样品处理和分析得到其透明质酸产量和蔗糖残余量，结果如图7和图8所示，所述的发酵培养条件为温度为37℃，培养时间24h，pH值为7.0以及转速200r/min。

更为具体的实施细节如下：

一、CovR表达载体和CovS表达载体的构建

以兽疫链球菌ATCC39920野生型基因组为模板，设计上游引物Ppgk-F和下游引物Ppgk-R，扩增Ppgk启动子；在CovR基因起始密码子ATG上游6bp处设计上游引物CovR-F，在终止密码子TAA处设计下游引物CovR-R，扩增CovR基因；在CovS基因起始密码子TTG上游15bp处设计上游引物CovS-F，在终止密码子TAG处设计下游引物CovS-R，扩增CovS基因。

PCR反应体系为：10×PCR Buffer10μL,dNTP(2mM)10μL,MgS04(250mM)4μL，上游引物和下游引物(10μM)各3μL，模板1μL,KODPlusDNA聚合酶(东洋纺株式会社，3462003)1μL，加无菌水至终体积为100μL。

PCR反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性15s，55℃退火30s，68℃延伸2min,反应35个循环，68℃后延伸l0min。

用上述PCR体系扩增获得完整的Ppgk启动子，CovR和CovS基因核苷酸序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

表1所用引物序列

将扩增获得的CovR基因片段和CovS基因片段用EcoR I/SalI进行双酶切，回收后分别与经Sph Ⅰ/Sal Ⅰ双酶切处理过的Ppgk启动子以及经EcoR Ⅰ/Sph Ⅰ切酶处理过的质粒片段pSET4s::oriB.s进行连接，pSET4s::oriB.s的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.4所示序列。将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于带有壮观霉素抗性(50μg/ml)的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆，进行菌落PCR验证和酶切验证，如图3、图4、图5、图6所示。并经测序比对正确，获得基因表达载体pSET4s::oriB.s::CovR如图1和pSET4s::oriB.s::CovS如图2。

其中，LB培养基为：胰蛋白陈：10.0g，酵母浸出物：5.0g，NaCl：10.0g，去离子水溶解后，定容至1.0L,pH调至7.0～7.2，固体培养基加1.5％的琼脂粉。121℃灭菌20min。

二、重组菌株CovR/OP、CovS/OP的构建

2.1兽疫链球菌感受态的制备。

(1)从-80℃取出保藏的菌株甘油管，在THY固体平板上进行三区划线，置于37℃培养箱中培养24～36h，至出现清晰单菌落。

(2)挑取单菌落接入装有50mLTHY液体培养基的250mL三角瓶中，37℃，200r/min培养12～14h。

(3)按1％的接种量将其接入新鲜的l00mL的THY的液体培养基中，37℃，200r/min继续培养至OD530大约为0.38左右，加入透明质酸酶(12.5kU/l00mL)(上海生工生物工程有限公司，37326-33-3)继续培养30min，使得OD530为0.58-0.60左右。置于冰上冰浴5min。

(4)于无菌操作台中将冰浴的三角瓶中的菌液分装至灭过菌的50mL离心管中，8000r/min,4℃，离心l0min。

(5)弃上清，加入20mL冰浴的0.5M的蔗糖溶液重悬菌体，8000r/min,4℃离心l0min。

(6)弃上清，加入500μL含质量浓度为15％的甘油的0.5M的蔗糖溶液，重悬菌体，分装至灭过菌的1.5mL的EP管中，每管50μL，放置-80℃冰箱中保藏。

2.2.兽疫链球菌的电转化和基因表达菌株的筛选。

(1)用清水将电转杯稍冲一下。

(2)向电转杯中加入75％酒精浸泡2h。

(3)弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2～3遍，然后用lmL的枪吸取超纯水反复吹打电转杯10遍以上。

(4)加入无水乙醇2mL于电转杯中，浸泡30min。

(5)弃去无水乙醇，于通风厨内吹干乙醇。

(6)将清洗好的电转杯放入-20℃冰箱内待用。

(7)-20℃取出电转杯置于冰上。

(8)从-80℃冰箱取出感受态置于冰上。待其溶化后加入5μL质粒，枪头吹打混匀后沿电转杯的壁加入电转杯，重新放回冰上。

(9)2500V(2mm电转杯)电转后将950μL复苏液加入电转杯中，吹打混匀，然后吸出置于离心管中。

(10)200r/min,37℃下复苏2h。

(11)涂板：8000r/min离心3min后，吸出900μL，将剩余的100μL混匀涂布于带有壮观霉素抗性的THY板。

(12)37℃下培养48h，可见长出转化子。将转化子在带有壮观霉素(100μg/mL)抗性的THY板上进行抗性点板验证，得到基因过表达菌株CovR/OP和CovS/OP。

其中，THY培养基为：牛肉浸粉10.0g，胰蛋白胨：20.0g，葡萄糖：2.0g，酵母浸出物：2.0g，NaHC0₃:2.0g，NaCl:2.0g，Na₂HP0₄:0.4g，去离子水溶解后，定容至1.0L,pH调至6.8，固体培养基加1.5％的琼脂粉，121℃灭菌20min。

三、CovR表达菌株和CovS表达菌株的代谢产物分析

3.1将WT、CovR/OP和CovS/OP菌株分别在500mL的摇瓶装液l00mL进行摇瓶发酵培养。所用发酵培养基：蔗糖：50g/L，酵母提取物：3.5g/L，酪蛋白胨：l0g/L,NaCl：1.5g/L,K₂HP0₄：2g/L,MgS0₄·7H₂O：0.4g/L。发酵条件：500mL发酵罐，装液量l00mL，接种量2％,37℃，pH7.0，转速200r/min，发酵24h，每4h取发酵液一次。

3.2HA产量的检测，具体步骤如下：

(1)发酵液预处理。用lmL移液枪准确量取各个时间点的样品各2mL至一新的l0mL离心管中，加入等体积的0.1％SDS，充分混匀，室温放置l0min。将样品在4℃，12000r/min条件下离心15min，将上清转移至一新的l0mL离心管中，去除菌体。用lmL移液枪准确量取2mL上清至一新的l0mL离心管中，加入3倍体积的无水乙醇充分混匀，4℃沉淀lh。4℃，5000r/min离心15min，上清置于另一离心管中保存待测蔗糖残余量。沉淀用无水乙醇洗涤一遍，然后置于4℃，5000r/min离心15min，上清倒掉，将沉淀室温晾干。用lmL移液枪准确量取2mLddH₂0，加入试管中使沉淀充分溶解，溶解后的样品经梯度稀释到浓度为0.lg/L以下后用于HA含量的检测。

(2)葡萄糖醛酸标准品的配制。用电子天平精确称取葡萄糖醛酸20.0g，置l00mL容量瓶中，加水溶解后定容至刻度。用lmL移液枪精确量取标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，分别加入l0mL量瓶中，加水稀释后定容至刻度，配制成浓度为10、20、30、40和50μg/mL的对照品溶液，4℃保存备用。

(3)样品检测。将具塞试管贴好标签，插入装满冰的冰盒中冰浴至4℃左右，准确量取5mL硼砂硫酸溶液(0.025mol/L，称取四硼酸钠4.77g，溶于浓硫酸(AR)500mL中即得。)，缓慢加入预冷的具塞试管中，置冰浴中冷至4℃左右。分别取空白溶液(娃哈哈水)、不同浓度的对照品溶液和样品溶液各lmL缓慢加入对应的试管中，轻轻振荡使其充分混匀，冰浴冷却至4℃左右。将试管塞好，盖上棉布于套，置沸水中加热l0min，放入冰水浴中冷却至室温。加入0.2mL咔唑试剂，充分混匀，置沸水中加热15min，放入冰水浴中冷却至室温。以空白对照调零后，在OD530处测定反应后标准品和样品的吸光度A，以吸光度对浓度c作图即可绘出标准曲线。根据公式以下计算样品HA含量。

测试结果如图7所示。

3.3蔗糖残余量检测骤如下：

(1)将上述提取透明质酸过程中保存的上清样品，梯度稀释到蔗糖糖浓度小于250mg/L。

(2)吸取待测样品溶液0.9mL(蔗糖含量应为40-250mg/L)，0.lmL2mol/L氢氧化纳，然后在100℃沸水浴中加热l0min，立即在流水中冷却。再加入间苯二酚溶液lmL以及l0mol/L盐酸3mL，摇匀后置于80℃水浴中加热8min，冷却后在OD500波长处，以空白调零，测定样品的吸光度，与标准样作对照，求样品中蔗糖含量。

测试结果如图8所示。

3.4粘度法测HA分子量

(1)准确量取10ml不同小时的发酵液，加入等体积0.1％SDS充分混匀，室温放置10min。4℃，12,000r/min离心15min。

(2)将上清移至一新的50ml离心管中，准确量取16ml上清(分装两管，每管8ml)，加入3倍体积的无水乙醇，4℃沉淀1h。

(3)4℃，5,000r/min离心10min，弃上清，沉淀用乙醇盐溶液(75％w/v乙醇，25％0.2MNaCl溶液)洗涤一次。

(4)4℃，10,000r/min离心15min，弃上清，室温晾干沉淀，加入等体积(发酵液体积)0.2MNaCl溶液溶解。

(5)充分溶解后，用0.45μm的滤膜过滤，用上述HA产量的检测方法检测HA的含量c。

(6)用乌氏粘度计测出其特性粘度[η]。根据公式计算出HA的分子量，

公式如下：

测定结果如表2所示。

表2透明质酸分子量测试结果

3.5琼脂糖凝胶电泳分析HA的分子量

(1)准确称量0.5g琼脂糖于烧杯中，向其中加入90mL蒸馏水，用微波炉低火加热2min后取出摇匀，重复2～3次直到琼脂糖充分溶解。

(2)量取10mL10×TAEbuffer以及上一步的烧杯放入48℃的水浴锅中，水浴加热15min后将10×TAEbuffer倒入烧杯中并充分震荡混匀。

(3)将已经溶好的胶液倒入事先摆好梳子的胶槽中，厚度约为3mm，待其凝固1h后，轻轻地向其表面倒入50mL1×TAEbuffer(并用塑料膜包裹)过夜后使用。

(4)向电泳槽内加入适量新鲜的1×TAEbuffer，然后将制好的胶放入电泳槽中，保证电泳液完全浸泡胶面且高于2mm(整个电泳过程中应不断倾倒电泳液，保证其高度)。

(5)向每个孔内分别加入待测样品7μg，两个相邻样品之间需要间隔一个孔，以免影响跑胶效果。

(6)点样完成之后，沉降5～10min，待观察孔中样品都沉降于孔底时，开启电泳仪，电压40，35mA，电泳1h；然后调节电泳仪65v，80mA，电泳大约5～6h，待示踪剂的蓝色条带全部跑出胶外后，停止电泳。

(7)戴手套取出电泳完毕的胶板(在蒸馏水中轻轻将胶取出)，用蒸馏水清洗多次。

(8)将胶放入已配置完成的50mL0.005％的Stains-All染液中，在避光环境中轻轻震荡，染色12h。

(9)将胶放入清水中褪色48h(避光环境，多次换水)。

(10)从避光环境中取出胶块，于自然光下褪色3h左右(待颜色褪掉，出现明显条带后停止褪色)。

(11).在合适的光线下照胶记录实验结果。

测试结果如图9所示:可以看出，重组菌株CovR/OP和CovS/OP产生的HA分子量显著高于野生型。

综上所述，通过克隆兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC39920基因组中CovR基因及CovS基因片段，并构建在兽疫链球菌ATCC39920内稳定存在的表达载体pSET4s::oriB.s::CovR和pSET4s::oriB.s::CovS，将构建成功的表达载体电转至兽疫链球菌ATCC39920菌株中得到工程菌株CovR/OP和CovS/OP。

上述构建得到的工程菌，在发酵过程HA产量均明显高于野生型。采用琼脂糖凝胶电泳法大致确定两株菌产生透明质酸的分子量范围，通过粘度法测定分子量的约值。野生型菌株、CovR/OP菌株和CovS/OP菌株产生的HA分子量展现出依次递增的特征。上述参照具体实施方式对该发明用于生产高分子量透明质酸基因表达载体及工程菌与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

序列表

SEQ ID NO.1 CovR基因：

GGTGTAATGACAAAGAAAATTTTAATTATCGAAGATGAAAAGAATCTTGCAAGATTTGTTTCGCTTGAGCTACAACATGAGGGTTACGAGGTGACCGTCGAGGTTAATGGTCGTGAGGGCTTGGAGACAGCCCTAGAGAAGGACTTTGACTTAATCCTTCTTGATTTGATGCTTCCTGAGATGGACGGATTTGAAGTGACACGTCGATTGCAAACAGAAAAAACGACTTACATCATGATGATGACTGCGCGTGACTCTATTATGGACGTTGTAGCCGGCTTGGATCGTGGTGCTGATGATTATATCGTGAAGCCATTTGCCATTGAGGAATTGCTGGCGCGTATTCGTGCTATCTTCCGTCGTCAGGACATTGAGTCAGAGAAAAAGACTCCTAGTCAAGGCGTTTACCGCGACTTAGTCTTAAACCCTCAAAACCGCTCTGTCAATCGCGGTGATGACGAGATTTCACTGACTAAGCGTGAATATGACCTGCTTAATATTTTGATGACAAACATGAATCGTGTCATGACTCGTGAGGAGCTCTTGTCTAACGTCTGGAAATATGACGAGGCTGTTGAAACTAACGTTGTTGATGTTTATATTCGTTACCTTCGTGGGAAGATCGATATCCCTGGGAAAGAGTCTTACATTCAAACTGTTCGTGGAATGGGTTATGTGATTCGCGAGAAATAA

SEQ ID NO.2 CovS基因：

ACAAACTACTTTTTGTTGAAACGAGAAAAGCAAACTATTTTTCAGGCTGTTAACATTGTTAGAGTTCGTCTCTCTGAGGTGGACTCTAATTTTACGTTAGAGAATTTAGCAGAGGTTCTCTATAAAAATGACAGAACGCATTTAAAGATTGATGACGCAAATGGCAGTCGTATTATCAGAAGTGAACGAGATATCACCAACACGCTCAATGCCAATGAGGATATCTATGTCTACAATGTTGATAAGCAAATGATCTTCACAACAGATGACGAAGAGGCCTCGCCAGGCTTAAATGGAACTATTGGTAAGGTAACCAAGGACCACATTGAGGAGCAATACAAGGGCTTTTCAATGACTCAGAAGGTCTACTCTAACAAGACAGGGAAGTTTGTAGGCTATGTTCAGGTTTTCCATGACTTGGAAAACTACTACATGATCAGAGCACGCCTCTTCTTCTGGCTTTTGGTGGTTGAGCTCTTTGGGGTTGGTCTGGCGTATTTCATTATCTTAATTGTCACACGCAACTTCTTGAAGCCTCTGAACAATCTTCATGATGTGATGCGGACGATTTCCAAAAATCCAGATAATCTGATGCTGCGCTCGGGTATTTCCTCAGGTGATGAAATTGAGGAATTGTCCGTTATCTTTGATAAAATGCTTGATAAGATTGAGACACATACACGATTGCAATCAAGATTTATTAGTGACGTCAGTCATGAGCTGCGCACGCCAGTTGCCATTATCAAGGGGCATATTGGATTATTGCAGCGCTGGGGCAAGGACGATAGTGCTATTTTAGATGAAAGCCTCACTGCAGCTGCGCATGAGGTTGACCGAATGGCTATTATGATCAATGACATGCTTGATATGATCCGAGTACAGGGGTCCTTTGAAGGGCATCAAAATGATACAACTGTTTTAGAGAGCTCTATTGAGACCGTTGTTGGTAATTTTAGGGTCCTGCGTGAGGATTTTGATTTTACCTGGTACTCTGAAAATCAAAGAACCCTAGCCAAGATTTATAAAAATCATTTTGAGCAGGCTCTGATGATTTTGATAGATAATGCGGTCAAGTATTCTAGGAAGGAAAAGAAAATCGTTATAGAATTAGCGGTTAATGCTAGCAATGAAGCTGTGGTTAAGGTTAAAGACAGAGGTGAGGGGATCTCAGAAGAGGATATTAAGCATATTTTTGAGCGCTTCTACCGCACTGATAGGTCCAGAAATCGAACCAGCACCCAAGCAGGTCTTGGGATTGGCTTATCCATTTTAAAGCAAATTGTTGATGGCTATCATTTACATATGGAGGTTGAGAGTGAGCTAAATAAAGGATCTGTCTTTATTTTGCGGATTCCCTTAGCTGATCATCAAGGCTCATAG

SEQ ID NO.3Ppgk启动子：

CATTTGCGTGATGTCATGACTATGTTGTGGCTTCCTGCCTACTTAGGTGATCATGATCTGCTGAAAAGGGGGTTATTCAAGGGATTTTTCAAGCGCTTTGAAAAATTGTGAAATAGTTAATTTATTGTTTTCAGATTTTATCCTTATCAAAAGAATTGTGTTATAATAGAGTGTACTAAAAAATATTAAGGAGTCTATGAAATGGCTAAATTGACTACGCG

SEQ ID NO.4pSET4s::oriB.s载体：

ACTAGTTATCGGCATAATCGTTAAAACAGGCGTTATCGTAGCGTAAAAGCCCTTGAGCGTAGCGTGGCTTTGCAGCGAAGATGTTGTCTGTTAGATTATGAAAGCCGATGACTGAATGAAATAATAAGCGCAGCGCCCTTCTATTTCGGTTGGAGGAGGCTCAAGGGAGTATGAGGGAATGAAATTCCCTCATGGGTTTGATTTTAAAAATTGCTTGCAATTTTGCCGAGCGGTAGCGCTGAACGAAGTCGAGATCAGGGAATGAGTTTATAAAATAAAAAAAGCACCTGAAAAGGTGTCTTTTTTTGATGGTTTTGAACTTGTTCTTTCTTATCTTGATACATATAGAAATAACGTCATTTTTATTTTAGTTGCTGAAAGGTGCGTTGAAGTGTTGGTATGTATGTGTTTTAAAGTATTGAAAACCCTTAAAATTGGTTGCACAGAAAAACCCCATCTGTTAAAGTTATAAGTGACTAAACAAATAACTAAATAGATGGGGGTTTCTTTTAATATTATGTGTCCTAATAGTAGCATTTATTCAGATGAAAAATCAAGGGTTTTAGTGGACAAGACAAAAAGTGGAAAAGTGAGACCATGGAGAGAAAAGAAAATCGCTAATGTTGATTACTTTGAACTTCTGCATATTCTTGAATTTAAAAAGGCTGAAAGAGTAAAAGATTGTGCTGAAATATTAGAGTATAAACAAAATCGTGAAACAGGCGAAAGAAAGTTGTATCGAGTGTGGTTTTGTAAATCCAGGCTTTGTCCAATGTGCAACTGGAGGAGAGCAATGAAACATGGCATTCAGTCACAAAAGGTTGTTGCTGAAGTTATTAAACAAAAGCCAACAGTTCGTTGGTTGTTTCTCACATTAACAGTTAAAAATGTTTATGATGGCGAAGAATTAAATAAGAGTTTGTCAGATATGGCTCAAGGATTTCGCCGAATGATGCAATATAAAAAAATTAATAAAAATCTTGTTGGTTTTATGCGTGCAACGGAAGTGACAATAAATAATAAAGATAATTCTTATAATCAGCACATGCATGTATTGGTATGTGTGGAACCAACTTATTTTAAGAATACAGAAAACTACGTGAATCAAAAACAATGGATTCAATTTTGGAAAAAGGCAATGAAATTAGACTATGATCCAAATGTAAAAGTTCAAATGATTCGACCGAAAAATAAATATAAATCGGATATACAATCGGCAATTGACGAAACTGCAAAATATCCTGTAAAGGATACGGATTTTATGACCGATGATGAAGAAAAGAATTTGAAACGTTTGTCTGATTTGGAGGAAGGTTTACACCGTAAAAGGTTAATCTCCTATGGTGGTTTGTTAAAAGAAATACATAAAAAATTAAACCTTGATGACACAGAAGAAGGCGATTTGATTCATACAGATGATGACGAAAAAGCCGATGAAGATGGATTTTCTATTATTGCAATGTGGAATTGGGAACGGAAAAATTATTTTATTAAAGAGTAGTTCAACAAACGGGCCAGTTTAGATCTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTAGTGTTCGTGAATACATGTTATAATAACTATAACTAATAACGTAACGTGACTGGCAAGAGATATTTTTAAAACAATGAATAGGTTTACACTTACTTTAGTTTTATGGAAATGAAAGATCATATCATATATAATCTAGAATAAAATTAACTAAAATAATTATTATCTAGATAAAAAATTTAGAAGCCAATGAAATCTATAAATAAACTAAATTAAGTTTATTTAATTAACAACTATGGATATAAAATAGGTACTAATCAAAATAGTGAGGAGGATATATTTGAATACATACGAACAAATTAATAAAGTGAAAAAAATACTTCGGAAACATTTAAAAAATAACCTTATTGGTACTTACATGTTTGGATCAGGAGTTGAGAGTGGACTAAAACCAAATAGTGATCTTGACTTTTTAGTCGTCGTATCTGAACCATTGACAGATCAAAGTAAAGAAATACTTATACAAAAAATTAGACCTATTTCAAAAAAAATAGGAGATAAAAGCAACTTACGATATATTGAATTAACAATTATTATTCAGCAAGAAATGGTACCGTGGAATCATCCTCCCAAACAAGAATTTATTTATGGAGAATGGTTACAAGAGCTTTATGAACAAGGATACATTCCTCAGAAGGAATTAAATTCAGATTTAACCATAATGCTTTACCAAGCAAAACGAAAAAATAAAAGAATATACGGAAATTATGACTTAGAGGAATTACTACCTGATATTCCATTTTCTGATGTGAGAAGAGCCATTATGGATTCGTCAGAGGAATTAATAGATAATTATCAGGATGATGAAACCAACTCTATATTAACTTTATGCCGTATGATTTTAACTATGGACACGGGTAAAATCATACCAAAAGATATTGCGGGAAATGCAGTGGCTGAATCTTCTCCATTAGAACATAGGGAGAGAATTTTGTTAGCAGTTCGTAGTTATCTTGGAGAGAATATTGAATGGACTAATGAAAATGTAAATTTAACTATAAACTATTTAAATAACAGATTAAAAAAATTATAAAAAAATTGAAAAAATGGTGGAAACACTTTTTTCAATTTTTTTGTTTTATTATTTAATATTTGGGAAATATTCATTCTAATTGGTAATCAGATTTTAGAAAAC。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒及工程菌与应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 693

<212> DNA/RNA

<213> CovR基因(Unknown)

<400> 1

ggtgtaatga caaagaaaat tttaattatc gaagatgaaa agaatcttgc aagatttgtt 60

tcgcttgagc tacaacatga gggttacgag gtgaccgtcg aggttaatgg tcgtgagggc 120

ttggagacag ccctagagaa ggactttgac ttaatccttc ttgatttgat gcttcctgag 180

atggacggat ttgaagtgac acgtcgattg caaacagaaa aaacgactta catcatgatg 240

atgactgcgc gtgactctat tatggacgtt gtagccggct tggatcgtgg tgctgatgat 300

tatatcgtga agccatttgc cattgaggaa ttgctggcgc gtattcgtgc tatcttccgt 360

cgtcaggaca ttgagtcaga gaaaaagact cctagtcaag gcgtttaccg cgacttagtc 420

ttaaaccctc aaaaccgctc tgtcaatcgc ggtgatgacg agatttcact gactaagcgt 480

gaatatgacc tgcttaatat tttgatgaca aacatgaatc gtgtcatgac tcgtgaggag 540

ctcttgtcta acgtctggaa atatgacgag gctgttgaaa ctaacgttgt tgatgtttat 600

attcgttacc ttcgtgggaa gatcgatatc cctgggaaag agtcttacat tcaaactgtt 660

cgtggaatgg gttatgtgat tcgcgagaaa taa 693

<210> 2

<211> 1380

<212> DNA/RNA

<213> CovS基因(Unknown)

<400> 2

acaaactact ttttgttgaa acgagaaaag caaactattt ttcaggctgt taacattgtt 60

agagttcgtc tctctgaggt ggactctaat tttacgttag agaatttagc agaggttctc 120

tataaaaatg acagaacgca tttaaagatt gatgacgcaa atggcagtcg tattatcaga 180

agtgaacgag atatcaccaa cacgctcaat gccaatgagg atatctatgt ctacaatgtt 240

gataagcaaa tgatcttcac aacagatgac gaagaggcct cgccaggctt aaatggaact 300

attggtaagg taaccaagga ccacattgag gagcaataca agggcttttc aatgactcag 360

aaggtctact ctaacaagac agggaagttt gtaggctatg ttcaggtttt ccatgacttg 420

gaaaactact acatgatcag agcacgcctc ttcttctggc ttttggtggt tgagctcttt 480

ggggttggtc tggcgtattt cattatctta attgtcacac gcaacttctt gaagcctctg 540

aacaatcttc atgatgtgat gcggacgatt tccaaaaatc cagataatct gatgctgcgc 600

tcgggtattt cctcaggtga tgaaattgag gaattgtccg ttatctttga taaaatgctt 660

gataagattg agacacatac acgattgcaa tcaagattta ttagtgacgt cagtcatgag 720

ctgcgcacgc cagttgccat tatcaagggg catattggat tattgcagcg ctggggcaag 780

gacgatagtg ctattttaga tgaaagcctc actgcagctg cgcatgaggt tgaccgaatg 840

gctattatga tcaatgacat gcttgatatg atccgagtac aggggtcctt tgaagggcat 900

caaaatgata caactgtttt agagagctct attgagaccg ttgttggtaa ttttagggtc 960

ctgcgtgagg attttgattt tacctggtac tctgaaaatc aaagaaccct agccaagatt 1020

tataaaaatc attttgagca ggctctgatg attttgatag ataatgcggt caagtattct 1080

aggaaggaaa agaaaatcgt tatagaatta gcggttaatg ctagcaatga agctgtggtt 1140

aaggttaaag acagaggtga ggggatctca gaagaggata ttaagcatat ttttgagcgc 1200

ttctaccgca ctgataggtc cagaaatcga accagcaccc aagcaggtct tgggattggc 1260

ttatccattt taaagcaaat tgttgatggc tatcatttac atatggaggt tgagagtgag 1320

ctaaataaag gatctgtctt tattttgcgg attcccttag ctgatcatca aggctcatag 1380

<210> 3

<211> 221

<212> DNA/RNA

<213> Ppgk启动子(Unknown)

<400> 3

catttgcgtg atgtcatgac tatgttgtgg cttcctgcct acttaggtga tcatgatctg 60

ctgaaaaggg ggttattcaa gggatttttc aagcgctttg aaaaattgtg aaatagttaa 120

tttattgttt tcagatttta tccttatcaa aagaattgtg ttataataga gtgtactaaa 180

aaatattaag gagtctatga aatggctaaa ttgactacgc g 221

<210> 4

<211> 4366

<212> DNA/RNA

<213> 基因表达载体pSET4s:: oriB.s(Unknown)

<400> 4

actagttatc ggcataatcg ttaaaacagg cgttatcgta gcgtaaaagc ccttgagcgt 60

agcgtggctt tgcagcgaag atgttgtctg ttagattatg aaagccgatg actgaatgaa 120

ataataagcg cagcgccctt ctatttcggt tggaggaggc tcaagggagt atgagggaat 180

gaaattccct catgggtttg attttaaaaa ttgcttgcaa ttttgccgag cggtagcgct 240

gaacgaagtc gagatcaggg aatgagttta taaaataaaa aaagcacctg aaaaggtgtc 300

tttttttgat ggttttgaac ttgttctttc ttatcttgat acatatagaa ataacgtcat 360

ttttatttta gttgctgaaa ggtgcgttga agtgttggta tgtatgtgtt ttaaagtatt 420

gaaaaccctt aaaattggtt gcacagaaaa accccatctg ttaaagttat aagtgactaa 480

acaaataact aaatagatgg gggtttcttt taatattatg tgtcctaata gtagcattta 540

ttcagatgaa aaatcaaggg ttttagtgga caagacaaaa agtggaaaag tgagaccatg 600

gagagaaaag aaaatcgcta atgttgatta ctttgaactt ctgcatattc ttgaatttaa 660

aaaggctgaa agagtaaaag attgtgctga aatattagag tataaacaaa atcgtgaaac 720

aggcgaaaga aagttgtatc gagtgtggtt ttgtaaatcc aggctttgtc caatgtgcaa 780

ctggaggaga gcaatgaaac atggcattca gtcacaaaag gttgttgctg aagttattaa 840

acaaaagcca acagttcgtt ggttgtttct cacattaaca gttaaaaatg tttatgatgg 900

cgaagaatta aataagagtt tgtcagatat ggctcaagga tttcgccgaa tgatgcaata 960

taaaaaaatt aataaaaatc ttgttggttt tatgcgtgca acggaagtga caataaataa 1020

taaagataat tcttataatc agcacatgca tgtattggta tgtgtggaac caacttattt 1080

taagaataca gaaaactacg tgaatcaaaa acaatggatt caattttgga aaaaggcaat 1140

gaaattagac tatgatccaa atgtaaaagt tcaaatgatt cgaccgaaaa ataaatataa 1200

atcggatata caatcggcaa ttgacgaaac tgcaaaatat cctgtaaagg atacggattt 1260

tatgaccgat gatgaagaaa agaatttgaa acgtttgtct gatttggagg aaggtttaca 1320

ccgtaaaagg ttaatctcct atggtggttt gttaaaagaa atacataaaa aattaaacct 1380

tgatgacaca gaagaaggcg atttgattca tacagatgat gacgaaaaag ccgatgaaga 1440

tggattttct attattgcaa tgtggaattg ggaacggaaa aattatttta ttaaagagta 1500

gttcaacaaa cgggccagtt tagatctcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca 1560

gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca 1620

gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca 1680

gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa 1740

ataccgcatc aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt 1800

gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag 1860

ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgaattcga 1920

gctcggtacc cggggatcct ctagagtcga cctgcaggca tgcaagcttg gcgtaatcat 1980

ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag 2040

ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg 2100

cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa 2160

tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca 2220

ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 2280

taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 2340

agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 2400

cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 2460

tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 2520

tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat 2580

gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 2640

acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 2700

acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 2760

cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 2820

gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 2880

gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 2940

agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 3000

ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa 3060

ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat 3120

atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga 3180

tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actagtgttc 3240

gtgaatacat gttataataa ctataactaa taacgtaacg tgactggcaa gagatatttt 3300

taaaacaatg aataggttta cacttacttt agttttatgg aaatgaaaga tcatatcata 3360

tataatctag aataaaatta actaaaataa ttattatcta gataaaaaat ttagaagcca 3420

atgaaatcta taaataaact aaattaagtt tatttaatta acaactatgg atataaaata 3480

ggtactaatc aaaatagtga ggaggatata tttgaataca tacgaacaaa ttaataaagt 3540

gaaaaaaata cttcggaaac atttaaaaaa taaccttatt ggtacttaca tgtttggatc 3600

aggagttgag agtggactaa aaccaaatag tgatcttgac tttttagtcg tcgtatctga 3660

accattgaca gatcaaagta aagaaatact tatacaaaaa attagaccta tttcaaaaaa 3720

aataggagat aaaagcaact tacgatatat tgaattaaca attattattc agcaagaaat 3780

ggtaccgtgg aatcatcctc ccaaacaaga atttatttat ggagaatggt tacaagagct 3840

ttatgaacaa ggatacattc ctcagaagga attaaattca gatttaacca taatgcttta 3900

ccaagcaaaa cgaaaaaata aaagaatata cggaaattat gacttagagg aattactacc 3960

tgatattcca ttttctgatg tgagaagagc cattatggat tcgtcagagg aattaataga 4020

taattatcag gatgatgaaa ccaactctat attaacttta tgccgtatga ttttaactat 4080

ggacacgggt aaaatcatac caaaagatat tgcgggaaat gcagtggctg aatcttctcc 4140

attagaacat agggagagaa ttttgttagc agttcgtagt tatcttggag agaatattga 4200

atggactaat gaaaatgtaa atttaactat aaactattta aataacagat taaaaaaatt 4260

ataaaaaaat tgaaaaaatg gtggaaacac ttttttcaat ttttttgttt tattatttaa 4320

tatttgggaa atattcattc taattggtaa tcagatttta gaaaac 4366

<210> 5

<211> 34

<212> DNA/RNA

<213> 引物CovR-F(Unknown)

<400> 5

acgcgtcgac gtaaggattg gtgtaatgac aaag 34

<210> 6

<211> 34

<212> DNA/RNA

<213> 引物CovR-R(Unknown)

<400> 6

ccggaattct tatttctcgc gaatcacata accc 34

<210> 7

<211> 34

<212> DNA/RNA

<213> 引物CovS-F(Unknown)

<400> 7

acgcgtcgac acaaactact ttttgttgaa acga 34

<210> 8

<211> 33

<212> DNA/RNA

<213> 引物CovS-R(Unknown)

<400> 8

ccggaattcc tatgagcctt gatgatcagc taa 33

<210> 9

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> 引物Ppgk-F(Unknown)

<400> 9

acatgcatgc atttgcgtga tgtcatgact 30

<210> 10

<211> 36

<212> DNA/RNA

<213> 引物Ppgk-R(Unknown)

<400> 10

acgcgtcgac ctcgagagtc aatttagcca tttcat 36

Claims (7)

1.一种利用工程菌在制备大分子量透明质酸方面中的应用，所述工程菌含有用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒，所述用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒是将CovR基因或CovS基因与长度为221bp的Ppgk启动子插入pSET4s:: oriB.s载体的多克隆位点处，构建成功pSET4s:: oriB.s::CovR或pSET4s:: oriB.s::CovS；

其中，所述Ppgk启动子的序列为SEQ ID NO.3所示，所述基因表达载体pSET4s::oriB.s的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示；

所述CovR基因的长度为687bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该CovR基因始于起始密码子 ATG 上游6bp，结束于终止密码子TAA；或者，所述CovS基因的长度为1363bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，该CovS基因始于起始密码子 TTG 上游15bp，结束于终止密码子TAG；

所述工程菌的构建方法为：

将用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒转入宿主菌，构建工程菌；其中，所述宿主菌为兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）ATCC39920。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述CovR基因、CovS基因来源于兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus) ATCC 39920 基因组。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述转入为电转入。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用为在以蔗糖为底物发酵生产透明质酸方面的应用。

5.一种利用工程菌制备大分子量透明质酸的方法，其特征在于：使用所述工程菌发酵获得；

所述工程菌含有用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒，所述用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒是将CovR基因或CovS基因与长度为221bp的Ppgk启动子插入pSET4s:: oriB.s载体的多克隆位点处，构建成功pSET4s:: oriB.s::CovR或pSET4s::oriB.s::CovS；

其中，所述Ppgk启动子的序列为SEQ ID NO.3所示，所述基因表达载体pSET4s::oriB.s的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示；

所述CovR基因的长度为687bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该CovR基因始于起始密码子 ATG 上游6bp，结束于终止密码子TAA；或者，所述CovS基因的长度为1363bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，该CovS基因始于起始密码子 TTG 上游15bp，结束于终止密码子TAG；

所述工程菌的构建方法为：

将用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒转入宿主菌，构建工程菌；其中，所述宿主菌为兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）ATCC39920。

6.根据权利要求5所述的利用工程菌制备大分子量透明质酸的方法，其特征在于：步骤如下：

按接种量2%向发酵培养基中接入工程菌，37℃，pH7.0，转速200r/min，发酵24小时，即得大分子量透明质酸；

其中，所述的发酵培养基为：蔗糖：50g/L，酵母提取物：3. 5g/L，酪蛋白胨：l0g/L，NaCl：1.5g/L， K₂HP0₄：2g/L，MgSO₄ • 7H₂O ：0. 4g/L。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述CovR基因、CovS基因来源于兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus) ATCC 39920 基因组；

所述转入为电转入。

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